CN113981087A - 一种用于辅助诊断胃癌的生物标志物及其应用 - Google Patents

一种用于辅助诊断胃癌的生物标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药检测领域，具体地说，涉及一种用于辅助诊断胃癌的生物标志物及其应用，采用烟酰胺磷酸核糖基转移酶作为辅助诊断胃癌的标志物，用于制备检测胃癌的诊断试剂或试剂盒，其中诊断试剂或者试剂盒对胃癌的检测所用的样本为血清、血浆或者体液。本发明的优点：绘制ROC曲线表明相较CEA和CA19‑9,NAMPT具有更好的特异性和敏感性、为NAMPT作为胃癌早期风险预测指标提供了实验依据。而三者联合辅助诊断胃癌的阳性率为90％。采用酶联免疫吸附试验检测胃癌患者手术前血清中NAMPT的水平，通过回顾性分析发现术前高NAMPT水平的胃癌患者生存率显著较差。这提示高NAMPT胃癌预后不良的潜在标志物。

Description

一种用于辅助诊断胃癌的生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药检测领域，具体地说，涉及一种用于辅助诊断胃癌的生物标志物及其应用。
背景技术
在全球范围内，胃癌(gastric cancer，GC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，95％左右的胃癌为腺癌，未经治疗者平均生存时间约为1年，因此占据恶性肿瘤发病和死亡的第二位和第三位，严重威胁到人类健康。我国是胃癌的发病大国，发病率约占全球的50％，且胃癌患者5年生存率只有20-30％。其主要原因为胃癌的临床特点和生物学行为，在发病早期不明显，且恶性程度较高、易发生转移，缺乏有效的筛查及治愈手段，因此大多数患者确诊时处于中晚期，导致放化疗敏感性差，预后不良，5年生存率低。
目前，胃癌的病因和发病机制尚未完全明了,胃癌的发生发展是多因素、多阶段和多步骤的复杂过程，涉及大量的分子参与和复杂的网络调控。有研究证据显示，幽门螺杆菌感染、烟草、酒精、多环芳烃化合物、N-亚硝基化合物暴露等被认为是胃癌发生的重要环境因素，而遗传背景不同的个体之间则存在胃癌易感性差异。从胃癌的发生发展全过程(正常粘膜→炎症→癌前病变→早期胃癌→进展期胃癌)中找出其中的关键分子，并确定为胃癌高危预警、早期诊断和有效治疗的生物标志物，是研究者们希望解决的关键科学问题。
胃癌的筛检和早期诊断主要通过粪便潜血试验(FOBT)和胃镜检查。FOBT便于组织实施且价格低廉，但灵敏度和特异度较差。胃镜检查为目前诊断癌前病变和早期癌最有效的手段，但检查成本较高、具有一定的侵入性，且可能伴随并发症，给被检查者带来不适，导致该检查在人群中推广性较低，而且对癌前病变及微小癌症的诊断也存在一定的局限性。因此，发现新型、非侵入性、高灵敏度、高特异度的早期诊断标志物，提高癌前病变和早期癌的检出率，从而实施针对性的治疗，对我国人群胃癌的防治具有重要的临床意义与应用前景。
烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nicotinamide phosphoribosyl transferase,NAMPT)是一种具有生物活性的多效细胞因子，特别是在影响其代谢和免疫力方面。有文献报道显示，NAMPT在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、胃癌和几种造血系统恶性肿瘤中均高表达，并且在肉瘤、乳腺癌、甲状腺癌和前列腺癌中NAMPT高表达与肿瘤浸润，转移潜力和化疗耐药性相关。NAMPT参与细胞内的生物能量和脂质代谢，是生物合成NAD最主要途径的关键限速酶，抑制NAMPT会导致NAD耗竭，进而抑制ATP合成，最终影响癌细胞增殖和凋亡。NAMPT通过可逆的催化将磷酸核糖基残基从5'-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)转移到NAM，从而产生NMN，然后将其转化烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶(NMNAT)合成NAD。NAMPT活性的微小改变可能会极大地影响NAD的生物合成和NAD依赖的细胞途径，对DNA修复、信号传导、转录和细胞凋亡中起着至关重要的作用，因此NAMPT有可能成为新的潜在抗癌靶标之一，检测NAMPT是否高表达，对肿瘤的鉴别、诊断、治疗和预后判断均有重要意义。
SCI期刊《Ann Transl Med》在2019Dec；7(23):785.刊登的论文Relationshipbetween NAMPT/PBEF/visfatin and prognosis of patients with malignant tumors:asystematic review and meta-analysis.Ann Transl Med.研究发现NAMPT可能是胃癌的致癌因子，在胃癌发生发展过程中起着重要作用。Zhao W等人在《Mol Med Rep》发表论文High glucose promotes gastric cancer chemoresistance in vivo and in vitro.同样表明NAMPT在胃癌组织中高表达，且NAMPT高表达总生存率降低。因此NAMPT可能是一种有价值的肿瘤生物标志物，也是胃癌患者生存的预测指标。
发明内容
本发明有两个目的：第一是针对现有对胃癌早期诊断、风控、监测及预后判断等技术中的不足，提供烟酰胺磷酸核糖基转移酶作为胃癌生物标志物的用途；第二是提供一种用于检测胃癌的诊断试剂盒；第三提供烟酰胺磷酸核糖基转移酶特异性抗体的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于辅助诊断胃癌的生物标志物，采用烟酰胺磷酸核糖基转移酶作为辅助诊断胃癌的标志物，用于制备检测胃癌的诊断试剂或试剂盒，其中诊断试剂或者试剂盒对胃癌的检测所用的样本为血清、血浆或者体液。
优选地，诊断试剂或者试剂盒对胃癌的检测所用的样本为血清，诊断试剂或者试剂盒包含测定血清中NAMPT含量的试剂；测定血清中NAMPT含晕的试剂为NAMPT的特异性抗体。
一种用于辅助诊断胃癌的生物标志物的应用，标本的收集与保存：受试者标本通过手术离体后马上留取胃癌组织和癌旁组织，分别为冰冻及石蜡组织标本2份，癌旁组织至少距离胃癌病灶2cm以上，采用冻存管保存标本并编号，分装后立刻放入一80℃冰箱中冷冻保存至检测；采集研究对象外周静脉血10ml，按标准流程在2小时内完成离心，分离血清、白细胞和红细胞，各分装成3份保存到1.5ml冻存管中，置于一80℃深低温冰箱保存备用；同时，收集胃良性病变和健康对照人群，来自同一个医院的同期体检病人，并按年龄、性别与病例进行匹配；病理信息以及临床诊治资料从医院病案摘录。
优选地，应用过程如下：
1)NAMPT表达水平与胃癌的关系：评价胃癌患者血液中NAMPT高表达水平的特异性和显著性；评价NAMPT在胃癌及癌旁组织中的表达；
2)NAMPT相关遗传变异的生物学功能与胃癌发生的关联，及其与环境因素交互作用：外周血NAMPT基因组DNA抽提与质检；遗传变异的生物信息学分析及功能研究；遗传变异的检测分型；
3)NAMPT对胃癌病人生存率的影响：评价NAMPT表达差异对病人生存率的影响，统计分析300例胃癌患者血清NAMPT水平差异对胃癌病人10年生存率影响。
优选地，其中评价胃癌患者血液中NAMPT高表达水平的特异性和显著性，是指通过单因素方差分析发现胃癌病人NAMPT偏高比例相对于其他癌症病人和正常体检人群具有显著性差异，表明NAMPT在胃癌人群中特异性表达；胃良性病变及正常对照者血清NAMPT水平存在差异；进一步单因素分析结果发现，胃癌癌患者血清NAMPT水平与淋巴结转移、TNM分期和BMI等因素相关。
优选地，评价NAMPT在胃癌及癌旁组织中的表达，是指对公开获得的人类胃癌数据库的NAMPT表达水平进行生物信息学分析，采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)，免疫组化实验和免疫印迹实验检测300例胃癌病人的癌和癌旁组织中的NAMPT表达和分布，根据NAMPT表达水平对患者进行分类，结合临床数据进行绘制Kaplan–Meier生存曲线，评价NAMPT表达水平与预后不良的关系。
优选地，其中NAMPT表达水平与胃癌的关系具体操作如下：
(1)采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)：①总RNA提取：取冻存组织，在液氮中研磨成粉状，提取总体RNA，按Trizol试剂说明提取组织总RNA，②引物设计：以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参，退火温度为60℃，根据NAMPT和GAPDH上游下游引物序列，扩增产物长度分别为110bp和150bp，③RT-PCR实验：紫外分光光度计对提取的组织总RNA定量后，按试剂盒说明，反转录成c DNA，预实验优化PCR反应条件，扩增目的基因，④采用相对定量的方法：以GAPDH基因m RNA的表达为内参基因,检测各组NAMPT的积分光密度值，依据公式计算出各组NAMPT积分光密度值之间的倍数，此倍数值的大小则反映了各组NAMPT4mRNA的表达量，比较各组的NAMPT 4mRNA的表达量有无统计学差异；
(2)采用蛋白质印迹法(Western Blot)：按RIPA裂解液说明提取组织中的总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。每孔加约70μg蛋白，用10％的SDS-PAGE凝胶电泳分离，湿转法(300mA，1.5h)将蛋白转移至PVDF膜，孔径为0.45μm；5％脱脂奶粉TBST中封闭1h，后加入NAMPT一抗，1:1500稀释，4℃摇床过夜，HRP标记的兔二抗IgG(1:2000稀释)室温孵育1h，ECL化学发光显色，以等量GAPDH作为内参，试验重复3次，使用凝胶成像系统分析软件统计，以目的条带灰度值与同样本的GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的表达水平；
(3)免疫组化染色SP法检测：胃癌和3癌旁组织标本均用甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚度4μm，常规脱蜡水化，PH7.0的柠檬酸钠缓冲液对抗原进行微波修复，按试剂盒说明SP法免疫组化染色，一抗浓度为1∶400，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，用已知的NAMPT阳性的癌症组织作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。
优选地，外周血NAMPT基因组DNA抽提与质检，采用改良盐析法抽提外周血基因组DNA，采用NanoDrop2000核酸仪测定DNA浓度与纯度。
优选地，遗传变异的生物信息学分析及功能研究，根据生物信息学分析定位的影响NAMPT水平的潜在功能位点，设计相应的分子生物学实验明确影响NAMPT水平的功能位点；
1)采用双荧光素酶报告基因实验分析遗传变异对基因转录的影响；
2)采用凝胶阻滞实验(EMSA)检测遗传变异对基因转录后调控的影响；
3)采用荧光素报告基因实验检测遗传变异对miRNA结合的影响；
4)采用ELISA检测遗传变异对NAMPT水平的影响。
优选地，遗传变异的检测分型，采用Sequenom MassArray分型法对NAMPT水平相关多态位点进行分型，该平台结合了单碱基引物延伸反应与灵敏可靠的MALDI-TOF质谱技术，分型技术可靠，灵敏度、特异性较高而成本较低。
本发明优点在于：
绘制ROC曲线表明相较CEA和CA19-9,NAMPT具有更好的特异性和敏感性、为NAMPT作为胃癌早期风险预测指标提供了实验依据。而三者联合辅助诊断胃癌的阳性率为90％。采用酶联免疫吸附试验检测胃癌患者手术前血清中NAMPT的水平，通过回顾性分析发现术前高NAMPT水平的胃癌患者生存率显著较差。这提示高NAMPT胃癌预后不良的潜在标志物。首次通过NAMPT相关遗传变异的生物学功能与胃癌发生的关联，及其与环境因素交互作用，阐明NAMPT在胃癌早期诊断和预后判断中的临床价值。
在20例胃癌患者组织中NAMPT蛋白的表达集中在胃癌组织，并且分期越高表达水平越高，结果表明NAMPT是强致胃癌基因。
附图说明
图1为胃癌患者临床肿瘤标本中NAMPT在胃癌组织和癌旁组织的表达水平图；
图2为血清NAMPT水平的总体生存分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
研究对象的纳入标准：⑴病理证实的初诊胃癌患者；⑵可手术，且能获得术后组织标本；⑶具备完整的临床、病理资料；⑷肝、肾功能均正常，体重指数(BMI)为20.00～30.00kg/m2。排除标准：⑴既往或同时性其他器官的恶性肿瘤；⑵曾在外院接受手术、化疗等其它治疗者；⑶严重糖尿病、严重感染、免疫系统疾病、肝肾疾病。且本项目已获申报单位伦理委员会的审查同意。本研究所需的生物样本在获取前均需获得患者同意。
标本的收集与保存：受试者标本通过手术离体后马上留取胃癌组织和癌旁组织，分别为冰冻及石蜡组织标本2份，癌旁组织至少距离胃癌病灶2cm以上，采用冻存管保存标本并编号，分装后立刻放入一80℃冰箱中冷冻保存至检测。采集研究对象外周静脉血10ml，按标准流程在2小时内完成离心，分离血清、白细胞和红细胞，各分装成3份保存到1.5ml冻存管中，置于一80℃深低温冰箱保存备用。同时，收集胃良性病变和健康对照人群，来自同一个医院的同期体检病人，并按年龄、性别与病例进行匹配。病理信息以及临床诊治资料从医院病案摘录。
1)NAMPT表达水平与胃癌的关系
评价胃癌患者血液中NAMPT高表达水平的特异性和显著性
胃癌患者中NAMPT表达水平的情况：本研究小组通过对大规模人群的血液中NAMPT进行统计和分析。我们发现胃癌病人血液中的NAMPT含量偏高(＞16.28ng/ml)的人数比例18.32％高于其他癌症病人和正常体检人群中NAMPT偏高比例8.65％。此外我们通过单因素方差分析发现胃癌病人NAMPT偏高比例相对于其他癌症病人和正常体检人群具有显著性差异(P＜0.05)，表明NAMPT在胃癌人群中特异性表达。
胃良性病变及正常对照者血清NAMPT水平存在差异，且差异具有统计学意义(P<0.05)(详见表1)。进一步单因素分析结果发现，胃癌癌患者血清NAMPT水平与淋巴结转移、TNM分期和BMI等因素相关(P<0.05)(详见表2)。
表1三组受试者血清NAMPT水平的差异(平均值±SD，ng/ml)
Figure BDA0003355762740000071
注：P<0.05具有有统计学差异
表2单因素分析血清NAMPT水平与病理特征的相关性
Figure BDA0003355762740000081
评价NAMPT在胃癌及癌旁组织中的表达
对公开获得的人类胃癌数据库的NAMPT表达水平进行生物信息学分析。采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)，免疫组化实验和免疫印迹实验检测300例胃癌病人的癌和癌旁组织中的NAMPT表达和分布，根据NAMPT表达水平(高表达组和低表达组)对患者进行分类，结合临床数据进行绘制Kaplan–Meier生存曲线，评价NAMPT表达水平与预后不良的关系。
具体操作如下：
(1)采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)：①总RNA提取：取冻存组织，在液氮中研磨成粉状，提取总体RNA，按Trizol试剂说明提取组织总RNA。②引物设计：以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参，退火温度为60℃，根据NAMPT和GAPDH上游下游引物序列，扩增产物长度分别为110bp和150bp。③RT-PCR实验：紫外分光光度计对提取的组织总RNA定量后，按试剂盒说明，反转录成c DNA，预实验优化PCR反应条件，扩增目的基因。④采用相对定量的方法：以GAPDH基因m RNA的表达为内参基因,检测各组NAMPT的积分光密度值，依据公式计算出各组NAMPT积分光密度值之间的倍数，此倍数值的大小则反映了各组NAMPT4mRNA的表达量。比较各组的NAMPT 4mRNA的表达量有无统计学差异。
(2)采用蛋白质印迹法(Western Blot)：按RIPA裂解液说明提取组织中的总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。每孔加约70μg蛋白，用10％的SDS-PAGE凝胶电泳分离，湿转法(300mA，1.5h)将蛋白转移至PVDF膜(孔径为0.45μm)。5％脱脂奶粉TBST中封闭1h，后加入NAMPT一抗(1:1500稀释)，4℃摇床过夜。HRP标记的兔二抗IgG(1:2000稀释)室温孵育1h，ECL化学发光显色。以等量GAPDH作为内参，试验重复3次，使用凝胶成像系统分析软件统计，以目的条带灰度值与同样本的GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
(3)免疫组化染色SP法检测：胃癌和3癌旁组织标本均用甲醛固定，石蜡包埋，连续切片(厚度4μm)，常规脱蜡水化，PH7.0的柠檬酸钠缓冲液对抗原进行微波修复，按试剂盒说明SP法免疫组化染色，一抗浓度为1∶400，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。用已知的NAMPT阳性的癌症组织作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。
在20例胃癌患者组织中NAMPT蛋白的表达集中在胃癌组织，并且分期越高表达水平越高(见表3)，这与之前研究发现NAMPT是强致癌基因相符。
表3 NAMPT，SIRT1/PARP在胃癌及癌旁组织中表达情况
Figure BDA0003355762740000091
胃癌患者临床肿瘤标本中NAMPT在胃癌组织和癌旁组织的表达水平(如图1)。
图1通过免疫组织化学检测NAMPT：(A)NAMPT在癌旁组织阴性表达和(B)NAMPT在癌旁组织的低表达，(C)胃癌组织中NAMPT的低表达,(D)胃癌组织中NAMPT的高表达。(E)NAMPT在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(T：胃癌组织，N：癌旁组织)。
2)NAMPT相关遗传变异的生物学功能与胃癌发生的关联，及其与环境因素交互作用
(1)外周血NAMPT基因组DNA抽提与质检
采用改良盐析法抽提外周血基因组DNA，采用NanoDrop2000核酸仪测定DNA浓度与纯度。
(2)遗传变异的生物信息学分析及功能研究
根据生物信息学分析定位的影响NAMPT水平的潜在功能位点，设计相应的分子生物学实验明确影响NAMPT水平的功能位点。
1)采用双荧光素酶报告基因实验分析遗传变异对基因转录的影响。
2)采用凝胶阻滞实验(EMSA)检测遗传变异对基因转录后调控的影响。
3)采用荧光素报告基因实验检测遗传变异对miRNA结合的影响。
4)采用ELISA检测遗传变异对NAMPT水平的影响。
(3)遗传变异的检测分型
采用Sequenom MassArray分型法对NAMPT水平相关多态位点进行分型，该平台结合了单碱基引物延伸反应与灵敏可靠的MALDI-TOF质谱技术，分型技术可靠，灵敏度、特异性较高而成本较低。
3)NAMPT对胃癌病人生存率的影响
评价NAMPT表达差异对病人生存率的影响，统计分析300例胃癌患者血清NAMPT水平差异对胃癌病人10年生存率影响详见(图2)。

Claims (10)

1.一种用于辅助诊断胃癌的生物标志物，其特征在于：采用烟酰胺磷酸核糖基转移酶作为辅助诊断胃癌的标志物，用于制备检测胃癌的诊断试剂或试剂盒，其中诊断试剂或者试剂盒对胃癌的检测所用的样本为血清、血浆或者体液。
2.根据权利要求1所述的一种用于辅助诊断胃癌的生物标志物，其特征在于：诊断试剂或者试剂盒对胃癌的检测所用的样本为血清，诊断试剂或者试剂盒包含测定血清中NAMPT含量的试剂；测定血清中NAMPT含晕的试剂为NAMPT的特异性抗体。
3.一种如权利要求2所述的用于辅助诊断胃癌的生物标志物的应用，其特征在于：
标本的收集与保存：受试者标本通过手术离体后马上留取胃癌组织和癌旁组织，分别为冰冻及石蜡组织标本2份，癌旁组织至少距离胃癌病灶2cm以上，采用冻存管保存标本并编号，分装后立刻放入一80℃冰箱中冷冻保存至检测；采集研究对象外周静脉血10ml，按标准流程在2小时内完成离心，分离血清、白细胞和红细胞，各分装成3份保存到1.5ml冻存管中，置于一80℃深低温冰箱保存备用；同时，收集胃良性病变和健康对照人群，来自同一个医院的同期体检病人，并按年龄、性别与病例进行匹配；病理信息以及临床诊治资料从医院病案摘录。
4.权利要求3所述的用于辅助诊断胃癌的生物标志物的应用，其特征在于：应用过程如下：
1)NAMPT表达水平与胃癌的关系：评价胃癌患者血液中NAMPT高表达水平的特异性和显著性；评价NAMPT在胃癌及癌旁组织中的表达；
2)NAMPT相关遗传变异的生物学功能与胃癌发生的关联，及其与环境因素交互作用：外周血NAMPT基因组DNA抽提与质检；遗传变异的生物信息学分析及功能研究；遗传变异的检测分型；
3)NAMPT对胃癌病人生存率的影响：评价NAMPT表达差异对病人生存率的影响，统计分析300例胃癌患者血清NAMPT水平差异对胃癌病人10年生存率影响。
5.权利要求4所述的用于辅助诊断胃癌的生物标志物的应用，其特征在于：其中评价胃癌患者血液中NAMPT高表达水平的特异性和显著性，是指通过单因素方差分析发现胃癌病人NAMPT偏高比例相对于其他癌症病人和正常体检人群具有显著性差异，表明NAMPT在胃癌人群中特异性表达；胃良性病变及正常对照者血清NAMPT水平存在差异；进一步单因素分析结果发现，胃癌癌患者血清NAMPT水平与淋巴结转移、TNM分期和BMI等因素相关。
6.权利要求4所述的用于辅助诊断胃癌的生物标志物的应用，其特征在于：评价NAMPT在胃癌及癌旁组织中的表达，是指对公开获得的人类胃癌数据库的NAMPT表达水平进行生物信息学分析，采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)，免疫组化实验和免疫印迹实验检测300例胃癌病人的癌和癌旁组织中的NAMPT表达和分布，根据NAMPT表达水平对患者进行分类，结合临床数据进行绘制Kaplan–Meier生存曲线，评价NAMPT表达水平与预后不良的关系。
7.权利要求4所述的用于辅助诊断胃癌的生物标志物的应用，其特征在于：其中NAMPT表达水平与胃癌的关系具体操作如下：
(1)采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)：①总RNA提取：取冻存组织，在液氮中研磨成粉状，提取总体RNA，按Trizol试剂说明提取组织总RNA，②引物设计：以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参，退火温度为60℃，根据NAMPT和GAPDH上游下游引物序列，扩增产物长度分别为110bp和150bp，③RT-PCR实验：紫外分光光度计对提取的组织总RNA定量后，按试剂盒说明，反转录成c DNA，预实验优化PCR反应条件，扩增目的基因，④采用相对定量的方法：以GAPDH基因m RNA的表达为内参基因,检测各组NAMPT的积分光密度值，依据公式计算出各组NAMPT积分光密度值之间的倍数，此倍数值的大小则反映了各组NAMPT 4mRNA的表达量，比较各组的NAMPT 4mRNA的表达量有无统计学差异；
(2)采用蛋白质印迹法(Western Blot)：按RIPA裂解液说明提取组织中的总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。每孔加约70μg蛋白，用10％的SDS-PAGE凝胶电泳分离，湿转法(300mA，1.5h)将蛋白转移至PVDF膜，孔径为0.45μm；5％脱脂奶粉TBST中封闭1h，后加入NAMPT一抗，1:1500稀释，4℃摇床过夜，HRP标记的兔二抗IgG(1:2000稀释)室温孵育1h，ECL化学发光显色，以等量GAPDH作为内参，试验重复3次，使用凝胶成像系统分析软件统计，以目的条带灰度值与同样本的GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的表达水平；
(3)免疫组化染色SP法检测：胃癌和3癌旁组织标本均用甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚度4μm，常规脱蜡水化，PH7.0的柠檬酸钠缓冲液对抗原进行微波修复，按试剂盒说明SP法免疫组化染色，一抗浓度为1∶400，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，用已知的NAMPT阳性的癌症组织作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。
8.权利要求4所述的用于辅助诊断胃癌的生物标志物的应用，其特征在于：外周血NAMPT基因组DNA抽提与质检，采用改良盐析法抽提外周血基因组DNA，采用NanoDrop2000核酸仪测定DNA浓度与纯度。
9.权利要求4所述的用于辅助诊断胃癌的生物标志物的应用，其特征在于：遗传变异的生物信息学分析及功能研究，根据生物信息学分析定位的影响NAMPT水平的潜在功能位点，设计相应的分子生物学实验明确影响NAMPT水平的功能位点；
1)采用双荧光素酶报告基因实验分析遗传变异对基因转录的影响；
2)采用凝胶阻滞实验(EMSA)检测遗传变异对基因转录后调控的影响；
3)采用荧光素报告基因实验检测遗传变异对miRNA结合的影响；
4)采用ELISA检测遗传变异对NAMPT水平的影响。
10.权利要求4所述的用于辅助诊断胃癌的生物标志物的应用，其特征在于：遗传变异的检测分型，采用Sequenom MassArray分型法对NAMPT水平相关多态位点进行分型，该平台结合了单碱基引物延伸反应与灵敏可靠的MALDI-TOF质谱技术，分型技术可靠，灵敏度、特异性较高而成本较低。
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