CN113687002A - 一种排除样本异质性及高丰度干扰能力的质控方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种排除样本异质性及高丰度干扰能力的质控方法，包括以下步骤：（1）培养多种细胞系，收集细胞；（2）在保证细胞总量一致情况下，对上述不同的细胞进行一系列不同比例的混合，制成混合细胞样品组用以模拟样本异质性及高丰度干扰；（3）将上述混合细胞样品制成质控标准品；（4）对上述指控标准品进行蛋白分析实验；（5）对数据中各种细胞所拥有的独立特征蛋白进行定量和分析。本发明方法通过对不同种类细胞的混合模拟临床组织样本异质性，以已知混合比例与最终蛋白分析的定量结果进行对照分析，可用于评价各实验室间蛋白分析系统对样本异质性及高丰度的抗干扰能力，作为蛋白组学分析过程中系列质控方法之一。

Description

一种排除样本异质性及高丰度干扰能力的质控方法
技术领域
本发明属于蛋白组学技术领域，具体地，涉及一种对含有异质性细胞或含有高丰度蛋白样本中蛋白标志物定量的质控方法。
背景技术
近年来，随着质谱硬件以及软件相关技术的提升，蛋白质组检测领域发展极为迅速，越来越多的应用到了临床肿瘤标志物的发现以及蛋白质组的分子分型，以及潜在药物靶点的发现，推动了精准医疗的发展。
组织样本通常由不同类型的细胞构成，且器官或肿瘤组织中不同位置组织结构的比例具有一定差异性，造成了不同样本间存在明显的异质性。在肿瘤研究中，肿瘤存在异质性已成为共识，且不同肿瘤样本中正常细胞与癌细胞的比例也都差异较大，将切下的肿瘤样本作为一个整体去定性定量其中的肿瘤标志物，将存在巨大的误差。目前，市面上没有能够模拟组织样本异质性的质控标准品，用以辅助判断肿瘤标志物定性定量的误差。同时，由于不同实验室在进行蛋白质组定量比较分析的时候，多数直接使用成品化的蛋白质组分析软件如Spectronaut、Maxquant、Peaks等进行直接数据处理并得出结论，其中仅会以统计学方法如中位数校正、无标签的基于强度的绝对量化（iBAQ）校正、占总数的分数（FOT）校正等对数据进行不同样本间进行校正归一，各种分析方法对样本异质性对抗干扰能力无法评价，不能根据分析方法对异质性的抗干扰能力不同而进行进一步校正以减少分析误差，这将导致结果的不精准，进一步影响该结果指导的临床诊治工作。因此，设立对抗样本异质性及高丰度蛋白干扰的室间质评标准品，对于把控蛋白质组研究、尤其是临床蛋白质组应用准确性意义重大，是蛋白组学分析中不可缺少的系列必备质控品之一。
发明内容
发明目的：现有技术中临床蛋白质组无法监控由于样品异质性或高丰度干扰造成的蛋白标志物定量的偏差，为解决上述技术问题，本发明提供了一种评价蛋白组学分析中排除样本异质性或高丰度干扰能力的质控方法。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种评价蛋白组学分析中排除样本异质性干扰能力的质控方法，包括以下步骤：
（1）培养多种细胞系，收集细胞；
（2）在保证细胞总量一致情况下，对上述不同的细胞进行一系列不同比例的混合，制成混合细胞样品组用以模拟样本异质性或高丰度干扰；
（3）将上述混合细胞样品制成质控标准品；
（4）对上述质控标准品进行蛋白分析实验，获取数据；
（5）对数据中各种细胞所拥有的独立特征蛋白进行定量，并对比各特征蛋白定量数据是否与上述混检的细胞数量比例相一致及偏差程度，即用于评价该蛋白组学分析方法对抗样本异质性干扰的能力；分析各特征蛋白定量数据在存在或不存在高丰度蛋白干扰时的一致性及偏差程度，即用于评价该蛋白质组学分析方法对抗高丰度蛋白干扰的能力；籍以达到对不同蛋白分析方法的质量控制目的。
优选的，步骤（1）中，所述细胞系含有人源细胞系，包括正常细胞和癌细胞；所述人源细胞系的细胞种类包括组织细胞、间质细胞、免疫细胞或红细胞等。
优选的，步骤（1）中，所述细胞系选自：来自肺组织的正常成纤维细胞（如CCD-8L细胞）和带有EGFR突变的肺部腺癌细胞（如HCC-827细胞），或者带有EGFR突变的肺部腺癌细胞（HCC-827细胞）和正常红细胞，或者来自肺组织的正常成纤维细胞（如CCD-8L细胞）、带有EGFR突变的肺部腺癌细胞（如HCC-827细胞）和正常红细胞。
优选的，步骤（1）中，排除样本异质性时，使用多种具有独立蛋白表达特征的同组织来源细胞系；排除高丰度干扰能力时，使用组织细胞与含有特定高丰度蛋白的细胞，如红细胞、白细胞、间质细胞、体液中富含的高丰度蛋白等。所述独立蛋白表达特征包括但不限于带有特定突变的细胞及相应的不带有所述特定突变的对应细胞、含有多拷贝的细胞及相应正常细胞、或具有过表达的细胞及相应正常表达细胞、或含有缺失基因的细胞及相应基因组完整的细胞等。进一步优选，所述特定突变包括如IDH、EGFR等肿瘤特征性突变。
优选的，步骤（2）中，至少混合两种细胞，不同细胞沉淀混合总和一致，包括细胞数、细胞质量或细胞体积，一系类不同细胞可采用多个比例，优选两者混合比例为1:0、4:1、1:1、1:4、0:1等；也可以是一系列多个细胞混合比例，优选的为比例如1：2：4……：N等。
优选的，步骤（3）中，所述混合细胞样品制成标品的方法包括：直接混匀后冷冻或加入琼脂糖混匀后进行冷冻，或者用琼脂糖凝胶包裹形成均匀细胞团块并进行福尔马林固定，最终制成为细胞蜡块等。
优选的，步骤（4）中，所述蛋白分析实验包括蛋白质组样本制备，方法如下：
a)标品前处理；
b)加入裂解液，超声裂解；
c)去交联，离心取上清；
d)蛋白浓度测定；
e)蛋白还原烷基化；
f)蛋白酶解；
g)肽段脱盐抽干及复溶后肽段定量。
进一步优选，
步骤a）中，标品前处理包括：冷冻样本进行液氮研磨；细胞蜡块标品先加入有机溶剂如二甲苯进行脱蜡，结束后采用不同浓度的乙醇（包括采用100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇等中的几种依次进行孵育）进行脱蜡后的复水。
步骤b）中，加入裂解液，超声裂解包括：裂解液含有十二烷基硫酸钠（SDS）、尿素、乙二胺四乙酸（EDTA）或酶抑制剂等中的一种或几种，超声裂解优选为使用超声探头接触式超声，1~5s-on，1~5s-off，时间3-20 min。
步骤c）中，去交联，离心取上清包括：去交联为温度80~100 ℃，离心为2-4℃，8,000-12,000 g 5-60 min。
步骤d）中，蛋白浓度测定包括：使用聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）方法进行蛋白定量。
步骤e）中，蛋白还原烷基化包括：加入二硫苏糖醇后于45～95℃条件下反应5～60分钟，再加入烷基化试剂碘乙酰胺或氯乙酰胺避光室温反应5~60分钟；或直接加入三(2-羧乙基)膦及氯乙酰胺，45～95℃条件下反应5～60分钟。
步骤f）中，蛋白酶解包括：使用SP3磁珠试剂盒对蛋白进行富集清洗，再加入酶解缓冲液（包括胰蛋白酶、碳酸氢铵、氯化钙、乙腈等），反应条件为温度为25～37 ℃，时间为2～16小时。
步骤g）中，肽段脱盐抽干包括：使用冷冻旋转真空干燥进行抽干。
优选的，步骤（4）中，所述蛋白分析实验包括蛋白质谱检测，方法包括以下步骤：使用液相色谱-串联质谱法进行检测，检测方法包括数据非依赖性数据采集（DIA）、数据依赖性数据采集（DDA）、平行反应监测（PRM）等检测方法。
优选的，步骤（5）中，对数据中特定蛋白定量数据进行抽提比较包括：使用软件包括Spectranaut、MaxQuant、PEAKs等对原始数据进行定性定量比对分析抽提得到总蛋白定量表，对总蛋白定量表进行数据校正，校正方法包括中位数校正、FOT校正、iBAQ校正、内标校正等，对反映细胞特征的蛋白进行分析比较，并计算相应细胞比例以检测分析方法抗异质性及高丰度蛋白的干扰。
有益效果：本发明方法对不同细胞进行相应比例的混合后进，可以更好的模拟异质性样本的情况，并以最终的特征性蛋白的定量准确性评估各家蛋白分析系统对于样本异质性及抗高丰度蛋白干扰的能力，可用于室间质评蛋白质谱检测分析的准确性。
具体实施方式
以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1，考察不同分析方法的异质性抗干扰能力。
1、培养正常细胞CCD-8L（来源肺组织，正常细胞，成纤维细胞），标为细胞1；该细胞不表达/低表达（本底）EGFR蛋白。
2、培养HCC-827细胞（肺部腺癌细胞，带有EGFR突变(E746 - A750 deletion)），标为细胞2；该细胞由于存在EGFR突变造成EGFR蛋白过表达。
3、收集两种细胞，并都定量细胞数至106/mL。
4、两种细胞各取1mL，分别作为参考品1，参考品2。
5、细胞充分重悬后，CCD-8L与HCC-827细胞按比例1:4，1:1，4:1进行充分混合，总体积为1mL，标记为标品1，标品2，标品3。
6、将细胞离心后，与琼脂糖凝胶充分混匀，再制备成石蜡块，并进行切片。
7、将三个标品切片在同一实验室、由同一人、用相同方法、同时进行蛋白质组提取，包括脱蜡复水、超声裂解、解交联、还原烷基化、蛋白酶解、肽段除盐纯化，方法如下：
a)使用二甲苯孵育三遍脱蜡，然后依次用100%乙醇、75%乙醇、50%乙醇进行孵育复水，每次孵育5 min，10,000 g 离心5 min，去上清；
b)沉淀加入200 uL4% SDS，超声10 min（3s-on，3s-off）；
c)95 ℃孵育1 h；
d)加入二硫苏糖醇（DTT），56 ℃孵育1 h，再加入碘乙酰胺（IAM）避光室温孵育45min；
e)取出100 ug蛋白，使用SP3磁珠富集蛋白；
f)向挂有蛋白的磁珠沉淀加入20 uL含有胰蛋白酶的酶解缓冲液，37 ℃孵育过夜；
g)将肽段使用SDB柱纯化除盐，冷冻抽干。
8、将获得的肽段在同一设备进行液相质谱分析，获得DIA原始数据，使用Spectronaut软件进行数据初步据处理，最终提取EGFR蛋白定量信息；
表1 EGFR蛋白在各样本中的定量信息
Figure 361096DEST_PATH_IMAGE002
。
9、以参考品1为参考，使用中位数校正、FOT校正（Fraction of Total，每个蛋白除以总蛋白强度）两种领域内常用分析方法进行数据校正后，EGFR蛋白定量结果的比较（以领域内常用的改变倍数为单位，标品改变倍数理论值计算公式为：标品改变倍数理论值=参考品1改变倍数*标品正常细胞百分比+参考品2改变倍数*标品癌细胞百分比），信息如下表：
表2使用中位数、FOT校正方法EGFR蛋白改变倍数
Figure 809394DEST_PATH_IMAGE003
。
结论：
1、由于参考品1为正常细胞，参考品2为癌细胞，参考品2/参考品1即可认定为标准的癌细胞中EGFR蛋白表达改变倍数；
2、从表2看出，在中位数、FOT校正数据中标品1-3中EGFR蛋白的改变倍数与理论值都存在误差；中位数校正结果中，当癌细胞实际比例大（1:4），测定改变倍数相较于理论值误差较大，且数值偏小，当癌细胞实际比例小时（4:1），测定改变倍数误差偏小，数值反而出现偏高，表明中位数校正中改变倍数偏差方向不完全一致，误差大小存在一定波动，与样本中癌细胞比例相关；FOT矫正中，所有测定改变倍数都大于理论值，误差都较大，最大可达到27.8%，且随着癌细胞比例减小时，误差会变大；说明两个方法都存在一定误差，中位数校正整体的误差较小；
3、测定完成后，即可将参考品1、2，标品1-3（不提供具体比例）提供给同类实验室，进行室间质评，同类实验室利用EGFR进行癌细胞比例的计算，与实际混合比例进行比较，即可反映质评实验室实验方法及数据分析方法抗异质性干扰的能力，作为蛋白组学向临床使用推进过程中质量控制的一部分。
实施例2，考察不同分析方法的抗高丰度蛋白干扰能力。
1、培养HCC-827细胞（肺部腺癌细胞，带有EGFR突变(E746 - A750 deletion)），标为细胞1。
2、收集红细胞，标为细胞2；红细胞存在大量高丰度血红蛋白。
3、收集两种细胞，并都定量细胞数至106/mL。
4、两种细胞各取1mL，分别作为参考品1，2。
5、细胞充分重悬后，HCC-827细胞与红细胞按比例9:1、19:1、49:1、99:1（模拟临床组织样本红细胞的真实比例）进行充分混合，总体积为1mL，标记为标品1、标品2、标品3、标品4。
6、将细胞离心后，与琼脂糖凝胶充分混匀，再制备成石蜡块，并进行切片。
7、将参考品1和4个标品切片进行蛋白质组提取，包括脱蜡复水、超声裂解、解交联、还原烷基化、蛋白酶解、肽段除盐纯化，方法如下：
a)使用二甲苯孵育三遍脱蜡，然后依次用100%乙醇、75%乙醇、50%乙醇进行孵育复水，每次孵育5 min，10,000 g 离心5 min，去上清；
b)沉淀加入200 uL4% SDS，超声10 min（3s-on，3s-off）；
c)95 ℃孵育1 h；
d)加入DTT，56 ℃孵育1 h，再加入IAM避光室温孵育45 min；
e)取出100 ug蛋白，使用SP3磁珠富集蛋白；
f)向挂有蛋白的磁珠沉淀加入20 uL含有胰蛋白酶的酶解缓冲液，37 ℃孵育过夜；
g)将肽段使用SDB柱纯化除盐，冷冻抽干。
8、将获得的肽段进行液相质谱分析，获得DIA原始数据，使用Spectronaut软件进行数据初步据处理，提取EGFR蛋白定量信息；
表3 EGFR蛋白定量信息（未校正与中位数校正数据）
Figure 418493DEST_PATH_IMAGE004
。
9、以参考品1为参考，使用中位数校正、FOT校正（Fraction of Total，每个蛋白除以总蛋白强度）两种领域内常用分析方法进行数据校正后，EGFR蛋白定量结果的比较（以领域内常用的改变倍数为单位），EGFR蛋白改变倍数及相应误差信息如下表：
表4使用中位数、FOT校正方法EGFR 蛋白改变倍数及相应误差
Figure 548123DEST_PATH_IMAGE005
。
结论：
1、参考品1为癌细胞，参考品2为具有高丰度蛋白的血细胞，混合两个样品可以模拟存在高丰度蛋白污染样品；
2、从表2看出，在中位数矫正中，随着红细胞比例的上升，标品中EGFR蛋白相比于参考品1中的改变倍数逐步增大，但改变倍数比例依旧接近1，误差都较小，小于5%，可以有效校正高丰度蛋白造成的干扰；在FOT校正中，随着红细胞比例的上升，标品中EGFR蛋白相比于参考品1中的改变倍数也逐步变大，但是差距都较大，尤其当红细胞比例达到9:1时，改变倍数已经达到0.82，存在较大误差达到18%，即使在低比例99:1的标品4中，误差也已经达到-7%，因不能有效校正高丰度蛋白的干扰；
3、测定完成后，即可将参考品1，标品1-4提供给同类实验室，进行室间质评，同类实验室计算EGFR改变比例，即可反映质评实验室实验方法及数据分析方法抗高丰度蛋白干扰的能力，作为蛋白组学向临床使用推进过程中质量控制的一部分。
实施例3，考察不同分析方法的异质性及高丰度抗干扰能力。
1、培养正常细胞CCD-8L（来源肺组织，正常细胞，成纤维细胞），标为细胞1；该细胞不表达/低表达（本底）EGFR蛋白。
2、培养HCC-827细胞（肺部腺癌细胞，带有EGFR突变(E746 - A750 deletion)），标为细胞2；该细胞由于存在EGFR突变造成EGFR蛋白过表达。
3、收集红细胞，标记为细胞3；红细胞存在大量高丰度血红蛋白。
4、收集三种细胞，并都定量细胞数至106/mL。
5、细胞1、2两种细胞各取1mL，分别作为参考品1，参考品2。
6、细胞充分重悬后，CCD-8L、HCC-827、红细胞3种细胞按比例18:72:10，45:45:10，72:18:10，19.6:78.4:2，49:49:2，78.2:19.6:2，20:80:0，50:50:0,，80:20:0，进行充分混合，总体积为1mL，标记为标品1-1，标品1-2，标品1-3，标品2-1，标品2-2，标品2-3，标品3-1，标品3-2，标品3-3。
7、将细胞离心后，与琼脂糖凝胶充分混匀，再制备成石蜡块，并进行切片。
8、将三个标品切片在同一实验室、由同一人、用相同方法、同时进行蛋白质组提取，包括脱蜡复水、超声裂解、解交联、还原烷基化、蛋白酶解、肽段除盐纯化，方法如下：
a)使用二甲苯孵育三遍脱蜡，然后依次用100%乙醇、75%乙醇、50%乙醇进行孵育复水，每次孵育5 min，10,000 g 离心5 min，去上清；
b)沉淀加入200 uL4% SDS，超声10 min（3s-on，3s-off）；
c)95 ℃孵育1 h；
d)加入DTT，56 ℃孵育1 h，再加入IAM避光室温孵育45 min；
e)取出100 ug蛋白，使用SP3磁珠富集蛋白；
f)向挂有蛋白的磁珠沉淀加入20 uL含有胰蛋白酶的酶解缓冲液，37 ℃孵育过夜；
g)将肽段使用SDB柱纯化除盐，冷冻抽干。
9、将获得的肽段在同一设备进行液相质谱分析，获得DIA原始数据，使用Spectronaut软件进行数据初步据处理，最终提取EGFR蛋白定量信息；
表5 EGFR蛋白在各样本中的定量信息
Figure 690391DEST_PATH_IMAGE006
。
10、以参考品1为参考，使用中位数校正、FOT校正（Fraction of Total，每个蛋白除以总蛋白强度）两种领域内常用分析方法进行数据校正后，EGFR蛋白定量结果的比较（以领域内常用的改变倍数为单位，标品改变倍数理论值计算公式为：标品改变倍数理论值=参考品1改变倍数*标品正常细胞百分比+参考品2改变倍数*标品癌细胞百分比），信息如下表：
表6使用中位数、FOT校正方法EGFR蛋白改变倍数
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
结论：
1、由于参考品1为正常细胞，参考品2为癌细胞，参考品2/参考品1即可认定为标准的癌细胞中EGFR蛋白表达改变倍数；
2、从表2看出，在中位数、FOT校正数据中标品1-3中EGFR蛋白的改变倍数与理论值都存在误差；
3、中位数校正结果中，当没有血细胞存在时（标品3-1~3），当癌细胞实际比例大（1:4），测定改变倍数相较于理论值误差较大，且数值偏小，当癌细胞实际比例小时（4:1），测定改变倍数误差偏小，数值反而出现偏高，表明中位数校正中改变倍数偏差方向不完全一致，误差大小存在一定波动，与样本中癌细胞比例相关；当存在血细胞的高丰度干扰时（标品1-1~3，标品2-1~3），当血细胞量逐步加大，由占整体0%到2%再到10%，可见，所有的误差都向偏大改变，说明血细胞造成在中位数校正中定量数据都相对偏大；
4、FOT矫正中，所有测定改变倍数都大于理论值，误差都较大，最大可达到36%，且随着癌细胞比例减小时，误差会变大，随着红细胞比例的提高，误差也会进一步变大；
5、上述两个校正方法的结果说明两个方法都存在一定误差，中位数校正整体的误差较小；
测定完成后，即可将参考品1、2，标品1-1~3，2-1~3，3-1~3（不提供具体比例）提供给同类实验室，进行室间质评，同类实验室利用EGFR进行癌细胞比例的计算，与实际混合比例进行比较，即可反映质评实验室实验方法及数据分析方法抗异质性干扰的能力，作为蛋白组学向临床使用推进过程中质量控制的一部分。辅以蛋白质谱分析过程中其他步骤的质控结果，本质控品将反映该实验室蛋白组学结果的综合准确性，并找出该实验室引起实验误差的原因。

Claims (10)

1.一种排除样本异质性及高丰度干扰能力的质控方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培养多种细胞系，收集细胞；
（2）在保证细胞总量一致情况下，对上述不同的细胞进行一系列不同比例的混合，制成混合细胞样品组用以模拟样本异质性或高丰度干扰；
（3）将上述混合细胞样品制成质控标准品；
（4）对上述质控标准品进行蛋白分析实验，获取数据；
（5）对数据中各种细胞所拥有的独立特征蛋白进行定量，并对比各特征蛋白定量数据是否与上述混检的细胞数量比例相一致及偏差程度，即用于评价该蛋白组学分析方法对抗样本异质性干扰的能力；分析各特征蛋白定量数据在存在或不存在高丰度蛋白干扰时的一致性及偏差程度，即用于评价该蛋白质组学分析方法对抗高丰度蛋白干扰的能力。
2.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（1）中，所述细胞系含有人源细胞系，包括正常细胞和癌细胞；所述人源细胞系的细胞种类包括组织细胞、间质细胞、免疫细胞或红细胞。
3.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（1）中，所述细胞系选自：来自肺组织的正常成纤维细胞和带有EGFR突变的肺部腺癌细胞，或者带有EGFR突变的肺部腺癌细胞和正常红细胞，或者来自肺组织的正常成纤维细胞、带有EGFR突变的肺部腺癌细胞和正常红细胞。
4.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（1）中，排除样本异质性时，使用多种具有独立蛋白表达特征的同组织来源细胞系；排除高丰度干扰能力时，使用组织细胞与含有特定高丰度蛋白的细胞。
5.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（2）中，至少混合两种细胞，不同细胞沉淀混合总和一致，包括细胞数、细胞质量或细胞体积。
6.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（3）中，所述混合细胞样品制成标品的方法包括：直接混匀冷冻或加入琼脂糖混匀后进行冷冻，或者优选用琼脂糖凝胶包裹形成均匀细胞团块并进行福尔马林固定，最终制成为福尔马林固定的细胞蜡块。
7.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（4）中，所述蛋白分析实验包括蛋白质组样本制备，方法如下：
a)标品前处理；
b)加入裂解液，超声裂解；
c)去交联，离心取上清；
d)蛋白浓度测定；
e)蛋白还原烷基化；
f)蛋白酶解；
g)肽段脱盐抽干及复溶后肽段定量。
8.根据权利要求7所述的质控方法，其特征在于：
步骤a）中，标品前处理包括：冷冻样本进行液氮研磨；细胞蜡块标品先加入有机溶剂进行脱蜡，结束后采用不同比例乙醇进行脱蜡后的复水；
步骤b）中，加入裂解液，超声裂解包括：裂解液含有SDS、尿素、EDTA或酶抑制剂中的一种或几种，超声裂解优选为使用超声探头接触式超声，1~5s-on，1~5s-off，时间3-20 min；
步骤c）中，去交联，离心取上清包括：去交联为温度80~100 ℃，离心为2-4℃，8,000-12,000 g 5-60 min；
步骤d）中，蛋白浓度测定包括：使用BCA方法进行蛋白定量；
步骤e）中，蛋白还原烷基化包括：加入二硫苏糖醇后于45～95℃条件下反应5～60分钟，再加入烷基化试剂碘乙酰胺或氯乙酰胺避光室温反应5~60分钟；或直接加入三(2-羧乙基)膦及氯乙酰胺，45～95℃条件下反应5～60分钟；
步骤f）中，蛋白酶解包括：使用SP3磁珠试剂盒对蛋白进行富集清洗，再加入酶解缓冲液，反应条件为温度为25～37 ℃，时间为2～16小时；
步骤g）中，肽段脱盐抽干包括：使用冷冻旋转真空干燥进行抽干。
9.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（4）中，所述蛋白分析实验包括蛋白质谱检测，方法包括以下步骤：使用液相色谱-串联质谱法进行检测，检测方法包括DIA、DDA、PRM检测方法。
10.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（5）中，对数据中特定蛋白定量数据进行定量对比包括：使用软件包括Spectranaut、MaxQuant、PEAKs对原始数据进行定性定量比对分析抽提得到总蛋白定量表，对总蛋白定量表进行数据校正，校正方法包括中位数校正、FOT校正、iBAQ校正、内标校正，对反映细胞特征的蛋白进行分析比较，并计算相应细胞比例以检测分析方法抗异质性及高丰度蛋白的干扰。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115436640A (zh) * 2022-11-07 2022-12-06 西湖欧米(杭州)生物科技有限公司 适于可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070087448A1 (en) * 2004-02-16 2007-04-19 Nelsestuen Gary L Biological profiles and methods of use
CN103033628A (zh) * 2012-12-18 2013-04-10 北京科技大学 制备个体全蛋白质组芯片的方法及其应用
CN109900815A (zh) * 2017-12-08 2019-06-18 中国科学院大连化学物理研究所 血清中IgG糖肽的绝对定量分析
CN109975461A (zh) * 2019-04-10 2019-07-05 中生北控生物科技股份有限公司 维生素d及其代谢物的质谱检测用校准品和质控品及其制备方法和应用
CN111505315A (zh) * 2020-05-07 2020-08-07 杭州师范大学 一种蛋白组合式标志物在制备儿童哮喘诊断试剂中的应用
US20210080469A1 (en) * 2019-09-16 2021-03-18 Battelle Memorial Institute Anoliter-scale sample processing and mass spectrometry acquisition method for single cell proteomics
CN112961237A (zh) * 2021-03-10 2021-06-15 中国计量科学研究院 人源化IgM单克隆抗体标准物质及制备方法
CN113105545A (zh) * 2021-04-29 2021-07-13 四川携光生物技术有限公司 一种ii型自免肝lkm-1、lc-1复合质控品及其制备方法、应用
US20210239660A1 (en) * 2020-01-31 2021-08-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High Confidence Compound Identification by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
CN113267394A (zh) * 2021-06-10 2021-08-17 谱天（天津）生物科技有限公司 用于蛋白质组质控的ffpe参考品、其制备方法及应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070087448A1 (en) * 2004-02-16 2007-04-19 Nelsestuen Gary L Biological profiles and methods of use
CN103033628A (zh) * 2012-12-18 2013-04-10 北京科技大学 制备个体全蛋白质组芯片的方法及其应用
CN109900815A (zh) * 2017-12-08 2019-06-18 中国科学院大连化学物理研究所 血清中IgG糖肽的绝对定量分析
CN109975461A (zh) * 2019-04-10 2019-07-05 中生北控生物科技股份有限公司 维生素d及其代谢物的质谱检测用校准品和质控品及其制备方法和应用
US20210080469A1 (en) * 2019-09-16 2021-03-18 Battelle Memorial Institute Anoliter-scale sample processing and mass spectrometry acquisition method for single cell proteomics
US20210239660A1 (en) * 2020-01-31 2021-08-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High Confidence Compound Identification by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
CN111505315A (zh) * 2020-05-07 2020-08-07 杭州师范大学 一种蛋白组合式标志物在制备儿童哮喘诊断试剂中的应用
CN112961237A (zh) * 2021-03-10 2021-06-15 中国计量科学研究院 人源化IgM单克隆抗体标准物质及制备方法
CN113105545A (zh) * 2021-04-29 2021-07-13 四川携光生物技术有限公司 一种ii型自免肝lkm-1、lc-1复合质控品及其制备方法、应用
CN113267394A (zh) * 2021-06-10 2021-08-17 谱天（天津）生物科技有限公司 用于蛋白质组质控的ffpe参考品、其制备方法及应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115436640A (zh) * 2022-11-07 2022-12-06 西湖欧米(杭州)生物科技有限公司 适于可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质

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