CN114891891A - 一种肝细胞癌早期诊断试剂盒、鉴别方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肝细胞癌的标志物及其鉴别技术领域，具体涉及一种肝细胞癌早期诊断试剂盒、鉴别方法及其应用，提供了血液中分子标记物的诊断试剂盒，其用于诊断肝细胞癌、监测肝细胞癌的进展，所述试剂盒包含多种核酸分子，其中一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，核酸表达生物标记是存在肝细胞癌的指征。本发明还通过相应的方法，鉴别一种或多种核酸分子在血浆外泌体中的表达量，通过确定血液中的多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，与健康对照相比，检测和/或监测肝细胞癌的发生、进展，或评价肝癌手术后治疗效果。

Description

一种肝细胞癌早期诊断试剂盒、鉴别方法及其应用
技术领域
本发明属于肝细胞癌的标志物及其鉴别技术领域，具体涉及一种肝细胞癌早期诊断试剂盒、鉴别方法及其应用。
背景技术
原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)占大多数，理想的治疗方法是早期切除。不幸的是，许多肝癌患者在没有早期诊断的情况下错过了切除肿瘤的机会。因此，寻找可靠有效的生物标志物对改善肝癌预后至关重要。
微RNA(microRNA，miRNA)是短RNA分子，占18-25个核苷酸，是非编码RNA家族的成员。这些miRNA通过与数百个互补的靶mRNA结合，在细胞增殖、分化和发育中发挥重要作用。大量研究表明，miRNA在包括癌症在内的多种疾病中大量表达。自那时以来，miRNA已被用作各种癌症的优秀候选生物标记物和治疗靶点。
生物液体中的外泌体miRNA已被证明是诊断疾病的潜在生物标志物，包括癌症，如膀胱癌尿液中的外泌体miRNA，卵巢癌血浆中的外泌体miRNA，以及胰腺导管腺癌诊断的胰液。
然而，体液中核糖核酸酶的存在对miRNA作为生物标记物的稳定性提出了疑问。外泌体是细胞外载体，直径在50-150nm之间。在被细胞释放到体液中后，外泌体被认为是调节靶细胞生物功能的生物信息(蛋白质、脂质和RNA)的载体。由于外泌体膜的存在，体内的miRNA可以被核糖核酸酶保护而不被降解，并且在体液中高度稳定。因此，有人认为外体miRNAs是诊断癌症的潜在癌症生物标志物。
HCC来源的外泌体中核酸的大多数为miRNAs，目前，已有许多研究报道外泌体miRNA介导肝癌的生长、转移和免疫逃逸。在肝细胞癌患者的血液外泌体中，许多miRNA与正常对照存在差异，这表明外泌体miRNAs适合作为HCC 的生物标志物。例如外泌体miRNA组(miR-10b-5p、miR-221-3p、miR-223-3p、 miR-21-5p)可以区分HCC和非HCC(AUC＝0.80，敏感性＝58％，特异性＝95％)。但是由于缺乏足够的敏感性，单一的或现有的外泌体miRNA组不适于作为准确的诊断生物标记用于临床应用。
因此，仍然有必要发现一组肝细胞癌病人血浆中外泌体诊断miRNA标记物。此外，临床亦一直需要一种在高风险个体中(即早期肝癌筛查、肝癌手术后复发)的早期检测和/或监测方法。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术的不足，提供一种肝细胞癌早期诊断试剂盒、鉴别方法及其应用，以解决技术背景中存在的技术问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种肝细胞癌早期诊断试剂盒，所述试剂盒包括多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是存在肝细胞癌的指征，其中，核酸表达生物标记包括编码 hsa-miR-212-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-1248和hsa-miR-1250-5p的任意一或多种核酸分子以及内部参照标定小核RNA序列U6。
进一步地，所述核酸表达生物标记包含至少5种核酸分子和/或至少5种核酸分子组合。
进一步地，所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多种健康对照中相比被下调。
进一步地，与一或多个健康对照相比，在一或多个目标血浆外泌体样本中，编码hsa-miR-212-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-1248和hsa-miR-1250-5p的任意一种或多种核酸分子的表达被下调，而小核RNAU6的表达不变。
进一步地，所述核酸表达生物标记还包括编码hsa-miR-212-5p-U6、 hsa-miR-519b-3p-U6、hsa-miR-1248-U6、hsa-miR-1250-5p-U6、hsa-miR-212-5p/U6、 hsa-miR-519b-3p/U6、hsa-miR-1248/U6、hsa-miR-1250-5p/U6、 hsa-miR-212-5p/hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-212-5p/hsa-miR-1248、 hsa-miR-212-5p/hsa-miR-1250-5p、hsa-miR-519b-3p/hsa-miR-1248、 hsa-miR-519b-3p/hsa-miR-1250-5p、hsa-miR-1248/hsa-miR-1250-5p的任意一种或多种核酸分子组合。
进一步地，与一或多个健康对照相比，在一或多个目标血浆外泌体样本中，编码hsa-miR-212-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-1248、hsa-miR-1250-5p、 hsa-miR-212-5p-U6、hsa-miR-519b-3p-U6、hsa-miR-1248-U6、hsa-miR-1250-5p-U6 的任意一种或多种核酸分子组合的表达被下调。
本发明还提供了一种用于鉴别展现肝细胞癌的一或多种目标血浆外泌体的方法，所述方法包括：
(a)在所述一或多种目标血浆外泌体中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；
(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述多种核酸分子的表达水平；
(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别出在所述目标血浆和对照血浆中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述差异表达的一或多种核酸分子一起代表如上述所定义的核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是肝细胞癌存在的指征。
本发明还提供了肝细胞癌早期诊断试剂盒在肝癌诊断中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了血液中分子标记物的诊断试剂盒，其用于诊断肝细胞癌、监测肝细胞癌的进展，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子均编码微 RNA序列，其中所述血浆外泌体中核酸分子中的一或多种在患者和健康对照中存在差异表达，且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是存在肝细胞癌的指征。
(2)本发明还通过相应的方法，鉴别一种或多种核酸分子在血浆外泌体中的表达量，提供了高效鉴别展现肝细胞癌的一或多种目标血浆外泌体的方法。
(3)本发明的目的是通过经验证的外泌体miRNA生物标记，用于早期筛查检测HCC、早期检测肝癌术后肿瘤复发以及监测患者手术治疗后的病情变化。其中，通过确定血液中的多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，与健康对照相比，肝细胞癌患者血浆外泌体中存在多种核酸分子差异表达，运用一种或多种差异表达的核酸分子的组合，作为生物标记物，检测和/或监测肝细胞癌的发生、进展，或评价肝癌手术后治疗效果。
附图说明
下面将参考附图来描述本发明示例性实施方式的特征、优点和技术效果。
图1为本发明鉴别肝细胞癌的一或多种目标血浆外泌体的工作流程图；
图2为外泌体miRNA样本测序差异表达miRNA热图；
图3为依据训练组样本中的表达量来绘制的ROC曲线图；
图4为实施例4中正处于研究中的所有参与者的ROC曲线图。
具体实施方式
本发明基于如下发现，即肝细胞癌能可靠地通过血浆中外泌体中的特定 miRNA表达生物标记以高准确性和灵敏性来鉴定，其中所述表达生物标记如本文定义典型地包括被下调的人类多个miRNA。特别地，所述miRNA表达生物标记——通过分析血浆外泌体中整体miRNA表达模式和/或各个miRNA各自的表达水平——能筛选肝细胞癌高风险个体进行早期检测并诊断肝细胞癌。
以下例证的本发明可以合适地在不存在未在本文中具体揭示的任何一或多个元件、一或多种限制的条件下实施。
本发明将根据特定的实施方案并参照附图加以描述，但是本发明不受其限制，仅受权利要求书限制。所描述的附图仅是示意性的，被认为是非限制性的。
当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元件或步骤。为本发明目的，术语“由……组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中组被限定为包含至少一定数目的实施方案，这也被理解为揭示了优选地仅由这些实施方案组成的组。
当指代单数形式名词使用不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”时，包括该名词的复数形式，除非特别指出。
术语“大约”在本发明中是指本领域技术人员理解仍能保证目的特征的技术效果的准确性区间。该术语通常表示偏离指示值的±10％，优选±5％。
以下术语或定义仅为了理解本发明而提供，这些定义不应被认为具有小于本领域技术人员理解的范围。
本发明的目的是经验证的miRNA生物标记，在高风险个体中检测肝细胞癌，其中通过确定血液中的多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA(miRNA)序列，其中与健康对照相比，肝细胞癌患者血浆中一种或多种多核酸分子差异表达，其中一种或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，该核酸表达生物标记是肝细胞癌的存在以及治疗效果的指征。
本文的术语“肝”指的是人体器官肝脏。
本文术语“癌症”(也称为癌)通常指任何类型的恶性新生物，即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示或具有发生癌特征倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变(基于遗传重编程(genetic re-programming))。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。
本文术语“肝细胞癌”指的是肝细胞的癌性生长。肝癌分为原发性肝癌(Primaryliver cancer)和转移性肝癌(Metastasis liver cancer)。原发性肝癌的病理分型包括肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)、胆管细胞癌和混合细胞癌，其中，肝细胞癌占到了原发性肝癌的95％以上。
本文术语“血浆”指的是血液的黄色液体成分，其中全血的血细胞通常会悬浮。大约占整个血液体积的55％。绝大部分是水(90％体积)并含有溶解的蛋白、葡萄糖、凝集因子、矿物质离子、激素和二氧化碳(血浆是分泌产物运输的主要介质)。血浆通过将新鲜血液在离心机中离心直到血细胞沉隆到离心管底部而制备。然后血浆被纯化和转移。血浆的密度大约是1.025kg/L、或1025 kg/m3。现今的研究表明外泌体miRNA在血浆中是稳定的。术语“血浆样本”指的是从被检测的个体或者健康对照获得的血浆。
本文术语“外泌体”指的是细胞释放到细胞外环境中的一种扁平球体状的内体膜囊泡，来自核内体系统。使用超离心法分离的外泌体在电镜成像下呈杯状形态，其直径通常在50～150nm。经过近几年的研究发现，外泌体是细胞间沟通的一种新的方式，其通过囊泡内包含的蛋白质、核酸等信息物质来完成细胞与细胞之间的交流。
本文所用术语“患者”，是指至少应该被认为是患有肝细胞癌的人；本文所用术语“目标血浆”是指从患者获取的血浆；术语“健康个体”或“健康对照”特指不具有任一癌症表现的健康个体。并且这里“对照血浆”是指从这些健康个体获取的血浆。但是，在一些应用里，例如，当比较不同的癌症类型时，这些个人有其他的癌症类型，这些从这些个体中获取的血浆也被特指为“对照”。
通常，所用的血浆样本来源干被诊断为肝细胞癌的研究对象的生物学样本。另外，为了更确定从“对比样本”获得数据，可从已知疾病状态的研究对象中收集。生物学样本可包括身体组织和液体，例如肝脏组织、血清、血细胞、痰液和尿液。此外，生物学样本可从具有结肝细胞癌特征或者疑似病例中获得。此外，如有有必要，样本可从得到的身体组织和液体中纯化得到作为生物学样本。本发明中，生物学样本来源于肝细胞癌患者的血浆样本及对照的血浆样本。根据本发明，核酸分子标记的表达水平通过研究对象来源的生物学样本测定得到。
在本发明的体外方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，优选以保护核酸(特别是RNA)或蛋白质的方式收集。
本文所用术语“微RNA”或“miRNA”是其在本领域的普通含义(Bartel， D.P.(2004)Cel123，281-292；He，L.and Hannon，G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5， 522-531)。因此，“微RNA”是指衍生自基因组基因座的RNA分子，其从可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物加工而来。成熟miRNA通常长度为 20、21、22、23、24或25个核苷酸，其它数目的核苷酸也可存在，例如18、 19、26或27个核苷酸。
miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟miRNA放置在非完全配对的RNA双链体之内(本文也称作茎-环或发夹结构或pre-miRNA)，所述双链体作为从更长的前体转录物进行miRNA加工的中间体。这一加工典型地通过分别称为Drosha和Dicer的两种特异的内切核酸酶的连续作用而发生。 Drosha从初级转录物(本文也称作“pri-miRNA”)产生典型地折叠成发夹或茎 -环结构的miRNA前体(本文也称作“pre-miRNA”)。从这个miRNA前体，通过Dicer切割miRNA双链体，其在发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟miRNA，在另一条臂包含类似大小的节段(通常称为miRNA*)。miRNA然后被导向其靶 mRNA以发挥其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自与预测的蛋白质编码区不同的基因组节段。
本文所用术语“miRNA前体”(“前体miRNA”或“pre-miRNA”)是指从其加工成熟miRNA的miRNA初级转录物的部分。典型地，pre-miRNA折叠成稳定的发夹(即双链体)或茎-环结构。发夹结构典型地长度为50-80个核苷酸，优选60-70个核苷酸(计数miRNA残基，与miRNA配对的残基，及任何间插节段，但排除更远端的序列)。
本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”是指编码微RNA(miRNA) 的任何核酸分子。因此，该术语不仅指成熟miRNA，也指相应的如上所述的前体miRNA及初级miRNA转录物。另外，本发明不限于RNA分子，也包括相应的编码微RNA的DNA分子，例如通过逆转录miRNA序列产生的DNA分子。编码本发明的微RNA序列的核酸分子典型地编码单个miRNA序列(即个体 miRNA)。但是，也可能这种核酸分子编码两个或多个miRNA序列(即两个或多个miRNA)，例如一个转录单位包含在常用调节序列如启动子或转录终止子控制下的两个或多个miRNA序列。
本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”也被理解为包括“有义核酸分子”(即核酸序列(5'→3')匹配或相应于所编码的miRNA(5'→3')序列的分子)及“反义核酸分子”(即核酸序列互补于所编码的miRNA(5'→3')序列或者换句话说匹配所编码的miRNA序列的反向互补序列(3'→5'))的分子)。本文所用术语“互补”是指“反义”核酸分子序列与相应的“有义”核酸分子序列(具有互补于反义序列的序列)形成碱基对、优选Watson-Crick碱基对的能力。
在本发明范围内，两个核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以完全互补，即它们不含有任何碱基错配和/或额外的或缺失的核苷酸。或者，两个分子包含一或多个碱基错配或者在它们的核苷酸总数上不同(由于添加或缺失导致)。优选地，“互补”核酸分子包含与包含在相应的“有义”核酸分子中的序列显示完全互补性的至少10个连续核苷酸。
因此，包含在本发明的诊断试剂盒中的编码miRNA序列的多种核酸分子可包括一或多种“有义核酸分子”和/或一或多种“反义核酸分子”。有时，诊断试剂盒包括一或多种“有义核酸分子”(即miRNA序列本身)，所述分子被认为组成了差异表达的miRNA(即分子标记)的全体或至少亚集合，所述差异表达的miRNA是存在或发生特定病症倾向的指征，本文是肝细胞癌。另一方面，当诊断试剂盒包括一或多种“反义核酸分子”(即与miRNA序列互补的序列)时，所述分子可包含适合用于检测和/或定量给定样品中的一或多种特定(互补)miRNA序列的探针分子(用于进行杂交测定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆转录或PCR应用)。
在本发明中定义的多种核酸分子可以包含至少2种、至少10种、至少50 种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1000种、至少10000种或至少100000种核酸分子，每种分子编码miRNA序列。
本文所用术语“差异表达”是指特定miRNA在目标血浆外泌体中的表达水平相比干健康对照血浆外泌体是改变的，其可以是上调(即在目标血浆中miRNA 浓度增加)或下调(即在目标血浆中miRNA浓度降低或消失)。换句话说，核酸分子在目标血浆中被激活至比在对照血浆中更高或更低的水平。
本发明范围内，核酸分子被认为是差异表达的，如果该核酸分子在靶细胞和对照细胞中的相应表达水平典型地相差至少5％或至少10％，优选地至少20％或至少25％，最优选地至少30％或至少50％。因此，后者的值相应于给定核酸分子在靶细胞中的表达水平相比于野生型对照细胞分别上调至少1.3倍或至少 1.5倍，或者反之在靶细胞中的表达水平下调至少0.7倍或至少0.5倍。
本文所用术语“表达水平”是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一或多种被分析血浆中的浓度。
如上所述，术语“对照血浆”典型地是指不具有肝细胞癌表型特征的(健康)血浆。但是，在一些应用中，例如当比较显示不同的癌或癌前状态的血浆时，具有较不严重疾病特征的血浆典型地被认为是“对照血浆”。
在具体的实施方案中，在给定样品的若干独立测量(例如两个、三个、五个或十个测量)和/或在一群目标血浆或对照血浆内的若干测量中获得的表达水平的标准值被用于分析。标准值可以用本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2SD(标准差)或平均值±3SD的范围可被用作标准值。
所获得的疾病或对照血浆外泌体miRNA表达水平之间的差异可以归一化至进一步的对照核酸例如管家基因的表达水平，管家基因的表达水平已知不根据获得样本的个体的疾病状态而不同。举例的管家基因包括β-肌动蛋白、甘油醛 -3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1等。在本专利的优选实施方案中，对照核酸是已知在收集样本的不同非癌和癌(前)状态中稳定表达的一种miRNA小核 RNA——U6。
但是，代替在任何实验中测定血浆样本表达水平，也可以基于实验证据和/ 或现有技术数据定义针对特定疾病表型(即疾病状态)的一或多个截断值。在这种情况中，血浆样本的各自表达水平可以用用于归一化的稳定表达的对照 miRNA测定。如果计算的“归一化”的表达水平高于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达上调的指征。反之，如果计算的“归一化”的表达水平低于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达下调的指征。
在本发明的背景下中，术语“鉴定肝细胞癌”也包括预测和可能性分析(“诊断”意义上)。本文公开的组合物和方法意在临床应用，以决定治疗形式，包括治疗性干预，诊断标准如疾病阶段，和疾病监控和疾病监视。根据本发明，可提供用干检查对象状态的中间结果。这种中间结果可与额外信息组合以帮助医生、护士或其它从业人员诊断出该对象患有该疾病。或者，本发明可用于检测对象衍生组织中的癌细胞，并提供有用信息给医生以进行诊断。
在本发明中，所鉴定的一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，该核酸表达生物标记是通过血浆样本鉴定肝细胞癌存在的指征。本文所用术语“表达生物标记”是指一组核酸分子(例如miRNA)，其中各个核酸分子的表达水平在肝细胞癌血浆外泌体样本和健康对照样本之间不同。本文中，核酸表达生物标记也指一组标记并代表最低数目的(不同)核酸分子，每种核酸分子编码能鉴定个体的表型状态的miRNA序列。
在第一方面，本发明涉及用于鉴别一或多种展现出肝细胞癌的目标血浆的外泌体中分子标记物的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和在一或多种对照血浆中差异表达，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是存在肝细胞癌的指征。
本文限定的核酸表达生物标记可包括至少5种核酸分子及由上述核酸分子组成的核酸分子组。
在实施方案中，所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多种健康对照中相比被下调。
通常，包含在核酸表达生物标记中的核酸分子是人类序列(以后称为“has” (智人(Homo sapiens))。
在实施方案中，所述核酸衰达生物标记包含编码编码hsa-miR-212-5p (SEQ-1)、hsa-miR-519b-3p(SEQ-2)、hsa-miR-1248(SEQ-3)和hsa-miR-1250-5p (SEQ-4)，以及内部参照标定小核RNA序列U6(SEQ-5)的任意一或多种核酸分子。
为了将编码微RNA序列的核酸表达生物标记中所获得的表达水平归一化，可使用小核RNA序列U6的核酸表达分子，其在肝细胞癌血浆外泌体中表达相对稳定。
表1：上述miRNA的核酸序列表
Figure BDA0003717420400000111
Figure BDA0003717420400000121
本文公开的所有miRNA及U6 snRNA序列均已经保存在miRBase数据库中 (http∶//microrna.sanger.ac.uk/)及NCBI GenBank数据库中 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)。
特别优选地，与一或多个健康对照相比，在一或多个目标血浆中，编码 hsa-miR-212-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-1248和hsa-miR-1250-5p的任意一种或多种核酸分子的表达被下调，而小核RNA序列U6的表达相对稳定。
如本文所用，术语“所述多种核酸分子的一或多种”及“任意一种或多种人靶细胞衍生的核酸分子”可涉及所述多种核酸分子的任何亚群，例如任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种、任七种、任八种、任九种、任十种等核酸分子，每种核酸分子均编码包含于所述核酸表达特征内的微RNA序列。
在更加优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-212-5p、 hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-1248、hsa-miR-1250-5p、(hsa-miR-212-5p-U6)、 (hsa-miR-519b-3p-U6)、(hsa-miR-1248-U6)、(hsa-miR-1250-5p-U6)、 hsa-miR-212-5p/U6、hsa-miR-519b-3p/U6、hsa-miR-1248/U6、hsa-miR-1250-5p/U6、 hsa-miR-212-5p/hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-212-5p/hsa-miR-1248、 hsa-miR-212-5p/hsa-miR-1250-5p、hsa-miR-519b-3p/hsa-miR-1248、 hsa-miR-519b-3p/hsa-miR-1250-5p、hsa-miR-1248/hsa-miR-1250-5p的任意一种或多种核酸组合。
本文所用术语“核酸组合”指的是整体上应用至少两种核酸表达水平。优选地可整体通过一个公式利用相对变化或计算结果。
在第二方面，本发明涉及用于监测肝癌术后早期复发的个体与健康个体进行区分的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列。
本文限定的核酸表达生物标记可包括至少5种核酸分子及由上述核酸分子组成的核酸分子组。
在实施方案中，所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多种健康对照中相比被下调。
在实施方案中，所述核酸表达生物标记包含编码编码hsa-miR-212-5p、 hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-1248和hsa-miR-1250-5p，以及内部参照标定小核RNA 序列U6的任意一或多种核酸分子。
表2：上述miRNA的核酸序列表
Figure BDA0003717420400000131
本文公开的所有miRNA及U6 snRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http∶//microrna.sanger.ac.uk/)及NCBI GenBank数据库中 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)。
如本文所用，术语“所述多种核酸分子的一或多种”及“任意一种或多种人靶细胞衍生的核酸分子”可涉及所述多种核酸分子的任何亚群，例如任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种、任七种、任八种、任九种、任十种等核酸分子，每种核酸分子均编码包含于所述核酸表达特征内的微RNA序列。
在更加优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-212-5p、 hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-1248、hsa-miR-1250-5p、(hsa-miR-212-5p-U6)、 (hsa-miR-519b-3p-U6)、(hsa-miR-1248-U6)、(hsa-miR-1250-5p-U6)、 hsa-miR-212-5p/U6、hsa-miR-519b-3p/U6、hsa-miR-1248/U6、hsa-miR-1250-5p/U6、 hsa-miR-212-5p/hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-212-5p/hsa-miR-1248、 hsa-miR-212-5p/hsa-miR-1250-5p、hsa-miR-519b-3p/hsa-miR-1248、 hsa-miR-519b-3p/hsa-miR-1250-5p、hsa-miR-1248/hsa-miR-1250-5p的任意一种或多种核酸组合。
实施例
实施例1：患者材料
在测序研究中，2019年收集了HCC患者3例和健康个体的血液样本3例。所有患者对参与科学研究都有知情同意。组织样本的收集依照协议由医院协会评论委员会批准所有样本在外科手术前获取。
在训练研究中，2018-2019年期间收集了HCC患者40例和健康个体的血液样本15例。所有患者对参与科学研究都有知情同意。组织样本的收集依照协议由医院协会评论委员会批准所有样本在外科手术前获取。
在验证研究中，2019-2021年期间收集了HCC患者60例和健康个体的血液样本19例。所有患者对参与科学研究都有知情同意。组织样本的收集依照协议由医院协会评论委员会批准所有样本在外科手术前获取。
测序、训练和验证研究中的血液样本的基础特征详见表3。
表3：发现和验证的基础特征
Figure BDA0003717420400000141
Figure BDA0003717420400000151
患者数据(年龄，性别等)来自医院数据库。肿瘤病理学是根据世界卫生组织肿瘤分类系统由三个病理学家独立进行的。病理追踪(例如通过苏木精和伊红(H&E)染色进行的组织学分析)用干明确确定给定样品的疾病状态(即，健康对照，腺瘤，腺癌或中间状态)以及确保样本分类的一致性。
实施例2：样本采集、外泌体分离及外泌体RNA的提取，参见图1中流程图所示，其系统地阐明了参照本发明的方法来确定表达生物标记的其本方法步骤，用于早期筛查检测HCC、早期检测肝癌术后肿瘤复发以及监测患者手术治疗后的病情变化。
所有血样均在抗凝管中采集，血浆在隔离后3小时内采集。血液样本在4℃下3000×g离心10分钟，血浆储存在液氮中进行外体分离。血浆外泌体提取在 24小时内完成。血浆样品用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释，通过0.22μm过滤器过滤，并在4℃下以150000×g离心2小时。沉淀在冷PBS中再悬浮，并在4℃和150000×g下离心2小时。收集沉淀物并将其重新悬浮在150μLPBS中进行外泌体鉴定，然后将剩余样品用于RNA提取。根据制造商的说明，用TRIzol试剂(Invitrogen)提取RNA。使用Nano-Drop分光光度计(Thermo FisherScientific) 对RNA进行定量。
实施例3：肝细胞癌相关血浆外泌体测序
外泌体miRNA的高通量测序由Aksomics公司进行。简而言之，总RNA样品在琼脂糖凝胶上运行，并切出miRNA条带用于构建cDNA库。然后用Illumina NextSeq 500测序仪对cDNA文库进行测序。原始测序数据经过质量控制后，终端数据与参考基因组进行比较，然后进行miRNA表达定量分析和差异表达筛选。测序结果见图2，图2为外泌体miRNA样本测序差异表达miRNA热图，共筛选1030个差异表达miRNA供进一步筛选。依据测序结果进一步筛选，候选外泌体miRNA(表4)。
表4：候选外泌体miRNA表达量
Figure BDA0003717420400000161
实施例4：外泌体miRNA二次筛选
通过qRT-PCR对训练组样本验证候选外泌体miRNA表达情况进行二次筛选，hsa-miR-212-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-1248、hsa-miR-1250-5p具有显著差异(表5)。依据训练组样本中表达量，绘制对应ROC曲线图，具体可参见图3，图3示出在本发明第一方面的微阵列上获得的优选的miRNA生物标记中所包含的人类miRNA，用于鉴定肝细胞癌的单个血浆外泌体miRNA。各个数据针对内部稳定对照小核RNA序列U6进行了归一化。图中还示出与健康对照相比，肝细胞癌患者的这些miRNA的AUC，图中数据表明在血液样本中可以可靠地将肝细胞癌患者与健康个体区别开。
表5：二次筛选后外泌体miRNA的差异表达及诊断效能
Figure BDA0003717420400000162
Figure BDA0003717420400000171
实施例5：外泌体miRNA组合的诊断效能验证
通过SPSS(25.0，IBM)软件，运用实施例4中训练组样本中外泌体miRNA 表达量数据，建立logistic回归方程构建诊断模型公式如下，其诊断ROC曲线如图4，由图4可知，该模型对研究中所有参与者的ROC曲线下面积为0.8343， 95％置信区间为0.7618～0.9067，敏感度67％，特异度88.24％，可认为具有较高的诊断效能。。
logit(p＝HCC)＝0.116×ΔCt(miR-212-5p)+0.297×ΔCt(miR-519b-3p)+0.114×ΔCt(miR-1248)+0.341×ΔCt(miR-1250-5p)–8.023
通过qRT-PCR检测验证组样本中hsa-miR-212-5p、hsa-miR-519b-3p、 hsa-miR-1248、hsa-miR-1250-5p及小核RNAU6的表达量，计算相对表达量。验证组样本中，共79例样本(HCC样本60例，健康对照样本19例)，预测结果见表6，真阳性率75％，真阴性率73.68％。利用研究中所有参与者血浆外泌体miRNA数据，分析诊断模型诊断效能，绘制对应ROC曲线图(图4)，该模型对研究中所有参与者的ROC曲线下面积为0.8343，95％置信区间为0.7618～ 0.9067，敏感度67％，特异度88.24％，可认为具有较高的诊断效能。
表6：诊断模型验证结果
Figure BDA0003717420400000172
实施例6：量化外泌体miRNA生物标记的方法
为了定性确定，选择了下列的所述核酸表达生物标记：hsa-miR-212-5p(SEQ IDNo.1)、hsa-miR-519b-3p(SEQ ID No.2)、hsa-miR-1248(SEQ ID No.3)和hsa-miR-1250-5p(SEQ ID No.4)，以及内部参照标定小核RNA序列U6(SEQ ID No.5)。
为了将血浆中核酸分子(即在核酸表达生物标记中所包含的编码微RNA序列的核酸分子)的表达水平归一化，可使用内部参照标定小核RNA序列U6(SEQ ID No.5)，其在肝细胞癌血浆外泌体中表达相对稳定。
实验通过Nanodrop分光光度计对提取得外泌体总RNA判断纯度和完整性。吸光度260nm/280nm为2.0最佳，表示RNA较纯。但纯度高不一定意味着RNA 完整性好，需取取6 xLoading buffer 2μL，总RNA4μL，ddH2O 6μL配成反应体系，进行琼脂糖凝胶电泳。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，且28srRNA的亮度应为18s rRNA 的两倍。
本专利限定使用特定的方式将上述的miRNA及小核RNA序列U6进行反转录。本研究中，配置外泌体miRNA的qPCR反应体系均使用锐博生物公司 miDETECT ATrackTM miRMAqPCR试剂盒。
第一步，对miRNA进行加尾：冰上制备如表7的配置比例配置反应体系，配置完成后混匀上述反应体系，于37℃下反应1h，反映完成后的Poly(A)Tailing 产物置于冰上备用，或保存于-80℃超低温冰箱备用。
表7：Poly(A)加尾法反应体系(冰上配制)
Figure BDA0003717420400000181
注：反应体系可按需求放大，20μL反应体系不应当超过5μg的总RNA。
第二步，对miRNA的加尾产物进行逆转录反应：冰上制备逆转录反应体系，反应体系配置比例如表8，混匀该反应体系后，于42℃下孵育1h，然后于72℃下反应10min。反应结束后所得产物为cDNA，该产物可以置于冰上备用或者于 -20℃低温冰箱保存。
表8：加尾产物逆转录反应体系(冰上配制)
Figure BDA0003717420400000191
第三步，制备qRT-PCR反应体系，冰上制备如表9反应体系，将此反应体系内的溶液加入384孔板，混匀。qPCR反应采用合适的PCR仪进行，反应体系：95℃10min，95℃2s，60℃20s，70℃10s，共40个循环。
表9：qRT-PCR反应体系(冰上配制)
Figure BDA0003717420400000192
典型地来说，对每个测量进行了至少三个独立的实验，并且所确定的miRNA 表达水平代表各单独获得的数据的平均值。将所选的4个miRNA的平均表达水平针对稳定表达的对照小核RNA序列U6(SEQ ID No.5)进行归一化，使用如下公式：
Log2([miRNA表达水平]-[U6表达水平])。
本发明miRNA表达生物标记的确定提供一个独特的分子标记，其使得可以通过血浆外泌体对肝细胞癌进行为筛查、检测和诊断。此外，该表达生物标记或可被用于监测肝细胞癌患者的治疗反应及引导做出治疗决策。
在此举例描述的的本发明可以适当地在不存在本文特别揭示的任何元件、限制的条件下进行。因此，例如术语“包含”、“包括”“含有”等应具有广泛含义且无限制。另外，本文应用的术语和表达用于描述本发明而无限制之意，且没有使用这些术语和表达排除任何其所示特征和描述或其一部分的等价物之意，但是应意识到在请求保护的本发明范围内可以进行各种修改。因此，应理解尽管通过实施方案和任选的特征对本发明进行的特别揭示，但是本领域技术人员可以对本发明进行修改和改变，这种修改和改变认为在本发明的范围内。
本文广泛及概括地描述了本发明。落入上位描述范围内的每个较窄的下位概念和亚上位集合也组成了本发明的一部分。这包括用条件或从上位中除去任何主题的否定限制对本发明的上位描述，而无论所除夫的主题是否在本文中特别引述。
其它实施方案在如下权利要求范围内。另外，当本发明的特征或各个方面用马库什组方式描述时，本领域技术人员能意识到本发明也以马库什组的任何各个成员或成员亚组方式被描述。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (8)

1.一种肝细胞癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，所述核酸表达生物标记由一种或多种差异表达的核酸分子组成，所述核酸表达生物标记是存在肝细胞癌的指征，其中，所述核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-212-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-1248和hsa-miR-1250-5p中的任意一或多种核酸分子以及内部参照标定小核RNA序列U6。
2.如权利要求1所述的一种肝细胞癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述核酸表达生物标记包含至少5种核酸分子和/或至少5种核酸分子组合。
3.如权利要求1所述的一种肝细胞癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多种健康对照中相比被下调。
4.如权利要求1～3任意一项所述的一种肝细胞癌早期诊断试剂盒，其特征在于：与一或多个健康对照相比，在一或多个目标血浆外泌体样本中，编码hsa-miR-212-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-1248和hsa-miR-1250-5p的任意一种或多种核酸分子的表达被下调，而小核RNAU6的表达不变。
5.如权利要求1所述的一种肝细胞癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述核酸表达生物标记还包括编码hsa-miR-212-5p-U6、hsa-miR-519b-3p-U6、hsa-miR-1248-U6、hsa-miR-1250-5p-U6、hsa-miR-212-5p/U6、hsa-miR-519b-3p/U6、hsa-miR-1248/U6、hsa-miR-1250-5p/U6、hsa-miR-212-5p/hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-212-5p/hsa-miR-1248、hsa-miR-212-5p/hsa-miR-1250-5p、hsa-miR-519b-3p/hsa-miR-1248、hsa-miR-519b-3p/hsa-miR-1250-5p、hsa-miR-1248/hsa-miR-1250-5p的任意一种或多种核酸分子组合。
6.如权利要求5所述的一种肝细胞癌早期诊断试剂盒，其特征在于：与一或多个健康对照相比，在一或多个目标血浆外泌体样本中，编码hsa-miR-212-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-1248、hsa-miR-1250-5p、hsa-miR-212-5p-U6、hsa-miR-519b-3p-U6、hsa-miR-1248-U6、hsa-miR-1250-5p-U6的任意一种或多种核酸分子组合的表达被下调。
7.一种用于鉴别展现肝细胞癌的一或多种目标血浆外泌体的方法，所述方法包括：
(a)在所述一或多种目标血浆外泌体中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；
(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述多种核酸分子的表达水平；
(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别出在所述目标血浆和对照血浆中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述差异表达的一或多种核酸分子一起代表如权利要求1～6任一项所定义的核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是肝细胞癌存在的指征。
8.权利要求1～6任一项所述的肝细胞癌早期诊断试剂盒在肝癌诊断中的应用。
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