CN110592223B - 一种NSCLC的诊断和预后标记物hsa_circRNA_012515的应用 - Google Patents

一种NSCLC的诊断和预后标记物hsa_circRNA_012515的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NSCLC的诊断和预后标记物hsa_circRNA_012515的应用。本发明研究发现hsa_circRNA_012515在NSCLC患者癌组织、NSCLC细胞及耐药细胞株中的表达水平均显著增高(P<0.01)。而且III–IV期、存在淋巴转移及EGFR突变阳性的患者高表达hsa_circRNA_012515。表明hsa_circRNA_012515可作为NSCLC新的生物标志物，且与NSCLC的发生发展密切相关。为解决NSCLC早期诊断困难、恶性程度高且患者预后不佳，目前缺乏较灵敏和准确的诊断标志物的问题提供了新的解决方案，也为NSCLC患者提供及时诊断并指导临床治疗。

Description

一种NSCLC的诊断和预后标记物hsa_circRNA_012515的应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种NSCLC的诊断和预后标记物 hsa_circRNA_012515的应用。
背景技术
肺癌是世界上最常见和致命的恶性肿瘤之一，其中超过80％的患者被诊断为非小细胞肺癌(NSCLC)，其5年生存率仅为15％。在发达国家，肺癌已经成为癌症死亡的主要原因。肺癌患者在早期通常无明显的临床症状，因此，70％的患者在发现时就已经处于肺癌晚期或存在局部癌转移。早期诊断有利于提高患者生存率。而确定新的生物标志物将有益于NSCLC的早期诊断。表皮生长因子受体(EGFR)突变是NSCLC患者最常见的突变点，其高表达与患者预后较差密切相关。吉非替尼是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，广泛应用于NSCLC的临床治疗，其疗效早已得到普遍认可。然而无可避免的 EGFR-TKI耐药严重影响了其临床应用。目前仍有相当比例患者耐药机制未明。因此，进一步寻找EGFR-TKI耐药靶标，阐述其耐药机制将有助于提高患者的治疗效果。
环状RNA(circRNA)属于非编码RNA，与线性RNA相比，其表达更稳定且具有高度保守序列。环状RNA首次发现于RNA病毒中，但随着近年来高通量测序和生物信息学分析的发展，许多研究发现真核生物同样表达丰富的 circRNA。circRNA在多种人类疾病的发生和发展中发挥关键作用，尤其是癌症。 circRNA具有不易被核酸外切酶RNase降解的特性，可以在多种疾病和组织中稳定和高度特异性表达，为作为生物标记提供了很大的可能性。此外，作为分子海绵竞争性抑制miRNA是circRNA最重要的作用机制，circRNA可以通过“海绵作用”吸附特定的miRNA从而影响mRNA的表达，从而发挥相应的功能。上述研究表明，circRNA在作为癌症诊断和治疗的新型生物标志物和治疗靶标方面具有不可估量的潜在价值。在本发明中，我们通过circRNA微阵列分析和 qRT-PCR验证发现，hsa_circRNA_012515在吉非替尼耐药的NSCLC组织中表达显著上调，且与患者预后较差密切相关。我们的研究结果可为鉴定NSCLC的生物标志物提供了新的线索。
发明内容
本发明提供的一种NSCLC的诊断和预后标记物hsa_circRNA_012515，序列如SEQID No.1所示。该环状RNA为为NSCLC的诊断和预后提供了一个新的分子标记和检测途径，而且该分子标记准确性高，灵敏度和特异性好，应用前景非常好。
本发明的第一个目的是提供所述的分子标记物hsa_circRNA_012515的一种具体应用：具体是该分子标记物在制备NSCLC诊断试剂中的应用。
进一步的，所述的NSCLC诊断试剂包括PCR试剂。
更进一步的，PCR试剂包含检测hsa_circRNA_012515的引物，序列为：
5’CGTTCGAGTGTCCTGTGGAA3’(F)，见SEQ ID No.2和
5’GCTTTATCATACTGCTTGCTGC3’(R),见SEQ ID No.3。
本发明的第二个目的是提供所述的分子标记物hsa_circRNA_012515的第二种具体应用，具体是该分子标记物在制备NSCLC预后试剂中的应用。
进一步的，所述的NSCLC预后试剂包括PCR试剂。
更进一步的，PCR试剂包含检测hsa_circRNA_012515的引物，序列为：
5’CGTTCGAGTGTCCTGTGGAA3’(F)和
5’GCTTTATCATACTGCTTGCTGC3’(R)。
本发明的第三个目的是提供所述的分子标记物hsa_circRNA_012515的第三种具体应用，具体是该分子标记物在制备检测NSCLC患者吉非替尼耐药试剂中的应用。
进一步的，所述的检测NSCLC患者吉非替尼耐药试剂包括PCR试剂。
更进一步的，PCR试剂包含检测hsa_circRNA_012515的引物，序列为：
5’CGTTCGAGTGTCCTGTGGAA3’(F)和
5’GCTTTATCATACTGCTTGCTGC3’(R)。
肺癌是目前临床上最常发现的癌症，也是全球死亡率最高的恶性肿瘤。NSCLC恶性程度较高，5年生存率极低，其原因在于对NSCLC基础生物学的了解不足，从而导致缺乏用于疾病检测的可靠生物标志物和有效的治疗药物。此外，肺癌患者的生存与癌症分期密切相关，有研究表明，肺癌患者从IA期进展到IV 期时，其5年总生存率从82％急剧下降到了6％。肺癌患者发病隐匿，早期极难发现，明确诊断时，患者多为晚期，几乎没有机会进行有效治疗。因此，尽早发现、提高早期诊断的准确度有利于改善患者预后、提高患者生存率。因此，为 NSCLC患者确定一种新的癌症特异性生物标志物以帮助及时诊断并指导临床治疗是目前亟待解决的问题。
circRNAs是一种广泛表达于哺乳动物中的内源性RNAs，具有结构稳定、组织特异性高和不易被核酸外切酶RNase降解的特性，因此，是作为多种疾病诊断和预后生物标志物的极佳选择。
早期发现与治疗是改善肺癌患者预后的关键。更好地理解与NSCLC发病相关的分子机制对于早期有效诊断是至关重要的。在本发明中，为了确定circRNA 在NSCLC中的表达，我们采用circRNA芯片检测了3名接受吉非替尼治疗的 NSCLC患者的癌组织和癌旁组织样品筛选候选circRNA，然后在大量临床样本、 NSCLC细胞及耐药细胞中进行qRT-PCR验证，结果表明hsa_circRNA_012515 在NSCLC组织及细胞中表达显著上升，特别是吉非替尼耐药的肺癌组织和NSCLC 细胞中。此外，ROC分析证实hsa_circRNA_012515具有高度的特异性和敏感性，是NSCLC较好的诊断指标。同时，我们的发现表明，与I/II期NSCLC患者相比，hsa_circRNA_012515在III/IV期NSCLC患者中的表达水平明显上调，且 hsa_circRNA_012515的表达水平在EGFR突变及存在淋巴转移的NSCLC患者中明显增加，这表明hsa_circRNA_012515可能参与了NSCLC的肿瘤细胞生长、进展和转移。此外，我们发现hsa_circRNA_012515的表达与DFS和OS显著相关，这表明hsa_circRNA_012515可能是指示NSCLC患者预后不良的重要标志物。上述这些结果表明hsa_circRNA_012515具有较好的临床相关性和使用价值，可用于 NSCLC患者的早期筛查。
circRNA通过“海绵”吸附作用调节miRNA的表达是其重要的作用机制之一。根据miRanda和TargetScan的预测结果，我们发现hsa-miR-98-5p、 hsa-miR-615-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p和hsa-let-7c-5p等5个miRNA可与hsa_circRNA_012515相互作用。这些miRNA可能与癌症细胞增殖和转移至关重要。该结果为本发明进一步探讨hsa_circRNA_012515在NSCLC发生发展中的作用机制提供理论基础。
总之，我们研究发现了hsa_circRNA_012515在NSCLC中的表达水平和诊断及预后价值。我们发现hsa_circRNA_012515在NSCLC组织、NSCLC细胞和 NSCLC耐药细胞中的表达水平均显著增加。此外，hsa_circRNA_012515表达上调与淋巴结转移和肿瘤分期及患者预后之间密切相关。因此， hsa_circRNA_012515可作为NSCLC较好的诊断和预后生物标志物。为未来 NSCLC患者开发个性化疗法提供临床理论基础。
附图说明
图1：NSCLC吉非替尼耐药样本circRNA基因芯片分析；图1A为circRNA表达的火山图，图1B为circRNA表达的散点图。
图2:5种circRNAS在20对样本中的qRT-PCR验证。*表示与对照组相比，差异具有统计学意义(p<0.05)；所有实验均重复三次。
图3：RT-PCR验证hsa_circRNA_012515在临床组织样本和细胞株中的表达；
图3A为NSCLC癌组织和癌旁组织中hsa_circRNA_012515的表达；图3B为不同肿瘤分期的癌组织中hsa_circRNA_012515的表达；图3C为hsa_circRNA_012515 在吉非替尼耐药和吉非替尼敏感NSCLC癌组织中的表达；图3D为hsa_circRNA_012515在肺上皮细胞、NSCLC细胞和NSCLC吉非替尼耐药细胞中的表达。
图4：hsa_circRNA_012515在不同化疗次数后在NSCLC中的表达。
图5：hsa_circRNA_012515的诊断和预后价值分析；图5A和图5B分别为生存曲线分析高表达/低表达hsa_circRNA_012515与患者预后(无疾病生存率和总生存率)之间的关系；图5C为hsa_circRNA_012515对NSCLC的ROC曲线分析。
图6：circRNA/miRNA相互作用的预测；M:miRanda软件预测circRNA/miRNA 的相互作用；T:TargetScan软件预测circRNA/miRNA的相互作用。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
1.材料与方法
2.1组织样本
本研究共收集2015-2018年中南大学湘雅三医院接受吉非替尼治疗的83例 NSCLC患者的癌组织和相应癌旁组织(>肿瘤边缘5cm处)。所有这些患者均为晚期NSCLC，经组织学或细胞学诊断证实。所有患者均通过电子病历系统收集基本信息(包括年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小、TNM分期、淋巴转移及肿瘤分化等)。使用在计算机断层扫描(CT)图像上确定的最宽直径计算肿瘤大小。磁共振成像(MRI)和CT表现分别用于诊断淋巴转移和评估肿瘤差异。根据世界卫生组织分类标准和国际抗癌联盟(第7版)的肿瘤节点转移系统进行肿瘤组织学分级和分期。所有组织样本取出后保存在-80℃备用。本研究所有样本的采集获得医院伦理委员会(APProval number:2014123)批准并获得患者知情同意。
2.2细胞培养
肺上皮细胞BEAS-2B、NSCLC细胞(HCC827、H1870、H1048、PC9和A459) 均来自中南大学湘雅医学院基础实验室。通过逐步增加吉非替尼浓度获得耐药细胞株PC9/R、A459/R。将所有细胞培养于1640培养基(HyClone,Logan,UT,USA)，将培养基放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。实验采用对数生长期细胞。
2.3RNA提取和转录
按照TRIzol试剂盒(Invitrogen公司，美国)要求分别从癌组织和癌旁组织及上述相应细胞中提取总RNA。通过分光光度法检测260和280nm处的吸光度来检测RNA的含量和质量。使用RNaseR(EPicentre公司，美国)降解总RNA中的线性RNA，将剩余circRNA扩增并转录成荧光cRNA。
2.4circRNA芯片测序
将3例组织样本处理后得到的荧光cRNA根据Arraystar Super RNA Labeling Kit(Arraystar,USA)的说明使用随机引物法进行标记。将标记的circRNA杂交至 ArraystarHuman circRNA Array V2(8x15K,Arraystar)上。使用the Agilent Scanner G2505C扫描芯片。采用Agilent Feature Extraction software(version 11.0.1.1)进行图像分析。使用GeneSPring 13.0(Agilent)软件分析circRNA数据。只有倍数变化> 2.0且P值<0.05才能确定为具有差异表达的circRNA。
2.5定量RT-PCR验证
将83例样本进行处理并转录成cDNA，在ViiA 7Real-time PCR System (APPliedBiosystems)进行实时qRT-PCR(Arraystar)检测CircRNA的表达。简言之，用总体积为10μL的随机引物将总RNA逆转录成cDNA。反应从95℃(30 秒)开始、然后在95℃(5秒)和60℃(20秒)下进行40个循环。β-actin表达作为qPCR的对照，通过β-actin标准化并使用2-ΔΔCt方法计算 hsa_circRNA_012515的表达水平(样品一式三份进行分析)。
hsa_circRNA_012515的引物序列为：
5’CGTTCGAGTGTCCTGTGGAA3’(F),见SEQ ID No.2和
5’GCTTTATCATACTGCTTGCTGC3’(R),见SEQ ID No.3。
hsa_circRNA_092547的引物序列为：
5’GGCTTGTGGATCAGAATCTGAA3’(F),见SEQ ID No.4和
5’CAAAATTGGGAAAGATGATGAA3’(R),见SEQ ID No.5。
hsa_circRNA_031235的引物序列为：
5’GGCAGAAGATCTGACAGGAT3’(F),见SEQ ID No.6和
5’GGCATCTGATGACTTTGACA 3’(R),见SEQ ID No.7。
hsa_circRNA_068252的引物序列为：
5’GGTAAAGTTGCCACAGGAAG 3’(F),见SEQ ID No.8和
5’GGACCATCACTTGGTGCAGT3’(R),见SEQ ID No.9。
hsa_circRNA_102641的引物序列为：
5’GTGAACTGCCTGAAGAGCTC3’(F),见SEQ ID No.10和
5’GTATCAACCCTCCTTGCT CT3’(R),见SEQ ID No.11。
β-actin的引物序列为：
5'GTGGCCGAGGACTTTGATTG3'(F),见SEQ ID No.12
和5’CCTGTAACAACGCATCTCATATT3’(R),见SEQ ID No.13。
2.6统计分析
数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，数据用平均值±标准偏差表示。使用t检验比较两组的平均值，ANOVA检验比较多组的平均值。建立受试者操作曲线(ROC)判断circRNA的诊断价值，当AUC等于0.5时，circRNA定义为没有诊断价值。建立KaPlan-Meier(K-M)生存曲线及通过Log-rank检验分析高/低circRNA组患者生存率是否存在差异。P<0.05为差异有显著统计学意义。
3.结果
3.1circRNA基因芯片分析
为了寻找NSCLC中表达的特异性circRNAs，我们首先利用芯片检测了3例接受吉非替尼治疗的NSCLC癌组织和癌旁组织中circRNAs的表达。芯片结果显示有147个circRNAs的表达存在差异，其中52个为上调，95个为下调(图1A，左图)。两组差异表达的circRNAs用散点图表示(图1B，右图)。从中选取表达差异最为明显的5个circRNA(表1)在20例样本(来源于前述的83例样本) 中进行qRT-PCR验证，结果如图2所示，hsa_circRNA_012515上调最明显，其表达水平要显著高于对照组(癌旁组织)。hsa_circRNA_012515的成环基本信息如图1C所示。
3.2hsa_circRNA_012515在NSCLC癌组织和细胞株中的表达显著上调
随后，我们进一步在60例样本(来源于前述的83例样本)中对hsa_circRNA _012515进行qRT-PCR验证，进一步确认了NSCLC中hsa_circRNA_012515表达显著上调(图3A)，且随肿瘤分期增加而上调(图3B)。此外，根据患者对吉非替尼治疗的反应，将收集的83例样本分为吉非替尼耐药(43例)和吉非替尼敏感(40例)，我们进一步发现，吉非替尼耐药的NSCLC癌组织中hsa_circRNA _012515的表达要显著高于吉非替尼敏感NSCLC癌组织hsa_circRNA_012515的表达(图3C)。同时，我们在NSCLC吉非替尼耐药细胞株中进行qRT-PCR验证，其结果与临床样本结果趋势符合(图3D)，这表明hsa_circRNA_012515上调可能是导致NSCLC患者发生吉非替尼耐药的机制之一。
3.3hsa_circRNA_012515表达与NSCLC患者临床病理特征相关
为了更好的了解hsa_circRNA_012515的临床价值，我们分析了 hsa_circRNA_012515的表达水平与NSCLC患者病理特征和实验室指标的相关性，结果表明(表2)，hsa_circRNA_012515在III–IV期、存在淋巴转移及EGFR 突变阳性的患者中表达水平显著增加(P<0.05)，而与年龄、性别，是否吸烟、肿瘤体积和肿瘤分化程度等无明显关系。此外，我们还分析了 hsa_circRNA_012515与NSCLC患者化疗之间的关系，结果显示(图4)，随着化疗次数的增加，hsa_circRNA_012515的表达水平逐渐下降。
3.4hsa_circRNA_012515是NSCLC良好的诊断指标且与患者预后相关
为了确定hsa_circRNA_012515对NSCLC患者的诊断价值，我们建立了 NSCLC患者的ROC曲线。其结果如图5C所示。hsa_circRNA_012515对NSCLC 患者的诊断有较高的准确度，其曲线下面积(AUC)为0.89，P<0.0001。这表明hsa_circRNA_012515可能是NSCLC较为特异和敏感的诊断指标。此外，基于hsa_circRNA_012515的平均表达水平，我们将83例患者分为高表达或低表达水平，其K-M生存分析表明，hsa_circRNA_012515表达高的患者的总生存期(OS) (图5B)和疾病无进展生存期(DFS)(图5A)均明显短于hsa_circRNA_012515表达低的患者。该结果表明hsa_circRNA_012515高表达与患者不良预后密切相关。
3.5hsa_circRNA_012515靶向预测miRNA
通过“海绵”作用吸附miRNA是circRNA最重要的作用机制。为了确定 hsa_circRNA_012515的潜在功能，使用基于TargetScan和miRanda的Arraystar 自制miRNA靶标预测软件预测circRNA和miRNA相互作用。总共有5个miRNA (hsa-miR-98-5p、hsa-miR-615-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p和hsa-let-7c-5p) 可与hsa_circRNA_012515相互作用(图6)
表1qRT-PCR验证的5circRNAs的基本信息
Figure BDA0002255097620000081
表2NSCLC患者circRNA表达水平和临床病例特征的关系
Figure BDA0002255097620000091
Figure BDA0002255097620000101
。
序列表
<110> 中南大学湘雅三医院
<120> 一种NSCLC的诊断和预后标记物hsa_circRNA_012515的应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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gtatcaaccc tccttgctct 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtggccgagg actttgattg 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctgtaacaa cgcatctcat att 23

Claims (3)

1.检测hsa_circRNA_012515的试剂在制备NSCLC诊断试剂中的应用，hsa_circRNA_012515序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的NSCLC诊断试剂包括PCR试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，PCR试剂包含检测hsa_circRNA_012515的引物，序列为：
F ：5’ CGTTCGAGTGTCCTGTGGAA3’和
R ：5’ GCTTTATCATACTGCTTGCTGC3’。
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