CN115436640B - 适于可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医学检验技术领域，具体是关于适于可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质，更具体的是提供甲状腺癌来源细胞系CAL62细胞系、8305C细胞系及其蛋白基质在作为可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质中的应用，所述细胞系及其蛋白溶液相对于样本之间的变异系数不大于15%，相对偏差不大于20%，基质均一性可控，可以常规制备，质量可控，互通性好，可用于评估甲状腺结节恶性程度或概率的系统、模型及试剂盒中参考物质的制备，具有很高的应用与辅助诊断潜力。

Description

适于可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质
技术领域
本发明属于医学检验技术领域，具体是关于适于可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质。
背景技术
甲状腺结节(Thyroid Nodules)是指在甲状腺内的肿块，进行吞咽动作时可随甲状腺而上下移动，可由多种病因引起，甲状腺结节是一种常见的临床病症，在普通人群中发病率约50~60%，多发于女性和高龄人群。临床上有多种甲状腺疾病如甲状腺退行性变、炎症、自身免疫以及新生物等都可以表现为结节，绝大多数甲状腺结节患者没有临床症状，常常是通过体检或自身触摸发现，通过病理检查发现的甲状腺结节中，只有5~15%的结节为恶性结节，即甲状腺癌。甲状腺结节可以单发，也可以多发，多发结节比单发结节的发病率高，但单发结节甲状腺癌的发生率较高。
目前常用甲状腺结节的检查方法包括：血清学检查，核素扫描，超声诊断，细针穿刺细胞学检查，甲状腺细针抽吸细胞学检查(FNAC)，颈部X线检查以及甲状腺功能测定等，然而通过液体活检(比如血液)或者基因检测检查甲状腺结节，不能同时获得良好的特异性及灵敏度。
虽然细针穿刺组织活检的敏感性和经济性使其广泛应用于甲状腺结节的检查中，然而结果符合率的高与低通常需要取决于穿刺操作者、细胞病理医生的技术和经验，并且仍有15%至30%的甲状腺结节不能通过FNA和细胞病理学得到清楚地评估。针对不确定性甲状腺结节的处理方式，主流观点是进行甲状腺全切或近半切。但大多数术后病理证实为良性结节，这显然会导致过度诊断和过度治疗。
蛋白质是生命活动的执行者，是生命表型的最终体现。定量蛋白质组学研究可从蛋白质组层面阐释某种生物现象的发生发展原因与规律，对生命科学以及人类自身疾病诊疗有重大意义。如对于肿瘤组织和非肿瘤组织的定量蛋白质组研究，可能发现某种肿瘤特异的蛋白质作为疾病的标志物，可用于肿瘤的早期诊断、确诊与分型。
液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)方法因其灵敏度高、特异性好等优势，广泛的被用于特异性蛋白质标志物的定量检测方法，然而遗憾的是可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽尚无商业化、成熟化的检测试剂盒，无法在对甲状腺结节恶性程度或概率进行评估的过程中实现高准确度、高精确度的检测要求，而实验室自建LC-MS/MS方法需关注替代基质与组织样本基质的差异性，即基质效应，而该效应会导致待测物及其同位素内标物在不同基质中的色谱质谱响应信号不一致，产生基质互通性问题，从而影响检测方法的准确度和精确度，因此应当避免或减低显著的基质效应的产生，基于此，合适的替代基质的选取就变得尤为重要。此外，质谱法进行FNA组织样本的肽段检测，判定甲状腺结节良恶性试剂盒中所用的参考物质及试剂盒质控品的设置均需要考虑选用模拟临床组织样本制备得到的替代基质的基质效应问题。而且对于待检测肽段，质控品和企业参考品需要采用模拟临床组织样本制备得到的的替代基质。
现有技术有名称为：LC-MS/MS检测血清25-羟基维生素D替代校准品基质的选择与评价的论文探讨了如何选择和评价液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测血清25-羟基维生素D[25(OH)D]的替代校准品基质。然而目前尚无资料公开质谱类IVD产品使用细胞株或其提取的蛋白质溶液作为基质。针对LC-MS/MS，对体液类的蛋白质(多肽)的检测技术，目前所采用的基质类型包括：1.Analyte Free True Matrix：没有待检测物的真实样本基质；2.Analyte-Depleted True or Surrogate Matrix：去除待检测物的真实样本基质；3.Alternate Species Matrix：其它物种的基质；4.Synthetic Surrogate Matrixes：合成替代基质。但针对组织类样本，且针对多个指标，以上4种基质都难以获得。另外，利用临床组织类样本存在均一性差、批次差异高、易受个体、地域等因素影响以及互通性差等缺点。
前述背景技术知识的记载旨在帮助本领域普通技术人员理解与本发明较为接近的现有技术，同时便于对本申请发明构思及技术方案的理解，应当明确的是，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日前已公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请技术方案的创新性。
发明内容
为解决上述背景技术中提及的至少一种技术问题，本发明的目的旨在提供甲状腺癌来源细胞系作为可用于评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质，相对于样本之间的变异系数不大于15%，相对偏差不大于20%，均一性可控，可以常规制备，质量可控，互通性好，可用于评估甲状腺结节恶性程度或概率的系统、模型及试剂盒中参考物质的制备，具有很高的应用与辅助诊断潜力。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案。
甲状腺癌来源细胞系在作为可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质中的应用。
所述甲状腺癌来源细胞系包括CAL62细胞系、8305C细胞系中的至少一种。
所述甲状腺癌来源细胞系的存在形式是细胞系和/或从细胞系提取的蛋白溶液。
所述多肽的肽段长度是7～38个氨基酸，等电点pI是3.77～9.99，疏水性分析GRAVY是-1.66～1.41。
所述多肽的序列包括编号1～179所示序列的至少一种：
编号1：ALTGHLEEVVLALLK；
编号2：SLLLTTIPQIGSTEWSETLHNLK；
编号3：FTVPMLK；
编号4：MSGGWELELNGTEAK；
编号5：DFLQSLK；
编号6：SIVEEIEDLVAR；
编号7：EEAENTLQSFR；
编号8：ISGLIYEETR；
编号9：LAPGTIVEVWK；
编号10：FSMVVQDGIVK；
编号11：SAADLISQAR；
编号12：DYGVLLEGSGLALR；
编号13：GETGPSGPVGPAGAVGPR；
编号14：ELPSFLGK；
编号15：GFGFVDFNSEEDAK；
编号16：GLGTDEDTLIEILASR；
编号17：SQVVAGTNYFIK；
编号18：HTLNQIDEVK；
编号19：IDEMPEAAVK；
编号20：TVAAPSVFIFPPSDEQLK；
编号21：IIFEDDR；
编号22：IQVLVEPDHFK；
编号23：GSFSEQGINEFLR；
编号24：LALDMEIHAYR；
编号25：LFDQAFGLPR；
编号26：LADMALALESAR；
编号27：LIQQQLEK；
编号28：LLVEHQAISFMLAEMAMK；
编号29：EASGLLSLTSTLYLR；
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编号31：VNNASLIGLGYTQTLRPGVK；
编号32：WSGPLSLQEVDEQPQHPLHVTYAGAAVDELGK；
编号33：LVQAFQFTDK；
编号34：RISGLIYEETR；
编号35：MVVESAYEVIK；
编号36：GFGFVTFDDHDPVDK；
编号37：GIDIHGVPYVINVTLPDEK；
编号38：ALAAGGYDVEK；
编号39：TGAQELLR；
编号40：HHSLGGQYGVQGFPTIK；
编号41：VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK；
编号42：LPEEWSQWLGGSSWPGYVRPLPPAAIESPAVAAPAYSR；
编号43：ATAVVDGAFK；
编号44：VVNVSSIMSVR；
编号45：IIFVVGGPGSGK；
编号46：LEDIPVASLPDLHDIER；
编号47：QVDQFLGVPYAAPPLAERR；
编号48：VFLENVIR；
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编号56：EVFEDAAEIR；
编号57：ALDDFVLGSAR；
编号58：GGSGAPILLR；
编号59：NVIGLQMGTNR；
编号60：LGGLTQAPGNPVLAVQINQDK；
编号61：ISIEMNGTLEDQLSHLK；
编号62：ISQLEMAR；
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编号64：IYLYTLNDNAR；
编号65：LAAQSTLSFYQR；
编号66：LAASEAATAISHQAIQILGGMGYVTEMPAER；
编号67：LQDAEIAR；
编号68：LQVTNVLSQPLTQATVK；
编号69：LSASSLTMESFAFLWAGGR；
编号70：LSQNNFALGYK；
编号71：LTLSALVDGK；
编号72：SDALETLGFLNHYQMK；
编号73：SFVLNLGK；
编号74：SGVYQHVTGEMMGGHAIR；
编号75：SLQELFLAHILSPWGAEVK；
编号76：VIISAPSADAPMFVMGVNHEK；
编号77：VLNNMEIGTSLFDEEGAK；
编号78：VNVDEVGGEALGR；
编号79：QGFGELLQAVPLADSFR；
编号80：QTAAQLILK；
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编号82：NFLINYYNR；
编号83：NGPVEGAFSVYSDFLLYK；
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编号85：NSITVPYK；
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编号89：AIWNVINWENVTER；
编号90：ALDVMVSTFHK；
编号91：ALIEVLQPLIAEHQAR；
编号92：ALINSPEGAVGR；
编号93：ALPGQLKPFETLLSQNQGGK；
编号94：ASIAGHMFDVVVIGGGISGLSAAK；
编号95：ATAVMPDGQFK；
编号96：ATSFLLALEPELEAR；
编号97：AVEFLASNESR；
编号98：AVQQPDGLAVLGIFLK；
编号99：AWITAPVALR；
编号100：DAQGLVLFDVTGQVR；
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编号108：EGMNIVEAMER；
编号109：ELDESLQVAER；
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编号114：ESYPVFYLFR；
编号115：EVQGFESATFLGYFK；
编号116：FEDENFILK；
编号117：FFPFGLVQLSSDLSK；
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编号131：GQTLVVQFTVK；
编号132：GQVEYLLK；
编号133：GVDEVTIVNILTNR；
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编号137：HLMLPDFDLLEDIESK；
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编号139：IFTSIGEDYDER；
编号140：ILVVIEPLLIDEDYYAR；
编号141：IMGIPEEEQMGLLR；
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编号148：LFDSDPITVTVPVEVSR；
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编号163：SSPVVIDASTAIDAPSNLR；
编号164：TEFLSFMNTELAAFTK；
编号165：TFRPAAMLIER；
编号166：TGAAPIIDVVR；
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编号168：VIILGDSGVGK；
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编号170：VLTQIGTSIQDFIEAEDDLSSFR；
编号171：VLVDQTTGLSR；
编号172：VLYLSAFTSK；
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编号174：VTLTSEEEAR；
编号175：WLHNEDQMAVEK；
编号176：YGFIEGHVVIPR；
编号177：YGINTTDIFQTVDLWEGK；
编号178：YNIPHGPVVGSTR；
编号179：YQLDPTASISAK。
所述应用包括基于LC-MS/MS方法对多肽进行检测。
生物分析测试(bioanalytical testing)和定量测定方法受到除待测物之外的污染物的干扰，所述污染物即是待测物的基质，所述干扰即基质效应(matrix effect)，基质能降低或增加对样品中各种待测物的灵敏度，而这种灵敏度的增加或降低与待测物的丰度不成比例。LC/MS-MS是药物代谢研究的优选方法，然而，基质效应可导致明显的分析误差，应该研究该效应以确保精确度、选择性和灵敏度未明显受损。
本发明方法提供了甲状腺癌来源细胞系CAL62细胞系、8305C细胞系及其蛋白溶液作为可用于评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质，验证表明两种细胞系及其蛋白溶液相对于不同来源的人甲状腺结节样本之间的变异系数均不大于15%，相对偏差不大于20%，可作为评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的优良的替代基质。针对结节类样本，临床组织样本具有均一性差、不可再生、批次差异显著、受地域、个体等因素影响较大，互通性差等缺陷；而本申请提供的作为替代基质的CAL62细胞系、8305C细胞系及其蛋白溶液的均一性可控，可以常规制备，质量可控，互通性好，是一种优良的替代基质，可用于评估甲状腺结节恶性程度或概率的系统、模型及试剂盒中参考物质的制备，具有很高的应用与辅助诊断潜力。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
本发明为实现上述目的而采用了上述技术方案，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
为让本发明的上述和/或其他目的、特征、优点与实例能更明显易懂，所附附图的说明如下：
图1是本发明的基质效应检测的流程图；
图2是1号肽段和5号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图3是8号肽段和10号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图4是12号肽段和13号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图5是14号肽段和18号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图6是19号肽段和20号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图7是22号肽段和23号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图8是24号肽段和25号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图9是26号肽段和27号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图10是28号肽段和29号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图11是31号肽段和32号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图12是34号肽段和35号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图13是36号肽段和39号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图14是41号肽段和43号肽段分别在基质中的基质因子示意图；
图15是44号肽段在基质中的基质因子示意图。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当替换和/或改动工艺参数实现，然而特别需要指出的是，所有类似的替换和/或改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品和制备方法已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本发明使用本文中所描述的方法和材料；但本领域中已知的其他合适的方法和材料也可以被使用。本文中所描述的材料、方法和实例仅是说明性的，并不是用来作为限制。所有出版物、专利申请案、专利案、临时申请案、数据库条目及本文中提及的其它参考文献等，其整体被并入本文中作为参考。若有冲突，以本说明书包括定义为准。
除非另外说明，所有的百分数、份数、比例等都以重量计。
当以范围、优选范围或一系列上限优选值和下限优选值给出数量、浓度或者其它数值或参数时，应理解其具体公开了由任何较大的范围限值或优选值和任何较小的范围限值或优选值的任何一对数值所形成的所有范围，而无论范围是否分别被公开。例如，当描述“1至5(1～5)”的范围时，所描述的范围应理解为包括“1至4(1～4)”、“1至3(1～3)”、“1至2(1～2)”、“1至2(1～2)和4至5(4～5)”、“1至3(1～3)和5”等的范围。除非另外说明，在本文描述数值范围之处，所述范围均包括范围端值以及该范围内的所有整数和分数。
除非具体说明，本文所描述的材料、方法和实例仅是示例性的，而非限制性的。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试，但本文仍描述了合适的方法和材料。
缩略语和关键术语定义
基质(Matrix)：指除了分析物之外，某物质形态内的所有成分。
基质效应：基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。
替代基质：又可被称为模拟基质。
空白基质：指没有待测物基质。
基质因子：最常用的基质效应评价方法是在标准分析方法中比较提取样品和纯溶液的响应，其中化合物的绝对基质效应定义为基质效应因子(MF)，其计算方式为：在不考虑回收率的情况下，比较待测物在基质组分存在和不含有基质组分的条件下响应，MF=提取后的空白基质加入待测物的响应/纯溶液中待测物的响应。
互换性(互通性)：互换性是参考物质的一个性质，与使用≥2个检测程序(MP)时，评估某个参考物质(RM)和临床样品(CS)结果间一致程度。
细胞系：细胞系(cell line)指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。也指可长期连续传代的培养细胞。
参考物质：主要用于分析质量控制、新方法的建立、测量系统刻度、实验室间比对分析或直接用作分析标准。包括校准物质和正确性质控物质，具有校准和评价测量系统两个主要功能。一种参考物质在一个测量程序或测量系统中既可以用作校准物质，也可以用作正确性质控物质，但不可以同时用作校准物质和正确性质控物质。参考物质在计量学领域也称为标准物质。参考物质是一个较宽的概念，溯源链顶端的一级校准物是参考物质，试剂盒中的校准物也是参考物质。
PCT处理：Pressure Cycling Technology高压循环破碎技术，可用于组织裂解与肽段提取。
轻标肽段：又称轻标、轻标肽，指待检测肽段。
质控肽段：又称质控肽，其是在待检测肽段序列的N端和C端各自加上特定数量氨基酸，在待检测肽段N端开始的第一个可以被重标同位素替代的位置，采用重标氨基酸标记(取决于市场上是否有相应重标同位素氨基酸，目前常用的是Val(13C5,15N，LEU(13C6,15N), ILE(13C6,15N)等，比如Val(13C5,15N)：5个碳原子被13C取代，1个氮原子被15N取代)。
内标肽段：又称内标、内标肽、重标、重标肽，指在待检测肽段序列基础上，在C端最后一个氨基酸，合成时采用重标氨基酸。
具体到本发明
提供甲状腺癌来源细胞系在作为可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质中的应用。
部分具体实施方式中，所述甲状腺癌来源细胞系包括CAL62细胞系、8305C细胞系中的至少一种。
CAL62细胞系是人甲状腺癌细胞系，具体是在1988年从一名70岁女性甲状腺间变性癌患者的甲状腺(右叶)中分离；8305C细胞系是人甲状腺癌未分化细胞系。本发明申请人通过大量实验发现，CAL62细胞系和8305C细胞系及两者的酶解蛋白溶液可在基于LC-MS/MS的肽段类检测方法中作为多种可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽肽段的替代基质，替代基质与样本间基质因子的变异系数CV不高于15%，相对偏差不高于20%，具有显著较低的基质效应，在作为评估甲状腺结节恶性程度或概率的系统、模型及试剂盒中的参考物质的制备过程中具有很高的应用与辅助诊断潜力。
部分具体实施方式中，所述多肽的肽段长度是7～38个氨基酸，等电点pI是3.77～9.99，疏水性分析GRAVY值是-1.66～1.41。
发明人经过大量的实验发现，来源自甲状腺结节的肽段中，当肽段长度介于7～38个氨基酸、等电点pI介于3.77～9.99、疏水性分析GRAVY值介于-1.66～1.41的肽段对甲状腺结节恶性程度或概率的评估具有积极有效的作用，系统验证后得知CAL62细胞系、8305C细胞系及其蛋白溶液可以作为上述所述生化性质限定的多肽肽段的替代基质，具有相对较低的基质效应，变异系数和相对偏差均较低(分别不高于15%和20%)，可用于评估甲状腺结节恶性程度或概率的系统、模型及试剂盒中参考物质的制备，具有很高的应用与辅助诊断潜力。
部分具体实施方式中，所述多肽的序列包括编号1～179所示多肽序列的至少一种。应当理解的是，本申请提供的编号1～179所示序列的多肽肽段仅是来源自甲状腺结节且符合肽段长度介于7～38个氨基酸、等电点pI介于3.77～9.99、疏水性分析GRAVY值介于-1.66～1.41的肽段的部分优选。
部分具体实施方式中，所述多肽的肽段长度是7～24个氨基酸，等电点pI是4.14～9.72，疏水性分析GRAVY值是-0.93～1.16。
部分具体实施方式中，所述多肽的序列包括编号1、5、10、13、18、19、22、24、25、27、28、35、39、41、44所示多肽序列的至少一种。
部分具体实施方式中，所述甲状腺癌来源细胞系的存在形式是细胞系和/或从细胞系提取的蛋白溶液。
部分具体实施方式中，所述蛋白溶液具体经由下述方法制备得到：细胞中加入裂解液至细胞沉淀，吹打，重悬，超声破碎后离心收集上清液。
部分具体实施方式中，裂解液是尿素/硫脲溶液。
部分具体实施方式中，裂解液中尿素的浓度是6M，硫脲的浓度是2M。
部分具体实施方式中，对700～800万个细胞，加入1.5mL裂解液。
部分具体实施方式中，超声破碎是在冰水浴下，950W最高功率超声仪，功率40%，超声5S，停5S，共运行2min。
部分具体实施方式中，离心是在12000g离心至少10min。
部分具体实施方式中，所述多肽的序列包括编号1～179所示多肽序列的至少一种。
部分具体实施方式中，所述应用包括基于LC-MS/MS对多肽进行检测。
通过LC-MS/MS方法检测取自待测机体的甲状腺结节样本中的目标多肽的蛋白质组学数据，基于所述的蛋白质组学数据能够获得机体甲状腺结节恶性程度或概率的评估结果，能够为临床提供甲状腺结节恶性程度的参考，而且对于现有临床无法鉴定的甲状腺结节，亦能够同时提供第二个评估结果(恶性概率)供医生参考。
提供可评估甲状腺结节恶性程度或概率的系统，
所述系统基于多肽评估甲状腺结节恶性程度或概率，
所述系统以CAL62细胞系、8305C细胞系中的至少一种作为所述多肽的替代基质。
部分具体实施方式中，所述CAL62细胞系、8305C细胞系的存在形式是细胞系和/或从细胞系提取的蛋白溶液。
提供可评估甲状腺结节恶性程度或概率的模型，
所述模型基于多肽评估甲状腺结节恶性程度或概率，
所述模型以CAL62细胞系、8305C细胞系中的至少一种作为所述多肽的替代基质。
部分具体实施方式中，所述CAL62细胞系、8305C细胞系的存在形式是细胞系和/或从细胞系提取的蛋白溶液。
部分具体实施方式中，所述多肽的肽段长度是7～38个氨基酸，等电点pI是3.77～9.99，疏水性分析GRAVY值是-1.66～1.41。
部分具体实施方式中，所述多肽的序列包括编号1～179所示多肽序列的至少一种。
部分具体实施方式中，所述多肽的肽段长度是7～24个氨基酸，等电点pI是4.14～9.72，疏水性分析GRAVY值是-0.93～1.16。
部分具体实施方式中，所述多肽的序列包括编号1、5、10、13、18、19、22、24、25、27、28、35、39、41、44所示多肽序列的至少一种。
提供可评估甲状腺结节恶性程度或概率的试剂盒，所述试剂盒的参考物质中含有CAL62细胞系、8305C细胞系中的至少一种。
部分具体实施方式中，所述参考物质包括参考品和/或质控品。
部分具体实施方式中，所述试剂盒以编号1～179所示多肽的至少一种作为检测标靶用于评估甲状腺结节恶性程度或概率。
部分具体实施方式中，所述试剂盒以CAL62细胞系、8305C细胞系中的至少一种作为所述多肽的替代基质。
部分具体实施方式中，所述CAL62细胞系、8305C细胞系的存在形式是细胞系和/或从细胞系提取的蛋白溶液。
以下详细描述本发明。
实施例1：
细胞系培养及蛋白溶液提取
以下述步骤获得CAL62细胞系、8305C细胞系：使用细胞系推荐培养基及培养条件，将细胞培养至80%~90%，吸弃培养基，对于每个培养皿，用5～10 mL PBS柔和清洗，重复三次。胰酶消化后，重悬，离心，PBS清洗后，冻存分装。
以下述步骤获得CAL62细胞系、8305C细胞系的蛋白溶液：对约750万个细胞，加入1.5mL裂解液(6M尿素/2M硫脲)，至细胞沉淀，吹打，重悬，使用探头式超声破碎仪将细胞裂解液中的打碎，冰水浴)(以WM-950W，功率40%，超声5S，停5S，共运行2min)，之后12000g离心10min，收集上清液。使用BCA定量试剂盒对蛋白溶液进行定量。
实施例2：
基质效应检测
如图1所示，通过下述实验步骤检测CAL62细胞系、8305C细胞系及其蛋白溶液的基质效应：
步骤一、质控肽用0.4%BSA溶液稀释至较高浓度质控肽段混合溶液(混标)，将质控肽+BSA溶液进行PCT处理，得到一份目标肽段中间液，取出适量稀释后得稀释液；稀释液为相当于0.4%BSA溶液经PCT前处理后得到的多肽溶液，且后续稀释液均为该溶液。
步骤二、在稀释液中添加内标肽混标，进行质谱检测，测定该溶液中各目标肽段的浓度。
步骤三、参照步骤二的检测结果将步骤一的目标肽段中间液分别稀释至高、低浓度目标肽段后加入内标肽段，配制出高低两个浓度的复溶液。
步骤四、直接取稀释液按体积比加入内标肽段，配制出空白复溶液。
步骤五、选择6个术中的临床术中样本、2种细胞系(Cal62、8305C)、2种蛋白溶液(Cal62、8305C)，临床样本的重量为1mg，细胞系约20万个细胞，蛋白溶液每个样本加样量相当于约20万细胞，每个样本进行6个重复。将临床术中样本、细胞系和蛋白溶液进行PCT前处理至除盐洗脱完成。
步骤六、将同种基质样本中6个重复的洗脱液进行混匀(每种基质混匀后总体积约为2400μL)，然后分别分装100μL进行浓缩(每种基质可分装出22个平行样)。每种基质选择1个平行样用Buffer A复溶，测定多肽浓度，从剩余的平行样中选择18个进行复溶(复溶体积依据测定的多肽浓度设置，使样本中多肽浓度控制在0.5μg/μL)，6个用高浓度目标肽段复溶液复溶，6个用低浓度目标肽段复溶液复溶，6个用空白复溶液复溶，以及高低浓度目标肽段复溶液(不含基质)和空白复溶液，同时进行质谱检测。本实施例中提供其中部分肽段的基质效应验证结果，肽段如表1所示，质控肽及内标肽的对应浓度如表2所示，样本数量计算具体如表3所示。
表1、多肽序列
注：内标肽及质控肽中的大括号表示对肽段中的氨基酸进行重标，如1号肽段的内标肽中对赖氨酸LYS的6个碳原子以13C取代、2个氮原子以15N取代。
表2、质控肽及内标肽的对应浓度
表3、实验样本安排
步骤七、对于每个基质，与不含基质的相应峰面积(待测内源肽段/内标肽，ratio)比值，计算每一分析物和内标的基质因子(基质的ratio/不含基质的ratio)。进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子，计算6个临床书中样本分别与2种细胞系和2种蛋白溶液基质因子的变异系数以及相对偏差。
CV计算方式：
1.计算每个样本的基质因子
高浓度样本的基质效应因子MF的计算方式为：(高浓度样本ratio-空白浓度样本ratio)/(高浓度复溶液ratio-空白复溶液ratio)；
低浓度样本的基质效应因子MF的计算方式为：(低浓度样本ratio-空白浓度样本ratio)/(低浓度复溶液ratio-空白复溶液ratio)；
2.分别计算各细胞系以及蛋白溶液与样本间基质因子的变异系数CV，CV=sd/mean×100%：2种细胞系和2种蛋白溶液分别计算与样本1、2、3、4、5、6的变异系数，选择合适的细胞系或蛋白溶液作为基质。
实施例3：
替代基质评价实验结果
同位素内标在不同基质中的响应值差异比较实验，取替代校准品基质的标准溶液各1组，按照样本测定方法对6份不同来源的人甲状腺结节样本进行检测，每个样本各检测6次，并采用t test分析对多组变量进行差异分析。基质因子结果如表4及图2～15所示，变异系数和相对偏差结果如表5所示。
表4、15条肽段在3类基质中的基质因子(以高浓度为例)
表5、4种模拟基质分别和组织样本之间的变异系数和相对偏差(以高浓度为例)
由上述表4和表5即可看出，CAL62细胞系及其蛋白溶液和8305C细胞系及其蛋白溶液在前述肽段中均可作为组织样本的替代基质，具有显著较低的基质效应，相比于临床样本的不可再生性、均一性差、批次差异显著、受地域、个体等因素影响较大以及互通性差等缺陷，甲状腺癌来源细胞系的均一性可控、互通性好、性状稳定、基质效应极低，可用于评估甲状腺结节恶性程度或概率的系统、模型及试剂盒中参考物质的制备，潜在医疗应用价值较高。
需要说明的是，考虑实验过程的复杂程度和本申请篇幅所限，本申请提供了具有代表性的15条多肽肽段的基质效应检测结果，结果显示CAL62细胞系及其蛋白溶液和8305C细胞系及其蛋白溶液在所述肽段中均可作为组织样本的替代基质。申请人在对全部179多肽条肽段进行了相关的基质效应检测后发现上述CAL62细胞系及其蛋白溶液和8305C细胞系及其蛋白溶液对应全部179条肽段均可具有变异系数不大于15%、相对偏差不大于20%的显著优异的基质效应，因此可作为全部179条肽段的组织样本的替代基质，可在甲状腺结节评估系统、评估模型及试剂盒中用于参考物质的制备，具有很高的应用与辅助诊断潜力。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
虽然上述具体实施方式已经显示、描述并指出应用于各种实施方案的新颖特征，但应理解，在不脱离本公开内容的精神的前提下，可对所说明的装置或方法的形式和细节进行各种省略、替换和改变。另外，上述各种特征和方法可彼此独立地使用，或可以各种方式组合。所有可能的组合和子组合均旨在落在本公开内容的范围内。上述许多实施方案包括类似的组分，并且因此，这些类似的组分在不同的实施方案中可互换。虽然已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开了本发明，但本领域技术人员应理解，本发明可超出具体公开的实施方案延伸至其它的替代实施方案和/或应用以及其明显的修改和等同物。因此，本发明不旨在受本文优选实施方案的具体公开内容限制。
本发明未尽事宜均为公知技术。

Claims (11)

1.甲状腺癌来源细胞系在制备可评估甲状腺结节恶性程度或概率的制剂中的用途，其特征在于：
所述甲状腺癌来源细胞系作为可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质；
所述甲状腺癌来源细胞系包括CAL62细胞系、8305C细胞系中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：
所述甲状腺癌来源细胞系的存在形式是细胞系或从细胞系提取的蛋白溶液。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述多肽的肽段长度是7～38个氨基酸，等电点pI是3.77～9.99，疏水性分析GRAVY值是-1.66～1.41。
4.根据权利要求1～3任一项所述的用途，其特征在于：所述多肽的序列如编号1～179所示序列的至少一种；
编号1：ALTGHLEEVVLALLK；
编号2：SLLLTTIPQIGSTEWSETLHNLK；
编号3：FTVPMLK；
编号4：MSGGWELELNGTEAK；
编号5：DFLQSLK；
编号6：SIVEEIEDLVAR；
编号7：EEAENTLQSFR；
编号8：ISGLIYEETR；
编号9：LAPGTIVEVWK；
编号10：FSMVVQDGIVK；
编号11：SAADLISQAR；
编号12：DYGVLLEGSGLALR；
编号13：GETGPSGPVGPAGAVGPR；
编号14：ELPSFLGK；
编号15：GFGFVDFNSEEDAK；
编号16：GLGTDEDTLIEILASR；
编号17：SQVVAGTNYFIK；
编号18：HTLNQIDEVK；
编号19：IDEMPEAAVK；
编号20：TVAAPSVFIFPPSDEQLK；
编号21：IIFEDDR；
编号22：IQVLVEPDHFK；
编号23：GSFSEQGINEFLR；
编号24：LALDMEIHAYR；
编号25：LFDQAFGLPR；
编号26：LADMALALESAR；
编号27：LIQQQLEK；
编号28：LLVEHQAISFMLAEMAMK；
编号29：EASGLLSLTSTLYLR；
编号30：FGQAATMEGIGAIGGTPPAFNR；
编号31：VNNASLIGLGYTQTLRPGVK；
编号32：WSGPLSLQEVDEQPQHPLHVTYAGAAVDELGK；
编号33：LVQAFQFTDK；
编号34：RISGLIYEETR；
编号35：MVVESAYEVIK；
编号36：GFGFVTFDDHDPVDK；
编号37：GIDIHGVPYVINVTLPDEK；
编号38：ALAAGGYDVEK；
编号39：TGAQELLR；
编号40：HHSLGGQYGVQGFPTIK；
编号41：VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK；
编号42：LPEEWSQWLGGSSWPGYVRPLPPAAIESPAVAAPAYSR；
编号43：ATAVVDGAFK；
编号44：VVNVSSIMSVR；
编号45：IIFVVGGPGSGK；
编号46：LEDIPVASLPDLHDIER；
编号47：QVDQFLGVPYAAPPLAERR；
编号48：VFLENVIR；
编号49：GTDVNVFNTILTTR；
编号50：IFVGGLSPDTPEEK；
编号51：GPGTSFEFALAIVEALNGK；
编号52：FSVVYAK；
编号53：MFIGGLSWDTTK；
编号54：ARPAEVGGMQLR；
编号55：SADTLWDIQK；
编号56：EVFEDAAEIR；
编号57：ALDDFVLGSAR；
编号58：GGSGAPILLR；
编号59：NVIGLQMGTNR；
编号60：LGGLTQAPGNPVLAVQINQDK；
编号61：ISIEMNGTLEDQLSHLK；
编号62：ISQLEMAR；
编号63：IVQAEGEAEAAK；
编号64：IYLYTLNDNAR；
编号65：LAAQSTLSFYQR；
编号66：LAASEAATAISHQAIQILGGMGYVTEMPAER；
编号67：LQDAEIAR；
编号68：LQVTNVLSQPLTQATVK；
编号69：LSASSLTMESFAFLWAGGR；
编号70：LSQNNFALGYK；
编号71：LTLSALVDGK；
编号72：SDALETLGFLNHYQMK；
编号73：SFVLNLGK；
编号74：SGVYQHVTGEMMGGHAIR；
编号75：SLQELFLAHILSPWGAEVK；
编号76：VIISAPSADAPMFVMGVNHEK；
编号77：VLNNMEIGTSLFDEEGAK；
编号78：VNVDEVGGEALGR；
编号79：QGFGELLQAVPLADSFR；
编号80：QTAAQLILK；
编号81：NAYAVLYDIILK；
编号82：NFLINYYNR；
编号83：NGPVEGAFSVYSDFLLYK；
编号84：NQLLQEELEALQLQLR；
编号85：NSITVPYK；
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编号87：AHSSMVGVNLPQK；
编号88：AITHLNNNFMFGQK；
编号89：AIWNVINWENVTER；
编号90：ALDVMVSTFHK；
编号91：ALIEVLQPLIAEHQAR；
编号92：ALINSPEGAVGR；
编号93：ALPGQLKPFETLLSQNQGGK；
编号94：ASIAGHMFDVVVIGGGISGLSAAK；
编号95：ATAVMPDGQFK；
编号96：ATSFLLALEPELEAR；
编号97：AVEFLASNESR；
编号98：AVQQPDGLAVLGIFLK；
编号99：AWITAPVALR；
编号100：DAQGLVLFDVTGQVR；
编号101：DGYNYTLSK；
编号102：DLQNVNITLR；
编号103：EAINVEQAFQTIAR；
编号104：EAVLIDPVLETAPR；
编号105：EDMTYAVR；
编号106：EFSGYVESGLK；
编号107：EFTPPVQAAYQK；
编号108：EGMNIVEAMER；
编号109：ELDESLQVAER；
编号110：ELLQTELSGFLDAQK；
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编号112：ELSDFISYLQR；
编号113：EMEENFAVEAANYQDTIGR；
编号114：ESYPVFYLFR；
编号115：EVQGFESATFLGYFK；
编号116：FEDENFILK；
编号117：FFPFGLVQLSSDLSK；
编号118：FLILPDMLK；
编号119：FLQGDHFGTSPR；
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编号121：FYALSASFEPFSNK；
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编号123：GDVTAQIALQPALK；
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编号126：GFPTIYFSPANK；
编号127：GGADVASIHLLTAR；
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编号129：GNDISSGTVLSDYVGSGPPK；
编号130：GNVGVVLFNFGK；
编号131：GQTLVVQFTVK；
编号132：GQVEYLLK；
编号133：GVDEVTIVNILTNR；
编号134：HFSPEELK；
编号135：HGESAWNLENR；
编号136：HILGFDTGDAVLNEAAQILR；
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编号139：IFTSIGEDYDER；
编号140：ILVVIEPLLIDEDYYAR；
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编号143：IPWFQYPIIYDIR；
编号144：LALQFTTNPK；
编号145：LAPITSDPTEATAVGAVEASFK；
编号146：LAVYQAGAR；
编号147：LEAAYLDLQR；
编号148：LFDSDPITVTVPVEVSR；
编号149：LGANSLLDLVVFGR；
编号150：LGLLGLANSLAIEGR；
编号151：LGPLVEQGR；
编号152：LLTEYGVSVLVLEAR；
编号153：LMEDLDR；
编号154：LNLEAINYMAADGDFK；
编号155：LWTLVSEQTR；
编号156：MDMSLDDIIK；
编号157：MLDWLQEK；
编号158：MQQQLDEYQELLDIK；
编号159：QDIAFAYQR；
编号160：QVSDLISVLR；
编号161：QVVESAYEVIK；
编号162：SLDVNQDSELK；
编号163：SSPVVIDASTAIDAPSNLR；
编号164：TEFLSFMNTELAAFTK；
编号165：TFRPAAMLIER；
编号166：TGAAPIIDVVR；
编号167：VAQLEQVYIR；
编号168：VIILGDSGVGK；
编号169：VIILTAAAQGIGQAAALAFAR；
编号170：VLTQIGTSIQDFIEAEDDLSSFR；
编号171：VLVDQTTGLSR；
编号172：VLYLSAFTSK；
编号173：VNLAELFK；
编号174：VTLTSEEEAR；
编号175：WLHNEDQMAVEK；
编号176：YGFIEGHVVIPR；
编号177：YGINTTDIFQTVDLWEGK；
编号178：YNIPHGPVVGSTR；
编号179：YQLDPTASISAK。
5.可评估甲状腺结节恶性程度或概率的系统，其特征在于：
所述系统基于多肽评估甲状腺结节恶性程度或概率，
所述系统包括CAL62细胞系、8305C细胞系中的至少一种作为所述多肽的替代基质。
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于：所述CAL62细胞系、8305C细胞系的存在形式是细胞系或从细胞系提取的蛋白溶液。
7.可评估甲状腺结节恶性程度或概率的试剂盒，所述试剂盒包括参考物质，其特征在于：所述参考物质中含有CAL62细胞系、8305C细胞系中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：
所述参考物质包括参考品和/或质控品。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒以编号1～179所示多肽的至少一种作为检测标靶用于评估甲状腺结节恶性程度或概率：
编号1：ALTGHLEEVVLALLK；
编号2：SLLLTTIPQIGSTEWSETLHNLK；
编号3：FTVPMLK；
编号4：MSGGWELELNGTEAK；
编号5：DFLQSLK；
编号6：SIVEEIEDLVAR；
编号7：EEAENTLQSFR；
编号8：ISGLIYEETR；
编号9：LAPGTIVEVWK；
编号10：FSMVVQDGIVK；
编号11：SAADLISQAR；
编号12：DYGVLLEGSGLALR；
编号13：GETGPSGPVGPAGAVGPR；
编号14：ELPSFLGK；
编号15：GFGFVDFNSEEDAK；
编号16：GLGTDEDTLIEILASR；
编号17：SQVVAGTNYFIK；
编号18：HTLNQIDEVK；
编号19：IDEMPEAAVK；
编号20：TVAAPSVFIFPPSDEQLK；
编号21：IIFEDDR；
编号22：IQVLVEPDHFK；
编号23：GSFSEQGINEFLR；
编号24：LALDMEIHAYR；
编号25：LFDQAFGLPR；
编号26：LADMALALESAR；
编号27：LIQQQLEK；
编号28：LLVEHQAISFMLAEMAMK；
编号29：EASGLLSLTSTLYLR；
编号30：FGQAATMEGIGAIGGTPPAFNR；
编号31：VNNASLIGLGYTQTLRPGVK；
编号32：WSGPLSLQEVDEQPQHPLHVTYAGAAVDELGK；
编号33：LVQAFQFTDK；
编号34：RISGLIYEETR；
编号35：MVVESAYEVIK；
编号36：GFGFVTFDDHDPVDK；
编号37：GIDIHGVPYVINVTLPDEK；
编号38：ALAAGGYDVEK；
编号39：TGAQELLR；
编号40：HHSLGGQYGVQGFPTIK；
编号41：VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK；
编号42：LPEEWSQWLGGSSWPGYVRPLPPAAIESPAVAAPAYSR；
编号43：ATAVVDGAFK；
编号44：VVNVSSIMSVR；
编号45：IIFVVGGPGSGK；
编号46：LEDIPVASLPDLHDIER；
编号47：QVDQFLGVPYAAPPLAERR；
编号48：VFLENVIR；
编号49：GTDVNVFNTILTTR；
编号50：IFVGGLSPDTPEEK；
编号51：GPGTSFEFALAIVEALNGK；
编号52：FSVVYAK；
编号53：MFIGGLSWDTTK；
编号54：ARPAEVGGMQLR；
编号55：SADTLWDIQK；
编号56：EVFEDAAEIR；
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编号143：IPWFQYPIIYDIR；
编号144：LALQFTTNPK；
编号145：LAPITSDPTEATAVGAVEASFK；
编号146：LAVYQAGAR；
编号147：LEAAYLDLQR；
编号148：LFDSDPITVTVPVEVSR；
编号149：LGANSLLDLVVFGR；
编号150：LGLLGLANSLAIEGR；
编号151：LGPLVEQGR；
编号152：LLTEYGVSVLVLEAR；
编号153：LMEDLDR；
编号154：LNLEAINYMAADGDFK；
编号155：LWTLVSEQTR；
编号156：MDMSLDDIIK；
编号157：MLDWLQEK；
编号158：MQQQLDEYQELLDIK；
编号159：QDIAFAYQR；
编号160：QVSDLISVLR；
编号161：QVVESAYEVIK；
编号162：SLDVNQDSELK；
编号163：SSPVVIDASTAIDAPSNLR；
编号164：TEFLSFMNTELAAFTK；
编号165：TFRPAAMLIER；
编号166：TGAAPIIDVVR；
编号167：VAQLEQVYIR；
编号168：VIILGDSGVGK；
编号169：VIILTAAAQGIGQAAALAFAR；
编号170：VLTQIGTSIQDFIEAEDDLSSFR；
编号171：VLVDQTTGLSR；
编号172：VLYLSAFTSK；
编号173：VNLAELFK；
编号174：VTLTSEEEAR；
编号175：WLHNEDQMAVEK；
编号176：YGFIEGHVVIPR；
编号177：YGINTTDIFQTVDLWEGK；
编号178：YNIPHGPVVGSTR；
编号179：YQLDPTASISAK。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒以CAL62细胞系、8305C细胞系中的至少一种作为所述多肽的替代基质。
11.根据权利要求7～9任一项所述的试剂盒，其特征在于：
所述CAL62细胞系、8305C细胞系的存在形式是细胞系或从细胞系提取的蛋白溶液。
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