CN117604111B - 用于小细胞肺癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于小细胞肺癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用。更具体地，本发明涉及一种用于小细胞肺癌的诊断和预后判断的生物标志物，所述生物标志物是PRRT1和/或TMOD2。本发明人已发现，PRRT1和TMOD2在小细胞肺癌患者中的表达水平低于健康人群中的表达水平。更特别地，本发明人发现，PRRT1和/或TMOD2的低水平表达在用于诊断小细胞肺癌时具有良好的灵敏度和特异性，并且与小细胞肺癌患者的预后相关，因此可以作为用于小细胞肺癌诊断和预后判断的生物标志物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于小细胞肺癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用。
背景技术
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是致死率最高的肿瘤。从病理分型上，肺癌有可分为小细胞肺癌（smallcell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lungcancer，NSCLC）。其中小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）起源于肺中的原始神经内分泌细胞，是一种高度致命的恶性肿瘤，占肺癌患者总数的15-20％。其较非小细胞肺癌有不同的生物学特性，如：瘤细胞倍增时间短、生长分数高、早期即可出现广泛转移。尽管小细胞肺癌对初始化疗治疗敏感，但多数患者不可避免地由于化疗耐药而复发，导致后续很难治疗并预后较差。小细胞肺癌的平均5年生存率低于7％，大多数患者出现转移性疾病并在12个月内死亡。由于小细胞肺癌很少通过手术治疗，很少有标本可用于研究。与非小细胞肺癌相比，小细胞肺癌的研究较少，近30年内小细胞肺癌的治疗没有显著临床进展。因此，进一步剖析小细胞肺癌发展过程中的分子机制，寻找鉴定新的诊断标志物，并且寻找小细胞肺癌治疗新靶点已成为小细胞肺癌防治的当务之急。目前已发现可潜在用于早期肺癌诊断和预后判断的几种生物标志物，包括TTF1，其表达于甲状腺滤泡上皮和肺泡上皮细胞的细胞核中，与肿瘤的分化程度呈正相关，分化越差则越可能表达缺失；TTF1是临床上区分肺癌亚型的最佳标志物之一。然而此生物标志物在小细胞肺癌诊断和预后判断中的应用仍需更深入研究。
循环肿瘤细胞是从原发肿瘤或者转移肿瘤上脱落下来、释放进入血液循环中的一群肿瘤细胞亚群。近些年的研究发现，一方面，循环肿瘤细胞在肿瘤发生的很早期就可能出现在患者的外周血中，这为癌症的早期诊断提供了帮助。另一方面，这些循环肿瘤细胞还可以用来预测癌症患者的预后，循环肿瘤细胞的发现往往预示着肿瘤的复发或转移，这也提示患者的预后不良。如何使用循环肿瘤细胞来对癌症尤其是特定癌症例如小细胞肺癌进行诊断或者预后，这也是我们未来在循环肿瘤细胞系列探索中的一个重要方向。使用循环肿瘤细胞进行诊断或预后的一大好处是其可以有效替代肿瘤活检，对于那些无法进行病理组织活检的患者，这是一个很好的替代指标，它可以帮助临床医生实时地对癌症的生物学特征进行动态监测和判断。然而，由于循环肿瘤细胞数量稀少，利用其作为诊断癌症尤其是特定癌症例如小细胞肺癌的手段存在挑战，并非所有的癌症相关标志物都可以在循环肿瘤细胞中被检测到。因此，寻找适用于借助循环肿瘤细胞进行诊断的生物标志物具有重要的临床价值。
发明内容
为了解决上述问题，本发明人已发现，PRRT1和TMOD2在小细胞肺癌患者中的表达水平低于健康人群中的表达水平。更特别地，本发明人发现，PRRT1和/或TMOD2的低水平表达在用于诊断小细胞肺癌时具有良好的灵敏度和特异性，并且与小细胞肺癌患者的预后相关，因此可以作为用于小细胞肺癌诊断和预后判断的生物标志物。
如本文所用，PRRT1是富含脯氨酸的跨膜蛋白1（proline rich transmembraneprotein 1，PRRT1）的简称，其NCBI Gene ID为80863。
如本文所用，TMOD2是原肌球调节蛋白2（tropomodulin 2，TMOD2）的简称，其NCBIGene ID为29767。
具体地，本发明提供了一种用于小细胞肺癌诊断的生物标志物，其中所述生物标志物是PRRT1和/或TMOD2。
在其他方面，本发明还提供了一种用于小细胞肺癌预后判断的生物标志物，其中所述生物标志物是PRRT1和/或TMOD2。
在其他方面，本发明还提供了一种用于小细胞肺癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测PRRT1和/或TMOD2表达的试剂。
在其他方面，本发明还提供了一种用于小细胞肺癌预后判断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测PRRT1和/或TMOD2表达的试剂。
在其他方面，本发明还提供了检测PRRT1和/或TMOD2表达的试剂在制备用于小细胞肺癌的诊断的工具中的用途。
在其他方面，本发明还提供了检测PRRT1和/或TMOD2表达的试剂在制备用于小细胞肺癌的预后判断的工具中的用途。
进一步地，所述小细胞肺癌的诊断包括以下步骤：
（1）收集待测受试者的样本，和收集对照样本；
（2）检测并比较待测受试者样本和对照样本中PRRT1和/或TMOD2的表达水平；
如果待测受试者的样本中PRRT1的表达水平与对照样本中PRRT1的表达水平相比降低，和/或待测受试者的样本中TMOD2的表达水平与对照样本中TMOD2的表达水平相比降低，则诊断所述待测受试者患有小细胞肺癌或处于患有小细胞肺癌的风险中。
进一步地，所述对照样本来源于健康人群或待测受试者的健康组织。
进一步地，所述小细胞肺癌的预后判断包括以下步骤：
（1）收集预后小细胞肺癌患者的样本为待测组，并以预前小细胞肺癌患者的样本为对照组；
（2）检测并比较待测组和对照组的样本中PRRT1和/或TMOD2的表达水平；
如果待测组样本中PRRT1的表达水平与对照组样本中PRRT1的表达水平相比升高，和/或待测组样本中TMOD2的表达水平与对照组样本中TMOD2的表达水平相比升高，则判断待测组的预后良好。
如本文所用，所述受试者包括哺乳动物，优选为灵长类哺乳动物，更优选为人。
如本文所用，所述待测受试者的样本包括受试者的临床生物样本，包括但不限于血清、血浆、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、组织、器官、石蜡切片、肿瘤组织、活检样本、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA或尿液脱落细胞中的一种或几种。在优选的实施方案中，所述待测受试者的样本包括待测受试者的肺组织，例如肺活检样本，所述对照样本来源于健康受试者的肺组织，例如肺活检样本，或待测受试者的健康组织，例如癌旁组织。在优选的实施方案中，所述待测受试者的样本为循环肿瘤细胞。
如本文所用，所述预后和预前小细胞肺癌患者的样本包括受试者的临床生物样本，包括但不限于血清、血浆、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、组织、器官、石蜡切片、肿瘤组织、活检样本、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA或尿液脱落细胞中的一种或几种。在优选的实施方案中，所述预后和预前小细胞肺癌患者的样本包括待测受试者的肺组织，例如肺活检样本。在优选的实施方案中，所述预后和预前小细胞肺癌患者的样本为循环肿瘤细胞。
如本文所用，检测待测受试者的样本中PRRT1和/或TMOD2的表达的试剂没有特别限制，并且是本领域技术人员熟知且容易获得的用于检测受试者样本中PRRT1和/或TMOD2在mRNA或蛋白质水平上的表达的试剂。例如，用于检测受试者样本中PRRT1和/或TMOD2的表达的试剂可以包括用于实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白/肽段芯片检测、化学发光、免疫印迹、微珠免疫检测、微流控免疫的相应试剂。
本发明的有益效果
本发明人已发现，PRRT1和TMOD2在小细胞肺癌患者中的表达水平低于健康人群中的表达水平。更特别地，本发明人发现，PRRT1和/或TMOD2的低水平表达，尤其是这两者在联合使用时，在用于诊断小细胞肺癌时具有良好的灵敏度和特异性，并且与小细胞肺癌患者的预后相关，因此可以作为用于小细胞肺癌诊断和预后判断的生物标志物。此外，本发明还发现可以通过收获受试者的循环肿瘤细胞并检测其中PRRT1和TMOD2的表达水平来对小细胞肺癌进行诊断和预后判断。
附图说明
图1显示了PRRT1和TMOD2在小细胞肺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的表达水平。
图2显示了PRRT1和TMOD2在小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞中的表达水平。
图3显示了PRRT1和TMOD2在人小细胞肺癌细胞NCI-H446和人正常肺上皮细胞Beas-2b中的表达水平。
图4显示了在过表达PRRT1和/或TMOD2后，人小细胞肺癌细胞NCI-H446的迁移能力和侵袭能力的变化。
图5显示了在过表达PRRT1和/或TMOD2后，人小细胞肺癌细胞NCI-H446中Notch信号途径的活化。
图6显示了PRRT1和TMOD2单独和联合地在小细胞肺癌患者与健康人群中的ROC曲线分析。
图7显示了PRRT1和TMOD2单独和联合地在小细胞肺癌患者与健康人群中的Kaplan-Meier生存曲线分析。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：人小细胞肺癌与配对正常组织的表达谱芯片分析
肿瘤基因组图谱(TCGA)计划由美国National Cancer Institute(NCI)和National Human Genome Research Institute(NHGRI)于2006年联合启动的项目，利用大规模测序为主的基因组分析技术，针对36种癌症进行大规模实验，TCGA基因组分析中心(GCC)比对肿瘤和正常组织，寻找与各癌症或者亚型相关的基因突变、扩增或者缺失。为理解癌症的分子机制，提高人们对癌症发病分子基础的科学认识提供帮助。
TCGA标准方法下载120对小细胞肺癌组织和正常组织的全基因表达谱数据及临床信息，统计分析采用R语言(3.1.1版本)软件，需安装及加载的程序包(heatmap，venndiagram，hist等)，然后用DESeq和edgeR程序包进行分析，找出差异表达的基因。最终筛选到在小细胞肺癌中显著低表达的两种基因，即PRRT1和TMOD2。
实施例2：PRRT1和TMOD2在小细胞肺癌中低表达
收集临床53例小细胞肺癌组织样本和35例癌旁正常组织样本，分别使用TRIzol法提取上述小细胞肺癌组织样本和癌旁正常组织样本的RNA，利用RT-qPCR方法分别检测PRRT1和TMOD2的mRNA水平。结果如图1所述，其证实PRRT1和TMOD2在小细胞肺癌中低表达。
实施例3：小细胞肺癌患者的循环肿瘤细胞中PRRT1和TMOD2表达水平的检测
1）抽取小细胞肺癌患者静脉血10mL于ACD抗凝管中，常规离心分离血浆备用；
2）对血浆中CTC细胞进行富集及分离，具体步骤为：通过向血浆中加入样本密度分离液（Cytelligen）提取血浆中单细胞层，之后加入免疫细胞去除磁珠对所提取单细胞层中的CD45+免疫细胞进行去除，通过差向富集对单细胞层中CTC进行浓缩及富集；
3）离心收获富集的CTC细胞，加入1ml的RNA裂解液吸至无酶EP管中；向EP管中加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒，室温静止3min，反复3次；12000×g、4℃离心15min；将上层水相加入新的无酶的EP管，在EP管中加入等体积异丙醇，颠倒、混匀，静置10min；12000×g、4℃离心15min；弃掉EP管液体，加入75％的乙醇1ml，震荡EP管；12000×g、4℃离心5min；弃净上清后室温放置干燥；加入适量DEPC水溶解RNA；检测RNA的纯度和浓度并通过RT-qPCR检测CTC细胞中PRRT1和TMOD2的表达，并将其与收获自正常肺组织的细胞中PRRT1和TMOD2的表达进行比较，结果如图2所述，其证实PRRT1和TMOD2在小细胞肺癌患者CTC细胞中低表达。
实施例4：PRRT1和TMOD2影响小细胞肺癌细胞的侵袭及迁移
将人小细胞肺癌细胞NCI-H446和人正常肺上皮细胞Beas-2b用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(含100U·mL-1青霉素和0.1mg·mL-1链霉素)，于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。
将培养的细胞消化收集后如实施例3所述提取RNA并通过RT-qPCR检测正常细胞及癌细胞中PRRT1和TMOD2的表达。结果如图3所示，其显示PRRT1和TMOD2在人小细胞肺癌细胞NCI-H446中的表达低于在人正常肺上皮细胞Beas-2b中的表达。
构建PRRT1和TMOD2的cDNA序列（分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2），连接于稳定表达质粒，进行病毒包装并转染小细胞肺癌细胞以得到过表达PRRT1和TMOD2的小细胞肺癌细胞(过表达结果如图3所示)，然后进行Transwell细胞迁移及侵袭实验验证，结果如图4所示，其显示在过表达PRRT1和TMOD2后，人小细胞肺癌细胞NCI-H446的迁移能力和侵袭能力有所下降，其中PRRT1和TMOD2同时过表达时的下降更为显著。
实施例5：PRRT1和TMOD2的过表达激活人小细胞肺癌细胞NCI-H446中Notch信号途径的活化
在实施例3中，我们已经证明PRRT1和TMOD2的过表达抑制小细胞肺癌发展。为了进一步了解其生物学机制，我们对PRRT1和/或TMOD2过表达的小细胞肺癌细胞进行了RNA测序分析，结果发现NOTCH受体及其靶基因的表达显著上调（图5A-B）。蛋白质印迹测定证实了PRRT1和/或TMOD2过表达后NCI-H446细胞中NOTCH受体的上调，并且当ZNF469和CHST14同时过表达时，NOTCH受体的上调更为显著（图5C）。这些结果表明，ZNF469和CHST14可能通过激活小细胞肺癌细胞中NOTCH信号途径从而抑制小细胞肺癌的发生和进展。
实施例6：PRRT1和TMOD2的小细胞肺癌诊断价值
利用实施例2测定的PRRT1和TMOD2在小细胞肺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的mRNA水平通过受试者工作曲线(ROC)对PRRT1和TMOD2的独立诊断及联合诊断实验结果进行分析。结果如图6所示，其显示PRRT1（灵敏度47.17％，特异性68.57％）和TMOD2（灵敏度54.72％，特异性71.43％）mRNA表达对小细胞肺癌具有比较一般的诊断效果，但联合诊断效果良好，ROC曲线下面积AUC(area under the ROC curve)＝0.7697，灵敏度可达62.26％，特异性可达75％。从此结果可知，单独的PRRT1和TMOD2具有一定的诊断效用，但诊断特异性和灵敏度仍不足，而两者联合使用时可以实现良好的灵敏度和特异性。因此，PRRT1和TMOD2可以用于单独和联合诊断小细胞肺癌。
实施例7：PRRT1和TMOD2与小细胞肺癌临床预后的关系
利用实施例2测定的PRRT1和TMOD2在小细胞肺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的mRNA水平，统计分析PRRT1和TMOD2与小细胞肺癌患者的整体生存率的关系。结果如图7所示，可以看出，PRRT1高表达(PRRT1High+TMOD2Low)或TMOD2高表达(PRRT1Low+TMOD2High)的小细胞肺癌患者组的五年总体生存率高于PRRT1和TMOD2低表达(PRRT1Low+TMOD2Low)的小细胞肺癌患者组，并且PRRT1高表达且同时TMOD2高表达(PRRT1High +TMOD2High)的小细胞肺癌患者组的五年总体生存率最高。这说明：PRRT1和/或TMOD2低表达与小细胞肺癌患者的不良预后有关。
需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (5)
1.检测PRRT1和TMOD2表达的试剂在制备用于小细胞肺癌的诊断的工具中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述小细胞肺癌的诊断包括以下步骤：
（1）收集待测受试者的样本，和收集对照样本；
所述对照样本来源于健康人群或待测受试者的健康组织，所述待测受试者的样本为血清、血浆、全血、脓液、器官、肿瘤组织、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA中的一种或几种；
（2）检测并比较待测受试者样本和对照样本中PRRT1和 TMOD2的表达水平；
如果待测受试者的样本中PRRT1的表达水平与对照样本中PRRT1的表达水平相比降低，和待测受试者的样本中TMOD2的表达水平与对照样本中TMOD2的表达水平相比降低，则诊断所述待测受试者患有小细胞肺癌或处于患有小细胞肺癌的风险中。
3.检测PRRT1和 TMOD2表达的试剂在制备用于小细胞肺癌的预后判断的工具中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述小细胞肺癌的预后判断包括以下步骤：
（1）收集预后小细胞肺癌患者的样本为待测组，并以预前小细胞肺癌患者的样本为对照组；
（2）检测并比较待测组和对照组的样本中PRRT1和TMOD2的表达水平；
如果待测组样本中PRRT1的表达水平与对照组样本中PRRT1的表达水平相比升高，和待测组样本中TMOD2的表达水平与对照组样本中TMOD2的表达水平相比升高，则判断待测组的预后良好。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述预后和预前小细胞肺癌患者的样本为血清、血浆、全血、脓液、器官、肿瘤组织、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA中的一种或几种。
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