CN114921546B - circHIPK2作为乳腺癌生物标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种circHIPK2作为乳腺癌生物标志物的应用，属于生物医药技术领域。本发明公开了circHIPK2作为乳腺癌生物标志物在制备乳腺癌诊断试剂盒或诊断试剂中的应用，所述乳腺癌诊断试剂盒或诊断试剂包括检测circHIPK2的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物。本发明针对circHIPK2分子，在乳腺癌患者中完成对乳腺癌组织、血清等样本的检测分析，结果显示，临床检测circHIPK2分子的表达水平对于乳腺癌的早期筛查诊断、疗效监测及预后分析具有重要意义，从而提高了乳腺癌的临床诊疗水平，具有良好的经济和社会效益。

Description

circHIPK2作为乳腺癌生物标志物的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种circHIPK2作为乳腺癌生物标志物的应用。
背景技术
世界卫生组织下属的国际癌症研究机构(IARC)近日发布最新数据显示，女性乳腺癌超越肺癌，成为发病率最高的癌症恶性肿瘤。目前，虽然乳腺癌的治疗技术获得了一定的进步，但仍有很多患者治疗后出现复发与转移，直接影响患者预后。早发现、早诊断、早治疗，能够有效控制病情恶化，并为患者争取更多生存期。目前乳腺癌的诊断、疗效监测、复发转移预测与预后判断的有效手段包括组织病理和B超、X线、MRI等影像学检查以及乳腺癌肿瘤标志物等。长期以来，组织活检病理学检查常作为肿瘤诊断的金标准，但组织活检技术有一定的局限性，主要表现为：创伤性较大；有限穿刺针数无法展现肿瘤的全部异质性；组织活检报告结果的滞后性对患者的治疗不利。影像学检查因肿瘤需达到一定体积大小的时才可能被检测到，另外还有辐射等原因不能作为实时检测手段。血液肿瘤标志物检测具有操作简便、无创、便于动态监测等优点，但是目前已广泛应用的肿瘤标志物如CEA、CA-153、CA199、CA72-4、CA125、AFP等，由于其诊断的灵敏度和特异性相对较低，尚不能满足恶性肿瘤诊断、疗效监测与预后判断的需要。因此，寻找满足恶性肿瘤临床应用的新型非创伤性分子标志物尤为迫切。
近年来，miRNAs，lncRNAs，circRNAs等非编码RNAs分子在乳腺癌发生发展中的作用及其在诊断及预后中的应用价值备受关注。
环状RNA(CircRNA)是前体mRNA反向剪接过程中产生的一类不具有5'-3'末端和polyA尾的单链共价闭合环状分子，其不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解，具有调控基因转录、选择性剪切、结合miRNA和蛋白质、翻译多肽等作用，是参与肿瘤发生发展的关键调控因子。因而circRNAs等非编码RNAs分子有作为肿瘤诊断及预后的新型标志物的潜力。利用环状非编码RNAs寻找肿瘤诊断、治疗以及评价患者预后的分子标志物已成为肿瘤医学转化领域的重要发展方向。
因而针对以上阐述的现阶段肿瘤诊断方法的缺陷与circRNAs所有的诊断优势，本发明拟寻找在乳腺癌诊断、治疗及预后评价中具有重要价值的环状RNA作为乳腺癌的新型生物标志物。
发明内容
本发明的目的是提供一种circHIPK2作为乳腺癌生物标志物的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该生物标志物对于乳腺癌的早期筛查诊断、疗效监测及预后分析具有重要意义，能够提高乳腺癌的临床诊疗水平，具有良好的经济和社会效益。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供circHIPK2作为乳腺癌生物标志物在制备乳腺癌诊断试剂盒或诊断试剂中的应用。
本发明还提供circHIPK2作为乳腺癌生物标志物在制备乳腺癌预后评估试剂盒或预后评估试剂中的应用。
进一步地，所述乳腺癌诊断试剂盒或诊断试剂和所述乳腺癌预后评估试剂盒或预后评估试剂包括检测circHIPK2的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物。
进一步地，所述乳腺癌诊断的方法包括如下步骤：
(1)收集待测对象的血清或组织样本，并以健康人群的血清或组织样本为对照组；
(2)利用上述引物对检测待测对象和对照组样本中生物标志物的含量，并将所得结果进行比对；
(3)根据比对结果判断待测对象是否为乳腺癌患者；若待测对象样本中生物标志物含量高于对照组，则判断为乳腺癌。
进一步地，所述乳腺癌预后评估的方法包括如下步骤：
(1)收集预后乳腺癌患者的血清或组织样本为待测组，并以预前乳腺癌患者的血清或组织样本为对照组；
(2)利用上述引物对检测待测组和对照组样本中生物标志物的含量，并将所得结果进行比对；
(3)根据比对结果评估乳腺癌患者预后治疗效果；若待测组样本中生物标志物含量低于对照组，则判断待测组预后评估有治疗效果。
进一步地，采用qPCR荧光染料法检测待测样本中生物标记物含量。
进一步地，所述qPCR荧光染料法的PCR扩增反应体系包括以下组分：2×AceQ qPCRSYBR Green Master Mix 10μl，上下游引物浓度均为10μM，用量各0.4μl，cDNA模板3μl，ddH2O补足至20μl；PCR扩增反应程序为：95℃预变性10min；95℃10s，60℃30s；40个循环。
本发明还提供一种用于诊断和/或预后评估乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测circHIPK2的试剂。
进一步地，所述试剂包括扩增circHIPK2的引物对。
进一步地，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ IDNO：2所示的下游引物。
本发明公开了以下技术效果：
本发明针对circHIPK2分子，总计在1000余例乳腺癌患者中完成对乳腺癌组织、血清等样本的检测分析；并结合病人的临床病理资料，全面系统的研究了相关分子在乳腺癌诊断、治疗及预后评价中的价值。结果显示，临床检测circHIPK2分子的表达水平，对于乳腺癌的早期筛查诊断、疗效监测及预后分析具有重要意义，从而提高了乳腺癌的临床诊疗水平，取得了良好的经济和社会效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明检测各组组织、血清中circHIPK2表达水平的实验流程图；
图2为验证circHIPK2引物特异性结果，A：琼脂糖凝胶电泳图，B：实时定量PCR溶解曲线图；
图3为circHIPK2分子环状结构验证的测序分析结果；
图4为circHIPK2分子稳定性验证结果，A：琼脂糖凝胶电泳图，B：qPCR后circHIPK2分子表达水平统计图；C：qPCR后GAPDH表达水平统计图；
图5为背靠背反向设计原则验证的琼脂糖凝胶电泳图；
图6为乳腺癌组织和癌旁组织内circHIPK2表达水平差异统计图；
图7为各组血清中circHIPK2表达水平差异统计图；
图8为组织中circHIPK2诊断乳腺癌的ROC曲线图；
图9为血清中circHIPK2诊断乳腺癌的ROC曲线图；
图10为circHIPK2、CA153及circHIPK2联合CA153和CEA诊断乳腺癌的ROC曲线图；
图11为circHIPK2鉴别诊断乳腺良恶性肿瘤的ROC曲线图；
图12为血清circHIPK2监测乳腺癌手术疗效的ROC曲线图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
1实验设计
1.1临床标本收集
征得苏州大学附属第二医院伦理委员会批准，并经患者及家属同意，签署知情同意书后，选取经病理证实为原发性乳腺癌并接受手术切除的患者入组研究。女性乳腺癌病例入选标准：①全部标本的病理切片均经2位病理学专家验证为乳腺癌；②术前均未行放、化疗和其他抗肿瘤治疗；③无严重其他系统疾患。记录详细病历资料信息，包括年龄、肿瘤部位、大体类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期(临床病理分期采用2010年UICC/AJCC第7版TNM分期法)以及随访资料。收集乳腺癌组织及癌旁组织，乳腺癌患者纤维瘤、良性乳腺病患者及健康人血清标本。所有患者及健康人年龄与乳腺癌组相匹配。
1.2 circHIPK2引物设计及PCR产物测序验证
①引物的选择：从circBase网站(http://www.circbase.org)下载hsa_circ_0001756序列，分别截取circRNA 5’端和3’端各200bp碱基序列，将3’端200bp序列放到5’端200bp前面，组成400bp新序列片段。将新片段放入NCBI网站的primer-blast程序中运行，选择得分较高的circRNA引物。②引物特异性检测：采用设计的引物进行琼脂糖凝胶电泳及qPCR定量检测，对引物的特异性进行检测。③分子环状结构验证：为了进一步验证circHIPK2的环状结构，我们将circRNA特异性引物的PCR产物进行测序分析，看其是否包含circHIPK2的反向剪接位点。④circHIPK2稳定性验证：circRNA由于其环状结构，比mRNA更耐RNase R酶的消化，将细胞提取的总RNA经RNase R消化，接着逆转录及普通PCR后进行琼脂糖凝胶电泳，同时用cDNA作为对照进行qPCR测试。⑤背靠背反向设计原则验证：circRNA仅能从RNA的逆转录产物中扩增出来，而不能从基因组(gDNA)中扩增出来。于是我们用circHIPK2的特异性引物分别以乳腺癌细胞的cDNA和gDNA为模板，进行普通PCR扩增实验,再将其产物进行琼脂糖凝胶电泳。
1.3 circHIPK2在临床标本中的检测
①组织RNA提取：将组织剪成小块并研磨成单个细胞，采用TRIzol法裂解组织，提取RNA，检测RNA浓度和质量。②血清RNA提取：向300μL血清加入750μL TRIzolTM LSReagent(Invitrogen)，按照TRIzolTM LS Reagent试剂操作说明书提取血清内RNA，检测RNA浓度及质量。③逆转录：将提取好的组织RNA、血清RNA按照诺唯赞公司逆转录试剂盒说明书(R131-02)配制逆转录体系，在PCR仪上设置50℃15min，85℃5S，逆转录得到cDNA。④定量RT-PCR检测：按照诺唯赞公司定量PCR说明书(Q312-02)配制荧光定量PCR反应体系，采用SYBER GREEN荧光染料法检测乳腺癌组织及癌旁组织，乳腺癌患者血清、健康人及纤维腺瘤及乳腺病患者血清内circHIPK2表达水平，采用相对定量方法2-△△ct法分析比较不同组别之间circHIPK2的表达差异(具体实验流程见图1)。
1.4 circHIPK2诊断价值、临床意义及预后评估分析
①诊断效能：使用SPSS软件绘制乳腺癌患者癌与癌旁组织、乳腺癌、健康人、纤维腺瘤及乳腺病患者血清内circHIPK2的受试者工作曲线(ROC曲线)，确定其最佳临界值、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确率及诊断效能等指标，并与乳腺癌传统血清诊断标志物CA-153、CEA进行诊断效能的比较及联合诊断分析。②诊断特异性：分析比较乳腺癌患者、纤维瘤、良性乳腺病患者术前血清circHIPK2表达水平，评价其在乳腺癌鉴别诊断中的价值。③疗效监测：分析比较乳腺癌患者术前术后血清circHIPK2表达水平，评价其在乳腺癌手术疗效监测中的价值。⑤临床意义分析：收集临床病理资料，分析乳腺癌组织、血清内circHIPK2表达水平与临床病理特征如瘤体大小、分化程度、淋巴结转移、TNM分期等相关性，揭示circHIPK2的临床意义。
2实验数据分析及结果
2.1引物设计与验证
2.1.1 circHIPK2引物及内参引物序列，如下：
表1
Figure GDA0003755324050000081
Figure GDA0003755324050000091
2.1.2 circHIPK2引物特异性验证
如图2所示，琼脂糖凝胶电泳条带单一(图2A)，产物位置与引物设计时预测结果一致，实时定量PCR溶解曲线呈现单峰(图2B)，引物特异性符合要求。
2.1.3分子环状结构验证
如图3所示，测序结果包含其特异的反向剪接位点AG-GT，确定了circHIPK2是具有闭合环状结构的环状RNA分子。circHIPK2的核苷酸序列如下所示：
>hsa_circ_0001756(GenBank:NM_001113239)HIPK2
GTATGGCCTCACATGTGCAAGTTTTCTCCCCTCACACCCTTCAATCAAGTGCCTTCTGTAGTGTGAAGAAACTGAAAATAGAGCCGAGTTCCAACTGGGACATGACTGGGTACGGCTCCCACAGCAAAGTGTATAGCCAGAGCAAGAACATCCCCCTGTCGCAGCCAGCCACCACAACCGTCAGCACCTCCTTGCCGGTCCCAAACCCAAGCCTACCTTACGAGCAGACCATCGTCTTCCCAGGAAGCACCGGGCACATCGTGGTCACCTCAGCAAGCAGCACTTCTGTCACCGGGCAAGTCCTCGGCGGACCACACAACCTAATGCGTCGAAGCACTGTGAGCCTCCTTGATACCTACCAAAAATGTGGACTCAAGCGTAAGAGCGAGGAGATCGAGAACACAAGCAGCGTGCAGATCATCGAGGAGCATCCACCCATGATTCAGAATAATGCAAGCGGGGCCACTGTCGCCACTGCCACCACGTCTACTGCCACCTCCAAAAACAGCGGCTCCAACAGCGAGGGCGACTATCAGCTGGTGCAGCATGAGGTGCTGTGCTCCATGACCAACACCTACGAGGTCTTAGAGTTCTTGGGCCGAGGGACGTTTGGGCAAGTGGTCAAGTGCTGGAAACGGGGCACCAATGAGATCGTAGCCATCAAGATCCTGAAGAACCACCCATCCTATGCCCGACAAGGTCAGATTGAAGTGAGCATCCTGGCCCGGTTGAGCACGGAGAGTGCCGATGACTATAACTTCGTCCGGGCCTACGAATGCTTCCAGCACAAGAACCACACGTGCTTGGTCTTCGAGATGTTGGAGCAGAACCTCTATGACTTTCTGAAGCAAAACAAGTTTAGCCCCTTGCCCCTCAAATACATTCGCCCAGTTCTCCAGCAGGTAGCCACAGCCCTGATGAAACTCAAAAGCCTAGGTCTTATCCACGCTGACCTCAAACCAGAAAACATCATGCTGGTGGATCCATCTAGACAACCATACAGAGTCAAGGTCATCGACTTTGGTTCAGCCAGCCACGTCTCCAAGGCTGTGTGCTCCACCTACTTGCAGTCCAGATATTACAG。
2.1.4分子稳定性验证
RNase R消化前后circHIPK2条带没有显著的变化，而GAPDH变化显著(见图4A)；qPCR结果也显示，酶处理前后circHIPK2的差异无统计学意义(见图4B)，而GAPDH在处理前后变化显著(见图4C)。
2.1.5背靠背反向设计原则验证
circHIPK2只能在cDNA中扩增出相应产物，而不能从gDNA中扩增出产物(图5)，以GAPDH为阳性对照。
2.1.6逆转录PCR反应体系及条件
表2逆转录PCR反应体系
Figure GDA0003755324050000111
反应条件：50℃15min，85℃5s，反应结束，4℃保存。
2.1.7定量PCR反应体系及条件
表3定量PCR反应体系
Figure GDA0003755324050000112
反应条件：95℃预变性10min；95℃10s，60℃30s；40个循环。
溶解曲线采集程序(采用仪器默认)。
2.2临床数据测定
2.2.1差异表达与筛查
乳腺癌组织内circHIPK2表达水平明显高于癌旁组织(图6)；乳腺癌患者血清circHIPK2表达量显著高于乳腺纤维瘤、良性乳腺病及健康体检者；乳腺纤维瘤、良性乳腺病患者血清内circHIPK2表达量显著高于健康体检者；手术治疗前乳腺癌患者血清circHIPK2表达水平明显高于治疗后(图7)。
2.2.2诊断效能
组织内circHIPK2的诊断敏感性为66.7％，特异性为95.2％，ROC曲线下面积为0.708(图8)；血清内circHIPK2的诊断敏感性为60.9％，特异性为93.5％，ROC曲线下面积为0.833(图9)，由表4及图10可知，circHIPK2曲线下面积为0.827；CA153曲线下面积为0.766；CEA曲线下面积为0.646。circHIPK2联合CA153和CEA进行乳腺癌的诊断，曲线下面积为0.897(AUC＝0.897)。
表4
Figure GDA0003755324050000121
注：检验结果变量CEA至少有一个在正实际状态组与负实际状态组之间的绑定值。统计可能有偏差；a.按非参数假定；b.原假设：真区域＝0.5。
2.2.3诊断特异性
乳腺良恶性肿瘤鉴别诊断的敏感性为72.8％，特异性为71.4％，曲线下面积为0.772(见图11)。
2.2.4手术疗效监测
血清circHIPK2作为乳腺癌手术疗效监测的敏感性为85.9％，特异性为93.3％，曲线下面积为0.954(见图12)。
2.2.5临床意义分析
根据表5可知，组织circHIPK2表达水平与肿瘤直径大小、TNM分期有显著相关性，根据表6可知，血清circHIPK2表达水平与肿瘤直径、年龄、淋巴结转移和TNM分期有显著相关性。
表5根据circHIPK2在肿瘤中的表达水平分析21例BC患者的临床特征
Figure GDA0003755324050000131
表6
Figure GDA0003755324050000132
Figure GDA0003755324050000141
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 核工业总医院
<120> circHIPK2作为乳腺癌生物标志物的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgtgtgctc cacctacttg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacccagtca tgtcccagtt g 21

Claims (6)

1.检测circHIPK2的试剂在制备乳腺癌诊断和/或预后评估试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测circHIPK2的试剂包括检测circHIPK2的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ IDNO：2所示的下游引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌诊断的方法包括如下步骤：
(1)收集待测对象的血清或组织样本，并以健康人群的血清或组织样本为对照组；
(2)利用权利要求2中所述引物对检测待测对象和对照组样本中circHIPK2的含量，并将所得结果进行比对；
(3)根据比对结果判断待测对象是否为乳腺癌患者；若待测对象样本中circHIPK2含量高于对照组，则判断为乳腺癌。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌预后评估的方法包括如下步骤：
(1)收集预后乳腺癌患者的血清或组织样本为待测组，并以预前乳腺癌患者的血清或组织样本为对照组；
(2)利用权利要求2中所述引物对检测待测组和对照组样本中circHIPK2的含量，并将所得结果进行比对；
(3)根据比对结果评估乳腺癌患者预后治疗效果；若待测组样本中circHIPK2含量低于对照组，则判断待测组预后评估有治疗效果。
5.根据权利要求3-4任一项所述的应用，其特征在于，采用qPCR荧光染料法检测待测样本中circHIPK2含量。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述qPCR荧光染料法的PCR扩增反应体系包括以下组分：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10μl，上下游引物浓度均为10μM，用量各0.4μl，cDNA模板3μl，ddH2O补足至20μl；PCR扩增反应程序为：95℃预变性10min；95℃10s，60℃30s；40个循环。
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