CN117625792B - 用于胃癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于胃癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用。更具体地，本发明涉及一种用于胃癌的诊断和预后判断的生物标志物，所述生物标志物选自HECW2、ANKFY1和ARHGAP31中的一种或多种。本发明人已发现，HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在胃癌患者中的表达水平高于健康人群中的表达水平。更特别地，本发明人发现，HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的高水平表达在用于诊断胃癌时具有良好的灵敏度和特异性，并且与胃癌患者的预后相关，因此可以作为用于胃癌诊断和预后判断的生物标志物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于胃癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用。
背景技术
目前诊疗手段多样，而且多学科综合诊治模式(multi-disciplinary team，MDT)的兴起使患者获益，但胃癌患者的预后仍不理想。其中一个很重要的原因是大多数胃癌患者早期并无明显症状，错过了早期诊断的黄金时间，确诊时已处于进展期。约90％的胃癌患者在确诊时已出现淋巴结转移，30％的患者更是出现远处转移。因此，早期诊断、早期干预仍是改善治疗疗效和提高生存时间的关键。目前胃镜是确诊胃癌的标准诊断手段，对胃癌的早期诊断率有质的提升。毕竟是有创检查，与操作者水平密切相关，所以目前胃镜筛查暂未能广泛普及。临床上肿瘤标志物常被用于辅助胃癌的诊断和疗效评估，包括癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)和糖链标志物(carbohydrate antigen，CA)，如糖链抗原19-9(CA19-9)和糖链抗原72-4(CA72-4)等，鉴于其诊断胃癌时较低的敏感性或特异性，需要发现能够更好地辅助胃癌诊断的生物标志物，从而对胃癌患者进行早期干预，进一步改善患者的预后。HER2是另一种用于胃癌诊断和预后判断的常用生物标志物。HER2是EGFR家族的重要成员，在正常上皮细胞中表达较低但在包括乳腺癌、胃癌和结直肠癌等多种肿瘤类型中过表达或扩增，易与 HER其他家族受体形成异二聚体，导致受体酪氨酸残基磷酸化并启动包括 MPK、PI3K、JAK、STAT3 和 PKC 等多种信号通路，从而导致细胞增殖和肿瘤发生。然而这些生物标志物在胃癌诊断和预后判断中的应用仍需更深入研究，并且仍然需要寻找其他新的胃癌诊断和预后判断生物标志物。
循环肿瘤细胞是从原发肿瘤或者转移肿瘤上脱落下来、释放进入血液循环中的一群肿瘤细胞亚群。近些年的研究发现，一方面，循环肿瘤细胞在肿瘤发生的很早期就可能出现在患者的外周血中，这为癌症的早期诊断提供了帮助。另一方面，这些循环肿瘤细胞还可以用来预测癌症患者的预后，循环肿瘤细胞的发现往往预示着肿瘤的复发或转移，这也提示患者的预后不良。如何使用循环肿瘤细胞来对癌症尤其是特定癌症例如胃癌进行诊断或者预后，这也是我们未来在循环肿瘤细胞系列探索中的一个重要方向。使用循环肿瘤细胞进行诊断或预后的一大好处是其可以有效替代肿瘤活检，对于那些无法进行病理组织活检的患者，这是一个很好的替代指标，它可以帮助临床医生实时地对癌症的生物学特征进行动态监测和判断。然而，由于循环肿瘤细胞数量稀少，利用其作为诊断癌症尤其是特定癌症例如胃癌的手段存在挑战，并非所有的癌症相关标志物都可以在循环肿瘤细胞中被检测到。因此，寻找适用于借助循环肿瘤细胞进行诊断的生物标志物具有重要的临床价值。
发明内容
为了解决上述问题，本发明人已发现，HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在胃癌患者中的表达水平高于健康人群中的表达水平。更特别地，本发明人发现，HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的高水平表达在用于诊断胃癌时具有良好的灵敏度和特异性，并且与胃癌患者的预后相关，因此可以作为用于胃癌诊断和预后判断的生物标志物。
如本文所用，HECW2是含C2和WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2（C2 and WW domaincontaining E3 ubiquitin protein ligase 2，HECW2）的简称，其NCBI Gene ID为57520。
如本文所用，ANKFY1是含锚蛋白重复序列和FYVE结构域1（ankyrin repeat andFYVE domain containing 1，ANKFY1）的简称，其NCBI Gene ID为51479。
如本文所用，ARHGAP31是Rho GTPase激活蛋白31（Rho GTPase activatingprotein 31，ARHGAP31）的简称，其NCBI Gene ID为57514。
具体地，本发明提供了一种用于胃癌诊断的生物标志物，其中所述生物标志物选自HECW2、ANKFY1和ARHGAP31中的一种或多种，优选全部。
在其他方面，本发明还提供了一种用于胃癌预后判断的生物标志物，其中所述生物标志物选自HECW2、ANKFY1和ARHGAP31中的一种或多种，优选全部。
在其他方面，本发明还提供了一种用于胃癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测HECW2、ANKFY1和ARHGAP31表达的试剂。
在其他方面，本发明还提供了一种用于胃癌预后判断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测HECW2、ANKFY1和ARHGAP31表达的试剂。
在其他方面，本发明还提供了检测HECW2、ANKFY1和ARHGAP31表达的试剂在制备用于胃癌的诊断的工具中的用途。
在其他方面，本发明还提供了检测HECW2、ANKFY1和ARHGAP31表达的试剂在制备用于胃癌的预后判断的工具中的用途。
进一步地，所述胃癌的诊断包括以下步骤：
（1）收集待测受试者的样本，和收集对照样本；
（2）检测并比较待测受试者样本和对照样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平；
如果待测受试者的样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平与对照样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平相比升高，则诊断所述待测受试者患有胃癌或处于患有胃癌的风险中。
进一步地，所述对照样本来源于健康人群或待测受试者的健康组织。
进一步地，所述胃癌的预后判断包括以下步骤：
（1）收集预后胃癌患者的样本为待测组，并以预前胃癌患者的样本为对照组；
（2）检测并比较待测组和对照组的样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平；
如果待测组样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平与对照组样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平相比降低，则判断待测组的预后良好。
如本文所用，所述受试者包括哺乳动物，优选为灵长类哺乳动物，更优选为人。
如本文所用，所述待测受试者的样本包括受试者的临床生物样本，包括但不限于血清、血浆、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、组织、器官、石蜡切片、肿瘤组织、活检样本、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA或尿液脱落细胞中的一种或几种。在优选的实施方案中，所述待测受试者的样本包括待测受试者的胃组织，例如胃活检样本，所述对照样本来源于健康受试者的胃组织，例如胃活检样本，或待测受试者的健康组织，例如癌旁组织。在优选的实施方案中，所述待测受试者的样本为循环肿瘤细胞。
如本文所用，所述预后和预前胃癌患者的样本包括受试者的临床生物样本，包括但不限于血清、血浆、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、组织、器官、石蜡切片、肿瘤组织、活检样本、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA或尿液脱落细胞中的一种或几种。在优选的实施方案中，所述预后和预前胃癌患者的样本包括待测受试者的胃组织，例如胃活检样本。在优选的实施方案中，所述预后和预前胃癌患者的样本为循环肿瘤细胞。
如本文所用，检测待测受试者的样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达的试剂没有特别限制，并且是本领域技术人员熟知且容易获得的用于检测受试者样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在mRNA或蛋白质水平上的表达的试剂。例如，用于检测受试者样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达的试剂可以包括用于实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白/肽段芯片检测、化学发光、免疫印迹、微珠免疫检测、微流控免疫的相应试剂。
本发明的有益效果
本发明人已发现，HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在胃癌患者中的表达水平高于健康人群中的表达水平。更特别地，本发明人发现，HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的高水平表达，尤其是这三者在联合使用时，在用于诊断胃癌时具有良好的灵敏度和特异性，并且与胃癌患者的预后相关，因此可以作为用于胃癌诊断和预后判断的生物标志物。此外，本发明还发现可以通过收获受试者的循环肿瘤细胞并检测其中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平来对胃癌进行诊断和预后判断。
附图说明
图1显示了HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在胃癌组织样本和癌旁正常组织样本中的表达水平。
图2显示了HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在胃癌患者循环肿瘤细胞中的表达水平。
图3显示了HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在人胃癌细胞AGS、BGC-823、MGC-803和人正常胃上皮细胞EGS1中的表达水平。
图4显示了在干扰HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达后，人胃癌细胞AGS的迁移能力（图4A）和侵袭能力（图4B）的变化。
图5显示了HECW2、ANKFY1和ARHGAP31单独和联合地在胃癌患者与健康人群中的ROC曲线分析。
图6显示了HECW2、ANKFY1和ARHGAP31单独和联合地在胃癌患者中的Kaplan-Meier生存曲线分析。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：人胃癌与配对正常组织的表达谱芯片分析
肿瘤基因组图谱(TCGA)计划由美国National Cancer Institute(NCI)和National Human Genome Research Institute(NHGRI)于2006年联合启动的项目，利用大规模测序为主的基因组分析技术，针对36种癌症进行大规模实验，TCGA基因组分析中心(GCC)比对肿瘤和正常组织，寻找与各癌症或者亚型相关的基因突变、扩增或者缺失。为理解癌症的分子机制，提高人们对癌症发病分子基础的科学认识提供帮助。
TCGA标准方法下载226对胃癌组织和正常组织的全基因表达谱数据及临床信息，统计分析采用R语言(3.1.1版本)软件，需安装及加载的程序包(heatmap，venndiagram，hist等)，然后用DESeq和edgeR程序包进行分析，找出差异表达的基因。判断标准：(1)癌/癌旁的表达量<-2，(2)P<0.05，(3)在胃癌中未被报道。最终筛选到在胃癌中显著高表达的三种基因，即HECW2、ANKFY1和ARHGAP31。
实施例2：HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在胃癌中高表达
收集临床85例胃癌组织样本和49例癌旁正常组织样本，分别使用TRIzol法提取上述胃癌组织样本和癌旁正常组织样本的RNA，利用RT-qPCR方法分别检测HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的mRNA水平。结果如图1所述，其证实HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在胃癌中高表达。
实施例3：胃癌患者的循环肿瘤细胞中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31表达水平的检测
1）抽取胃癌患者静脉血10mL于ACD抗凝管中，常规离心分离血浆备用；
2）对血浆中CTC细胞进行富集及分离，具体步骤为：通过向血浆中加入样本密度分离液（Cytelligen）提取血浆中单细胞层，之后加入免疫细胞去除磁珠对所提取单细胞层中的CD45+免疫细胞进行去除，通过差向富集对单细胞层中CTC进行浓缩及富集；
3）离心收获富集的CTC细胞，加入1ml的RNA裂解液吸至无酶EP管中；向EP管中加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒，室温静止3min，反复3次；12000×g、4℃离心15min；将上层水相加入新的无酶的EP管，在EP管中加入等体积异丙醇，颠倒、混匀，静置10min；12000×g、4℃离心15min；弃掉EP管液体，加入75％的乙醇1ml，震荡EP管；12000×g、4℃离心5min；弃净上清后室温放置干燥；加入适量DEPC水溶解RNA；检测RNA的纯度和浓度并通过RT-qPCR检测CTC细胞中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达，并将其与收获自正常胃组织的细胞中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达进行比较，结果如图2所述，其证实HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在胃癌患者CTC细胞中高表达。
实施例4：HECW2、ANKFY1和ARHGAP31影响胃癌细胞的侵袭及迁移
将人胃癌细胞AGS和人正常胃上皮细胞EGS1用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(含100U·mL-1青霉素和0.1mg·mL-1链霉素)，于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。
将培养的细胞消化收集后如实施例3所述提取RNA并通过RT-qPCR检测正常细胞及癌细胞中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达。结果如图3所示，其显示HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在人胃癌细胞AGS、BGC-823、MGC-803中的表达均高于在人正常胃上皮细胞EGS1中的表达。
通过siRNA干扰HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在胃癌细胞中的表达(siRNA序列：siNC：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUUCAUACTT-3’(SEQ ID No.1)；siHECW2：5’-GAGGACGUCAGGAUUCACUCAAUGATT-3’(SEQ ID No.2); siANKFY1：5’-GCUAAUCCUGAGGUGACGAUGACAATT-3’(SEQ ID No.3)；siARHGAP31：5’-GCCAUUCCCAUUGCUGACCUCUUCUTT-3’(SEQ ID No.4))(干扰结果如图3所示)，然后进行Transwell细胞迁移及侵袭实验验证，其结果分别如图4A和B所示，其显示在干扰HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达后，人胃癌细胞AGS的迁移能力和侵袭能力有所下降，其中同时干扰HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达时的下降更为显著。
实施例5：HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的胃癌诊断价值
利用实施例2测定的HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在胃癌组织样本和癌旁正常组织样本中的mRNA水平通过受试者工作曲线(ROC)对HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的独立诊断及联合诊断实验结果进行分析。结果如图5所示，其显示HECW2（灵敏度49.41％，特异性85.71％）、ANKFY1（灵敏度65.88％，特异性79.59％）和ARHGAP31（灵敏度76.47％，特异性71.43％）mRNA表达对胃癌具有良好的诊断效果，但联合诊断效果最佳，ROC曲线下面积AUC(areaunder the ROC curve)＝0.9580，灵敏度可达84.71％，特异性可达91.84％。从此结果可知，单独的HECW2、ANKFY1和ARHGAP31具有一定的诊断效用，但诊断特异性和灵敏度仍不足，而三者联合使用时可以实现优异的灵敏度和特异性。因此，HECW2、ANKFY1和ARHGAP31可以用于单独和联合诊断胃癌。
实施例6：HECW2、ANKFY1和ARHGAP31与胃癌临床预后的关系
利用实施例2测定的HECW2、ANKFY1和ARHGAP31在胃癌组织样本和癌旁正常组织样本中的mRNA水平，统计分析HECW2、ANKFY1和ARHGAP31与胃癌患者的整体生存率的关系。结果如图6所示，可以看出，HECW2低表达(HECW2Low+ANKFY1High+ARHGAP31High)、ANKFY1低表达(HECW2High+ANKFY1Low+ARHGAP31High)或ARHGAP31低表达(HECW2High+ANKFY1High+ARHGAP31Low)的胃癌患者组的五年总体生存率高于HECW2、ANKFY1和ARHGAP31高表达(HECW2High+ANKFY1High+ARHGAP31High)的胃癌患者组，并且HECW2、ANKFY1和ARHGAP31三者同时低表达(HECW2Low+ANKFY1Low+ARHGAP31Low)的胃癌患者组的五年总体生存率出人意料地非常高。这说明：HECW2、ANKFY1和ARHGAP31高表达与胃癌患者的不良预后有关，当HECW2、ANKFY1和ARHGAP31均低表达时，可以指示胃癌患者的良好预后。
需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于胃癌诊断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为HECW2、ANKFY1和ARHGAP31。
2.一种用于胃癌预后判断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为HECW2、ANKFY1和ARHGAP31。
3.一种用于胃癌诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测HECW2、ANKFY1和ARHGAP31表达的试剂。
4.一种用于胃癌预后判断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测HECW2、ANKFY1和ARHGAP31表达的试剂。
5.检测HECW2、ANKFY1和ARHGAP31表达的试剂在制备用于胃癌的诊断的工具中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述胃癌的诊断包括以下步骤：
（1）收集待测受试者的样本，和收集对照样本；
所述对照样本来源于健康人群或待测受试者的健康组织，
所述待测受试者的样本为血清、血浆、全血、脓液、器官、肿瘤组织、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA或尿液脱落细胞中的一种或几种；
（2）检测并比较待测受试者样本和对照样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平；
如果待测受试者的样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平与对照样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平相比升高，则诊断所述待测受试者患有胃癌或处于患有胃癌的风险中。
7.检测HECW2、ANKFY1和ARHGAP31表达的试剂在制备用于胃癌的预后判断的工具中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述胃癌的预后判断包括以下步骤：
（1）收集预后胃癌患者的样本为待测组，并以预前胃癌患者的样本为对照组；
（2）检测并比较待测组和对照组的样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平；
如果待测组样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平与对照组样本中HECW2、ANKFY1和ARHGAP31的表达水平相比降低，则判断待测组的预后良好。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述预后和预前胃癌患者的样本包括血清、血浆、全血、脓液、器官、肿瘤组织、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA或尿液脱落细胞中的一种或几种。
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