CN114410785B - hsa_circ_0003045作为乳腺癌诊断和/或预后标志物的应用 - Google Patents
hsa_circ_0003045作为乳腺癌诊断和/或预后标志物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及hsa_circ_0003045作为乳腺癌诊断和/或预后标志物的应用。乳腺癌对女性健康构成了重要威胁,该疾病耐药、转移和复发的频率较高,晚期乳腺癌患者预后状况不佳,提供一种早期诊断标志物对避免乳腺癌的不良预后具有重要意义。本发明提供了hsa_circ_0003045作为乳腺癌诊断和/或预后标志物的应用,该标志物在病灶组织和癌旁组织中表达量具有明显的差异,并且与乳腺癌的不良预后相关,对于乳腺癌的临床诊断及不良预后防治具有重要的检测价值。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤标志物技术领域,具体涉及hsa_circ_0003045作为乳腺癌诊断和/或预后标志物的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。美国最新的癌症统计结果显示,女性乳腺癌已超过肺癌成为最常见的恶性肿瘤。尽管肺癌是癌症死亡的主要原因,但世界范围内乳腺癌的发病率和死亡率仍处于较高水平。目前,新辅助化疗联合局部治疗(手术或放疗)和术后全身化疗已成为公认的治疗乳腺癌的策略。由于耐药、转移和复发的频率较高,乳腺癌患者的预后没有得到明显改善。尽管I期确诊的乳腺癌患者5年生存率为100%,但IV期确诊的乳腺癌患者的5年生存率却大幅下降到26%。因此利用生物标志物进行乳腺癌早期检测,非常重要和紧迫。
环状RNA(CircRNA)是一类新的内源性非编码RNA(NcRNAs)。与线性RNA不同,CircRNA形成共价闭合的连续环,既没有5‘帽结构,也没有3’多聚腺苷酸尾部,可抵抗RNA酶的降解,因此环状RNA比线性RNA更加稳定和保守。研究表明,CircRNAs具有组织/发育阶段特异性表达,在肿瘤进展中起着重要作用,并可作为某些疾病的生物标志物。
发明内容
为了获取具有良好诊断及预后意义的标志物,在该筛选过程中,本发明基于ROC曲线分析证实,hsa_circ_0003045在乳腺癌组织中明显下调,可以较好地区分乳腺癌组织及其癌旁组织,曲线下面积为0.6997,敏感性为61.96%,特异性78.53%。所述CircRNA的低表达与乳腺癌较大的直径、PR低表达、HER-2阳性、Ki-67高表达及组织学分级、non-luminal分型呈正相关。基于上述研究可以推断,该CircRNA可以有效地区别乳腺癌病变组织及正常组织,可作为一种诊断及预后标志物在临床加以应用。
基于上述研究成果,本发明提供以下技术方案:
本发明第一方面,提供hsa_circ_0003045作为乳腺癌诊断和/或预后标志物的应用。
上述第一方面所述应用包括但不限于以下任意一种方式:
(1)通过对患者检测样本中hsa_circ_0003045的表达含量进行检测,从而确认该患者是否为乳腺癌患者;
(2)通过对乳腺癌患者检测样本中hsa_circ_0003045的表达含量进行检测,从而评估患者的预后情况;
(3)hsa_circ_0003045的检测试剂作为制备乳腺癌诊断和/或预后检测试剂的应用。
上述第一方面的应用中,所述诊断标志物的检测样本为患者的临床生物样本,包括但不限于血清(血浆)、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、组织、器官、石蜡切片中的一种或几种等。本发明验证可行的一种方式中,所述检测样本为患者的病灶组织样本或疑似病灶组织样本。
根据本发明研究结果,在乳腺癌患者的病灶样本中,上述hsa_circ_0003045的表达含量低于癌旁组织,并且其表达含量的降低与乳腺癌细胞的增殖活性、提示预后不良的病理参数呈正相关。因此,上述各个方面的应用中,检测样本中hsa_circ_0003045含量降低意味着有更大的可能患者患有乳腺癌,或乳腺癌具有不良的预后情形。
本发明第二方面,提供一种用于乳腺癌诊断和/或预后检测的试剂组合,所述试剂组合用于检测样本中hsa_circ_0003045的表达含量。
上述第二方面所述试剂组合的种类依据所述circRNA的检测方法确定,本领域可行的检测方式如PCR方法或Northern Blotting。本发明提供的一种效果较好的实施方式中,提供一种适用于PCR方法检测hsa_circ_0003045的诊断试剂盒,所述诊断试剂盒至少包括如下诊断试剂:
(1)引物;
(2)样本组织裂解试剂;
(3)PCR反应体系。
进一步的,所述引物包括待测circRNA引物,还包括内参标志物的引物;具体的实例中,所述circRNA引物序列如下:
Forward:CCAACTCCTTCGGTCTTTGA(SEQ ID NO.1)
Reverse:TGATGTCCACGGAAGGGT(SEQ ID NO.2);
所述内参标志物的引物序列如下:
Forward:GGCCTCCAAGGAGTAAGACC(SEQ ID NO.3)
Reverse:AGGGGAGATTCAGTGTGGTG(SEQ ID NO.4)。
进一步的,所述样本组织裂解试剂包括但不限于TRIZOL试剂、异丙醇、乙醇、缓冲试剂。
本发明第三方面,提供一种用于乳腺癌诊断和/或预后判断试剂盒,所述试剂盒中包括第二方面所述的试剂组合。
本发明第四方面,提供一种乳腺癌患者预后情况判断方法,所述判断方法包括检测患者病灶组织中hsa_circ_0003045的含量。
上述判断方法中,所述hsa_circ_0003045的含量可通过第三方面所述试剂盒进行检测,若患者病灶组织中hsa_circ_0003045的含量低于对照组,则表明患者乳腺癌发展具有较大的转移或恶化风险。所述hsa_circ_0003045的cutoff值是本领域技术人员根据试剂盒、表达量计算方法、样本等因素可以常规确定的技术内容。
以上一个或多个技术方案的有益效果是:
本发明的一个方案中提供了hsa_circ_0003045作为乳腺癌诊断和预后判断标志物的应用,与癌旁组织相比,上述标志物具有良好的检测特异性,对于乳腺癌的诊断及预后判断具有重要的临床应用价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述hsa_circ_0003045在乳腺癌组织与癌旁组织的qRT-PCR数据比对结果;
图2为实施例1中所述hsa_circ_0003045的ROC曲线分析结果。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
(1)临床样本
2016年6月27日至2021年7月8日,于山东大学齐鲁医院招募了163名乳腺癌患者。所有患者和对照组均为汉族女性。
收集163名乳腺癌患者的癌及癌旁组织,并将新鲜的组织样品立即储存在液氮中直至进一步分析。所有乳腺癌及癌旁组织均在手术中获取。所有参与者均获得书面知情同意书。本研究经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准。
(2)RNA提取(TRIZOL法)
1)将30-50mg储存于液氮中的组织标本取出后迅速转移到EP管中,加入Trizol试剂700μl,用组织剪充分剪碎组织,直至成糊末状(无明显可见颗粒)。向上述裂解液中加入280ml的RNase-free ddH2O,上下颠倒混匀,室温静置5min,12,000rpm(4℃)离心15min。
2)取出离心管,此时溶液分成上层水相(含RNA)和深色的下层沉淀(含蛋白质、DNA、多糖等杂质),小心吸取上层水相至一个新的离心管中。
3)加入等体积异丙醇,上下颠倒混匀,静置10min。
4)12,000rpm(4℃)离心10min,通常可以看见白色沉淀,小心弃去上清。
5)向EP管中加入75%乙醇1000μl,轻弹管底,使沉淀悬浮,并上下颠倒数次。
6)8,000rpm(4℃)离心5min,弃去上清,在室温下晾干。注:不可过度干燥,否则RNA样品很难溶解。
7)向EP管中加入适量RNase-free ddH2O溶解沉淀,室温涡旋3min,使RNA沉淀充分溶解。
8)对RNA的浓度及纯度进行测量。先使用RNase-free ddH2O调零,再取溶解后的RNA 1μl,在微量分光光度计上检测RNA浓度并进行记录,OD260/OD280比值在1.8-2.2之间表明纯度较高。RNA不用时储存于-80℃冰箱。
(3)反转录RNA
1)RNA的变性
把RNA在65℃条件下进行5分钟后,立即放于冰上冷却。
2)配制反应液
3)逆转录反应
(4)实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)
1)融化并混匀各种PCR反应所需溶液,并置于冰上。
2)配制PCR反应体系
轻弹管底将溶液混合,5000rpm短暂离心。
3)加样:将9ul混合液加到PCR板对应的每个孔中。再加入对应的1μl cDNA。小心粘上Sealing Film封口膜,并短暂离心混合。在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。
4)将上述PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。所有的指标均按以下程序进行:95℃,60s;40个PCR循环(95℃,15s;60℃,15s;72℃,45s(收集荧光))。
5)融解曲线分析,GAPDH作为内参将circRNA表达进行标准化,并使用2-△Ct法计算。
表1 PCR反应涉及的引物序列
(5)统计分析
使用GraphPad Prism 5(San Diego,CA)和SPSS 23.0(SPSS,Chicago,IL,USA)进行统计学分析。Student t检验和卡方检验用于分析两组之间的差异。受试者工作特征曲线(ROC)分析用于确circRNA的诊断价值。P<0.05被认为具有统计学意义。
3、有益效果
3.1乳腺癌与其癌旁组织相比,hsa_circ_0003045表达显著下调
qRT-PCR数据显示,与癌旁组织相比,hsa_circ_0003045在乳腺癌患者组织中显著下调(图1,P<0.001)。
3.2差异表达的hsa_circ_0003045的诊断价值
使用ROC曲线分析并计算受试者工作特征曲线下面积(AUC)来检测差异表达的circRNA的诊断性能。结果显示,hsa_circ_0003045可鉴别乳腺癌和癌旁组织,AUC为0.6997(图2,P<0.001)。hsa_circ_0003045的敏感性和特异性分别为61.96%和78.53%。
3.3 hsa_circ_0003045表达水平预测乳腺癌预后。
卡方检验分析hsa_circ_0003045的表达水平与临床病理参数之间的关系(表2)。结果显示,hsa_circ_0003045的低表达与较大的肿瘤直径,较低的PR表达水平,HER-2阳性,non-luminal分型,较高的Ki-67表达水平以及较高的组织学分级相关。这些因素往往预示肿瘤恶性程度相对较高,患者预后较差。这提示hsa_circ_0003045的低表达可能提示患者预后不良。
表2 hsa_circ_0003045表达与乳腺癌患者临床病理特征的相关性。
1LNM:Lymph node metastasis,淋巴结转移*:P<0.05
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学齐鲁医院
<120> hsa_circ_0003045作为乳腺癌诊断和/或预后标志物的应用
<130> 2010
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccaactcctt cggtctttga 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgatgtccac ggaagggt 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggcctccaag gagtaagacc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aggggagatt cagtgtggtg 20
Claims (4)
1.检测hsa_circ_0003045的试剂组合在制备乳腺癌诊断和/或预后的产品中的应用;所述产品包括试剂盒;
所述试剂组合中至少包括如下试剂:
(1)引物;
(2)样本组织裂解试剂;
(3)PCR反应体系;
所述引物包括hsa_circ_0003045引物,还包括内参标志物的引物;所述hsa_circ_0003045引物序列如下:
Forward:CCAACTCCTTCGGTCTTTGA(SEQ ID NO.1)
Reverse:TGATGTCCACGGAAGGGT(SEQ ID NO.2);
所述内参标志物的引物序列如下:
Forward:GGCCTCCAAGGAGTAAGACC(SEQ ID NO.3)
Reverse: AGGGGAGATTCAGTGTGGTG(SEQ ID NO.4)。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,检测样本为患者的临床生物样本,包括血清、血浆、全血、分泌物、脓液、体液、组织、器官、石蜡切片中的一种或几种。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述检测样本为患者的病灶组织样本或疑似病灶组织样本。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述样本组织裂解试剂包括TRIZOL试剂、异丙醇、乙醇、缓冲试剂。
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