CN104569397B - 一种乳腺癌检测质控品及其制备方法 - Google Patents

一种乳腺癌检测质控品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳腺癌检测质控品及其制备方法，尤指一种用于HER2基因扩增FISH检测的质控物及其制备方法，属于临床检验学、病理学和生物技术领域。一种乳腺癌检测质控品，是用培养的乳腺癌细胞系制作成石蜡包埋的标本切片。本发明的优点是：采用体外培养的乳腺癌细胞系制作的质控品，可以作为真实组织样本制作的质控品的替代品，样本量大、重复性高，并且通过选择不同细胞系可以完成不同HER2基因水平的检测，制作方法简便，能够批量生产，易于保存，可用于室内质量控制和室间质量评价。

Description

一种乳腺癌检测质控品及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种乳腺癌检测质控品及其制备方法，尤指一种用于HER2基因扩增FISH检测的质控物及其制备方法，属于临床检验学、病理学和生物技术领域。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升的趋势。原癌基因HER2(人类表皮生长因子受体2基因)是当前研究的热点之一。有资料显示，大约20-30％的乳腺癌浸润性导管癌中有HER2基因的过表达。大量研究证实，HER2基因扩增不仅与乳腺癌的发生、发展及预后密切相关，而且对药物治疗方案的选择也至关重要。
HER2阳性的乳腺癌对常规的化疗和内分泌治疗反应差，肿瘤浸润性强，无病生存期短，预后差。为此，多种阻断HER2的抗癌药物相继问世，其中曲妥珠单抗是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于HER2的细胞外部位，适用于治疗HER2过度表达的乳腺癌。由于只有HER2蛋白过度表达和基因扩增的乳腺癌患者接受曲妥珠单抗治疗才有效，因此准确评价HER2基因和蛋白水平对治疗至关重要。
检测HER状态的方法有：对于HER2/neu共表达产生的蛋白水平的免疫组化，单拷贝和双拷贝的FISH(荧光原位杂交)、CISH(显色原位杂交)以及SISH(银增强原位杂交)。对于HER2基因扩增的FISH检验是检测HER2状态的金标准，根据ASCO/CAP的指南标准，对于免疫组化检测积分为2+的标本，必须使用FISH检测进行验证，以避免出现假阳性的可能。然而对于这种方法来说，一个好的质控品是保证检测的准确度的关键。传统上的质控品倾向于使用乳腺癌患者的组织样本作为检测质控品，但是这种质控品来源局限，一致性较差，在应用的过程中存在较大的局限性。此外，患者来源的质控品只能随机测定HER2阳性与阴性，无法特定地反映出HER2基因表达水平以及多体造成的假阳性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种来源广、易于获得、一致性好的乳腺癌检测质控品。
本发明要解决的另一个技术问题是提供这种乳腺癌检测质控品的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种乳腺癌检测质控品，是用乳腺癌细胞系通过福尔马林固定，石蜡包埋，切片烤片后制作成标本切片。
所述乳腺癌细胞系选自MCF-7细胞系、MDA-MB-453细胞系和SKBR-3细胞系中的一种或几种。
本发明采用体外培养的乳腺癌细胞系制作的质控品，可以替代真实组织样本制作的质控品。我们研究了多种已经公开的乳腺癌细胞系，发现乳腺癌细胞系SKBR3和MDA-MB-453可以表达HER2基因的扩增，而细胞系BT-20、MBA-MD-175和MDA-MB-231则检测不到扩增或者检测量低。MCF-7是阴性细胞，其HER2基因水平和正常人一致，基本为一条染色体上有一个HER2基因。发明人通过比较细胞系SKBR3和MCF-7，发现SKBR3细胞系和MCF-7细胞系相比能表现几乎10倍的基因扩增以及15倍的HER2蛋白的表达。发明人对于使用的细胞系通过PCR方法验证HER2基因水平，结果显示本发明所选择的细胞系能精确地显示HER2基因水平的梯度变化。因此我们筛选出HER2基因和HER2蛋白表达水平存在不同差异的特定细胞系，通过这些体外培养的乳腺癌细胞系制作质控品，可以对HER2基因的不同表达水平做出区分。
所述MCF-7细胞系还包括多体MCF-7细胞系。
所述多体MCF-7细胞系是MCF-7细胞系经秋水仙素处理得到。我们使用秋水仙素处理MCF-7细胞系，使细胞分裂周期停留在分裂中期，造成细胞染色体形成2倍的现象，制作乳腺癌细胞系假性多体的细胞系。由于在细胞培养过程中的细胞多为二倍体细胞，并不能特异地选择出多体细胞，这种方法得到的假性多体细胞弥补了这个缺点。
所述的乳腺癌检测质控品，优选是用培养的MCF-7细胞系、MDA-MB-453细胞系、SKBR-3细胞系和多体MCF-7细胞系分别制作的标本切片。也可以是多体MCF-7细胞系制作的标本切片与上述任意一种或多种细胞系制作的标本切片的组合。该质控品能够模拟乳腺癌病理组织的HER2基因不同表达水平以及多体的情况。
一种乳腺癌检测质控品的制备方法，包括以下步骤：
(1)培养乳腺癌细胞系：取乳腺癌细胞系体外培养至107～108数量级并处于对数生长期；
(2)制备多体细胞系：取MCF-7细胞系体外培养至107～108数量级并处于对数生长期，加入秋水仙素，培养2-4小时，形成多体MCF-7细胞系；
(3)制作质控品切片：收集对数生长期的乳腺癌细胞系和多体MCF-7细胞系，经过固定、脱水、透明化处理、石蜡包埋、切片，制成质控品切片。
所述步骤(1)和(3)中的乳腺癌细胞系选自MCF-7细胞系、MDA-MB-453细胞系和SKBR-3细胞系中的一种或几种。
所述步骤(3)的固定是指每种细胞分别加入15ml 10％中性甲醛固定细胞1小时后1000r 5min离心，弃上清，加入1XPBS冲洗细胞3次。
所述步骤(3)的脱水是指加入80％乙醇15ml，静置10min后1500r 5min离心，弃上清；加入90％乙醇15ml，静置10min后1500r 5min离心，弃上清；加入95％乙醇15ml，静置10min后1500r 5min离心，弃上清；加入无水乙醇15ml，静置15min后1500r 5min离心，弃上清；加入无水乙醇15ml，静置15min后1500r 5min离心，弃上清。
所述步骤(3)的透明化处理是指加入无水乙醇和二甲苯的混合液(体积比1:1)7ml,静置10min 1500r 5min离心，弃上清；加入二甲苯7ml静置10min，1500r 5min离心，吸去6ml上清；吹打混匀将细胞悬液转移到1.5ml EP管中，1500r 5min离心尽量吸干净上清；
所述步骤(3)的石蜡包埋是指70℃融化石蜡，将融化的500ul液体石蜡分别加入到每种细胞团中，吹打混匀后，吸出到包埋盒(约500ul)；再次灌蜡包埋；
所述步骤(3)的切片是指4μm/张切片，切片后于恒温37℃水箱内展片，用载玻片捞片，晾干，置于70℃温箱烤片3h。
发明人对于得到的切片标本通过金菩嘉、安必平公司试剂盒进行检测验证；对于得到的切片标本通过免疫组化的方法进行检测验证。FISH实验和免疫组化结果分别从基因和蛋白两方面证明我们制作的质控品达到了预期的阴阳性梯度和多体的目标。
本发明筛选得到了三种HER2基因和HER2蛋白表达水平存在不同差异的细胞系培养到细胞数量达到107～108/蜡块，同时使用秋水仙素处理MCF-7细胞系，使细胞分裂周期停留在分裂中期，造成细胞染色体形成2倍的现象，制作乳腺癌细胞系假性多体的细胞系。之后将上述细胞系通过福尔马林固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制作乳腺癌细胞系蜡块，对蜡块进行4μm切片，烤片，制作能用于HER2基因扩增FISH检验的质控品。这种通过细胞系制作的质控品来源丰富，重复性和一致性高，同时能够人为控制和选择所需的HER2基因扩增水平的质控品，克服了传统质控品的不足。通过细胞系制作的质控品操作简便，试验周期短，能够大批量生产。本研究制作的质控品能够作为乳腺癌个体化检测的质控品，用于室内质量控制(IQC)和室间质量评价(EQA)，并且具用较好的重复性和一致性。
本发明的乳腺癌细胞系质控品可以长期保存在大多数的温度条件下，在室温和4℃环境保存两周后检测效果无变化。因此，我们得到的切片质控品可以用于EQA和IQC，在将切片质控品作为EQA评估试验的质控品发放的时候，它可以在室温下无需冰袋进行邮寄并能长时间保存在-20℃或者-4℃条件下。
本发明的优点是：本发明采用体外培养的乳腺癌细胞系制作的质控品，可以作为真实组织样本制作的质控品的替代品，样本量大、重复性高，并且通过选择不同细胞系可以完成不同HER2基因水平的检测，制作方法简便，能够批量生产，易于保存，可用于室内质量控制和室间质量评价。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以便公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为三种细胞HER2目的基因和内参基因GAPDH同时进行实时荧光定量PCR的曲线图，其中基线为绿色标记线。
图2为细胞系制作切片的细胞分布示例情况，图2上为10倍物镜下观察结果，图2下为40倍物镜下观察结果。
图3为安必平公司试剂盒检测四种切片标本的荧光示意图，其中A为40倍物镜下SKBR-3细胞系切片检测的FISH荧光图，B为40倍物镜下MDA-MB-453细胞系切片检测的FISH荧光图，C为40倍物镜下MCF-7细胞系切片检测的FISH荧光图，D为40倍物镜下MCF-7多体细胞系切片检测的FISH荧光图。
图4为免疫组化检测四种切片标本的结果图，其中A为阴性对照免疫组化结果图，B为MCF-7细胞系切片免疫组化结果图，C为MDA-MB-453细胞系切片免疫组化结果图，D为SKBR-3细胞系切片免疫组化结果图，E为MCF-7处理后多体细胞切片免疫组化结果图。
具体实施方式
以下为实施例中涉及的主要材料和试剂：
乳腺癌细胞MCF-7，北京协和医科大学细胞库，中国
乳腺癌细胞MDA-MB-453，北京协和医科大学细胞库，中国
乳腺癌细胞SKBR-3，武汉大学中国典型培养物保藏中心，中国
QIAamp DNA Mini Kit，凯杰企业管理有限公司，中国
20×TaqMan Gene Expression Assay，ABI，美国
2×TaqMan Gene Expression Master Mix，ABI，美国
秋水仙素，国药集团化学试剂北京有限公司，中国
中性甲醛、无水乙醇、二甲苯，国药集团化学试剂北京有限公司，中国
苏木素伊红染色试剂，碧云天生物技术研究所，中国
北京金菩嘉医疗科技有限公司HER-2基因扩增检测试剂盒，金菩嘉医疗科技有限公司，中国
广州安必平医药科技有限公司HER-2/neu基因检测试剂盒，广州安必平医药科技有限公司
免疫组化相关试剂盒及试剂，福州迈新公司公司，中国
实施例一：PCR方法验证多种肿瘤细胞系HER2基因表达情况
按照实施例2步骤1的方法培养乳腺癌细胞系至对数生长期，使用试剂盒QIAampDNA Mini Kit(凯杰企业管理有限公司，中国)进行下述实验。
1.DNA提取：
①将培养达到对数期的三种乳腺癌细胞系，分别吸取1×106个细胞到一个离心管中。
②打开金属浴56℃；AL(裂解液)使用前震荡混匀，如果有沉淀则用56℃水浴加热。
③用200ul PBS处理上述得到的三种细胞，吹打混匀。
④向其中加入20μl QIAGEN Proteinase K；将上述220ul样本吸出到1.5ml EP管中，加入200ul Buffer AL(裂解液)，用涡旋振荡器震荡15秒，确认形成均质状态。
⑤56℃金属浴，10min；用离心机短暂离心。
⑥加入200ul无水乙醇，用涡旋振荡器震荡15秒，用离心机短暂离心。
⑦将离心管中的液体吸入到QIAamp Mini spin column，8000r 1min离心。
⑧倒掉滤液，换新的collection tube，在column中加入500ul Buffer AW1，8000r1min离心。
⑨倒掉滤液，换新的collection tube，在column中加入500ul Buffer AW2，14，000r 3min离心。
⑩倒掉滤液，空转：14，000r 1min离心；弃掉collection tube，将离心柱置于新的1.5ml EP管中，向其中加入200ul Buffer AE或蒸馏水回溶DNA，室温静置1-5min，8000r1min离心。
所得的DNA产物分装，用分光光度计测量所提取的DNA浓度
2.实时荧光PCR检测三种细胞扩增曲线以及Ct值：
20×TaqMan Gene Expression Assay，ABI，美国
2×TaqMan Gene Expression Master Mix，ABI，美国
引物和探针为试剂盒自带
①稀释三种细胞DNA的量为5ng/ul，加入到下述反应体系中，反应包括两部分，本身的目的基因以及内参基因同时在两个孔内进行扩增，目的基因和内参基因的反应体系的配制加样量应保持一致。反应体系都应处在一个高压过的1.5ml离心管中，同时做空白对照排除DNA污染干扰：
表1
PCR反应混合的成分 每20ul反应体系加入的溶液体积(ul)
20×TaqMan Gene Expression Assay 1
2×TaqMan Gene Expression Master Mix 10
DNA溶液 4
去离子水 5
将离心管内反应体系充分混匀，并短暂的离心离心管；将20ul PCR反应体系转移到96孔反应板的一个孔内(8联)；密封反应孔并短暂离心。
②用7500实时荧光定量PCR系统检测，热循环条件：
表2
在60℃1min阶段收集荧光信号。
(3)结果
①细胞提取DNA的浓度：SKBR-3：5ng/ul MCF-7:53ng/ul MDA-MB-453：21ng/ul
②RT-PCR结果:三种细胞系检测的Ct值结果如表3所示：
表3：细胞系HER2基因和内参基因的Ct值
Ct值 HER2 GAPDH ΔCt
MCF-7 29.2029 23.9257 5.2772
SKBR-3 27.6177 26.0693 1.5484
MDA-MB-453 28.1799 25.029 3.1509
根据2-ΔΔCt的原理，可以计算出阳性肿瘤细胞相对于阴性肿瘤细胞的拷贝数的倍数，若设MCF-7细胞的拷贝数为1，则其他阳性细胞相对于其的倍数＞2则为阳性扩增。经过计算，MDA-MB-453相对于MCF-7的拷贝数为4.366倍，SKBR-3相对于MCF-7的拷贝数为13.258倍，说明阳性细胞系相对于阴性细胞系存在HER2扩增并且扩增存在梯度，具体PCR曲线见图1。
实施例2：乳腺癌细胞系HER2基因扩增FISH检测质控品制备
1.培养乳腺癌细胞系：
MCF-7细胞系用含10％胎牛血清DMEM培养液培养,培养基中含有10％胎牛血清,100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素；MDA-MB-453细胞系用含20％胎牛血清DMEM培养液培养，培养基中含有20％胎牛血清，100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素；SKBR-3细胞系用含20％胎牛血清McCoy’s 5a培养液培养，培养基中含有20％胎牛血清，100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素。在37℃含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化进行细胞传代，将三种细胞系扩大培养至107-108数量级并处于对数生长期。
2.制备多体细胞系：
取MCF-7细胞系用含10％胎牛血清DMEM培养液培养,培养基中含有10％胎牛血清,100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素。在37℃含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化进行细胞传代，扩大培养至所需数量107-108数量级并处于对数生长期，加入10μg/ml秋水仙素1ml，继续培养2-4小时。
3.制作质控品切片：
(1)收集对数生长期的乳腺癌细胞系和多体MCF-7细胞系：以上四种细胞，倒掉旧培养基，向培养瓶中加入1xPBS 4ml，清洗3次；加入1ml胰酶，放入37℃、5％CO2孵箱孵2min；待大部分细胞被消化下来，立即加入培养基终止胰酶的消化作用，用一次性巴氏吸管将细胞吹打混匀吸入一个15ml离心管内；
(2)固定：每种细胞分别加入15ml 10％中性甲醛固定细胞1小时后1000r 5min离心，弃上清，加入1XPBS冲洗细胞3次；
(3)乙醇梯度脱水：加入80％乙醇15ml，静置10min后1500r 5min离心，弃上清；加入90％乙醇15ml，静置10min后1500r 5min离心，弃上清；加入95％乙醇15ml，静置10min后1500r 5min离心，弃上清；加入无水乙醇15ml，静置15min后1500r 5min离心，弃上清；加入无水乙醇15ml，静置15min后1500r 5min离心，弃上清；
(4)透明化处理：加入无水乙醇和二甲苯的混合液(体积比1:1)7ml,静置10min1500r 5min离心，弃上清；加入二甲苯7ml静置10min，1500r 5min离心，吸去6ml上清；吹打混匀将细胞悬液转移到1.5mlEP管中，1500r 5min离心尽量吸干净上清；
(5)包埋：70℃融化石蜡，将融化的500ul液体石蜡分别加入到每种细胞团中，吹打混匀后，吸出到包埋盒(约500ul)；再次灌蜡包埋；
(6)切片：4μm/张切片，切片后于恒温37℃水箱内展片，用载玻片捞片，晾干，置于70℃温箱烤片3h。
制成乳腺癌细胞系HER2基因扩增FISH检测质控品，包括MCF-7细胞系质控品切片，MDA-MB-453细胞系质控品切片，SKBR-3细胞系质控品切片和多体细胞MCF-7细胞系质控品切片。这些质控品切片在进行室内质量控制和室间质量评价时，可以单独使用或任意组合使用。
实施例3：HE染色观察质控物的细胞分布
一.方法：
1.样本处理：染色前将质控物预热10min，二甲苯中脱蜡5分钟；换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5分钟；无水乙醇5分钟；90％乙醇2分钟；70％乙醇2分钟；蒸馏水2分钟。
2.染色：苏木素染色液染色5-10分钟；HCL水溶液分化5s；浸自来水中反蓝，约5分钟；蒸馏水再洗涤一遍(数秒钟)；95％乙醇5秒。；伊红染色液染色30秒-2分钟。
3.脱水透明封片：95％乙醇脱水2分钟；换用新鲜的95％乙醇再脱水2分钟；二甲苯透明5分钟；换用新鲜的二甲苯，再透明5分钟；用中性树胶或其它封片剂封片；显微镜下观察。
二.结果
所制备的切片在光镜下分布散在，几乎无细胞重叠现象，细胞符合乳腺癌细胞基本特征，图2所示为四种细胞系质控物切片中的一种，其他质控物切片HE染色结果与之类似。
实施例4：通过市场上常用FISH试剂盒对制备质控品进行验证
一.方法
1.利用金菩嘉公司HER2FISH试剂盒进行验证：
(1)将四种烤好的切片置于二甲苯中，15分钟×2次。
(2)分别置入两瓶无水乙醇、85％酒精、70％酒精各2分钟。
(3)蒸馏水清洗，加入预先预热的95℃去离子水的考普林瓶中25分钟。
(4)置于37℃的0.25％胃酶的考普林瓶中2-3分钟。待将细胞周边组织充分消化后用去离子水洗几次。
(5)置入70％、85％和无水乙醇中脱水各2分钟，晾干。
(6)在标本区域中间滴加荧光探针10ul，盖上盖玻片，用橡胶水泥封闭盖玻片一圈，将切片放入原位杂交仪中，设置程序：变性为83℃5分钟，杂交为42℃16h，启动原位杂交仪。
(7)撕去橡胶水泥，拿去盖玻片，放入65℃水浴的0.3％NP-40考普林瓶里面2分半，摇晃洗片
(8)放入室温下0.1％NP-40考普林瓶里面30秒到1分钟，摇晃洗片。
(9)放入70％酒精中，2-3分钟，摇晃洗片，擦干玻片背面，晾干。
(10)滴加DAPI，用洁净盖玻片封片，荧光显微镜下观察。
2.利用安必平公司HER2FISH试剂盒进行验证：
(1)将四种烤好的切片置于二甲苯中，15分钟×2次。
(2)分别置入两瓶无水乙醇、85％酒精、70％酒精各3分钟。
(3)加入预先预热的95℃水浴锅的考普林瓶中(蒸馏水)10分钟,取出后室温晾干。
(4)置于37℃水浴锅中，滴加胃酶100ul左右，覆盖组织，消化1分钟。消化后使用2XSSC洗2次，终止消化反应。镜下观察胞质荧光基本不可见。
(5)加入70％、85％和无水乙醇中脱水各3分钟，取出室温晾干。
(6)在标本区域中间滴加荧光探针10ul，盖上盖玻片，用橡胶水泥封闭盖玻片一圈。
(7)将切片放入原位杂交仪中，设置程序：变性为85℃5分钟，杂交为37℃16h，启动原位杂交仪。
(8)避光取出切片，撕去橡胶水泥，放入37℃水浴的2X SSC中洗去盖玻片，摇晃洗片10分钟，再放入37℃水浴的0.1％NP-40/2X SSC里面5分钟，摇晃洗片。
(9)放入70％酒精、85％酒精、无水乙醇中，3分钟，擦干玻片背面，取出室温晾干。
(10)滴加DAPI，用洁净盖玻片封片，荧光显微镜下观察。
二.结果
1.金菩嘉公司HER2FISH试剂盒检测结果：计数细胞数为20个，具体四种切片的HER2基因拷贝数和HER2/CEP17比值见表4：
表4：四种细胞系切片的HER2/CEP17比值和HER2平均拷贝数以及结果判断
2.安必平公司HER2FISH试剂盒检测结果：计数细胞数为20个，具体四种切片的HER2基因拷贝数和HER2/CEP17比值见表5：
表5：四种细胞系切片的HER2/CEP17比值和HER2平均拷贝数以及结果判断
我们使用两种国内常用试剂盒进行检测得到了四种细胞系制作切片的结果，基本符合预期结果，检测效果较好，仅举安必平公司试剂盒验证的HER2FISH荧光图为例，金菩嘉公司验证的荧光图与之类似，见图3。
实施例5：通过免疫组化方法对制备质控品HER2蛋白水平进行验证
一.方法
1.常规脱蜡水化：将SKBR-3、MCF-7、MDA-MB-453和多体细胞四张质控物切片浸于二甲苯中1Omin，三次。取出切片置于100％无水乙醇中lOmin两次；依次置入95％、90％、85％、80％、70％各级酒精备lOmin。蒸馏水洗3min×3次。
2.抗原修复：将切片浸入柠檬酸抗原修复液中，置于微波炉中，沸腾后持续15min，修复抗原。室温冷却后，蒸馏水冲洗2次，PBS冲洗2次×3min。
3.切片甩掉并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中，滴加50ul过氧化酶阻断溶液,以阻断内源性过氧化物酶的活性,室温下避光孵育1Omin。用PBS(pH7.4)冲洗3次,每次3min。
4.甩去PBS液,擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中。切片滴加50ul的非免疫性动物血清,室温下孵育10min。
5.甩去血清,切片滴加50ul的第一抗体,室温下孵育60min或4℃过夜,建议按每种抗体说明书操作。PBS冲洗3次,每次5min。阴性对照以PBS缓冲液作为第一抗体。
6.甩去PBS液并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中,切片滴加50ul的第二抗体,室温下孵育10min。用PBS(pH7.4)冲洗3次,每次3min。
7.甩去PBS液并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中,切片滴加50ul链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液,室温下避光孵育10min。用PBS(pH7.4)冲洗3次,每次3min。
8.甩去PBS液并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中,切片滴加100ul新鲜配置的DAB溶液,显微镜下观察3-5min,阳性显色为棕黄色。
9.蒸馏水冲洗终止显色,苏木素复染,PBS冲洗返蓝。
10.梯度酒精脱水干燥每级10min，二甲苯透明两次10min，中性树胶封固。
二.结果
阴性对照(用PBS代替一抗)：可以看出为阴性结果，无着色；MCF-7切片：为阴性结果，评分为0，无着色；MDA-MB-453切片：为阳性结果，结果判断为3+；SKBR-3切片：强阳性结果，结果判读至少为3+；多体细胞切片：阴性，无着色，评分为0。IHC结果满足预期结果，验证了我们制作的切片从检测蛋白表达的角度，也能证实FISH结果，与FISH结果相互佐证。同时，IHC结果也符合制片中反应出的阳性强度的梯度问题。具体免疫组化的结果如图4。

Claims (6)

1.一种乳腺癌检测质控品，其特征在于：是用乳腺癌细胞系通过福尔马林固定，石蜡包埋，切片烤片后制作成标本切片；所述乳腺癌细胞系为MCF-7细胞系、MDA-MB-453细胞系和SKBR-3细胞系；所述MCF-7细胞系还包括多体MCF-7细胞系；所述多体MCF-7细胞系是MCF-7细胞系经秋水仙素处理得到；为MCF-7细胞系质控品切片，MDA-MB-453细胞系质控品切片，SKBR-3细胞系质控品切片和多体细胞MCF-7细胞系质控品切片。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌检测质控品，其特征在于：是用培养的MCF-7细胞系、MDA-MB-453细胞系、SKBR-3细胞系和多体MCF-7细胞系制作成石蜡包埋的标本切片。
3.权利要求1或2所述的乳腺癌检测质控品的制备方法，包括以下步骤：
(1)培养乳腺癌细胞系：取乳腺癌细胞系体外培养至107～108数量级并处于对数生长期；
(2)制备多体细胞系：取MCF-7细胞系体外培养至107～108数量级并处于对数生长期，加入秋水仙素，培养2-4小时，形成多体MCF-7细胞系；
(3)制作质控品切片：收集对数生长期的乳腺癌细胞系和多体MCF-7细胞系，经过固定、脱水、透明化处理、石蜡包埋、切片，制成质控品切片；
所述步骤(1)和(3)中的乳腺癌细胞系选自MCF-7细胞系、MDA-MB-453细胞系和SKBR-3细胞系。
4.根据权利要求3所述的乳腺癌检测质控品的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的固定是指每种细胞分别加入15ml 10％中性甲醛固定细胞1小时后1000r/min 5min离心，弃上清，加入1XPBS冲洗细胞3次。
5.根据权利要求3所述的乳腺癌检测质控品的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的脱水是指加入80％乙醇15ml，静置10min后1500r/min 5min离心，弃上清；加入90％乙醇15ml，静置10min后1500r/min 5min离心，弃上清；加入95％乙醇15ml，静置10min后1500r/min 5min离心，弃上清；加入无水乙醇15ml，静置15min后1500r/min 5min离心，弃上清；加入无水乙醇15ml，静置15min后1500r/min 5min离心，弃上清。
6.根据权利要求3所述的乳腺癌检测质控品的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的透明化处理是指加入无水乙醇和二甲苯的混合液,无水乙醇和二甲苯的体积比1:1,7ml,静置10min 1500r/min 5min离心，弃上清；加入二甲苯7ml静置10min，1500r/min 5min离心，吸去6ml上清；吹打混匀将细胞悬液转移到1.5mlEP管中，1500r/min 5min离心尽量吸干净上清；
所述步骤(3)的石蜡包埋是指70℃融化石蜡，将融化的500ul液体石蜡分别加入到每种细胞团中，吹打混匀后，吸出到包埋盒；再次灌蜡包埋；
所述步骤(3)的切片是指4μm/张切片，切片后于恒温37℃水箱内展片，用载玻片捞片，晾干，置于70℃温箱烤片3h。
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