CN110531083A - 间皮素检测细胞质控片 - Google Patents

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CN110531083A CN201810545950.0A CN201810545950A CN110531083A CN 110531083 A CN110531083 A CN 110531083A CN 201810545950 A CN201810545950 A CN 201810545950A CN 110531083 A CN110531083 A CN 110531083A
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Abstract

本发明涉及一种间皮素免疫组化检测细胞质控片以及相关检测试剂，所述细胞质控片包括切片区；所述切片区粘附有石蜡切片，所述石蜡切片含有4种起对照作用的表达间皮素的阴性、弱阳性、阳性、强阳性细胞团；本发明涉及的免疫组化检测细胞质控片主要用于提高免疫组化检测结果的准确性和一致性，有良好的应用前景。

Description

间皮素检测细胞质控片
技术领域
本发明涉及一种间皮素免疫组化检测相关细胞或组织样品对照质控片以及相关检测试剂。
背景技术
间皮素(Mesothelin，MSLN)是一个膜蛋白，间皮素基因编码的是一个71KD的前蛋白，经修饰切割变成两段，40KD的糖基化磷脂酰肌醇细胞膜锚定蛋白和31KD的游离片段称为巨核细胞促进因子。有研究证实 40KD的膜锚定蛋白包含一段与另一个肿瘤标志物CA125蛋白的结合区，它们可能与细胞粘附有关，因而猜测可能会有助于原发癌发生远端转移(例如腹腔转移)，并导致预后较差。
虽然Mesothelin的功能尚不确切，但是无论是细胞膜结合区还是游离区都被证实可以作为间皮癌、胰腺癌、卵巢癌等多种肿瘤的标志物和治疗靶点。据报道胰腺癌(86％-100％)和卵巢非黏液性癌，其中浆液性癌 (93％-100％)、透明细胞癌(43％-75％)和移行细胞癌(100％)中存在MSLN阳性表达。大约40％到50％的肺腺癌和15％到30％的肺鳞状细胞癌也有报道存在MSLN阳性表达。准确的鉴别出患有大量表达 MSLN蛋白肿瘤的患者(即可能从MSLN靶向治疗中受益的患者)，对于指导患者的用药是有意义的。
免疫组化方法的主要原理是：应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究方式。
免疫组化技术的主要特点是：1特异性强：免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性；2敏感性高：抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理分析工作。3定位准确：该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入具有重要的意义。
由于免疫组化实验过程相对复杂，影响检测结果的因素较多，并且免疫组化结果的判读受判读者主观影响相对较大，因此，一般而言，需要标准化的对照装置，例如：细胞质控片。现有技术中的用于免疫组化实验的质控片并没有设置不同表达强度的对照细胞，因此，对照效果有待提高。
在实验过程中使用细胞质控片作用如下：
在免疫组化过程中对于细胞质控片染色是否正常可以作为免疫组化检测系统正常的依据，如果实验过程出现意外可以辅助寻找问题。
质控片可以用于抗体筛选，实验条件筛选等过程，节省购买医院病理切片的成本，相比病理组织，使用细胞质控片具有较高的一致性。
病理组织进行免疫组化检测后，组织会出现不同强度的染色，组织中肿瘤细胞染色强度的高低与染色所占的的百分比通常能够反映肿瘤组织中靶标抗原的表达量。细胞质控片中存在MSLN不同表达强度的细胞，免疫组化染色后能够显示不同的染色强度，在病理组织切片免疫组化结果判读时，细胞质控片可以作为染色强度的“比色卡”作用，辅助病理切片免疫组化结果的判读。提高对免疫组化实验结果判读的精密度，从而提高该靶标免疫组化检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于免疫组化法检测肿瘤靶标MSLN蛋白表达情况的质控切片，该质控切片的作用是能够提高MSLN靶标蛋白免疫组化检测结果的可信度和准确性。
一方面，本发明提供了一个在使用免疫组化法检测肿瘤靶标MSLN 蛋白表达情况时能够实现质控功能的粘附载玻片，包括磨砂区和切片区，其特征在于：所述磨砂区贴有标签，标签内容包括质控片名称与批号；所述切片区粘附有厚度为3-5μm的石蜡切片，每张石蜡切片含有2行2列共4个点的细胞团，每个细胞团的直径为3-5mm，厚度为3-5μm。上述四个细胞团的四株细胞分别是293细胞、CFPAC-1细胞、OVCAR-3细胞以及间皮素强阳性表达的OVCAR-3-MSLN细胞。另一方面，所述四个细胞团具有不同的MSLN表达量，表达量关系为：293细胞(不表达 MSLN)＜CFPAC-1细胞＜OVCAR-3细胞＜OVCAR-3-MSLN细胞；
另一方面，本申请涉及相关细胞质控片在制备间皮素检测试剂中的用途。
另一方面，本申请涉及间皮素强阳性表达的OVCAR-3-MSLN细胞在制备间皮素免疫组化检测试剂盒中的应用。
另一方面，本申请涉及用于检测MSLN的免疫组化试剂盒，其包含本申请制备的细胞质控片。
另一方面，本申请涉及一种用于免疫组织化学技术质量控制的参照物，其特征在于：所述参照物包括两种对照物：质量控制的阳性对照物、质量控制的阴性对照物；其中，阳性对照物为：CFPAC-1细胞、OVCAR-3 细胞以及间皮素强阳性表达的OVCAR-3-MSLN细胞；阴性对照物为:293 细胞。
另一方面，本申请涉及一种免疫组化检测方法，所述方法使用本申请制备的细胞质控片作为对照。
另一方面，本发明提供一种细胞石蜡包埋的方法和一种细胞质控片的制备方法。
具体而言，本发明提供一种细胞石蜡包埋的方法，其步骤包括：
(1)细胞培养
对293细胞、CFPAC-1细胞、OVCAR-3细胞以及OVCAR-3-MSLN 细胞在培养基中进行培养；
(2)细胞收集与固定
上述细胞培养至铺满细胞培养皿底部的80-90％时，收取细胞。将培养基倒掉，用磷酸缓冲盐溶液洗涤，加胰酶消化3-5min，显微镜下观察细胞变圆，加1ml细胞培养基终止消化，用移液器将细胞吹打均匀收集并计数，加入磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞，离心，弃上清，细胞用4％多聚甲醛或10％中性福尔马林固定液重悬，室温固定；
(3)琼脂糖支撑细胞
琼脂糖凝胶配制：称取琼脂糖加磷酸缓冲盐溶液配制成3-4％浓度的溶液，加盖锡箔纸于微波炉中加热至琼脂糖完全溶解，取出置于60℃水浴中保温待用；
细胞与琼脂糖混合：经过固定过程，自然沉降至体积至100μl，用移液器小心移去上清；将盛有细胞的离心管在60℃水浴中预热，用预热的移液器移取与细胞等体积的琼脂糖凝胶，加入离心管中与细胞混匀，混匀后的琼脂糖、细胞混合物移到去除针头的1ml注射器针管中，室温冷却成型；
(4)细胞团脱水
将与琼脂糖混合的细胞团取出，切成0.5cm厚度的小段，放置在做好标记的脱水筐内；将细胞团依次浸入不同浓度梯度的乙醇中进行组织脱水：
(5)细胞团透明
进行完梯度乙醇脱水的细胞团依次块浸入到二甲苯I和二甲苯II中进行透明，每次进行透明时间为20min(二甲苯I和二甲苯II成分一致，只是为了区分是两次操作)；
(6)细胞团浸蜡
石蜡块置于浸蜡杯中于65℃烘箱中一段时间至石蜡完全融化，将进行组织透明后的细胞团浸入到融化的石蜡中进行组织浸蜡；
(7)细胞团包埋
手动包埋过程在60℃烘箱中进行，将融化的石蜡倒入组织包埋底模中，将浸蜡结束的细胞团从相应的脱水筐中取出，迅速放入到组织包埋底模的石蜡中，放入时尽量不要有气泡产生，调整好细胞的位置，将做好上下标记的包埋框覆盖在包埋盒上，转移至冷却台上冷却30min可以获得组织包埋石蜡块。在使用石蜡块之前，将293细胞所在位置外边缘垂直切掉一小块石蜡，用作切片方位标记。
一些实施方案中，所述培养中使用的培养基包括：
293细胞的培养基包括：Gibco RPMI1640培养基+10％FBS；
CFPAC-1细胞的培养基包括：Gibco IMDM培养基+10％FBS；
OVCAR-3细胞的培养基包括：Gibco RPMI1640-A10491-01培养基 +20％FBS+0.01mg/ml胰岛素；
OVCAR-3-MSLN细胞的培养基包括：Gibco RPMI1640-A10491-01 培养基+20％FBS+0.01mg/ml胰岛素。
一些实施方案中，所述细胞培养的条件包括：37℃，5％CO2静置培养2-3天，直到细胞增殖到占培养皿底部80-90％。
一些实施方案中，所述步骤(4)的脱水步骤为：70％乙醇过夜—80％乙醇1.5h—90％乙醇1.5h—95％乙醇1.5h—100％乙醇50min—100％乙醇50min。
一些实施方案中，所述步骤(3)的混匀步骤整个过程在3min之内完成。
一些实施方案中，所述步骤(2)中的胰酶加入量为：1-2ml 0.25％的胰酶。
一些实施方案中，所述步骤(2)中固定液的添加量为2×107cells/ml。
一些实施方案中，细胞质控片的制备方法包括：使不同MSLN靶标蛋白表达强度的细胞按照2行2列的顺序整齐的排列在细胞切片上，其实现的技术效果为：在不同批次生产出来的细胞质控片能够达到高度一致，从而保证产品批次间的一致性。
一些实施方案中，其中所述的FBS为胎牛血清，Gibco RPMI1640 (ATCC改良)培养基是美国Gibco公司货号为A1049101的RPMI 1640 培养基(即为Gibco RPMI1640-A10491-01)；Gibco IMDM培养基是美国Gibco公司货号为12440053的IMDM培养基；Gibco RPMI1640普通培养基为Gibco公司货号为11875135的培养基；
其中，OVCAR-3-MSLN细胞的获得步骤如下：
1.目的基因的扩增：设计引物从目的基因载体上获取扩增目的基因 MSLN全长；
2.目的基因与表达质粒酶切：扩增后的目的基因MSLN使用胶回收试剂盒进行切胶回收，并用限制性内切酶进行酶切，同时使用同种内切酶酶切表达载体；
3.目的基因表达质粒的构建：将目的基因片段和表达载体进行连接；将连接产物转化到感受态细胞中，扩增后涂布平板；挑取单个菌落进行菌落PCR；选取扩增产物正确的菌落进行测序；测序正确重组质粒即为构建好的表达质粒；
4.目标基因慢病毒的包装：接种293T细胞于T75培养瓶中，过夜培养后更换无血清培养基，将表达质粒、包装质粒和包膜质粒混合后再与Lipofectamine2000混合后加入293T细胞(转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系)中，培养48小时候收集上清并浓缩后分装；
5.目的细胞感染：取对数生长期目的细胞，加入24孔板中，过夜培养；吸去细胞原有的培养基，加入病毒稀释液和稀释好的polybrene溶液，感染总体积为250μL，轻轻混匀；感染24小时后，去除含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养基继续培养；对于携带嘌呤霉素抗性基因的病毒换上含嘌呤霉素的新鲜完全培养基，筛选稳定转染的细胞株；
6.细胞株单克隆化：将上述获得的过表达MSLN目的基因稳转细胞株采用有限稀释法获得单个克隆的细胞株，根据病理组织中MSLN表达强度，选择MSLN表达强度与病理组织中MSLN高表达强度一致的细胞株即为：MSLN强阳性表达OVCAR-3-MSLN细胞。
此外，PBST(phosphate buffered solution)即含吐温-20的磷酸盐冲液，能够提供相对稳定的离子环境和pH缓冲能力，是生物学中经常使用的缓冲盐溶液，主要用于免疫组化和原位杂交，酶联免疫等实验中，清洗免疫印迹膜等。
附图说明
图1：流式细胞筛选实验结果。
图2：细胞涂片免疫细胞染色筛选结果。
A图：293细胞MSLN特异性抗体1染色结果。
B图：CFPAC-1细胞MSLN特异性抗体1染色结果。
C图：OVCAR-3细胞MSLN特异性抗体1染色结果。
D图：OVCAR-3-MSLN细胞MSLN特异性抗体1染色结果。
E图：293细胞MSLN特异性抗体2染色结果。
F图：CFPAC-1细胞MSLN特异性抗体2染色结果。
G图：OVCAR-3细胞MSLN特异性抗体2染色结果。
H图：OVCAR-3-MSLN细胞MSLN特异性抗体2染色结果。
I图：293细胞空白对照结果。
J图：CFPAC-1细胞空白对照结果。
K图：OVCAR-3细胞空白对照结果。
L图：OVCAR-3-MSLN细胞空白对照结果。
图3：WB法筛选细胞的实验结果。
其中，细胞裂解液上样顺序是：1.293；2.CFPAC-1；3.OVCAR-3； 4.OVCAR-3-MSLN。
抗体孵育顺序：1.GAPDH；2.MSLN特异性抗体1；3.MSLN特异性抗体2。
图4：细胞包埋与切片过程示意图。
图5：细胞质控片染色结果与病理组织染色结果的比较实验。
A图：293细胞染色结果。
B图：CFPAC-1细胞染色结果。
C图：与293细胞染色强度相对应的病例组织染色结果。
D图：与CFPAC-1细胞染色强度相对应的病例组织染色结果。
E图：OVCAR-3细胞染色结果。
F图：OVCAR-3-MSLN细胞染色结果。
G图：与OVCAR-3细胞染色强度相对应的病例组织染色结果。
H图：与OVCAR-3-MSLN细胞染色强度相对应的病例组织染色结果。
图6：质控片结构示意图。
具体实施方式
实施例1：细胞质控片细胞的筛选
1.流式细胞筛选
(1)收集细胞：将待检测的细胞用0.25％的胰酶消化后收集， 1000rpm离心5min，弃上清。
(2)固定：向收集到的细胞中加入适量的4％多聚甲醛重悬细胞，置于4℃固定30min；PBS 2000rpm离心3min洗涤3次，弃上清。
(3)计数：将所有的细胞株各使用1ml PBS(所述PBS为磷酸缓冲盐溶液)重悬细胞，使用细胞计数仪进行计数，根据计数结果，将不同克隆株的细胞数目调整一致，2000rpm离心3min弃上清。
(4)一抗：将细胞株分别用200μl PBS重悬，按照实验方案加入一抗(所述一抗为特异性识别MSLN蛋白的抗体)，使抗体的终浓度保持一致，充分混匀后4℃孵育30min。PBS2000rpm离心3min洗涤3次，弃上清。
(5)二抗：用200μl PBS重悬细胞，按照实验方案加入与一抗种属相对应的荧光二抗(商品名：Dylight 488货号：46402)；二抗的终浓度为1:200，充分混匀后4℃孵育30min。PBS 2000rpm离心3min洗涤3 次，弃上清。
(6)检测：用500μl PBS重悬细胞转入流式检测管，使用FL1通道进行上机检测。
(7)实验结果：根据图1的实验结果表明：293细胞、CFPAC-1细胞、OVCAR-3细胞以及OVCAR-3-MSLN细胞的表达量各不相同，表达强度依次增强，说明上述四株细胞有可能适合用作细胞质控片的指示细胞。
2.细胞涂片染色筛选
(1)收集细胞：用胰酶消化收集细胞，PBS洗涤，1000rpm离心5min 弃上清。
(2)固定：向离心管中加入1ml 4％多聚甲醛吹散细胞，室温固定 30min，PBS洗涤，1000rpm离心5min弃上清。
(3)涂片：用10μl枪头吸取少量细胞悬液(尽量高浓度)，按照实验方案在防脱载玻片上涂成细胞团，通风橱中晾干。
(4)封闭：滴加封闭液100μl/片(3％H2O2)，室温(37℃)10min， PBS(pH7.2-7.6)浸泡2*3min。
(5)一抗：特异性识别MSLN蛋白的抗体按照1:100稀释后添加到细胞涂片上，100μl/片，37℃孵育1h，并设置抗体稀释液代替一抗作为空白对照组。PBS(pH7.2-7.6)浸泡2*3min。
(6)反应放大剂：按照DAB显色试剂盒(该试剂盒来自福州迈新，货号:KIT-0016)说明书，滴加试剂盒中的反应放大剂100μl/片，37℃孵育10min。
(7)二抗：按照试剂盒(福州迈新，货号:KIT-0016)，的说明书进行二抗检测系统的孵育和操作。PBS(pH7.2-7.6)浸泡2*3min。
(8)DAB显色：使用DAB显色试剂盒(福州迈新，货号:KIT-0016)，取850μl蒸馏水，加试剂盒中4A、4B、4C试剂各50μl，混匀后加至切片。室温显色，镜下根据染色情况控制反应时间，一般在1-3分钟。蒸馏水洗涤。
(9)苏木素染色：滴加苏木素100μl/片，室温条件下染色1min。
(10)分化：苏木素染色后的切片用1％盐酸乙醇分化10s，立即用大量自来水冲洗。
(11)脱水，透明，封片步骤如下依次进行，75％乙醇1次，95％乙醇1次，100％乙醇一次，各5min。二甲苯10min。切片取出后，滴加树胶封片，切片置于显微镜下观察。
根据图2所示的实验结果可知：293细胞、CFPAC-1细胞、OVCAR-3 细胞以及OVCAR-3-MSLN细胞MSLN蛋白的表达量各不相同，表达强度依次增强，说明上述四株细胞适合用作细胞质控片的指示细胞。
3.WB检测筛选
(1)5％浓缩胶和10％分离胶制备
A.将长短两块玻璃板相对放置，长玻璃板有间隔条的一面面向短玻璃板，两玻璃板放在灌胶框内夹紧，确保两玻璃板下边缘处在同一水平面上，将放有玻璃板的灌胶框放在灌胶架上。
B.按照分离胶配方配制10％的分离胶，用移液器将纯化水以及以下溶液分别加到烧杯中，混匀后立即灌胶，并用1.0-1.5ml纯化水封顶端，检查是否存在气泡，若有气泡，用枪头小心将气泡挑出，放置 15min～30min。
C.分离胶凝固后，倒掉上层纯化水，并用吸水纸吸干，按照5％浓缩胶配方配制浓缩胶，用移液器将纯化水以及以下溶液分别加到烧杯中，混匀后立即灌胶，插入样品梳，放置10～40min。浓缩胶凝固后，将样品梳拔出。
(2)样品处理
A.293、CFPAC-1、OVCAR-3(来自武大)以及OVCAR-3-MSLN 细胞裂解液使用BCA试剂盒进行定量。根据定量结果将4株细胞的细胞裂解液分别稀释至5mg/ml，MSLN-ECD抗原用PBST稀释250倍至 2μg/ml(MSLN-ECD抗原来自G&P Biosciences公司，货号：FCL1589)。
B.将稀释好的样品分别与4×非还原loading Buffer以及10×样品还原剂混合成还原样品；将稀释好的样品与4×非还原loading Buffer以及一定量PBS(与还原样品中10×样品还原剂添加量相同)混合制成非还原样品。
C.将所有样品10000rpm离心3min后置于100℃处理5min，再于10000rpm离心3min准备上样，上样体积5μL/well。
(3)SDS-PAGE
5％浓缩胶恒压85V，电泳时间20min；10％分离恒压150V，电泳时间50min至1小时，待溴酚蓝距离底部1.5至2.0cm时关闭电源。
(4)Western Blot
A.转膜：将凝胶小心从胶板中分离出，置于半干转膜缓冲液中，厚滤纸用转膜缓冲液浸透，PVDF膜用甲醇活化10s。在半干转印槽中自上至下按照厚滤纸→PVDF膜→凝胶→厚滤纸顺序依次放好，注意排出气泡并小心吸除多余缓冲液。打开电源，恒流80mA电压小于20V，时间1h。结束后取下PVDF膜，用PBST在摇床上振荡洗涤3次，每次5min。
B.封闭：配制5％脱脂奶粉，加5％脱脂奶粉浸没PVDF膜，摇床封闭90min。封闭结束后倒掉脱脂奶粉，PBST在摇床上振荡洗涤3次，每次5min。
C.一抗孵育：MSLN特异性抗体1和抗体2，GAPDH抗体分别用 PBST分别按照1:3000稀释。向PVDF膜中加稀释好的一抗，摇床振荡过夜。倒掉一抗，在摇床上用PBST振荡洗涤3次，每次5min。
D.二抗孵育：将HRP-羊抗兔二抗以及HRP-羊抗鼠二抗按照1:10000 稀释。按照与一抗种属对应的原则加稀释好的相应二抗摇床振荡孵育1h。倒掉二抗，在摇床上用PBST振荡洗涤3次，每次5min。
E.显影和成像：从冰箱中取出显影液平衡至室温，取1.0mL过氧化物缓冲液与1.0mL化学发光底物混合均匀，注意避光。将PVDF膜置于成像仪的托盘上，滴加ECL(增强化学发光法)底物。打开软件，曝光成像。根据图3的实验结果显示：在细胞裂解液上样量相同的情况下，293 细胞、CFPAC-1细胞、OVCAR-3细胞以及OVCAR-3-MSLN细胞MSLN 蛋白的表达量各不相同，表达强度依次增强，存在明显的梯度趋势，这说明上述四株细胞适合用作细胞质控片的指示细胞。
实施例2：细胞石蜡包埋和切片制作方法
2.1细胞石蜡包埋方法
实验材料：
MSLN四合一细胞质控片包括四个细胞株：293(Number: CRL-1573TM)、CFPAC-1(Number:CRL-1918)、OVCAR-3 (Number:HTB-161)以及OVCAR-3-MSLN细胞经过稳定转染人源化MSLN基因，形成的能够稳定过表达MSLN蛋白的细胞系。细胞培养和包埋过程中使用的材料均能够通过商业途道购买获得。
实验过程：
1.细胞培养
细胞名称：293(染色强度为0)
培养基：Gibco RPMI1640培养基+10％FBS
细胞名称：CFPAC-1(染色强度为1)
培养基：Gibco IMDM培养基+10％FBS
细胞名称：OVCAR-3(染色强度为2)
培养基：Gibco RPMI1640-A10491-01培养基+20％FBS+0.01mg/ml 胰岛素
细胞名称：OVCAR-3-MSLN(染色强度为3)
培养基：Gibco RPMI1640-A10491-01培养基+20％FBS+0.01mg/ml 胰岛素
培养条件：37℃，5％CO2静置培养；2-3天，细胞增殖到占培养皿底部80-90％传代一次。
2细胞收集与固定
上述细胞培养至铺满细胞培养皿底部的80-90％时，收取细胞。将培养基倒掉，用1-2ml PBS洗涤一次，加1-2ml 0.25％胰酶消化3-5min，显微镜下观察细胞变圆，加1ml细胞培养基终止消化，用移液器将细胞吹打均匀收集并计数，加入3-5ml PBS洗涤细胞，1000rpm离心5min，弃上清，细胞用4％多聚甲醛或者10％中性福尔马林固定液重悬，固定液的添加量为2×107cells/1ml固定液，室温固定16h-24h。
3琼脂糖支撑细胞
琼脂糖凝胶配制：称取琼脂糖加PBS配制成3-4％浓度的溶液，加盖锡箔纸于微波炉中加热至琼脂糖完全溶解，取出置于60℃水浴中保温待用。
细胞与琼脂糖混合：1-2×107cells经过固定过程，自然沉降至体积约 100μl，用移液器小心移去上清。将盛有细胞的离心管在60℃水浴中预热，用预热的移液器移取与细胞等体积的琼脂糖凝胶，加入离心管中与细胞混匀(该步操作混匀动作需轻柔，整个过程宜控制在3min之内，减少水分蒸发的影响)，混匀后的琼脂糖、细胞混合物移到去除针头的1ml注射器针管中，室温冷却成型。
4细胞团脱水
将与琼脂糖混合的细胞团取出，切成0.5cm厚度的小段，放置在做好标记的脱水筐内。将细胞团依次浸入不同浓度梯度的乙醇中进行组织脱水：70％乙醇过夜→80％乙醇1.5h→90％乙醇1.5h→95％乙醇1.5h→ 100％乙醇50min→100％乙醇50min。
5细胞团透明
进行完梯度乙醇脱水的细胞团依次块浸入到二甲苯I和二甲苯II中进行透明，每次进行透明时间为20min。
6细胞团浸蜡
石蜡块置于浸蜡杯中65℃烘箱中2h至石蜡完全融化，将进行组织透明后的细胞团浸入到融化的石蜡中进行组织浸蜡，浸蜡1次后换蜡再进行 1次浸蜡，每次1h。
7细胞团包埋
手动包埋过程在60℃烘箱中进行。将融化的石蜡倒入组织包埋底模中，将浸蜡结束的细胞团从相应的脱水筐中取出，迅速放入到组织包埋底模的石蜡中，放入时尽量不要有气泡产生，调整好细胞的位置，将做好上下标记的包埋框覆盖在包埋盒上，转移至冷却台上冷却30min可以获得组织包埋石蜡块。在使用石蜡块之前，将293细胞所在位置外边缘垂直切掉一小块石蜡，用作切片方位标记。
2.2切片制作方法
1)固定：切片机按照生产厂商提供的操作说明进行使用，使用前应该保证刀片的锋利，然后将蜡块固定到支持器上，注意保证切角位置位于蜡块的右上角。
2)修块：修块模式下，修块切片厚度可以调节至15-20μm，修切蜡块至包埋的四个细胞团全部可以被切到。应该尽量的避免修块次数，并且应该保证组织的连续性。
3)切片：调整切片厚度为3-5μm左右，然后进行切片，切片必须保证完整、均匀、厚度适宜、没有刀痕、无褶皱和开裂。
4)展片：用毛笔轻轻挑起切片，用镊子移至漂烘仪中的水面中展开 (温度37-40℃，将切片转移至漂烘仪水面的过程中，切片可以旋转但不可以翻转)。
5)捞片：将展开的切片贴于载玻片上，捞片时右手持载玻片磨砂区，保持石蜡缺口位于左上方，尽量避免切片和载玻片之间产生气泡。倾斜载玻片至45度使切片上多余的水流下。
6)烤片：将载玻片置于烘箱中60℃烘烤30min可以制成组织石蜡切片，储存以备后续实验。制作切片的示意图参见图4。
实施例3：细胞质控片使用方法
实验材料
主要的实验材料包括乙醇，二甲苯，柠檬酸盐抗原修复液，DAB显色试剂盒等材料均可以通过商品化途道获得。
具体实验操作步骤：
(1)烤片：开启恒温鼓风干燥箱设置65℃预热，恒温鼓风干燥箱温升至65℃时，取石蜡切片放到切片架上，放入烘箱烤片1h。
(2)脱蜡复水：烤片结束后，取出石蜡切片迅速转移至二甲苯中，室温脱蜡20min。然后按下列顺序梯度乙醇复水，无水乙醇：5min→95％乙醇：5min→75％乙醇：5min，然后转移到PBST中浸泡备用。(该过程在通风橱中进行)
(3)抗原修复：配制1L的0.01M柠檬酸盐抗原修复液(pH6.0)，倒入压力锅中，压力锅放置到电磁炉上选择烧水程序开盖加热至沸腾后放入切片。盖上盖子，继续1600W加热至安全阀顶起，调节电磁炉至800W，继续加热2.5min。计时结束后关闭电磁炉，取下压力锅，放置到实验台上，室温冷却约10min后至安全阀落下。打开锅盖，修复液自然冷却至室温。1×PBST缓冲液洗涤切片3次，每次5min。
(4)画圈：使用吸水纸将玻片上组织外多余的缓冲液擦掉，使用免疫组化笔圈定组织区域，以防止液体外流导致干片。(注意：免疫组化笔需要笔尖朝下竖立放置，如画圈效果不好可以多次重复画圈，或更换新的免疫组化笔)。
(5)封闭：切片甩干净多余的PBST缓冲液摆放到湿盒中，4℃冰箱中从DAB显色试剂盒(放大聚合物法)中取出试剂1(内源性过氧化物酶封闭试剂)，滴加100μl到组织上，37℃孵育10min，1×PBST缓冲液洗涤切片3次，每次5min。
(6)一抗孵育：切片甩干净多余的PBST缓冲液摆放到湿盒中，4℃冰箱中取抗间皮素一抗试剂，滴加100μl至组织位置，盖上湿盒盖子，37℃孵育1h。1×PBST缓冲液洗涤切片3次，每次5min。
(7)反应放大剂：切片甩干净多余的PBST缓冲液摆放到湿盒中，4℃
冰箱中从DAB染色试剂盒(福州迈新，货号:KIT-0016)中取出试剂 2(反应放大剂)，滴100μl滴至组织位置，盖上湿盒盖子，37℃孵育10min。 1×PBST缓冲液洗涤切片3次，每次5min。
(8)高敏型酶标抗小鼠/兔IgG聚合物：切片甩干净多余的PBST缓冲液摆放到湿盒中，4℃冰箱中从DAB染色试剂盒(放大聚合物法)中取出试剂3(高敏型酶标抗小鼠/兔IgG聚合物)，加100μl至组织位置，盖上湿盒盖子，室温孵育10min。1×PBST缓冲液洗涤切片3次，每次5min。
(9)DAB显色液配制：使用前配制，4℃冰箱中从DAB染色试剂盒 (放大聚合物法)中取出试剂4A(DAB缓冲液)、4B(稳定型DAB底物)、 4C(稳定型DAB色原)；1ml的4A试剂中添加4B和4C试剂各50μl，配制好的DAB染色液避光室温保存。
(10)DAB显色：切片甩干净多余的PBST缓冲液摆放到湿盒中，放到湿盒中，滴加100μl DAB显色液至组织位置，室温孵育1-3min，1 ×PBST缓冲液洗涤切片3次，每次5min。
(11)苏木素染色：切片甩干净多余的PBST缓冲液摆放到湿盒中，滴加100μl苏木素复染色液至组织位置，室温孵育1min(可根据实际调整染色时间)，自来水冲洗切片5min，直至苏木素冲洗干净。
(12)分化(根据苏木素性质选择是否需要)：切片浸入分化液中处理10s，迅速取出切片用自来水冲洗玻片5min。
(13)脱水、透明：将冲洗切片的自来水甩干，按下列顺序梯度乙醇脱水，75％乙醇：5min→95％乙醇：5min→无水乙醇：5min，从无水乙醇中取出的切片放入二甲苯10min进行透明处理。(该过程在通风橱中进行)
(14)封片：取出切片摆放到通风橱中，在二甲苯挥发干之前滴加中性树胶，盖上盖玻片。(该过程在通风橱中进行)
(15)阅片：封片结束后在显微镜下观察染色结果。
根据图5所示的实验结果表明：该细胞质控片与实际进行肿瘤标志物MSLN蛋白免疫组化检测后的病理组织样本染色具有高度的一致性，故可以作为免疫组化分析过程中的质控对照，提高检测的准确性。
实施例4OVCAR-3-MSLN细胞的构建
1.目的基因表达载体的构建
设计引物从包含人MSLN编码序列的载体(pCMV3，采购自义翘神州)上扩增全长MSLN，使用胶回收试剂盒进行切胶回收，并用限制性内切酶进行酶切，同时使用同种内切酶酶切慢病毒表达载体 (pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGKL-PURO，采购自汉恒生物)。将MSLN基因片段和表达载体进行连接，将连接产物转化到感受态细胞中，扩增后涂布平板。挑取单个菌落进行菌落PCR，选取扩增产物正确的菌落进行测序。测序正确重组质粒即为构建好的表达载体。
2.目标基因慢病毒的包装
接种293T细胞于T75培养瓶中，过夜培养后更换无血清培养基，将表达载体、包装载体和包膜载体(其分别是： pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGKL-PURO、paPAX2、pMD.2G,采购自汉恒生物)混合后再与Lipofectamine2000混合后加入293T细胞(转染了腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系)中，培养48小时候收集上清并浓缩后分装。
3.目的细胞的获得
取对数生长期目的细胞，加入24孔板中，过夜培养；吸去细胞原有的培养基，加入病毒稀释液和稀释好的polybrene溶液，感染总体积为250 μL，轻轻混匀；感染24小时后，去除含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养基(Gibco RPMI1640-A10491-01培养基+20％FBS+0.01mg/ml胰岛素)继续培养；对于携带嘌呤霉素抗性基因的病毒换上含嘌呤霉素的新鲜完全培养基，得到稳定转染的细胞株。
将上述获得的过表达MSLN目的基因稳转细胞株采用有限稀释法获得单克隆，从而得到OVCAR-3-MSLN为MSLN强阳性表达细胞。

Claims (14)

1.一种间皮素免疫组化检测细胞质控片，包括切片区；所述切片区粘附有石蜡切片，所述石蜡切片含有4种起对照作用的表达间皮素的阴性、弱阳性、阳性、强阳性细胞团。
2.权利要求1所述的细胞质控片，所述4种细胞团是4种间皮素表达量不同的细胞，分别是：间皮素阴性表达的293细胞、间皮素弱阳性表达的CFPAC-1细胞、间皮素阳性表达的OVCAR-3细胞、间皮素强阳性表达的OVCAR-3-MSLN细胞。
3.权利要求2所述的细胞质控片，其中所述OVCAR-3-MSLN细胞为经遗传修饰从而表达外源MSLN蛋白的OVCAR-3细胞。
4.权利要求1所述的细胞质控片，所述石蜡切片的厚度是3-5μm。
5.权利要求1所述的细胞质控片，所述细胞团的直径为3-5mm。
6.权利要求1-5任一权利要求所述的细胞质控片在制备间皮素检测试剂中的用途。
7.间皮素强阳性表达的OVCAR-3-MSLN细胞在制备间皮素免疫组化检测试剂盒质控片中的应用，所述OVCAR-3-MSLN细胞由OVCAR-3细胞转入外源MSLN基因获得，其能够表达外源MSLN蛋白。
8.一种用于免疫组织化学技术检测间皮素蛋白质量控制的参照物，所述参照物包括：阳性对照物、阴性对照物；其中，阳性对照物为：CFPAC-1细胞、OVCAR-3细胞以及OVCAR-3-MSLN细胞，其中所述OVCAR-3-MSLN细胞为经遗传修饰从而表达外源MSLN的OVCAR-3细胞；阴性对照物为：293细胞。
9.一种非诊断目的的免疫组化检测方法，所述方法使用权利要求1-5的细胞质控片作为对照。
10.一种用于制备间皮素免疫组化检测细胞质控片的方法，其包括以下步骤：
(1)细胞培养
对293细胞、CFPAC-1细胞、OVCAR-3细胞以及间皮素强阳性表达的OVCAR-3-MSLN细胞在培养基中进行培养；
(2)细胞收集与固定
培养上述细胞至其铺满细胞培养皿底部的80-90％时，收集细胞；清除培养基，磷酸缓冲盐溶液洗涤，胰酶消化，显微镜下观察细胞变圆时，加1ml细胞培养基终止消化，用移液器将细胞处理均匀、收集并计数，加入磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞，离心，弃上清，细胞用4％多聚甲醛或10％中性福尔马林固定液重悬，室温固定；
(3)琼脂糖支撑细胞
琼脂糖凝胶配制：称取琼脂糖加磷酸缓冲盐溶液配制成3-4％浓度的溶液，加热至琼脂糖溶解，取出置于60℃水浴中保温待用；
细胞与琼脂糖混合：经过固定过程，自然沉降至体积约100μl，用移液器小心移去上清；将盛有细胞的离心管在60℃水浴中预热，用预热的移液器移取与细胞等体积的琼脂糖凝胶，加入离心管中与细胞混匀，混匀后的琼脂糖、细胞混合物转移到注射器针管中，室温冷却成型；
(4)细胞团脱水
将与琼脂糖混合的细胞团取出，切成小段，放置在做好标记的脱水筐内；将细胞团依次浸入不同浓度梯度的乙醇中进行组织脱水；
(5)细胞团透明
将步骤(4)获得的细胞团依次浸入到二甲苯中进行透明；
(6)细胞团浸蜡
将石蜡块置于浸蜡杯中于65℃烘箱中一段时间至石蜡完全融化，将进行组织透明后的细胞团浸入到融化的石蜡中进行组织浸蜡；
(7)细胞团包埋
将融化的石蜡倒入组织包埋底模中，将浸蜡结束的细胞团从相应的脱水筐中取出，放入到组织包埋底模的石蜡中，将包埋框覆盖在包埋盒上，转移至冷却台上冷却，获得组织包埋石蜡块。
11.权利要求10所述的方法，所述培养中使用的培养基包括：
293细胞的培养基包含：Gibco RPMI1640培养基+10％FBS；
CFPAC-1细胞的培养基包含：Gibco IMDM培养基+10％FBS；
OVCAR-3细胞的培养基包含：Gibco RPMI1640-A10491-01培养基+20％FBS+0.01mg/ml胰岛素；
间皮素强阳性表达的OVCAR-3-MSLN细胞的培养基包含：GibcoRPMI1640-A10491-01培养基+20％FBS+0.01mg/ml胰岛素。
12.权利要求10所述的方法，所述细胞培养的条件包括：37℃，5％CO2静置培养2-3天。
13.权利要求10所述的方法，所述步骤(4)的脱水步骤为：70％乙醇过夜；80％乙醇1.5h；90％乙醇1.5h；95％乙醇1.5h；100％乙醇处理50min；100％乙醇处理50min。
14.一种检测间皮素表达的免疫组化试剂盒，其包含权利要求1-5所述细胞质控片。
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