CN117604112B - 用于胰腺癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于胰腺癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用。更具体地，本发明涉及一种用于胰腺癌的诊断和预后判断的生物标志物，所述生物标志物是ZNF469和/或CHST14。本发明人已发现，ZNF469和CHST14在胰腺癌患者中的表达水平明显高于健康人群中的表达水平。更特别地，本发明人发现，ZNF469和/或CHST14的高水平表达在用于诊断胰腺癌时具有良好的灵敏度和特异性，并且与胰腺癌患者的预后相关，因此可以作为用于胰腺癌诊断和预后判断的生物标志物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于胰腺癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用。
背景技术
胰腺癌是一组主要起源于胰腺导管上皮及腺泡细胞的恶性肿瘤，恶性程度极高，起病隐匿，早期诊断困难，进展迅速，生存时间短，是预后最差的恶性肿瘤之一，被称为"癌中之王”。
目前主要根据胰腺癌的组织来源对其进行分类，常见的为导管上皮发生的导管腺癌、起源于腺泡细胞的腺泡细胞癌和胰岛细胞发生的胰岛细胞癌，导管腺癌约占90%，腺泡细胞癌占9%，其余占1%左右。
由于胰腺癌生长部位隐蔽，且缺乏特征性临床表现，因而早期诊断至今仍比较困难。因此，长期以来许多学者一直在致力于敏感性、特异性更高的胰腺癌诊断技术的研究，以期提高早诊、早治率，进一步改善疗效。但目前对于大多数胰腺癌的诊断仍需赖于临床症状及体征并结合相应的影像学方面的检查。目前胰腺癌的治疗主张手术、放疗、化疗、内镜治疗、生物治疗、对症及支持等综合治疗。
近年来有许多涉及胰腺癌转移鉴别的研究，为上述领域的探索提供了很有前景的研究策略，但是迄今为止报道的胰腺癌的生物标志物仍然较少，不能满足临床诊断和治疗的需要。PDX1是胰腺发育和β细胞成熟的关键转录因子，已有研究报道PDX1在胰腺癌细胞中过度表达，但在每个癌症阶段其作用不同。虽然PDX1已经被报道为胰腺癌中潜在的癌症标志物，但它的作用尚未得到详细研究。因此寻找新的有效的生物标志物，对于实现胰腺癌的个体化精准诊断和治疗具有重要的意义。
循环肿瘤细胞是从原发肿瘤或者转移肿瘤上脱落下来、释放进入血液循环中的一群肿瘤细胞亚群。近些年的研究发现，一方面，循环肿瘤细胞在肿瘤发生的很早期就可能出现在患者的外周血中，这为癌症的早期诊断提供了帮助。另一方面，这些循环肿瘤细胞还可以用来预测癌症患者的预后，循环肿瘤细胞的发现往往预示着肿瘤的复发或转移，这也提示患者的预后不良。如何使用循环肿瘤细胞来对癌症尤其是特定癌症例如胰腺癌进行诊断或者预后，这也是我们未来在循环肿瘤细胞系列探索中的一个重要方向。使用循环肿瘤细胞进行诊断或预后的一大好处是其可以有效替代肿瘤活检，对于那些无法进行病理组织活检的患者，这是一个很好的替代指标，它可以帮助临床医生实时地对癌症的生物学特征进行动态监测和判断。然而，由于循环肿瘤细胞数量稀少，利用其作为诊断癌症尤其是特定癌症例如胰腺癌的手段存在挑战，并非所有的癌症相关标志物都可以在循环肿瘤细胞中被检测到。因此，寻找适用于借助循环肿瘤细胞进行诊断的生物标志物具有重要的临床价值。
发明内容
为了解决上述问题，本发明人已发现，ZNF469和CHST14在胰腺癌患者中的表达水平明显高于健康人群中的表达水平。更特别地，本发明人发现，ZNF469和/或CHST14的高水平表达在用于诊断胰腺癌时具有良好的灵敏度和特异性，并且与胰腺癌患者的预后相关，因此可以作为用于胰腺癌诊断和预后判断的生物标志物。
如本文所用，ZNF469是锌指蛋白469（zinc finger protein 469，ZNF469）的简称，其NCBI Gene ID为84627。
如本文所用，CHST14是碳水化合物磺基转移酶14（carbohydratesulfotransferase 14，CHST14）的简称，其NCBI Gene ID为113189。
具体地，本发明提供了一种用于胰腺癌诊断的生物标志物，其中所述生物标志物是ZNF469和/或CHST14。
在其他方面，本发明还提供了一种用于胰腺癌预后判断的生物标志物，其中所述生物标志物是ZNF469和/或CHST14。
在其他方面，本发明还提供了一种用于胰腺癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测ZNF469和/或CHST14表达的试剂。
在其他方面，本发明还提供了一种用于胰腺癌预后判断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测ZNF469和/或CHST14表达的试剂。
在其他方面，本发明还提供了检测ZNF469和/或CHST14表达的试剂在制备用于胰腺癌的诊断的工具中的用途。
在其他方面，本发明还提供了检测ZNF469和/或CHST14表达的试剂在制备用于胰腺癌的预后判断的工具中的用途。
进一步地，所述胰腺癌的诊断包括以下步骤：
（1）收集待测受试者的样本，和收集对照样本；
（2）检测并比较待测受试者样本和对照样本中ZNF469和/或CHST14的表达水平；
如果待测受试者的样本中ZNF469的表达水平与对照样本中ZNF469的表达水平相比升高，和/或待测受试者的样本中CHST14的表达水平与对照样本中CHST14的表达水平相比升高，则诊断所述待测受试者患有胰腺癌或处于患有胰腺癌的风险中。
进一步地，所述对照样本来源于健康人群或待测受试者的健康组织。
进一步地，所述胰腺癌的预后判断包括以下步骤：
（1）收集预后胰腺癌患者的样本为待测组，并以预前胰腺癌患者的样本为对照组；
（2）检测并比较待测组和对照组的样本中ZNF469和/或CHST14的表达水平；
如果待测组样本中ZNF469的表达水平与对照组样本中ZNF469的表达水平相比降低，和/或待测组样本中CHST14的表达水平与对照组样本中CHST14的表达水平相比降低，则判断待测组的预后良好。
如本文所用，所述受试者包括哺乳动物，优选为灵长类哺乳动物，更优选为人。
如本文所用，所述待测受试者的样本包括受试者的临床生物样本，包括但不限于血清、血浆、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、组织、器官、石蜡切片、肿瘤组织、活检样本、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA或尿液脱落细胞中的一种或几种。在优选的实施方案中，所述待测受试者的样本包括待测受试者的胰腺组织，例如胰腺活检样本，所述对照样本来源于健康受试者的胰腺组织，例如胰腺活检样本，或待测受试者的健康组织，例如癌旁组织。在优选的实施方案中，所述待测受试者的样本为循环肿瘤细胞。
如本文所用，所述预后和预前胰腺癌患者的样本包括受试者的临床生物样本，包括但不限于血清、血浆、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、组织、器官、石蜡切片、肿瘤组织、活检样本、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA或尿液脱落细胞中的一种或几种。在优选的实施方案中，所述预后和预前胰腺癌患者的样本包括待测受试者的胰腺组织，例如胰腺活检样本。在优选的实施方案中，所述预后和预前胰腺癌患者的样本为循环肿瘤细胞。
如本文所用，检测待测受试者的样本中ZNF469和/或CHST14的表达的试剂没有特别限制，并且是本领域技术人员熟知且容易获得的用于检测受试者样本中ZNF469和/或CHST14在mRNA或蛋白质水平上的表达的试剂。例如，用于检测受试者样本中ZNF469和/或CHST14的表达的试剂可以包括用于实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白/肽段芯片检测、化学发光、免疫印迹、微珠免疫检测、微流控免疫的相应试剂。
本发明的有益效果
本发明人已发现，ZNF469和CHST14在胰腺癌患者中的表达水平明显高于健康人群中的表达水平。更特别地，本发明人发现，ZNF469和/或CHST14的高水平表达，尤其是这两者在联合使用时，在用于诊断胰腺癌时具有良好的灵敏度和特异性，并且与胰腺癌患者的预后相关，因此可以作为用于胰腺癌诊断和预后判断的生物标志物。此外，本发明还发现可以通过收获受试者的循环肿瘤细胞并检测其中ZNF469和CHST14的表达水平来对胰腺癌进行诊断和预后判断。
附图说明
图1显示了ZNF469和CHST14在胰腺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的表达水平。
图2显示了ZNF469和CHST14在胰腺癌患者循环肿瘤细胞中的表达水平。
图3显示了ZNF469和CHST14在人胰腺癌细胞PANC-1和人正常胰腺细胞HPDE中的表达水平。
图4显示了在干扰ZNF469和/或CHST14表达后，人胰腺癌细胞PANC-1的迁移能力和侵袭能力的变化。
图5显示了ZNF469和/或CHST14沉默后PANC 1细胞中YAP1和CYR61的表达水平的蛋白质印迹测定。
图6显示了ZNF469和CHST14单独和联合地在胰腺癌患者与健康人群中的ROC曲线分析。
图7显示了ZNF469和CHST14单独和联合地在胰腺癌患者与健康人群中的Kaplan-Meier生存曲线分析。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：人胰腺癌与配对正常组织的表达谱芯片分析
肿瘤基因组图谱(TCGA)计划由美国National Cancer Institute(NCI)和National Human Genome Research Institute(NHGRI)于2006年联合启动的项目，利用大规模测序为主的基因组分析技术，针对36种癌症进行大规模实验，TCGA基因组分析中心(GCC)比对肿瘤和正常组织，寻找与各癌症或者亚型相关的基因突变、扩增或者缺失。为理解癌症的分子机制，提高人们对癌症发病分子基础的科学认识提供帮助。
TCGA标准方法下载102对胰腺癌组织和正常组织的全基因表达谱数据及临床信息，统计分析采用R语言(3.1.1版本)软件，需安装及加载的程序包(heatmap，venndiagram，hist等)，然后用DESeq和edgeR程序包进行分析，找出差异表达的基因。判断标准：(1)癌/癌旁的表达量<-2，(2)P<0.05，(3)在胰腺癌中未被报道。最终筛选到在胰腺癌中显著高表达的两种基因，即ZNF469和CHST14。
实施例2：ZNF469和CHST14在胰腺癌中高表达
收集临床65例胰腺癌组织样本和42例癌旁正常组织样本，分别使用TRIzol法提取上述胰腺癌组织样本和癌旁正常组织样本的RNA，利用RT-qPCR方法分别检测ZNF469和CHST14的mRNA水平。结果如图1所述，其证实ZNF469和CHST14在胰腺癌中高表达。
实施例3：胰腺癌患者的循环肿瘤细胞中ZNF469和CHST14表达水平的检测
1）抽取胰腺癌患者静脉血10mL于ACD抗凝管中，常规离心分离血浆备用；
2）对血浆中CTC细胞进行富集及分离，具体步骤为：通过向血浆中加入样本密度分离液（Cytelligen）提取血浆中单细胞层，之后加入免疫细胞去除磁珠对所提取单细胞层中的CD45+免疫细胞进行去除，通过差向富集对单细胞层中CTC进行浓缩及富集；
3）离心收获富集的CTC细胞，加入1ml的RNA裂解液吸至无酶EP管中；向EP管中加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒，室温静止3min，反复3次；12000×g、4℃离心15min；将上层水相加入新的无酶的EP管，在EP管中加入等体积异丙醇，颠倒、混匀，静置10min；12000×g、4℃离心15min；弃掉EP管液体，加入75％的乙醇1ml，震荡EP管；12000×g、4℃离心5min；弃净上清后室温放置干燥；加入适量DEPC水溶解RNA；检测RNA的纯度和浓度并通过RT-qPCR检测CTC细胞中ZNF469和CHST14的表达，并将其与收获自正常胰腺组织的细胞中ZNF469和CHST14的表达进行比较，结果如图2所述，其证实ZNF469和CHST14在胰腺癌患者CTC细胞中高表达。
实施例4：ZNF469和CHST14影响胰腺癌细胞的侵袭及迁移
将人胰腺癌细胞PANC-1和人正常胰腺细胞HPDE用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(含100U·mL-1青霉素和0.1mg·mL-1链霉素)，于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。
将培养的细胞消化收集后如实施例3所述提取RNA并通过RT-qPCR检测正常细胞及癌细胞中ZNF469和CHST14的表达。结果如图3所示，其显示ZNF469和CHST14在人胰腺癌细胞PANC-1中的表达显著高于在人正常胰腺细胞HPDE中的表达。
通过siRNA干扰ZNF469和CHST14在胰腺癌细胞中的表达(siRNA序列：siNC：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUUCAUACTT-3’(SEQ ID No.1)；siZNF469：5’-CGGCCAAGGGCAGGCGGGCCUCCUATT-3’(SEQ ID No.2); siCHST14：5’-AUCGUGGCCUCCAGCGGGCUGCUGCTT -3’(SEQ ID No.3))(干扰结果如图3所示)，然后进行Transwell细胞迁移及侵袭实验验证。结果如图4所示，其显示在单独和联合干扰ZNF469和CHST14基因的表达后，人胰腺癌细胞PANC-1的迁移能力和侵袭能力显著下降，其中联合干扰后的下降更为显著。
实施例5：干扰ZNF469和CHST14的表达抑制胰腺癌中Hippo信号途径的活化
在实施例3中，我们已经证明干扰ZNF469和CHST14的表达抑制胰腺癌发展。为了进一步了解其生物学机制，我们对ZNF469和/或CHST14敲低的胰腺癌细胞进行了RNA测序分析。PANC-1细胞中ZNF469和/或CHST14沉默显著失调了151个基因的表达：其中71个差异表达基因上调，80个下调。根据差异表达显著水平，我们发现YAP1（Hippo信号通路中的下游效应物）和CYR61（Hippo信号通路中的主要下游靶标）在ZNF469和/或CHST14沉默的PANC-1细胞中显著下调（图5）。蛋白质印迹测定证实了ZNF469和/或CHST14沉默后PANC 1细胞中YAP1和CYR61的下调，并且当ZNF469和CHST14同时沉默时，YAP1和CYR61的下调更为显著。这些结果表明，ZNF469和CHST14可能通过激活胰腺癌细胞中Hippo信号途径的活化从而促进胰腺癌的发生和进展。
实施例6：ZNF469和CHST14的胰腺癌诊断价值
利用实施例2测定的ZNF469和CHST14在胰腺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的mRNA水平通过受试者工作曲线(ROC)对ZNF469和CHST14的独立诊断及联合诊断实验结果进行分析。结果如图6所示，其显示ZNF469（灵敏度72.31％，特异性69.05％）和CHST14（灵敏度70.77％，特异性73.85％）mRNA表达对胰腺癌具有独立诊断效果，但联合诊断效果更佳，ROC曲线下面积AUC(area under the ROC curve)＝0.9121，灵敏度可达76.92％，特异性可达88.10％。从此结果可知，单独的ZNF469诊断灵敏度较高但特异性不足，单独的CHST14诊断特异性较高但灵敏度不足，而两者联合使用时可以实现较高的灵敏度和特异性。因此，ZNF469和CHST14可以用于单独和联合诊断胰腺癌。
实施例7：ZNF469和CHST14与胰腺癌临床预后的关系
利用实施例2测定的ZNF469和CHST14在胰腺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的mRNA水平，统计分析ZNF469和CHST14与胰腺癌患者的整体生存率的关系。结果如图7所示，可以看出，ZNF469低表达(ZNF469Low+CHST14 High)或CHST14低表达(ZNF469 High+CHST14Low)的胰腺癌患者组的五年总体生存率明显高于ZNF469和CHST14高表达(ZNF469 High+CHST14High)的胰腺癌患者组，并且ZNF469低表达且同时CHST14低表达(ZNF469 Low+CHST14Low)的胰腺癌患者组的五年总体生存率最高。这说明：ZNF469和/或CHST14高表达会导致胰腺癌患者的不良预后。
需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (6)
1.检测ZNF469和CHST14表达的试剂在制备用于胰腺癌的诊断的工具中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胰腺癌的诊断包括以下步骤：
（1）收集待测受试者的样本，和收集对照样本；
（2）检测并比较待测受试者样本和对照样本中ZNF469和CHST14的表达水平；
如果待测受试者的样本中ZNF469的表达水平与对照样本中ZNF469的表达水平相比升高，和待测受试者的样本中CHST14的表达水平与对照样本中CHST14的表达水平相比升高，则诊断所述待测受试者患有胰腺癌或处于患有胰腺癌的风险中。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述对照样本来源于健康人群或待测受试者的健康组织，
所述待测受试者的样本为血清、血浆、全血、脓液、器官、肿瘤组织、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA中的一种或几种。
4.检测ZNF469和CHST14表达的试剂在制备用于胰腺癌的预后判断的工具中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述胰腺癌的预后判断包括以下步骤：
（1）收集预后胰腺癌患者的样本为待测组，并以预前胰腺癌患者的样本为对照组；
（2）检测并比较待测组和对照组的样本中ZNF469和CHST14的表达水平；
如果待测组样本中ZNF469的表达水平与对照组样本中ZNF469的表达水平相比降低，和待测组样本中CHST14的表达水平与对照组样本中CHST14的表达水平相比降低，则判断待测组的预后良好。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述预后和预前胰腺癌患者的样本为血清、血浆、器官、肿瘤组织、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA中的一种或几种。
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