CN111929447B - 一种pd-l1免疫组织化学参考品及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种PD‑L1免疫组织化学参考品及其制备方法和应用，通过同源重组的方式将PD‑L1的cDNA序列敲入细胞系，获得单克隆细胞系，通过qRT‑PCR和免疫组织化学染色，确定单克隆细胞系的PD‑L1表达强度；将PD‑L1免疫组织化学无染色、弱染色、中等染色及强染色的单克隆细胞系切片中的任意一种或多种排列在一张载玻片上，作为PD‑L1免疫组织化学染色的参考品。本发明的参考品，可作为PD‑L1免疫组织化学的良好外部对照，监控整个PD‑L1免疫组织化学流程的有效性，为PD‑L1表达的检测提供高灵敏度和高特异性的评判标准。

Description

一种PD-L1免疫组织化学参考品及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种PD-L1免疫组织化学参考品及其制备方法和应用。
背景技术
程序性死亡配体-1（Programmed death-ligand 1，PD-L1）是B7超家族成员，属于I型跨膜蛋白，在人类中由CD274基因编码。PD-L1在活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞表面表达，在癌组织中也广泛表达，如肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾癌、肠癌、食道癌、胰腺癌等。PD-L1与T细胞表面的受体PD-1结合，发挥负调控作用，抑制T细胞的激活、分化和增殖，使得肿瘤细胞逃避T细胞杀伤，获得免疫逃逸。
近年来肿瘤免疫治疗取得飞速发展，以抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体为代表的免疫检查点抑制剂成为临床研究的热点。截至2020年3月，中国已上市4款进口PD-1/PD-L1单抗药物，4款国产PD-1单抗药物，如纳武利尤单抗（Nivolumab）、帕博利珠单抗（Pembrolizumab）、特瑞普利单抗（Toripalimab）、信迪利单抗（Sintilimab）、卡瑞利珠单抗（Camrelizumab）、度伐利尤单抗（Durvalumab）、替雷利珠单抗（Tislelizumab）和阿替利珠单抗（Atezolizumab）。抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体药物的上市必然伴随检测试剂的出现。目前美国FDA批准的与抗 PD-1抗体或抗PD-L1抗体药物配套使用的试剂均为针对PD-L1蛋白的抗体检测试剂。检测方法都是对石蜡包埋的组织（FFPE）样本进行免疫组织化学检测。目前用于PD-L1识别的单克隆抗体克隆号有28-8、22C3 、SP263和SP142。有报告指出其中的28-8、22C3、SP263克隆号抗体检测的一致性较高。
由于PD-L1的检测结果对于患者的用药具有重要的指导作用，为提高用药的有效性，准确的PD-L1免疫组织化学检测至关重要。随着抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体药物研究的发展，相应的检测需求也日趋增多，除了商业化的检测试剂盒，也有很多实验室自建检测方法（Laboratory Developed Tests，LDT）的需求，可以预见更多新的PD-L1检测试剂也会应运而生。
影响免疫组织化学结果的因素众多，比如抗原修复条件、抗体使用、显色反应条件、操作一致性等诸多因素，上述因素的细微改变就会影响最终的结果，因此，免疫组织化学的过程质控显得尤为重要。目前还少有PD-L1的免疫组织化学参考品，有报道用不同的人体组织样本进行切片作为PD-L1表达的测试片，但是存在比较明显的缺陷和不足：1、样本来源于数量有限的人体组织，属于一次性材料，无法长期稳定的用于参考品生产；2、使用不同的人体组织样本（如扁桃体组织和癌症组织），存在组织异质性和不可重复性，不能很好的确保参考品的均匀性和一致性，无法稳定的提供明确的PD-L1表达强度的对照。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种PD-L1免疫组织化学参考品及其制备方法和应用，通过同源重组的方式将PD-L1的cDNA序列敲入细胞系，获得单克隆细胞系，通过qRT-PCR和免疫组织化学染色，确定所述单克隆细胞系的PD-L1表达强度；将PD-L1免疫组织化学无染色、弱染色、中等染色及强染色的单克隆细胞系切片排列在一张载玻片上，作为PD-L1免疫组织化学染色的参考品。
本发明采用的技术方案：
一种PD-L1免疫组织化学参考品，包含以下成份：
（1）PD-L1无染色对照细胞点、PD-L1弱染色对照细胞点、PD-L1中等染色对照细胞点、PD-L1强染色对照细胞点中的任意一个或多个；
（2）PD-L1待测样品放置区；
所述PD-L1无染色对照细胞点设置有PD-L1无表达的单克隆细胞系切片，所述PD-L1弱染色对照细胞点设置有PD-L1弱表达的单克隆细胞系切片，所述PD-L1中等染色对照细胞点设置有PD-L1中等表达强度的单克隆细胞系切片，所述PD-L1强染色对照细胞点设置有PD-L1强表达的单克隆细胞系切片，所述染色为免疫组织化学染色，所述PD-L1待测样品放置区用于放置待检测的组织或细胞切片。
进一步的，所述PD-L1无染色对照细胞点选自PD-L1免疫组织化学染色强度为0、染色结果无着色的单克隆细胞系切片。PD-L1mRNA相对内参基因GAPDH的相对表达量<0.0001。
进一步的，所述PD-L1弱染色对照细胞点选自PD-L1免疫组织化学染色强度为1+、染色结果为浅黄色的单克隆细胞系切片。PD-L1 mRNA相对内参基因GAPDH的相对表达量≥0.002且<0.02。
进一步的，所述PD-L1中等染色对照细胞点选自PD-L1免疫组织化学染色强度为2+、染色结果为棕黄色的单克隆细胞系切片。PD-L1 mRNA相对内参基因GAPDH的相对表达量≥0.02且<0.2。
进一步的，所述PD-L1强染色对照细胞点选自PD-L1免疫组织化学染色强度为3+、染色结果为棕褐色的单克隆细胞系切片。PD-L1 mRNA相对内参基因GAPDH的相对表达量≥0.2。
进一步的，所述单克隆细胞系中含有稳定转化的外源PD-L1基因。
进一步的，所述外源PD-L1基因通过同源重组的方式整合到细胞基因组中，所述同源重组的方式采用CRISPR/Cas9系统。
进一步的，所述单克隆细胞系切片为石蜡包埋的切片。
进一步的，所述单克隆细胞系切片的厚度为3～10μm。
本发明还提供一种具有所述的参考品的PD-L1免疫组织化学诊断载玻片，所述载玻片上排列有所述（1）PD-L1无染色对照细胞点、PD-L1弱染色对照细胞点、PD-L1中等染色对照细胞点、PD-L1强染色对照细胞点中的任意一个或多个；
和
（2）PD-L1待测样品放置区。
本发明还提供一种所述的PD-L1免疫组织化学参考品的制备方法，包含以下步骤：
（1）将PD-L1的cDNA序列敲入细胞系，获得单克隆细胞系；
（2）通过qRT-PCR和免疫组织化学染色，确定所述单克隆细胞系的PD-L1表达强度；
（3）将PD-L1免疫组织化学无染色、弱染色、中等染色、强染色的单克隆细胞系切片中的任意一种或多种排列在一张载玻片上，留出放置待测样本的区域，作为PD-L1免疫组织化学染色的参考品。
进一步的，所述步骤（1）中通过同源重组的方式将PD-L1的cDNA序列敲入细胞系，所述同源重组的方式采用CRISPR/Cas9系统。
进一步的，所述步骤（2）中所述的免疫组织化学染色需要将所述单克隆细胞系包埋成蜡块后切片。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
（1）采用基因编辑的细胞系作为参考品的原料，可以无限的稳定扩繁，实现参考品的长期稳定生产，克服了采用人体组织样本来源的局限性。
（2）采用单克隆细胞，因此每个质控对照的PD-L1表达具有良好的均匀性和一致性，能够保证参考品的稳定性。
（3）采用多个具有明确PD-L1表达强度梯度的基因编辑细胞，因此可以设置明确的PD-L1表达强度梯度的对照，使参考品具有PD-L1不同染色强度的动态范围。
（4）本发明的参考品具有明确的PD-L1染色强度，可以对PD-L1免疫组织化学染色过程及其结果的可信度进行有效评估。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的PD-L1参考品的示意图，其中1、2、3、4分别为PD-L1无染色、弱染色、中等染色、强染色对照细胞点，5为待测样品放置区域。
图2为本发明的PD-L1参考品的4个细胞点在28-8、SP263、22C3克隆号的抗体的PD-L1的免疫组织化学染色结果。
图3为PD-L1免疫组织化学参考品的扁桃体/胎盘组织对照类似的质控效果。图中1、2、3、4分别为本发明PD-L1免疫组织化学参考品的无膜染色、膜弱染色、膜中等染色和膜强染色对照。5-1为扁桃体组织对照，在不同部位显示出膜强染色、膜弱染色和膜无染色。5-2为胎盘组织对照，显示出膜强染色。
图4为PD-L1免疫组织化学参考品用于PD-L1实验室自建检测方法的优化。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明提供一种PD-L1免疫组织化学参考品，包含以下成份：
（1）PD-L1无染色对照细胞点、PD-L1弱染色对照细胞点、PD-L1中等染色对照细胞点、PD-L1强染色对照细胞点中的任意一个或多个；
（2）PD-L1待测样品放置区；
所述PD-L1无染色对照细胞点设置有PD-L1无表达的单克隆细胞系切片，所述PD-L1弱染色对照细胞点设置有PD-L1弱表达的单克隆细胞系切片，所述PD-L1中等染色对照细胞点设置有PD-L1中等表达强度的单克隆细胞系切片，所述PD-L1强染色对照细胞点设置有PD-L1强表达的单克隆细胞系切片，所述染色为免疫组织化学染色，所述PD-L1待测样品放置区用于放置待检测的组织或细胞切片。
本发明还提供一种所述的PD-L1免疫组织化学参考品的制备方法，包含以下步骤：
（1）通过同源重组的方式将PD-L1的cDNA序列敲入细胞系，获得单克隆细胞系；
（2）通过qRT-PCR和免疫组织化学染色，确定所述单克隆细胞系的PD-L1表达强度；
（3）将PD-L1免疫组织化学无染色、弱染色、中等染色及强染色的单克隆细胞系切片的任意一个或多个排列在一张载玻片上，留出放置待测样本的区域，作为PD-L1免疫组织化学染色的参考品。
实施例1将包含PD-L1基因的质粒整合到细胞基因组的特定位点，获得稳定转化的单细胞克隆
采用转基因的方式，优选的，采用CRISPR/Cas9系统，通过同源重组的方式将包含PD-L1基因的质粒整合到细胞基因组的特定位点。其中，用作整合的质粒，包含同源臂、PD-L1基因（NM_014143.4）的cDNA序列和抗性筛选基因。整合的位点可根据需求选择，优选的位点为AAVS1。具体步骤如下：
1）针对整合位点，设计特异的向导RNA（guide RNA，gRNA），并构建向导RNA的表达载体。向导RNA的序列为：5’-ggggccactagggacaggat-3’。
2）构建整合质粒pEF1-PDL1-UC57，包括同源左臂、PD-L1基因的cDNA序列、抗性筛选基因和同源右臂等元件。一般地，同源臂的长度为500-1000bp。
3）将向导RNA的表达载体转染至目标细胞GM12878，24h再次转染整合质粒。
4）48h后，将细胞培养基换成包含抗生素的培养基，进行细胞的筛选。筛选的时间周期，根据抗生素的不同有所差别。
5）筛选结束后，将剩余的细胞进行单细胞克隆：
a)消化并收集细胞；b)对细胞准确计数，按照倍比稀释的方法，用培养基将活细胞稀释至5个/mL，并将细胞混匀；c)取10mL细胞悬液，均匀分到一块96孔板中；d)待细胞克隆形成时，标记有克隆的孔，加入少量胰蛋白酶（~20μL）消化细胞：取部分细胞进行PCR，用作sanger测序。剩余细胞扩大培养，待细胞扩大至6孔板时，收集并裂解细胞，提取RNA。
6）用一对检测PD-L1 mRNA表达的引物对，优选的，在本实施例中使用正向引物：5’-GCTGAATTGGTCATCCCAGAAC-3’，反向引物：5’-TGGCTCCCAGAATTACCAAGTG-3’和检测内参基因GAPDH mRNA表达的引物对，优选的，在本实施例中使用正向引物：5’-TGTGCTCACCCACCAACAAT -3’，反向引物：5’-TGCTCTGACTTTAGCACCTGTT -3’，以20ng 总RNA作为模板，采用天根生物的SuperRealPreMix Plus (SYBR Green) 试剂盒与BIORAD CFXCONNECT荧光PCR仪进行qRT-PCR，检测多个单克隆细胞系的PD-L1和内参基因GAPDH的mRNA表达。qRT-PCR的操作参照说明书进行。
7）qRT-PCR能够检测获得每个单克隆细胞系的PD-L1和内参基因GAPDH的Ct值。Ct值是qRT-PCR扩增曲线达到阈值时的循环数。按照2^(-Ct(PD-L1)-Ct(GAPDH))法计算PD-L1相对于内参基因GAPDH的相对表达量。一些单克隆的PD-L1 mRNA的相对表达量如下表：
单克隆编号 相对表达量
3 0.000
22 0.007
6 0.015
25 0.035
16 0.064
7 0.151
13 0.248
11 0.510
实施例2 制备细胞石蜡包埋蜡块
具体步骤如下：
1）采用FBS培养基培养实施例1中的单克隆细胞，培养结束后离心收集细胞。
2）用10%中性福尔马林固定细胞48h。细胞固定后，用70 %（v/v）的乙醇重悬细胞，洗去残留的福尔马林溶液。
3）将上述固定好的细胞悬液与等体积的琼脂糖凝胶溶液混合、固定成型。
4）使用Leica全自动脱水机进行脱水处理。
5）细胞团经脱水后，放入包埋模具中，采用徕卡HistoCore Arcadia H + C包埋机，进行石蜡包埋。包埋好的蜡块放置于徕卡RM2255石蜡切片机上，进行切片，切片厚度为3-10μm。
6）将切片铺在37℃水面上展片。
7）将切片捞到防脱载玻片上，烤片至干燥为止。
得到PD-L1表达量不同的各个单克隆细胞的石蜡包埋切块。
实施例3 通过免疫组织化学方法确认多个细胞克隆的PD-L1的表达
采用PD-L1（22C3）检测试剂盒（免疫组织化学法），按照试剂盒说明书在相应的仪器（Autostainer Link 48组织染色机）上对实施例2获得的石蜡包埋切块进行免疫组织化学染色。具体步骤如下：
1）脱蜡、水化和抗原修复：
a）设置免疫组织化学预处理系统预热温度和冷却温度为65℃。设置加热至97℃且维持20分钟。b）每个PT Link缸中灌注1.5L低pH值1x抗原修复液工作液，以覆盖组织切片。c）将抗原修复液预热至65℃。d）将插有石蜡包埋组织切片的Autostainer切片架浸入PTLink缸中，内含预热的低pH值1x抗原修复液工作液。97℃孵育20分钟。e）待抗原修复液孵育完毕且温度冷却至65℃后，从PT Link缸中取出插有切片的Autostainer切片架，并立即放入含有室温缓冲清洗液的缸中。F）切片在室温缓冲清洗液中孵育5分钟。
2）染色：脱蜡、水化和抗原修复三合一操作后，将插有切片的Autostainer切片架放置到Autostainer Link 48组织染色机上。仪器按照PD-L1检测试剂盒（免疫组织化学法）染色方案执行染色步骤、滴加正确的试剂、监控孵育时间和冲洗切片。试剂孵育时间被预编程到Dako Link软件中。
3）复染：切片应用苏木素染色液复染5min。
4）封片：使用非水溶性永久封片剂封片。
5）对染色的切片进行判读，确定各个单克隆细胞系的PD-L1免疫组织化学染色特性。
6）将各个单克隆细胞系的PD-L1免疫组织化学染色特性与mRNA相对表达量相对应，如下表所示：
单克隆编号 相对表达量 PD-L1免疫组织化学染色情况
3 0.000 无染色（0）
22 0.007 弱染色（1+）
6 0.015 弱染色（1+）
25 0.035 中等染色（2+）
16 0.064 中等染色（2+）
7 0.151 中等染色（2+）
13 0.248 强染色（3+）
11 0.510 强染色（3+）
根据行业内的共识《免疫组织化学标记结果的判断方法》，以0、1+、2+、3+来区分细胞或组织的免疫化学染色强度：
0代表无染色，染色结果无着色；
1+代表弱染色，染色结果为浅黄色；
2+代表中等染色，染色结果为棕黄色；
3+代表强染色，染色结果为棕褐色。
PD-L1无染色对照细胞点选自PD-L1免疫组织化学染色强度为0的单克隆细胞系切片。PD-L1mRNA相对内参基因GAPDH的相对表达量<0.0001；
PD-L1弱染色对照细胞点选自PD-L1免疫组织化学染色强度为1+的单克隆细胞系切片。PD-L1 mRNA相对内参基因GAPDH的相对表达量≥0.002且<0.02；
PD-L1中等染色对照细胞点选自PD-L1免疫组织化学染色强度为2+的单克隆细胞系切片。PD-L1 mRNA相对内参基因GAPDH的相对表达量≥0.02且<0.2；
PD-L1强染色对照细胞点选自PD-L1免疫组织化学染色强度为3+的单克隆细胞系切片。PD-L1 mRNA相对内参基因GAPDH的相对表达量≥0.2。
分别选择具有代表性膜染色为无染色（3号）、弱染色（6号）、中等染色（16号）及强染色（13号）的细胞系，作为后续制备PD-L1免疫组织化学参考品的细胞系。
实施例4PD-L1免疫组织化学参考品的设计
参考品的设计包括但不限于如下形式：将无染色、弱染色、中等染色及强染色依次并排成一行，置于载玻片靠近顶部的位置，留出下方用于放置待测样本，如附图1所示，其中1、2、3、4分别为PD-L1无染色、弱染色、中等染色、强染色对照细胞点，5为待测样品放置区域。本实施例仅列举了一种可能的形式，4个细胞点中的一个或任意多个，任意多个细胞点的排列顺序，以及细胞点在载玻片上的任意摆放位置都可以实现本发明的方案，可以根据客户的需求进行个性化定制。例如，客户仅需要无染色的对照细胞点，载玻片上就仅放置无染色的对照细胞点，并留出放置待测样本的区域；客户仅需要中等染色的对照细胞点，载玻片上就仅放置中等染色的对照细胞点，并留出放置待测样本的区域；以此类推，如果客户需要某2个对照细胞点或3个或4个细胞对照点同理。染色完成后检查所述载玻片上的PD-L1无染色对照细胞点、PD-L1弱染色对照细胞点、PD-L1中等染色对照细胞点、PD-L1强染色对照细胞点的染色情况，若所有细胞点呈现正常的染色情况，则判断免疫组织化学染色过程是正常的，结果是有效、可信的；若任何一个细胞点的染色情况与描述不相符合，则判断该次免疫组织化学染色过程存在异常，结果是无效的、不可信的，应该用新的样品重新进行免疫组织化学染色。
实施例5PD-L1免疫组织化学参考品的制备
本发明参考品的制备采用基因编辑的细胞系作为原料，为了应用于生产要进行无限的稳定扩繁，从而实现参考品的长期稳定生产。故要分别对实施例1-3的实验操作筛选得到的PD-L1无染色对照细胞点（3号）、PD-L1弱染色对照细胞点（6号）、PD-L1中等染色对照细胞点（16号）、PD-L1强染色对照细胞点（13号）进行新一轮的扩繁切片，具体步骤如下：
1）采用FBS培养基培养实施例3中选出的单克隆细胞，培养结束后离心收集细胞。
2）用10%中性福尔马林固定细胞48h。细胞固定后，用70 %（v/v）的乙醇重悬细胞，洗去残留的福尔马林溶液。
3）将上述固定好的细胞悬液与等体积的琼脂糖凝胶溶液混合、固定成型。
4）使用Leica全自动脱水机进行脱水处理。
5）细胞团经脱水后，将几个细胞团按照前述设计方案放入包埋模具中，采用徕卡HistoCore Arcadia H + C包埋机进行石蜡包埋。包埋好的蜡块放置于徕卡RM2255石蜡切片机上，进行切片，切片厚度为3-10μm。
6）将切片铺在37℃水面上展片。
7）将切片捞到防脱载玻片上，烤片至干燥为止。即得PD-L1免疫组织化学参考品。
实施例6PD-L1免疫组织化学参考品的适用性验证
将制备好的PD-L1免疫组织化学参考品用多个克隆号的PD-L1抗体对参考品进行验证。各个抗体的免疫组织化学染色步骤按照相应的试剂盒的使用说明进行。染色结果见附图2，图2为本发明的PD-L1参考品的4个细胞点在28-8、SP263、22C3多个克隆号的PD-L1的免疫组织化学染色结果。结果表明本发明的PD-L1参考品在目前常用的几个克隆号的抗体（28-8、SP263、22C3）染色中都分别呈现膜无染色、膜弱染色、膜中等染色、膜强染色的特性，具有良好的一致性。表明本发明的PD-L1参考品能够适用于PD-L1各种抗体克隆号的染色流程监控。
实施例7 PD-L1免疫组织化学参考品具有扁桃体/胎盘组织对照类似的质控效果
将常用于PD-L1质控的扁桃体组织和胎盘组织切片，放置在本发明的PD-L1免疫组织化学参考品的5号区域，采用与实施例3中同样的方法进行PD-L1免疫组织化学（22C3克隆号）。结果如附图3所示。图中1、2、3、4分别为本发明PD-L1免疫组织化学参考品的无膜染色、膜弱染色、膜中等染色和膜强染色对照。5-1为扁桃体组织对照，扁桃体隐窝上皮部分呈膜强染色，生发中心滤泡巨噬细胞呈膜弱至中等染色，内皮、成纤维细胞及表面上皮呈无染色。5-2为胎盘组织对照，显示出膜强染色。结果表明，本发明的PD-L1免疫组织化学参考品与跟扁桃体组织和胎盘组织切片具有一致的免疫组织化学对照效果。且由于本发明采用了可以无限繁殖的细胞系，因此来源供应充足稳定，能够克服组织对照取材的不便利性和不稳定性。
实施例8PD-L1免疫组织化学参考品用于PD-L1实验室自建检测方法的优化
本发明的PD-L1免疫组织化学参考品可用于PD-L1免疫组织化学实验室自建检测方法（LDT）的优化。将本发明的PD-L1免疫组织化学参考品利用某实验室自建检测方法进行免疫组织化学染色，结果如附图4所示。图中的1、2、3、4分别表示PD-L1免疫组织化学参考品的无膜染色、膜弱染色、膜中等染色和膜强染色细胞。在优化DAB显色时间这一步骤时，检测方法A（DAB显色2分钟）条件下，A1及A4能够分别呈现正常的无膜染色和膜强染色，但A2和A3呈现无膜染色；检测方法B（DAB显色10分钟）条件下B1呈现无膜染色，但B2、B3和B4都呈现膜强染色，且有不同程度的非特异性染色；在检测方法C（DAB显色5分钟）条件下，C1、C2、C3及C4分别呈现正确的无膜染色、膜弱染色、膜中等染色和膜强染色。结果表明，检测方法A使染色结果偏弱，检测方法B使染色结果偏强且产生非特异性染色，所以检测方法A和B均不能准确的反映细胞的PD-L1表达强度。而经过多次优化调整后的检测方法C则能够准确的区分不同的PD-L1表达强度。可见，使用本发明的PD-L1免疫组织化学参考品可以优化PD-L1 IHCLDT检测方法。
综上，本专利方案可以长期稳定的提供具有不同染色强度动态范围的PD-L1免疫组织化学参考品，可以有效的检测免疫组织化学过程是否正常，能正确检测出不同强度的PD-L1表达。可作为日常PD-L1免疫组织化学的良好外部对照，监控整个PD-L1免疫组织化学流程的有效性；或用于有效的PD-L1免疫组织化学LDT流程质控；或作为PD-L1免疫组织化学室间质评的参考品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种PD-L1免疫组织化学参考品，其特征在于，由以下成份组成：
（1）PD-L1无染色对照细胞点、PD-L1弱染色对照细胞点、PD-L1中等染色对照细胞点、PD-L1强染色对照细胞点；
（2）PD-L1待测样品放置区；
所述PD-L1无染色对照细胞点设置有PD-L1免疫组织化学染色强度为0的单克隆细胞系切片；
所述PD-L1弱染色对照细胞点设置有PD-L1免疫组织化学染色强度为1+的单克隆细胞系切片；
所述PD-L1中等染色对照细胞点设置有PD-L1免疫组织化学染色强度为2+的单克隆细胞系切片；
所述PD-L1强染色对照细胞点设置有PD-L1免疫组织化学染色强度为3+的单克隆细胞系切片；
所述染色为免疫组织化学染色，所述PD-L1待测样品放置区用于放置待检测的组织或细胞切片；所述单克隆细胞系中含有稳定转化的外源PD-L1基因，所述外源PD-L1基因通过同源重组的方式整合到细胞基因组中，所述同源重组的方式采用CRISPR/Cas9系统；所述PD-L1免疫组织化学染色强度为0的单克隆细胞系、所述PD-L1免疫组织化学染色强度为1+的单克隆细胞系、所述PD-L1免疫组织化学染色强度为2+的单克隆细胞系、所述PD-L1免疫组织化学染色强度为3+的单克隆细胞系是来自同一株母细胞的PD-L1表达量不同的细胞。
2.根据权利要求1所述的参考品，其特征在于，所述单克隆细胞系切片为石蜡包埋的切片。
3.一种具有权利要求1-2任一项所述的参考品的PD-L1免疫组织化学诊断载玻片，其特征在于，所述载玻片上排列有所述（1）PD-L1无染色对照细胞点、PD-L1弱染色对照细胞点、PD-L1中等染色对照细胞点、PD-L1强染色对照细胞点；
和
（2）PD-L1待测样品放置区。
4.一种如权利要求1所述的PD-L1免疫组织化学参考品的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）通过同源重组的方式将PD-L1的cDNA序列敲入同一种细胞系，获得单克隆细胞系；所述同源重组的方式采用CRISPR/Cas9系统；
（2）通过qRT-PCR和免疫组织化学染色，确定所述单克隆细胞系的PD-L1表达强度；
（3）将PD-L1免疫组织化学无染色、弱染色、中等染色、强染色的单克隆细胞系切片排列在一张载玻片上，留出放置待测样本的区域，作为PD-L1免疫组织化学染色的参考品。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述的免疫组织化学染色需要将所述单克隆细胞系包埋成蜡块后切片。
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