CN111808966A

CN111808966A - miRNA在诊断乳腺癌患病风险的应用

Info

Publication number: CN111808966A
Application number: CN202010864254.3A
Authority: CN
Inventors: 周猛; 包思琪; 刘嘉琦; 苏建忠
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2020-08-25
Filing date: 2020-08-25
Publication date: 2020-10-23
Anticipated expiration: 2040-08-25
Also published as: CN111808966B

Abstract

本发明公开了miRNA在诊断乳腺癌患病风险的应用，所述miRNA包含miR‑128‑1、miR‑128‑2、miR‑421。利用本发明的miRNA诊断乳腺癌患病风险的AUC值为0.95，表明本发明的miRNA诊断效能高，可用于临床。

Description

miRNA在诊断乳腺癌患病风险的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及miRNA作为诊断乳腺癌患病风险的应用。更具体而言，本发明涉及3个不同miRNA的组合在诊断乳腺癌患病风险中的应用，包括基于所述3个不同miRNA的组合来制备用于诊断乳腺癌患病风险的试剂盒、芯片、以及利用所述试剂盒和芯片对乳腺癌患病风险进行判断的方法。

背景技术

乳腺癌是全球女性发病率最高的癌症，占所有癌症的23％，同时乳腺癌也是女性癌症死亡的主要原因。根据世界卫生组织2012年的统计数据(GLOBOCAN 2012)，相比于2008年，在过去四年间，乳腺癌的全球发病率增加了20％，死亡率增加了14％。在欧美国家，女性乳腺癌年发病率为100～110/10万。虽然中国女性乳腺癌总体年发病率为30/10万，约为欧美国家的1/3左右，但是年死亡率与欧美国家接近。而且近10年来，中国女性乳腺癌的发病率呈明显上升趋势，正以每年3％的速度递增，城市乳腺癌发病率更是以每年7.5％的速度增长。同时，中国女性乳腺癌的发病年龄呈现出年轻化趋势，发病高峰年龄为40～50岁，比西方国家提前10年，已严重威胁我国妇女的健康。

乳腺癌的诊断主要依赖于对组织活检的组织学检查、或对细针抽吸物(FNA)的细胞学检查。一种有吸引力的替代方案是使用基于血液的测试。迄今为止，血清肿瘤标志物，如CA15.3或BR27.29具有低灵敏度，并且因此不用于乳腺癌检测。因此，需要微创方法来改进对乳腺癌的检测和早期诊断。

miRNA为长约22nt的内源非编码RNA。除了在正常生理过程中发挥作用外，miRNA还通过调控促癌基因或抑癌基因的表达，在肿瘤细胞的发育和增殖过程中发挥重要作用。并且，已有研究显示miRNA的差异表达能够区分乳腺癌组织和癌旁组织，提示其可能成为新的乳腺癌诊断、预后及预测标志物，不过，创伤性检测一定程度上限制了组织miRNA作为标志物的应用。因而，体液中的miRNA的发现为乳腺癌新型无创标志物的研究开创了新的空间。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于诊断乳腺癌患病风险的miRNA标志物。

本发明的目的之二在于提供一种用于诊断乳腺癌患病风险的回归模型。

本发明的目的之三在于提供一种用于诊断乳腺癌患病风险的系统。

本发明的目的之四在于提供上述miRNA的应用。

本发明的目的之五在于提供一种诊断乳腺癌患病风险的新方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种用于诊断乳腺癌患病风险的miRNA标志物，相比健康对照，所述miRNA标志物表达上调代表受试者患有乳腺癌的风险高；

所述miRNA标志物包括miR-128-1、miR-128-2、miR-421中的一个或多个；

优选地，所述miRNA标志物是miR-128-1、miR-128-2、miR-421中的任意一个；

优选地，所述miRNA标志物是miR-128-1、miR-128-2、miR-421中的任意二个；

优选地，所述miRNA标志物是miR-128-1、miR-128-2、miR-421的组合。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的miRNA标志物的检测试剂。

本发明的检测试剂种类不受限制，只要能检测前面所述的miRNA标志物表达水平的试剂均可。

所述检测试剂包括检测miRNA标志物表达水平方法中使用的试剂。

本发明检测miRNA标志物表达水平的方法包括但不限于基于杂交的方法，例如微阵列、RNA印迹、生物发光、测序方法以及实时定量聚合酶链反应(qPCR或RT-qPCR)。由于miRNA的小尺寸(约22个核苷酸)，因此提供精确的、可再现的以及准确的定量结果和最高的动态范围的最稳健的技术是qPCR，它目前被认为是通常用于验证其它技术的结果的标准。这样的方法的变化形式是例如数字聚合酶链反应(数字PCR)，它也可以被使用。

本发明还提供了一种用于诊断乳腺癌患病风险的产品，所述产品包括前面所述的检测试剂。

进一步，所述产品还包括一个回归模型，所述回归模型包括一个数学公式，所述数据公式如下：miGISig评分＝(0.501×miRNA-421的表达水平)+(0.6808×miRNA-128-1的表达水平)+(-0.3617×miRNA-128-2的表达水平)。

使用本发明的所述产品诊断乳腺癌患病风险的步骤如下：

1)检测受试者样本中miR-128-1、miR-128-2、miR-421的表达水平；

2)将步骤1检测的miRNA表达水平代入前面所述的数学公式中，计算出miGISig评分；

3)当miGISig评分高于cuf-off值时，提示该受试者患有乳腺癌的风险高；当miGISig评分低于cuf-off值时，提示该受试者患有乳腺癌的风险低。

本发明中所指的样本可以是从受试者获得的任何样本，只要所考虑的样本含有核酸序列即可。更确切地说，所述样本将含有RNA。所述样本可以是从可能患有或可能没有癌症的受试者获得的；可以是从无癌症的受试者获得的。

进一步，所述样本包括但不限于组织样本、体液样本或细胞外液样本。体液或细胞外液的细胞组分和非细胞组分的实例是但不限于羊水、乳汁、支气管灌洗液、脑脊髓液、初乳、间质液、腹膜液、胸膜液、唾液、精液、尿液、泪液、全血、血浆、血清血浆、血红细胞、白细胞以及血清。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片。

所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于所述miRNA标记物的部分或全部序列。

进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

所述试剂盒包括针对miRNA标记物的引物和/或探针。

本发明还提供了一种用于诊断乳腺癌患病风险的系统，所述系统包括诊断模块，所述诊断模块利用前面的回归模型对乳腺癌患病风险作出判断。

进一步，所述系统还可以包括数据输入模块。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的miRNA标志物的应用，所述应用包括以下任一项所述的应用：

1)在制备前面所述的检测试剂中的应用；

2)在制备前面所述的产品中的应用；

3)在制备前面所述的系统中的应用。

本发明所用的术语“差异表达”是指特定miRNA在靶样本中的表达水平与在对照样本中相比是改变的，所述对照样本可以是健康人的样本或是乳腺癌患者的正常样本(癌旁)，其可以是上调(即在靶样本中miRNA浓度增加)或下调(即在靶样本中miRNA浓度降低或消失)。换句话说，核酸分子在靶样本中被激活至比在对照样本中更高或更低的水平。

本发明所用的术语“表达水平”是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一个或多个被分析血清中的浓度。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果。

本发明提出了3种miRNA联合作为诊断乳腺癌患病风险的生物标志物。血液中的miRNA具有如下优势：1)更稳定：miRNA在血浆、血清中的稳定性好，经过煮沸、反复冻融、强酸、强碱、DNA酶、RNA酶等多种极端条件的处理，其含量仍保持相对稳定；2)更敏感：研究发现某些miRNA在疾病早期已有变化，可预示疾病的发生，而且核酸体外扩增技术的发展使得低丰度分子的检测成为可能；3)更特异：miRNA具有组织表达和病理过程的特异性，不同疾病有各自特异的循环miRNA表达谱，而且基于碱基配对的序列特异性扩增避免了技术上的假阳性；4)更方便：相比蛋白类标志物检测需要筛选和制备特异性抗体，miRNA可以直接测定。

附图说明

图1显示无监督层次聚类分析图；

图2显示体细胞突变频率图；

图3显示GU样组UBQLN4基因表达水平的统计图；

图4显示非整倍体评分图；

图5显示通过单变量Cox回归分析总生存期的结果图；

图6显示在TCGA队列中miRNAs在乳腺肿瘤中的表达水平统计图，其中A：miR-421；B：miR-128-1；C：miR-128-2；

图7显示GSE73002队列中miRNAs在乳腺肿瘤中的表达水平统计图，其中A：miR-421；B：miR-128-1；C：miR-128-2；

图8显示GSE41922队列中miRNAs在乳腺肿瘤中的表达水平统计图，其中A：miR-128；B：miR-421；

图9显示miGISig诊断BC患者的ROC曲线图；

图10显示血清外泌体中miRNAs的表达水平统计图，其中A：miR-128；B：miR-421；

图11显示血清外泌体中miRNAs诊断BC患者的ROC曲线图；

图12显示不同细胞中miRNAs表达水平统计图，其中A：miR-128-1；B：miR-128-2；C：miR-421；

图13显示miRNAs模拟物转染细胞后miRNAs表达水平统计图；

图14显示多核和微核的比例，其中A：细胞图；B：统计图；

图15显示不同周期细胞数检测图，其中A：对照；B：miR-128-1；C：miR-128-2；D：miR-421；

图16显示不同周期细胞数统计图，其中A：miR-128-1；B：miR-128-2；C：miR-421；

图17显示细胞增殖统计图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细描述本发明，以下所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

如本文所用的术语“miRNA”指的是微小RNA，即小的非编码RNA分子，它们在一些实施例中含有约22个核苷酸，并且存在于植物、动物以及一些病毒中。已知miRNA在RNA沉默和基因表达的转录后调节中具有功能。这些高度保守的RNA通过与特异性mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)结合来调节基因的表达。举例来说，每一种miRNA被认为调节多种基因，并且由于数百种miRNA基因被预测存在于高等真核生物中。miRNA倾向于从基因组中的几个不同的基因座转录。这些基因编码具有发夹结构的长RNA，这些长RNA在由一系列RNA酶III酶(包括Drosha和Dicer)加工时形成在3'末端上具有2个核苷酸突出端的通常约22核苷酸长的miRNA双链体。

如本文术语“评分”指的是数学分数，它可以使用本领域已知的用于统计分类的目的的多种数学方程式和/或算法中的任一种来计算。这样的数学方程式和/或算法的实例可以是但不限于选自由以下各项组成的组的(统计)分类算法：支持向量机算法、逻辑回归算法、多项逻辑回归算法、费舍尔氏线性判别算法、二次分类器算法、感知器算法、k-最近邻算法、人工神经网络算法、随机森林算法、决策树算法、朴素贝叶斯算法、自适应贝叶斯网络算法、以及组合了多种学习算法的集成学习方法。

实施例1乳腺癌GI相关的miRNA鉴定

1、公共RNA测序数据、基因芯片数据和临床资料收集

从TCGA基因组数据共享数据门户(https://portal.gdc.cancer.gov/).)获取乳腺癌(BC)和卵巢癌(OV)患者的临床特征、miRNA-seq(Illumina HiSeq RPM型)表达数据、RNA-seq(Illumina HiSeq FPKM型)表达数据和体细胞突变信息。仅保留具有配对miRNA、mRNA表达谱、生存信息和体细胞突变信息的女性患者。总共保留了522个BC样品。用于验证的非TCGABC miRNAs微阵列数据集从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载，包括GSE73002(N＝3966)和GSE41922(N＝54)。本研究中使用的公共BC miRNA数据集列在表1和表2中。

表1数据集信息

表2乳腺癌患者的临床病理特征

每个TCGA样本的基因组不稳定性是通过癌症基因组内的全部体细胞突变来测量的。体细胞突变频率高(前25％)的肿瘤定义为基因不稳定(GU)样组，低频率体细胞突变(后25％)的肿瘤定义为基因稳定(GS)样组。在GU样组和GS样组之间差异表达的miRNAs被定义为GI相关的候选miRNAs(GImiRs)。

在TCGA-BC队列中对GU样组和GS样组的miRNA表达进行差异分析，鉴定出18个差异表达的miRNAs(DEmiRNAs)(见表3)。其中，与GS样瘤相比，GU样瘤中有4个miRNAs表达上调，14个miRNAs表达下调。基于18个DEmiRNAs表达水平的无监督层次聚类分析产生了两个患者群：GS样组(N＝318)和GU样组(N＝204)(图1)。GU样组的体细胞突变频率明显高于GS样组(中位数分别为57.5vs.29，P<0.001，Mann-Whitney U检验；图2)。同时，GU样组UBQLN4基因表达水平和非整倍体评分显著高于GS样组(P<0.001，Mann-Whitney U检验；图3和4)。通过对18个DEmiRNAs mRNA靶标的功能富集分析，发现了几个丰富的生物学过程和途径，包括转化生长因子β(TGF-β)、转录调控、负调控有丝分裂细胞周期的G1/S转变、细胞对DNA损伤刺激的反应和Notch信号通路，这些都是已知的与GI相关的生物学途径。

表3 18个miRNA信息

实施例2 GI相关的miRNA标记(miGISig)的建立

通过单变量Cox回归分析OS，发现GU样组和GS样组之间的OS有显著差异(中位OS11.7vs>16年，P＝0.027，log-rank检验；图5)。提示18个DEmiRNAs与BC患者的预后有关。

通过多变量Cox回归分析了上述18个DEmiRNAs，并确定了三个miRNA标记(以下简称miGISig)，通过包含miGISig的表达值，并按其多元Cox回归分析的回归系数加权，构建了以下回归模型：miGISig评分＝(0.501×miR-421的表达水平)+(0.6808×miR-128-1的表达水平)+(-0.3617×miR-128-2的表达水平)。

实施例3 miGISig对BC的诊断价值

1、分析肿瘤和健康对照中miR-128-1、miR-128-2、miR-421的表达情况

结果显示：在TCGA、GSE73002和GSE41922队列中，3个miRNAs在乳腺肿瘤中的表达显著高于健康对照(图6-8)，这表明它们在乳腺癌发生中的致癌作用，并强调了miGISig在乳腺癌风险评估中的潜力。

2、评估miGISig在检测BC患者中的诊断准确性

GSE73002中，miGISig回归模型区分BC和健康对照的AUC＝0.95，最佳临界点为-0.489，敏感性是0.92，特异性是0.954(表4，图9)；miRNA-128-1区分BC和健康对照的AUC＝0.887；miRNA-128-2区分BC和健康对照的AUC＝0.884；miRNA-421区分BC和健康对照的AUC＝0.933(图9)。相比单个miRNA，三个miRNA联合诊断的AUC值更高。上述结果显示miGISig回归模型在预测BC风险方面的可靠和稳健的性能。

表4 miGISig回归模型的诊断效能

	实际健康对照	实际肿瘤患者
			预测健康对照	2559	102
预测肿瘤患者	124	1177

4、miGISig作为一种潜在的非侵入性诊断生物标志物的临床适用性

选择来自中国医学科学院肿瘤医院的30例患者，包括20例BC患者和10例年龄匹配的健康女性。从这30名受试者身上采集10ml的外周血样进行外泌体分离。在IlluminaHiSeq2000平台上根据制造商的方案进行小RNA测序，并根据每百万读数(RPM)值计算miRNA的表达量。本研究经中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会批准，并征得所有参与者的书面知情同意。

结果：与健康人相比，BC患者血清中外泌体miR-128和miR-421的表达水平显著升高(P＝0.003，P＝0.002，Mann-Whitney U检验，图10)。进一步通过ROC分析评估了外泌体miR-128和miR-421的诊断价值，发现外泌体miR-128(AUC＝0.825)和miR-421(AUC＝0.835)都是BC风险的显著预测因子(图11)。

实施例4 miGISig过表达对BC细胞生理指标的影响

1、BC细胞中miGISig表达

1.1细胞培养

乳腺癌细胞系MCF-7、BT549、SKBR-3、BT474、T47D、SW527、MDA-MB-231和正常人乳腺上皮细胞184A1、MCF-10A购自美国典型培养库(ATCC；Rockville，MD，USA)。184A1和MCF-10A细胞接种于含有2 mM L-谷氨酰胺、20ng/ml表皮生长因子、100ng/ml霍乱毒素、0.01mg/ml胰岛素、500ng/ml氢化可的松和5％马血清(HyClone)的DMEM-F12培养基中，37℃、5％CO₂条件下培养。MCF-7 细胞接种于含有2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、10mM HEPES和10％胎牛血清(Gibco)的DMEM中，37℃、5％CO₂条件下培养。用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养BT549和SKBR-3细胞。BT474和T47D细胞接种于含2Mm L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氢钠、1mM丙酮酸钠、0.01mg/ml胰岛素、10mM HEPES和5％胎牛血清(HyClone)的RPMI1640培养基中，37℃、5％CO₂条件下培养。SW527细胞培养接种于含2Mm L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖、1.5 g/L碳酸氢钠、10％胎牛血清(HyClone)的DMEM中，37℃、5％CO₂条件下培养。MDA-MB-231细胞接种于含10％胎牛血清(HyClone)的Leibovitz‘s L-15培养基中，37℃、5％CO₂条件下培养。

1.2 QPCR

用TRIzol试剂(Thermo Science，Grand Island，NY，USA)从细胞中提取总RNA，用Quantscript RT Kit(天根，中国北京)反转录成cDNA。使用标准程序在StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems(ABI),Foster City,CA,USA)上进行qRT-PCR分析。以U6作为内源性对照，所有miRNA的相对表达量均归一化为U6的相对表达量，引物序列如表5所示。

表5引物序列

1.3结果

基因不稳定的非整倍体MDA-MB-231细胞中miR-128-1、miR-128-2、miR-421表达量低(图12)。

2、miGISig表达对细胞相关指标的影响

2.1基因组不稳定检测

(1)miRNA mimic转染

从miRBase数据库获得miR-128-1-5p、miR-128-2-5p和miR-421的序列。由RiboBio实验室(中国广州)设计合成了miRNAs模拟物和阴性对照。miRNAs和对照的引物序列列在表4中。根据制造商的说明使用HiperFect(Qiagen，Valencia，CA)对miRNA模拟物进行转染。

(2)QPCR

步骤同前。

结果显示：将miRNAs模拟物转染MDA-MB-231细胞培养48小时后，miR-128-1、miR-128-2和miR-421的表达水平明显升高(图13)。

(3)多核和微核的比例检测

步骤：将免疫荧光染色的细胞接种于6孔微孔板中，40％～50％融合的细胞转染miRNAs模拟物培养24h，再将细胞接种于24孔板中进行细胞爬片培养24h。细胞用4％多聚甲醛固定，Triton X-100通透，DAPI染色5min后进行高含量分析(HCA)(Thermo Science)。

结果显示：过表达miR-128-1、miR-128-2和miR-421自发地增加了MDA-MB-231细胞中多核和微核的比例(miR-128-1、miR-128-2和miR-421组分别为25％、31％和22％，而对照组为18％)(图14)。

2.2细胞周期检测

由于细胞周期调控缺陷可能导致基因组不稳定，之后检查过表达miR-128-1、miR-128-2和miR-421是否导致细胞周期异常进展。

(1)流式细胞仪分析

MCF-7和MDA-MB-231细胞接种于6孔微孔板中，细胞达到40％～50％融合度时转染miRNAs模拟物，培养48h。收集细胞，用细胞周期试剂盒按说明书对收集细胞进行孵育。流式细胞仪(Beckman Coulter)分析细胞周期。

(2)结果

过表达3个miRNAs模拟物后，MDA-MB-231细胞中S期细胞比例增加，而G2/M期细胞比例减少(图15和图16)。

2.3细胞增殖检测

(1)CCK8检测步骤

乳腺癌细胞(MCF-7和MDA-MB-231)用细胞计数试剂盒(CCK8，Dojindo)按说明书进行增殖测定。将MCF-7和MDA-MB-231细胞以每孔1×10³细胞密度接种于96孔微孔板中，每隔2天测量1块。将CCK-8试剂以1：10的比例加入细胞培养液中，37℃孵育1h后，用微量平板阅读器(Bio-Tek EPOCH2，BioTek Instrument，Inc.，USA)测定450nm处的吸光度。

(2)结果

过表达miR-128-1、miR-128-2和miR-421后，MDA-MB-231细胞的增殖能力明显增强(图17)。这些结果表明，miGISig与基因组的不稳定性有关，可以作为癌基因促进乳腺癌细胞的生长。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> miRNA在诊断乳腺癌患病风险的应用

<141> 2020-08-25

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acactccagc tgggcggggc cgtagcactg t 31

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagtctc agac 44

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acactccagc tggggggggc cgatacactc t 31

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagtctc gtac 44

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acactccagc tgggatcaac agacattaat t 31

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgaggcgc ccaa 44

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims

1.一种用于诊断乳腺癌患病风险的miRNA标志物，其特征在于，相比健康对照，所述miRNA标志物表达上调代表受试者患有乳腺癌的风险高；

优选地，所述miRNA标志物是miR-128-1、miR-128-2、miR-421的组合。

2.权利要求1所述的miRNA标志物的检测试剂。

3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括微阵列、RNA印迹、生物发光、测序方法以及实时定量聚合酶链反应中使用的试剂；优选地，所述试剂包括针对所述miRNA标志物的引物或探针。

4.一种用于诊断乳腺癌患病风险的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求2或3所述的检测试剂；

优选地，所述产品还包括一个回归模型，所述回归模型包括一个数学公式，所述数据公式如下：miGISig评分＝(0.501×miRNA-421的表达水平)+(0.6808×miRNA-128-1的表达水平)+(-0.3617×miRNA-128-2的表达水平)。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，使用所述产品诊断乳腺癌患病风险的步骤如下：

1)检测受试者样本中miR-128-1、miR-128-2、miR-421的表达水平；

2)将步骤1检测的miRNA表达水平代入权利要求4中的数学公式中，计算出miGISig评分；

3)当miGISig评分高于cuf-off值时，该受试者患有乳腺癌的风险高；当miGISig评分低于cuf-off值时，该受试者患有乳腺癌的风险低，

优选地，所述样本包括组织样本、体液样本或细胞外液样本；更优选低，体液样本包括羊水、乳汁、支气管灌洗液、脑脊髓液、初乳、间质液、腹膜液、胸膜液、唾液、精液、尿液、泪液、全血、血浆、血清、血红细胞、白细胞。

6.根据权利要求4或5所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于所述miRNA标记物的部分或全部序列。

8.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括针对miRNA标记物的引物和/或探针。

9.一种用于诊断乳腺癌患病风险的系统，其特征在于，所述系统包括诊断模块，所述诊断模块利用权利要求4中的回归模型对乳腺癌患病风险作出判断；

优选地，所述系统还包括数据输入模块。

10.权利要求1所述的miRNA标志物的应用，其特征在于，所述应用包括以下任一项所述的应用：

1)在制备权利要求2或3所述的检测试剂中的应用；

2)在制备权利要求4-8中任一项所述的产品中的应用；

3)在制备权利要求9所述的系统中的应用。