KR101841673B1 - 유전자의 결실을 이용한 유방암 환자의 예후 예측 방법 - Google Patents

유전자의 결실을 이용한 유방암 환자의 예후 예측 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자의 결실을 이용한 유방암 환자의 예후 예측 방법에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 유방암의 예후의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체의 시료를 수득하는 단계; 상기 시료에서 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; 상기 추출된 유전체 DNA에서 유전자 결실 여부를 확인하는 단계; 및 유전체 DNA에 유전자의 결실이 확인된 피검체를 유방암의 예후가 나쁜 것으로 판단하는 단계를 포함하는 삼중음성 유방암 환자의 예후의 마커를 검출하는 방법, 유전자의 결실을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물, 그리고 이를 유효성분으로 포함하는 키트에 대한 것이다.
본 발명자들이 규명한 바와 같이, 삼중음성 유방암 조직에서 다수의 특정 유전자의 결실과 유방암 환자의 예후 사이에 밀접한 상관관계가 있으므로, 관련 유전자의 결실을 마커로 검출하기 위한 본 발명의 방법과 조성물은 유방암, 특히 효율적인 바이오마커가 부재한 삼중음성 유방암의 예후를 판단하기 위한 정보를 제공하는 데 유용하다.

Description

유전자의 결실을 이용한 유방암 환자의 예후 예측 방법{Method for predicting prognosis of breast cancer patients using gene deletions as biomarkers}
본 발명은 유전자의 결실을 이용한 유방암 환자의 예후 예측 방법에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 유방암의 예후의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체의 시료를 수득하는 단계; 상기 시료에서 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; 상기 추출된 유전체 DNA에서 유전자 결실 여부를 확인하는 단계; 및 유전체 DNA에서 유전자의 결실이 확인된 피검체를 유방암의 예후가 나쁜 것으로 판단하는 단계를 포함하는 유방암 환자의 예후의 마커를 검출하는 방법, 유전자의 결실을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물, 그리고 이를 유효성분으로 포함하는 키트에 대한 것이다.
유방암은 전세계적으로 매해 사망 450,000건과 발생 1,300,000건 이상인 매우 중요한 암 중의 하나이다. 유방암은 유전적, 후생적, 전사적 변화에 기인한 다양한 병리 현상과 임상적인 특징으로 인해 매우 복합적인 질병이다. 유전자와 단백질 발현 프로파일에 따라 유방암은 luminal A 타입, luminal B 타입, HER2 타입 그리고 삼중음성 유방암(triple negative breast cancer, TNBC)으로 분류할 수 있다. TNBC는 에스트로젠 수용체(estrogen receptor, ER), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor, PR), 그리고 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)의 발현이 모두 결핍되어 있는 종양으로 정의된다. TNBC는 침습 유방암(invasive breast cancer)의 약 10~20%를 차지하며, TNBC 환자의 치사율은 진단 후 5년 동안 증가한다.
Luminal A, B 그리고 HER2 타입의 유방암은 각각 호르몬 치료와 HER2 수용체 표적 치료를 적용할 수 있지만, TNBC는 치료의 표적이 되는 수용체(ER, PR, HER2)가 존재하지 않기 때문에 TNBC에서는 상기 요법의 치료 효과를 기대할 수 없다. TNBC의 진단과 치료용 바이오마커를 발굴하기 위한 전체 유전체 수준(genome-wide)의 선구적인 연구가 있었으나, 한국인들의 TNBC의 바이오마커 개발을 위한 포괄적인 연구는 아직도 이루어지지 않은 실정이다.
최근 들어, 기존의 전체 유전체 또는 전체 엑솜 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS)과 비교하여 비용 대비 효과 면에서 우수한 암 유전체(cancer genome)에 대한 표적 엑솜(exome) 부위를 분석하는 표적 엑솜 차세대 시퀀싱(targeted exome NGS) 분석 기술이 인간의 암의 임상 진단, 발암 기작 연구, 그리고 치료의 표적을 찾는 과정을 크게 발전시켰다. 표적 엑솜 NGS는 전체 엑솜과 비교하여 비교적 저가의 비용으로 표적 엑손 부위의 서열을 충분히 심층적으로 판독할 수 있기 때문에 보다 신뢰할 만한 돌연변이와 복제수(copy number)의 변이 분석을 수행하는데 매우 유리하다. 특히 HaloPlex 표적 농축 시스템은 exome의 표적 부위를 포획하는데 매우 효율적이기 때문에 표적 엑솜 NGS에 매우 유용함이 이미 알려져 있다.
이에 상기 기술을 활용하여 한국인에 적합한 유방암, 특히 TNBC의 진단과 치료를 위한 바이오마커의 발굴이 필요하다.
이에 본 발명자들은 유방암, 특히 삼중음성 유방암 환자의 예후를 진단할 수 있는 유전자 마커를 개발하기 위하여 암과 연관된 표적 유전자들에 대한 엑솜 시퀀싱(exome sequencing)을 실시하고, 다수 유전자의 결실(deletion)과 유방암 환자의 생존율과 밀접한 관계가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은
유방암의 예후의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
(a) 피검체의 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 시료에서 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
(c) 상기 추출된 유전체 DNA에서 유전자 결실 여부를 확인하는 단계; 및
(d) 유전체 DNA에서 유전자의 결실이 확인된 피검체를 유방암의 예후가 나쁜 것으로 판단하는 단계를 포함하는 유방암 환자의 예후의 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
유전자의 결실을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
유전자의 결실을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물을 유효성분으로 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
유방암의 예후의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
(a) 피검체의 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 시료에서 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
(c) 상기 추출된 유전체 DNA에서 유전자 결실 여부를 확인하는 단계; 및
(d) 유전체 DNA에서 유전자의 결실이 확인된 피검체를 유방암의 예후가 나쁜 것으로 판단하는 단계를 포함하는 유방암 환자의 예후의 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
유전자의 결실을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
유전자의 결실을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물을 유효성분으로 포함하는 키트를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 유방암의 예후의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
(a) 피검체의 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 시료에서 유전체 DNA ( genomic DNA )를 추출하는 단계;
(c) 상기 추출된 유전체 DNA 에서 유전자 결실 여부를 확인하는 단계; 및
(d) 유전체 DNA 에서 유전자의 결실이 확인된 피검체를 유방암의 예후가 나쁜 것으로 판단하는 단계를 포함하는 유방암 환자의 예후의 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 방법에 따른 유방암 환자의 예후의 마커를 검출하는 방법은 삼중음성 유방암(triple negative breast cancer, TNBC) 환자에게 적용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에서 ‘삼중음성 유방암(triple negative breast cancer, TNBC)'은 유방암을 호르몬 수용체와 HER2의 발현 여부에 따라 분류한 4가지 분자적 유형 중, 유방암 조직에서 호르몬 수용체인 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)와 프로게스테론 수용체(progesteron receptor, PR) 그리고 HER2(human epidermal growth factor receptor2)가 발현되지 않는 유방암을 의미한다. TNBC는 다른 암들과 함께 'basal-type'으로 분류되기도 하지만, 뚜렷한 분류 기준이 있는 것은 아니다. Basal-type cancer는 cytokeratin 5/6과 내피세포 증식인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR) 염색 여부로 정의되지만 이 또한 기준이 확립되어 있지는 않으며, 약 75%의 basal-type breast cancer가 TNBC일 것으로 추정된다(Hudis CA et al., Oncologist, Suppl 1:1-11, 2011).
본 발명의 방법에 따라 유방암의 예후를 판단하기 위하여 유전자 결실 여부를 확인하는 유전자는 구체적으로는 WRN, PTPRD, ATM, GNAQ, KIT, TCF4, CHUK, CTNNA1, EPHA5, TCF12, LIFR, PDGFRA, PLCG2, BUB1B, MLL2, 및 RPS6KA2로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것이다. 상기 유전자 중 하나를 선택할 수도 있고, 둘 이상의 유전자를 선택하여 조합하여 그 결실 여부를 유방암 예후 예측에 이용할 수도 있다.
본 발명에서 'WRN' 유전자는 Werner syndrome ATP-dependent helicase, DNA helicase, RecQ-like type 3 또는 RECQ3, RECQL2, RECQL3 등의 약어로 불리는 RecQ Helicase 패밀리에 속하는 helicase 효소 단백질을 암호화한다. 인간의 8번 염색체 상에 8p12에 위치하며 약 37개의 엑손으로 구성되어 있다. WRN 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 Genbank accession no. NC_000008.11(31033262~31173761bp), 그리고 WRN 유전자의 mRNA는 NM_000553.4(5765bp) 등으로 공지되어 있다.
본 발명에서 'PTPRD' 유전자는 receptor-type tyrosine-protein phosphatase delta, protein tyrosine phosphatase, receptor type D, 그리고 HPTP, PTPD, HPTPD, HPTPDELTA, RPTPDELTA 등의 약어로 불리는 탈인산화효소를 암호화한다. 인간의 9번 염색체 상에 9p23-p24.3에 위치하며, 약 49개의 엑손으로 구성되어 있다. PTPRD 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000009.12(8314246~10612723bp), 그리고 mRNA는 NM_001040712.2(8257bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 'ATM' 유전자는 Ataxia telangiectasia mutated의 약어로서, AT1, ATA, ATC, ATD, ATE, ATDC, TEL1, TELO1 등으로 불리기도 하는, DNA double strand break(DSB)에 의하여 활성화되는 serine/threonine kinase를 암호화한다. DNA에 DSB 손상이 일어나면 p53, CHK2, BRCA1 등과 같은 DNA damage에 관련된 주요 단백질을 인산화하여 세포 주기가 정지되고, DNA 복구(repair) 또는 세포사멸(apoptosis)가 일어나도록 하는 역할을 한다. 인간에서 ATM 유전자는 11번 염색체 상(11q22-q23; 108.22~108.37Mb)에 위치하고 있으며, ATM 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 Genbank accession no. NC_000011.10(108222500~108369102bp)으로, ATM 유전자의 mRNA는 Genbank accession no. NM_000051.3(13147bp) 등으로 공지되어 있다. ATM 유전자는 63여 개의 엑손(exon)으로 이루어져 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 'GNAQ' 유전자는 guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha, G protein subunit alpha q, 그리고 GAQ, SWS, CMC1, G-ALPHA-q 등으로 불리는 Gq alpha subunit 단백질을 암호화한다. 인간에서 GNAQ 유전자는 9번 염색체 상에 9q21 위치하며, 약 7개 엑손으로 이루어져 있다. GNAQ 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000009.12(77716274~78031449bp)으로, GNAQ 유전자의 mRNA는 NM_002072.4(6343bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 'KIT' 유전자는 KIT proto-oncogene receptor tyrosine kinase, mast/stem cell growth factor receptor(SCFR), proto-oncogene c-Kit or tyrosine-protein kinase Kit, 그리고 PBT, C-Kit, CD117 등으로 불리는 receptor tyrosine kinase 단백질을 암호화하며, KIT 단백질에는 다양한 아형(isoform)이 존재한다. 인간에서 KIT 유전자는 4번 염색체 상에 4q12에 위치하며, 약 21개의 엑손으로 구성되어 있다. KIT 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000004.12(54657928~54740715bp), 그리고 mRNA는 NM_000222.2(5190bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 ‘TCF4’유전자는 transcription factor 4(TCF-4), immunoglobulin transcription factor 2(ITF-2), 그리고 E2-2, ITF2, PTHS, SEF2, FECD3, ITF-2, SEF-2, TCF-4, SEF2-1, SEF2-1A, SEF2-1B, SEF2-1D, bHLHb19 등으로 불리는 전사인자를 암호화한다. 인간에서는 18번 염색체 상에 18q21.1에 위치하며, 약 34개의 엑손으로 구성되어 있다. TCF4 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000018.10(55222331~55635993bp), 그리고 mRNA는 NM_001083962.1(8332bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 ‘CHUK’ 유전자는 inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit alpha(IKK-α), conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase, 그리고 IKK1, IKKA, IKBKA, TCF16, NFKBIKA, IKK-alpha 등으로 불리는 단백질 인산화효소를 암호화한다. 인간에서는 10번 염색체 상에 10q24-q25에 위치하며, 약 23개의 엑손으로 구성되어 있다. CHUK 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000010.11(100186113~100229610bp), mRNA는 NM_001278.4(3628bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 ‘CTNNA1’ 유전자는 αE-catenin, catenin alpha-1, 그리고 MDPT2, CAP102 등으로도 알려져 있는, 심장 근육에서 액틴 섬유를 근초(sarcolemma)에 고정시키는 역할을 하는 단백질을 암호화한다. 인간에서는 5번 염색체 상에 5q31.2에 위치해 있으며, 약 22개의 엑손으로 구성되어 있다. CTNNA1 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000005.10(138753396~138935034bp), 그리고 mRNA의 염기서열은 NM_001290307.2(3872bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 ‘EPHA5’ 유전자는 EPH receptor A5, ephrin type-A receptor 5, 그리고 EK7, CEK7, EHK1, HEK7, EHK-1, TYRO4 등으로 알려진 ephrin receptor subfamily에 속하는 단백질을 암호화한다. 인간에서는 4번 염색체 상 4q13.1에 위치하며 약 21개의 엑손으로 구성되어 있다. EPHA5 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000004.12(65319563~65670495bp), 그리고 mRNA의 염기서열은 NM_001281765.2(8438bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 ‘TCF12’ 유전자는 transcription factor 12, 그리고 HEB, CRS3, HTF4, TCF-12, bHLHb20, HsT17266 등으로 알려진 전사인자를 암호화한다. 인간에서는 15번 염색체 상에 15q21에 위치하며, 약 25개의 엑손으로 구성되어 있다. TCF12 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000015.10(56918289~57291129bp)에, 그리고 mRNA의 염기서열은 NM_001306219.2(4076bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 ‘LIFR’ 유전자는 leukemia inhibitory factor receptor, leukemia inhibitory factor receptor alpha, 그리고 SWS, SJS2, STWS, CD118, LIF-R 등으로도 알려진 LIF 수용체의 subunit을 암호화한다. 인간에서는 5번 염색체 상에 5p13-p12에 위치하며, 약 24개 엑손으로 구성되어 있다. LIFR 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000005.10(38474963~38595405bp)에, 그리고 mRNA 염기서열은 NM_001127671.1(10258bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 ‘PDGFRA’유전자는 platelet-derived growth factor receptor, alpha, 그리고 GAS9, CD140A, PDGFR2, PDGFR-2, RHEPDGFRA 등으로 알려진 receptor tyrosine kinase 단백질을 암호화한다. 인간에서는 4번 염색체 상에 4q12에 위치하며 약 28개의 엑손으로 구성되어 있다. PDGFRA 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000004.12(54229097~54298245bp), 그리고 mRNA 서열은 NM_006206.4(6574bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 ‘PLCG2’ 유전자는 1-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-2, phospholipase C gamma 2, 그리고 FCAS3, APLAID, PLC-IV, PLC-gamma-2 등으로 알려진 phospholipase 단백질을 암호화한다. 인간에서는 16번 염색체 상에 16q24.1에 위치하며 약 25개의 엑손으로 구성되어 있다. PLCG2 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000016.10 (81779258~81962693bp), 그리고 mRNA의 염기서열은 NM_002661.4(8707bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 ‘BUB1B’ 유전자는 mitotic checkpoint serine/threonine-protein kinase BUB1 beta, BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase B, 그리고 MVA1, SSK1, BUBR1, Bub1A, MAD3L, hBUBR1, BUB1beta 등으로 알려져 있는 인산화효소 단백질을 암호호한다. 인간에서는 15번 염색체 상 15q15에 위치하며, 약 23개의 엑손으로 구성되어 있다. BUB1B 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000015.10(40161009~40221136bp), 그리고 mRNA의 염기서열은 NM_001211.5(3749bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 ‘MLL2’ 유전자는 histone-lysine N-methyltransferase 2D (KMT2D), myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia protein 2, lysine methyltransferase 2D, 그리고 ALR, KMS, MLL4, AAD10, KABUK1, TNRC21, CAGL114 등으로 알려진 histone methyltransferase 효소 단백질을 암호화한다. 인간에서는 12번 염색체 상 12q13.12에 위치하며, 약 56개 엑손으로 구성되어 있다. MLL2 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000012.12 (49018975~49061895bp), 그리고 mRNA의 염기서열은 NM_003482.3(19432bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명에서 ‘RPS6KA2’ 유전자는 ribosomal protein S6 kinase alpha-2, ribosomal protein S6 kinase A2, 그리고 RSK, HU-2, RSK3, p90RSK2, p90-RSK3, pp90RSK3, MAPKAPK1C, S6K-alpha, S6K-alpha2 등으로 알려진 RSK family의 serine threonin kinase를 암호화한다. 인간에서는 6번 염색체 상 6q27 위치에 26개 엑손으로 구성되어 있다. RPS6KA2 유전자가 위치한 genomic DNA의 염기서열은 NC_000006.12(166409366~166862550bp)에, 그리고 mRNA 염기서열은 NM_001006932.2(6018bp) 등의 Genbank accession no.로 공지되어 있다.
본 발명자들이 규명한 바에 따르면, 상기 서술된 유전자의 결실 여부는 유방암, 특히 TNBC 유방암의 예후와 밀접한 상관관계가 있다. 본 발명의 일실시예에서는 유방암 환자의 예후 판단과 치료에 유용한 유전자 마커를 발굴하기 위하여, TNBC 환자에서 수득한 시료를 이용하여 표적으로 선별한 유전자에 대하여 엑솜 시퀀싱(targeted exome sequencing)을 실시하였다. 70여명의 한국인 TNBC 환자의 유방암 조직과 정상 조직에서 채취한 시료에서 추출된 유전체 DNA(genomic DNA)에 대하여 엑솜 시퀀싱을 실시한 결과, 유방암 조직에서 WRN, PTPRD, ATM, GNAQ, KIT, TCF4, CHUK, CTNNA1, EPHA5, TCF12, LIFR, PDGFRA, PLCG2, BUB1B, MLL2, 및 RPS6KA2 유전자에서 결실이 발견되었다.
본 발명의 다른 일실시예의 분석에 따르면 상기 유전자의 결실과 TNBC 유방암 환자의 생존률은 밀접하게 연관되어 있다. 상기 유전자에 동형 결실(homozygous deletion)이 존재하는 TNBC 환자의 경우, 그렇지 않은 환자와 비교하여 재발(reccurence), 원격 전이(distant metastasis)의 확률이 높고, 무병 생존율(disease free survival, DFS)과 무원격전이 생존율(distant metastasis free survival, DMFS)이 현저하게 낮은 것으로 관찰되었다. 또한 카플란-마이어 생존 곡선 분석에서도 유전자의 동형 결실을 갖는 환자의 생존 기간이 짧은 것으로 나타나, 상기 유전자의 동형 결실과 TNBC의 예후가 역상관관계에 있음을 확인하였다.
따라서 통상의 기술자는 본 발명자들이 규명한 유전자의 결실과 TNBC 예후 사이의 상관관계를 이용하여 유방암, 특히 TNBC의 예후 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있음을 이해할 수 있다.
본 발명에서 ‘예후(prognosis)’는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 암 환자에 있어서 예후는 통상적으로 암 재발 또는 외과적 시술 후 일정기간 내의 전이 여부 또는 생존기간을 뜻한다. 예후의 예측(또는 예후의 진단)은 특히 초기 유방암 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 유방암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다. 예후 예측은 질환 치료제에 대한 환자의 반응, 치료 경과에 대한 예측도 포함된다.
본 발명에서 유방암, 보다 구체적으로는 TNBC의 예후를 판단하기 위한 마커로서 유전자의 결실(deletion)은 유전자에서 단백질을 암호화하는 부분인 엑손(exon)의 결실인 것이 바람직하다. 유전자의 결실은 해당 유전자를 구성하는 엑손의 하나 또는 그 이상의 엑손에서 발생한 것일 수 있으며, 결실의 크기에는 길이의 제한이 없다. 하나 이상의 엑손이 전부 결실된 것일 수도 있다. 예를 들어, ATM 유전자의 결실은 63개의 엑손 중 하나 또는 하나 이상의 exon에서 발생할 수 있다. 또한 보다 정확한 예후 판단을 위해서는 상기 유전자 결실은 해당 유전자의 대립 형질에 모두 결실이 존재하는 ATM 유전자의 동형 결실(homozygous deletion)인 것이 바람직하다.
유전자의 결실 여부를 판단하기 위한 시료는 구체적으로는 유방암 조직에서 채취하게 된다. 유방암 조직에서의 genomic DNA의 변이를 확인하기 위하여 동일한 피검체에서 유방암 조직에 대응되는 부위 또는 유방암 조직 주변의 암이 아닌 정상 조직을 추가적으로 채취할 수도 있다. 상기 시료에서 genomic DNA를 추출분리하고, 유전자 결실을 분석하는데 큰 제한을 주는 것이 아니라면, 보관 또는 다른 분석, 예를 들어, 면역조직화학적 염색을 위한 전처리를 한 것일 수도 있다. genomic DNA 분석을 위해서는 시료는 채취한 지 얼마 안 된 것(fresh sample) 또는 급속냉동한 것(frozen sample)이 바람직하지만, 포르말린으로 고정하고 파라핀에 포매(FFPE, formalin-fixed paraffin-embedded)한 조직을 시료로 할 수도 있다.
상기 유방암 환자에서 채취한 유방암 조직의 시료에서 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2 유전자의 발현의 부재를 확인하는 단계를 실시하여 유방암 중에서도 TNBC를 추가적으로 확진할 수 있다. 이 때 유전자의 발현의 부재는 공지의 방법을 이용하여 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 부존재를 확인하게 된다.
상기 유전자 결실 여부는 유전체 DNA(genomic DNA, gDNA)에서 특정 유전자의 작은 삽입 또는 결실(INDEL)을 감지하기 위하여 통상적으로 사용되는 방법이라면 제한 없이 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 또한 유전자의 결실 부위가 큰 경우에는 복제수 변이(copy number variation, CNV)를 야기할 수도 있으므로, 복제수 변이를 감지하는 방법을 이용하여 유전자 결실 여부를 확인하는 것도 가능하다. 구체적으로는 시퀀싱에 기반한 방법인 직접적 시퀀싱(direct sequencing), 차세대 시퀀싱(next generation sequencing), 표적 엑솜 시퀀싱(targeted exome sequencing), 시퀀싱 read depth 방법, 전체 유전체 염기서열 정렬(whole genome sequence assembly); 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 기반한 방법인 정량적 중합효소연쇄반응(quantitative PCR), multiplex amplifiable probe hybridization(MAPH), multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA), paralogue ratio test(PRT); DNA array에 기반한 방법인 array comparative genomic hybridization(array CGH), SNP microarray; 혼성화(hybridization)에 기반한 방법인 fiber FISH, southern blotting 및 pulsed field gel electrophoresis(PFGE) 등에서 적절하게 선택하여 본 발명에 따른 마커를 검출하는 방법을 실시할 수 있다. 이들 방법에 대한 보다 구체적인 내용은 문헌(Cantsilieris S et al., Genomics, 101(2):86-93, 2013)을 참고로 할 수 있다.
통상의 기술자는 상기 방법을 실시함에 있어서, 특정 유전자의 결실을 확인하기 위하여 필요한 프라이머 또는 프로브는 공지되어 있는 해당 유전자와 유전자 주위의 gDNA의 염기서열 정보를 이용하여 공지의 방법에 따라 gDNA 상의 적절한 위치와 염기서열의 조성을 선택할 수 있다.
또한 본 발명은
유전자의 결실을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상기 유방암 환자의 예후 예측용 조성물은 삼중음성 유방암(TNBC) 환자의 예후를 판단하기 위하여 적용되는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 유방암 환자의 예후 예측용 조성물에 의하여 유전자 결실 여부를 확인하는 유전자는 구체적으로는 WRN, PTPRD, ATM, GNAQ, KIT, TCF4, CHUK, CTNNA1, EPHA5, TCF12, LIFR, PDGFRA, PLCG2, BUB1B, MLL2, 및 RPS6KA2로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 상기 유전자 중 하나에서 유전자 결실을 확인하는 것일 수도 있고, 둘 이상의 유전자의 조합에서 유전자 결실을 확인하는 것일 수도 있다.
상기 조성물은 구체적으로 특정한 유전자의 결실을 확인하기 위한 방법을 실시하기 위하여 필요한 제제를 포함한다. 유전자의 결실을 확인하기 위한 방법은 시퀀싱, PCR, 혼성화, array 등 다양한 기술에 기반한 것일 수 있으며, 앞서 서술한 바와 같다. 특정 유전자의 결실을 확인할 수 있는 제제는 구체적으로는 해당 유전자 특이적인 프라이머의 쌍 또는 프로브일 수 있다. 이들 프라이머 또는 프로브는 형광, 방사성 동위원소 등으로 표지된 것일 수 있다.
또한 본 발명은
유전자의 결실을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물을 유효성분으로 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트는 상기 설명한 유전자의 결실을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물을 유효성분으로 포함한다. 또한 유전자 결실 여부를 확인하는 데 필요한 기타 구성요소들, 예를 들어 유전자 결실을 확인하기 위한 실험 방법을 수행하는 데 필요한 버퍼, 조효소, 효소 기질, 양성 대조군 DNA 등을 추가로 포함한다. 상기 키트는 피검체의 시료로부터 추출된 유전체 DNA로부터 유전자 결실 여부를 유방암 예후의 마커로 검출하는 구성 단위가 된다.
따라서, 본 발명은 유방암의 예후의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체의 시료를 수득하는 단계; 상기 시료에서 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; 상기 추출된 유전체 DNA에서 유전자 결실 여부를 확인하는 단계; 및 유전체 DNA에 유전자의 결실이 확인된 피검체를 유방암의 예후가 나쁜 것으로 판단하는 단계를 포함하는 유방암 환자의 예후의 마커를 검출하는 방법, 유전자의 결실을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물, 그리고 이를 유효성분으로 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명자들이 규명한 바와 같이 삼중음성 유방암 조직에서 다수의 특정 유전자의 결실과 유방암 환자의 예후 사이에 밀접한 상관관계가 있으므로, 해당 유전자의 결실 여부를 확인함으로써 유방암, 특히 삼중음성 유방암의 치료와 예후의 판단에 유용한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 표적 엑솜 시퀀싱 분석 대상인 70명의 한국인 삼중음성 유방암 환자의 임상병리적 특징과 유방암의 예후(DFS, 무병 생존율; DMFS, 무원격전이 생존율)의 상관관계를 나타낸다.
도 2는 엑솜 시퀀싱으로 확인된 WRN(도 2의 A), ATM(도 2의 B), BRCA1(도 2의 C), BRCA2(도 2의 D) 유전자 결실을 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)로 확인한 결과를 나타낸다. TNBC로 시작하는 일련번호는 NGS로 결실이 확인된 분석 대상 환자를 나타내며, N은 환자의 정상 조직(normal), T는 환자의 암 조직(tumor)을 의미한다.
도 3은 70명의 한국인 삼중음성 유방암 환자에서 확인된 유전자 결실과 예후 간 연관성에 대한 위험율(hazard ratio) 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 유전자의 동형 결실 돌연변이와 삼중음성 유방암 환자의 예후 사이의 상관관계를 DFS(도 4의 A)와 DMFS(도 4의 B)를 통해 분석한 결과를 나타낸다. HR, 위험율(hazard ratio); CI, 신뢰구간(confidence interval).
도 5는 삼중음성 유방암 환자의 생존 확률과 유전자의 동형 결실 돌연변이의 상관관계를 나타내는 카플란-마이어 생존 분석도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법>
연구윤리
한국인 유방암 환자 중 TNBC 환자의 암 유전체를 분석하기 위한 본 연구 계획은 삼성의료원의 의학연구윤리심의위원회에서 검토하고 승인하였다. 본 연구에 참여한 모든 환자들은 서면 고지에 입각하여 조직을 기증하는 것에 동의하였다. 또한 본 연구는 인간 대상 의학연구에 대한 헬싱키 선언을 준수하여 진행되었다.
표적 유전자 선정
표적 유전자(target gene)는 생어 연구소(Sanger institute)의 암 유전자 컨센서스(cancer gene consensus)에서 고형암(solid tumor)과 육종(sarcoma)에 연관된 돌연변이가 보고된 유전자를 선정하였다(234 유전자). 혈액암 관련 유전자는 선정하지 않았다. 세포 성장과 인산화효소에 관련된 인자, 전사 인자도 포함되었다(135 유전자). 전체 368 유전자와 이들의 5,700여 개의 코딩 엑손(coding exon) 부위에 해당하는 총 961,497bp의 표적 부위를 분석하였다.
HaloPlex 표적 농축 기반 차세대 시퀀싱( NGS )
총 70명의 한국인 TNBC 환자의 종양 조직과 정상 조직은 삼성의료원에서 채취하였다. 환자의 시료는 액체 질소를 이용하여 급속냉동하거나, 포르말린으로 고정하고 파라핀에 내장하여(formalin fixed-paraffin embedded, FFPE) 조직학적 분석을 위한 조직 블록으로 만들었다. 유전체 DNA(genomic DNA)는 냉동 시료로부터 DNeasy Blood&Tissue kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 제조사 지침에 따라 추출하였다. DNA의 순도는 spectrophotometer로 흡광도를 측정하여 2.1≥ (260/280 ratio)≥1.8, (OD260/230)≥1.5의 기준에 맞는지 확인하였다. 유전체 DNA는 제한효소로 절단하고, 단일가닥으로 변성(denature)한 뒤, 분절된 표적 DNA를 바이오틴에 접합된 HaloPlex 프로브에 혼성화(hybridization)하고, 자성을 띤 스트렙타비딘 비드로 회수하였다. 프로브에 결합하고 원형화된 표적 DNA는 ligation시키고, 원형화된 표적 DNA만 PCR로 증폭하여 서열분석을 위한 표적을 농축한 뒤 Illumina HiSeq 2000으로 시퀀싱하였다.
면역조직학적 분석
FFPE 조직 샘플은 절단하고 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 병리학자가 검증하였다. TNBC 환자의 종양 조직 샘플을 estrogen receptor(ER), progesterone receptor(PR), human epidermal growth factor receptor 2(HER2)에 대하여 면역조직학적 염색하고, 염색된 조직은 병리학자가 검사하여 상기 수용체의 발현이 결핍되어 있음을 확인하였다.
단일염기변이와 짧은 삽입과 결실에 대한 바이오인포매틱스 분석
Paired-end sequence raw read는 정리하고 필터링 하여 양질(Phred Q score>20)의 선명한 리드를 도출하였다. Burrows-Wheeler Alignment(BWA 0.5.9), Genome Analysis Toolkit(GATK), Samtools을 이용하여 도출된 paired-end sequencing 리드를 인간의 reference genome hg19에 정렬하고, 단일염기변이(single nucleotide variant, SNV)와 짧은 삽입과 결실(INDEL)을 확인하였다. SNV와 INDEL의 분석은 dbSNP135, dbNSFP COSMIC, 1000 Genomes variants databases 그리고 소프트웨어 프로그램으로 SNPEff, SIFT, PolyPhen2, LRT, PhyloP, Mutation_Taster, Mutation_Assessor, FATHMM, GERP_NR을 이용하였다. 중복되지 않는 체세포 SNV와 INDEL을 선별하기 위해서 read allele frequency를 20% 보다 높게, 정렬된 리드(mapped read)의 절대적인 수는 15 이상, 그리고 SNV와 INDEL allele read count는 대응되는 정상 조직에서의 표적 유전자에 대해 0인 것으로 기준을 유지하였다. 이들 변이는 Interactive Genomic Viewer 프로그램과 NextGENe v2.3.1.(Soft genetics, Inc.)에서 시각화하여 확인하였다.
복제수 변이에 대한 바이오인포매틱스 분석
종양 조직과 정상 조직 간의 유전체 복제수 변이(copy number variation, CNV)는 NextGENe v2.3.1(Soft Genetics, Inc.) 소프트웨어로 분석하였는데, 전체 유전자 수준의 리드(read) 해당 범위(coverage)를 전체적으로 표준화(global normalization)한 후, 종양 조직과 대응되는 정상 조직의 표적 유전자 부위의 중간값 리드(median read)를 비교하였다. CNV는 종양 조직과 정상 조직 사이의 read coverage의 log2 비율로 판단하였다. Log2 비율의 수치가 1.5를 초과하는 CNV는 증폭 중인 상태(amplication status)인 것으로, log2 비율의 수치가 -1.2 미만인 경우 동형 결실 상태(homozygous loss status)인 것으로 하였다.
유전자 변이의 실험적 확인
NGS로 결실이 확인된 유전자 중 WRN, ATM, 그리고 BRCA1, BRCA2에 대하여 real-time qPCR을 이용하여 CNV를 검증하였다. TNBC 환자의 genomic DNA에 대하여 표 1에 기재된 primer를 이용하여 qPCR을 실시하고, 결과는 TERT를 지표 유전자(reference gene)으로 하여 ddCt 방법으로 정량화하였다. 분석 대상 환자의 정상 조직(normal)의 DNA copy 수와 암 조직(tumor)의 copy 수를 log2 ratio로 비교하여 1.2 이하인 경우를 homozygous deletion으로 분류하였다.
Figure 112016045511210-pat00001
<실시예 1>
유방암 환자 시료를 이용한 엑솜 시퀀싱
유방암 환자의 예후 판단과 치료를 위한 동반진단을 위한 유전자 마커를 발굴하기 위하여 표적으로 선별한 유전자에 대한 엑솜 시퀀싱(targeted exome sequencing)을 실시하였다.
TNBC 유방암으로 진단받은 70명의 한국인 환자에서 암 조직과 주변 정상조직을 채취하여 일부는 포르말린으로 고정하고 파라핀에 내장하여(formalin-fixed, paraffin-embeded, FFPE) 염색하고 조직학적으로 분석하여 삼중음성 유방암을 확인하였다. 분석에 포함된 환자의 기본적인 임상병리적 특징과 이들이 위험율에 미치는 영향은 도 1에 나타난 바와 같다. 나머지 시료는 급속냉동한 후, 엑솜 시퀀싱을 위한 유전체 DNA(genomic DNA, gDNA)를 추출하였다. 암 조직의 체세포 유전변이(somatic mutation)을 확인하기 위해 암 조직과 주변의 정상 조직을 동시에 분석하여 비교하는 방법을 진행하였다. 추출한 gDNA의 순도를 측정하여 소정의 기준을 만족하는 샘플만을 이용하여 이후 실험을 진행하였다(2.1≥(260/280 ratio)≥1.8; OD260/230≥1.5).
표적 엑솜 시퀀싱을 수행하기 위한 library는 Haloplex 표적 선별 패널을 사용하여 제작하였으며, 기존에 알려진 암 관련 유전자 234개와 세포 성장과 관련된 전사 인자 유전자 134개를 포함하는 총 368개 유전자 전체의 엑솜을 표적으로 하여 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS)을 수행하였다. gDNA를 변성시키고, 8종류의 제한효소로 절단한 뒤, 바이오틴이 부착된 프로브를 사용하여 표적 DNA를 원형화시켰다. 이렇게 원형화된 표적 DNA 조각들을 자기 스트렙타아비딘을 이용해 선별하고, PCR 반응으로 증폭하여 라이브러리를 제작한 뒤 HiSeq2000으로 염기서열을 분석하였다. 염기서열분석으로 도출된 리드(read) 중 Phred Q score가 21 이상인 리드를 Burrows-Wheeler Alignemt를 사용하여 인간 표준 게놈 hg19에 맵핑하고, Genome Analysis Toolkit와 Samtools를 사용하여 단일염기변이와 짧은 삽입-결실을 발굴하였다. 또한 NextGENe를 사용하여 유전자 복제수 변이를 발굴하였다.
그 결과, 중복 없는 292가지 체세포 변이(220종의 신규 돌연변이와 72종의 기존에 알려진 돌연변이)와 30 종류의 짧은 삽입-결실(INDEL; 7종의 신규한 삽입과 2종의 기존에 알려진 삽입; 11종의 신규한 결실과 10종의 기존에 알려진 결실)이 확인되었다. 구체적으로, WRN, PTPRD, ATM, GNAQ, KIT, TCF4, CHUK, CTNNA1, EPHA5, TCF12, LIFR, PDGFRA, PLCG2, BUB1B, MLL2, RPS6KA2, 그리고 유방암과 밀접하게 관련된 것으로 알려진 BRCA1, BRCA2 등의 유전자에서 결실(deletion)이 확인되었다. 이 중, ATM 유전자에서 결실이 발견된 엑손은 표 2에 기재한 바와 같다.
Figure 112016045511210-pat00002
나아가, 엑솜 시퀀싱으로 결실(deletion)이 확인된 상기 유전자 중 WRN과 ATM에 대하여 RT(real-time)-qPCR로 deletion 여부를 재확인하였다(도 2). 결실을 분석한 유전자의 엑손과 대상 환자는 표 3에 기재한 바와 같다. 엑솜 시퀀싱으로 결실이 확인된 환자에서 암 조직(tumor)와 정상 조직(normal)을 동시에 채취하여 암 조직에서의 해당 유전자 결실 여부를 확인하는 방법으로 분석하였다. 본 분석에 포함된 많은 TNBC 환자에서 선대로부터 유전된 germline mutation이 존재하는 것으로 확인된 BRCA1, BRCA2 유전자도 qPCR 분석에 포함하였다. 엑솜 시퀀싱으로 deletion이 확인된 TNBC 환자들의 genomic DNA는 deletion이 없는 TNBC 환자들의 genomic DNA와 비교하여 상대적으로 해당 유전자의 PCR product fold change가 낮아 복제수(copy number)가 감소한 것으로 확인되어 유전자에 결실이 존재하는 것으로 입증되었다.
Figure 112016045511210-pat00003
< 실시예 2>
유전자의 동형 결실과 유방암 환자의 생존률의 상관관계
표적 엑솜 시퀀싱 결과로 확인된 유전자의 결실(deletion) 돌연변이와 유방암 환자의 예후의 연관성을 확인하였다.
분석에 포함된 모든 삼중음성 유방암 환자에 대하여, WRN, PTPRD, ATM, GNAQ, KIT, TCF4, CHUK, CTNNA1, EPHA5, TCF12, LIFR, PDGFRA, PLCG2, BUB1B, MLL2, RPS6KA2 유전자의 동형 결실(homozygous deletion)과 비례적 위험율(proportional hazard ratio, HR)의 상관관계를 재발(recurrence), 원격 전이(distant metastasis) 등의 지표를 이용하여 분석하였다(도 3). 특히 WRN(recurrence, HR=5.283, p-value=0.011), PTPRD(recurrence, HR=4.114, p-value=0.011), BUB1B(distant metastasis, HR=9.062, p-value=0.011) 그리고 ATM(recurrence, HR=6.904, p-value=0.001; distant metastasis, HR=10.335, p-value=0.007) 등의 유전자에서 동형 결실과 재발, 원격 전이간 높은 상관관계가 관찰되었다.
또한 상기 유전자들에 대하여 유전자의 동형 결실이 무병 생존율(disease free survival, DFS)과 무원격전이 생존율(distant metastasis free survival, DMFS)과의 상관관계를 분석하였다(도 4). 그 결과, WRN, PTPRD, ATM, GNAQ, KIT, TCF4, CHUK, CTNNA1, EPHA5, TCF12, LIFR, PDGFRA, PLCG2, BUB1B, MLL2, RPS6KA2 등의 유전자의 동형 결실은 TNBC 환자의 생존률에 큰 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 카플란-마이어 생존 곡선의 분석에서도(도 5), ATM 유전자와 WRN 유전자에 대하여, 유전자가 결실되지 않은 환자보다 동형 결실을 가진 환자의 생존 기간이 짧은 것으로 나타나, 유방암의 예후가 좋지 않음을 확인하였다. 이상의 결과는 상기 유전자의 동형 결실과 삼중음성 유방암의 예후가 역상관관계에 있음을 보여주는 것이다.
이상 살펴본 바와 같이, 다수 유전자의 결실을 마커로 검출하기 위한 본 발명의 방법과 조성물은 유방암, 특히 삼중음성 유방암 환자의 예후를 판단하기 위한 마커를 개발하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
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Claims (15)

  1. 삼중음성 유방암(triple negative breast cancer)의 예후의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
    (a) 피검체의 시료를 수득하는 단계;
    (b) 상기 시료에서 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
    (c) 상기 추출된 유전체 DNA에서 WRN, PTPRD, ATM, GNAQ, KIT, TCF4, CHUK, EPHA5, TCF12, LIFR, PDGFRA, PLCG2, BUB1B, MLL2, 및 RPS6KA2로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 동형 결실(homozygous deletion) 여부를 확인하는 단계; 및
    (d) 유전체 DNA에서 유전자의 결실이 확인된 피검체를 유방암의 예후가 나쁜 것으로 판단하는 단계를 포함하는 유방암 환자의 예후의 마커를 검출하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 유전자 결실 여부는 직접적 시퀀싱(direct sequencing), 차세대 시퀀싱(next generation sequencing), 표적 엑솜 시퀀싱(targeted exome sequencing), 시퀀싱 read depth 방법, 전체 유전체 염기서열 정렬(whole genome sequence assembly), 정량적 중합효소연쇄반응(quantitative PCR), multiplex amplifiable probe hybridization(MAPH), multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA), paralogue ratio test(PRT), array comparative genomic hybridization(array CGH), SNP microarray, fiber FISH, southern blotting 및 pulsed field gel electrophoresis(PFGE)로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 피검체의 시료는 유방암 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 삼중음성 유방암은 피검체의 유방암 조직에서 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2 유전자의 발현의 부재를 확인함으로써 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유전자의 발현의 부재는 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 부존재로 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 피검체의 시료는 동일한 피검체에서 수득한 정상적인 조직을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 정상적인 조직 시료에서는 유전자 결실이 부재한 것을 특징으로 하는 방법.
  11. WRN, PTPRD, ATM, GNAQ, KIT, TCF4, CHUK, EPHA5, TCF12, LIFR, PDGFRA, PLCG2, BUB1B, MLL2, 및 RPS6KA2로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자의 동형 결실(homozygous deletion)을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 삼중음성 유방암(triple negative breast cancer) 환자의 예후 예측용 조성물.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서, 상기 제제는 프로브 또는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 삭제
  15. 제11항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 키트.
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