CN114317750B

CN114317750B - 一种卵巢癌生物标志物及其在制备用于卵巢癌腹水转移疾病的药物或试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN114317750B
Application number: CN202111639789.1A
Authority: CN
Inventors: 刘淑鹏; 程忠平; 祖拜旦·苏来曼; 王春燕; 罗宁; 陈莹莹; 丁金晔
Original assignee: Shanghai Tenth Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai Tenth Peoples Hospital
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2024-05-14
Anticipated expiration: 2041-12-29
Also published as: CN114317750A

Abstract

本发明公开了一种卵巢癌生物标志物及其在制备用于卵巢癌腹水转移疾病的药物或试剂盒中的应用，所述卵巢癌生物标志物为circRNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。本发明的卵巢癌生物标志物能够用于制备预防、治疗或诊断卵巢癌腹水转移的药物或试剂盒，利用生物信息分析能够有效地进行分子水平检测来判断卵巢癌患者发生转移的标志，进而为个体化治疗这些疾病提供便利，同时对后续临床研究的开展具有重要的指导意义。

Description

一种卵巢癌生物标志物及其在制备用于卵巢癌腹水转移疾病的药物或试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种卵巢癌生物标志物及其在制备用于卵巢癌腹水转移疾病的药物或试剂盒中的应用。

背景技术

卵巢癌在女性生殖系统三大恶性肿瘤中死亡率最高，上皮性卵巢癌(EpithelialOvarian Cancer，EOC)是最致命的妇科恶性肿瘤之一。由于其高度侵袭性的特点，EOC的五年存活率约为27％，其标准化治疗方案为手术切除肿瘤后联合应用铂类或紫杉醇类药物治疗。虽然在治疗上有了很大的进步，但仍有超过一半的病例在治疗后出现耐药、转移和疾病复发的情况。

卵巢癌进展期腹膜内广泛转移多见，在晚期(Ⅲ-Ⅳ期)卵巢癌患者中约75％伴有大量腹水。腹水是卵巢癌复发和预后不良的独立预后因素，可能导致化疗耐药、转移和可切除性减少，严重影响了患者的生活质量和死亡率。最近的研究发现腹膜转移与上皮-间充质转化(Epithelial to Mesenchymal Transition，EMT)、多细胞聚集体(MulticellularAggregates，MCAS)或球体有关。在这个过程中，卵巢癌细胞从原发部位分离到腹腔，在那里它们以多细胞聚集体(MCAS)或球体的形式循环存在。一旦肿瘤细胞到达合适的位置，它们就会在腹膜、大网膜以及盆腔和腹部器官的表面形成恶性菌落。腹水中含有大量的肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞和生长因子以及细胞外基质成分。卵巢癌腹水代表了肿瘤转移的微环境，为肿瘤的扩张、迁移和细胞增殖提供了合格的条件。有趣的是，从EOC患者的腹水中分离出的球体已被发现具有EMT的特征。因此，迫切需要了解腹水腹膜转移的机制，寻找有用的生物标志物和有效预防卵巢癌转移。

同时，卵巢癌早期症状隐匿，常在症状出现之前就已发生腹腔转移。卵巢癌的临床诊断主要通过糖蛋白125(CA125)、人附睾蛋白(HE4)和糖蛋白724(CA724)等生物学指标和影像学进行卵巢癌的诊断和疗效检测，但现有的血清生物学标志物敏感性、特异性并不是十分理想，而CT、MRI价格昂贵且有辐射。卵巢癌诊断的金标准是组织病理学活检，但由于肿瘤异质性和操作的有创性、不可重复性，使其具有局限性。因此，亟需寻找新的生物标志物实现卵巢癌的早期诊断，并进行疗效监测有十分重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种卵巢癌生物标志物，能够用于制备预防、治疗或诊断卵巢癌腹水转移的药物或试剂盒，在卵巢癌预防、治疗、诊断、疗效监测和预后中均具有极大的价值。

在本发明的第一个方面，提出了一种卵巢癌生物标志物，所述卵巢癌生物标志物为circRNA；其中，所述circRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。

在本发明中，环状RNA(Circular RNA，circRNA)不同于线性RNA分子，是一大类具有闭合环状结构的特殊非编码RNA。circRNA大量存在于真核细胞中，通常具有组织或发育阶段的表达特异性，且多数序列高度保守，具有重要调控功能。研究发现，有许多circRNAs在正常与癌组织之间呈差异表达，因此，其对于癌症的调控和检测具有十分重要的作用，是潜在的肿瘤生物标志物。

在本发明的第二个方面，提出了上述卵巢癌生物标志物在制备预防和/或治疗卵巢癌腹水转移疾病的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述药物能够抑制所述circRNA的表达。在一些实施例中，实验确证了通过靶向沉默所述circRNA(即hsa_circ_0000918和hsa_circ_0000497)、抑制所述circRNA的表达，能够抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，因此，通过抑制所述circRNA的表达对预防和治疗卵巢癌腹水转移具有一定的效果。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述药物为靶向沉默如权利要求1所述的卵巢癌生物标志物的siRNA。

在本发明中，小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)有时称为短干扰RNA(short interfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，能够干扰表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述siRNA包含：核苷酸序列如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的序列对；和/或核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的序列对。

在本发明的第三个方面，提出了上述卵巢癌生物标志物在制备诊断卵巢癌腹水转移疾病的试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒能够定性或定量地检测所述circRNA的表达。在一些实施例中，实验确证了所述circRNA(即hsa_circ_0000918和hsa_circ_0000497)在腹水转移的组织中显著性高表达，在原位卵巢癌组织中表达量较低，因此，通过检测患者的所述circRNA表达量情况即可准确判断患者是否发生腹水转移，对卵巢癌患者的诊断和预后判断具有十分有效的判断。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述定性或定量地检测所述circRNA的表达包括：通过qPCR检测circRNA的水平。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述试剂包含：核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物对；和/或核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的引物对。

在本发明的第四个方面，提出了一种预防和/或治疗卵巢癌腹水转移的药物，所述药物为靶向沉默所述卵巢癌生物标志物的siRNA。

在本发明中，靶向沉默所述卵巢癌生物标志物的siRNA通过与所述circRNA靶向结合，抑制所述circRNA表达，降低所述circRNA的含量。

在本发明的一些实施方式中，所述siRNA包含：核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQID No.4所示的序列对；和/或核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的序列对。

在本发明的第五个方面，提出了一种诊断卵巢癌腹水转移的试剂盒，所述试剂盒包含定性或定量地检测所述卵巢癌生物标志物的表达的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂包含：核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示的引物对；和/或核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的引物对。

本发明的实施例至少具有以下有益效果：本发明主要提供了一种用于卵巢癌腹水转移的生物标志物circRNA，该circRNA在卵巢癌腹水中高表达；本发明通过利用高通量测序技术对收集的卵巢癌原发组织，腹水肿瘤细胞和转移灶组织标本进行分析，筛选出在卵巢癌腹水中表达存在异常的2种circRNA，实验确认该2种circRNA能够促进卵巢癌经腹水转移，因此，通过检测该circRNA的表达能够诊断卵巢癌的复发及愈后情况，抑制该circRNA的表达能够预防或治疗卵巢癌的腹水转移；本发明利用生物信息分析能够有效地进行分子水平检测来判断卵巢癌患者发生转移的标志，进而为个体化治疗这些疾病提供便利，同时对后续临床研究的开展具有重要的指导意义。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中原发灶(T)、腹水(ASC)、转移灶(M)的mRNA表达谱数据的PCA主成分分析图；

图2为本发明实施例1中基因集富集分析(ssGSEA)分析图，图中显示了原发部位、腹水和转移部位的上皮表型和间质表型在mRNA表达中的富集情况；

图3为本发明实施例1中原发灶、腹水和转移灶mRNA表达中EMT所有基因的表达情况图；

图4为本发明实施例2中circRNA在原发部位组织和腹水肿瘤细胞中差异性表达情况图；

图5为本发明实施例2中circRNA在腹水肿瘤细胞和转移部位组织中差异性表达情况图；

图6为本发明实施例2中对circRNAs表达进行软聚类分析得到聚类结果，其中，横轴代表样本(T、ASC、M)，垂直轴表示表达式更改，E簇(上皮表型，包括簇1，2，5)和M簇(间质表型，包括簇4)；

图7为本发明实施例2中ASC组和T组、ASC组和M组以及cluster_E组之间差异表达的circRNA之间重叠的circRNA的Venn图；

图8为本发明实施例2中ASC组和T组、ASC组和M组以及cluster_M组之间差异表达的circRNA之间重叠的circRNA的Venn图；

图9为本发明实施例2中差异表达circRNA的热图，红色代表高表达水平；绿色代表低表达水平；每行代表一个circRNA；每列代表组织样本的表达谱；

图10为本发明实施例3中hsa_circ_0000497的结构图；

图11为本发明实施例3中hsa_circ_0000918的结构图；

图12为本发明实施例3中Sanger测序法测定hsa_circ_0000497的反向剪接位点图；

图13为本发明实施例3中Sanger测序法测定hsa_circ_0000918的反向剪接位点图；

图14为本发明实施例3中hsa_circ_0000497和hsa_circ_0000918在SKOV3细胞中小干扰RNA转染后的表达效率图；

图15为本发明实施例3中划痕实验结果图；

图16为本发明实施例3中transwell侵袭实验和迁移实验结果图；

图17为本发明实施例3中western-blot实验结果图；

图18为本发明实施例4中circRNA在临床标本中的表达情况结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

(1)细胞系和细胞培养：

本发明实施例中使用的卵巢癌细胞系SKOV3在本实验室保存，并在实验开始时用STR华科基因技术(中国)进行检测。细胞系在37℃、5％CO₂、至少95％湿度的RPMI1640(Gibco，美国)+10％胎牛血清(BI，中国)中培养。

(2)统计分析：

在本发明实施例中所有实验至少重复三次。所有统计分析均使用R软件(v.4.0.3)和上述软件包进行。P<0.05被认为具有统计学意义。

实施例1：转录组分析确定卵巢癌经腹水转移过程的生物学过程

本实施例通过高通量测序技术，分析了9例卵巢癌原发灶标本、4例腹水肿瘤细胞和9例转移灶标本的circRNA和mRNA表达谱检测。

1.1实验对象及组织标本

本实施例中选取了上海市第十人民医院妇产科确诊为卵巢癌患者作为研究对象，取9位卵巢癌患者的肿瘤原发部位组织9例，腹水肿瘤细胞4例，转移部位组织9例，患者情况如下表1所示。这些患者均由本研究由上海市第十人民医院肿瘤研究所伦理委员会批准，肿瘤原发灶和转移灶的病理学分类由资深病理学家确认。腹水样本以3000转/分离心5min，然后小心去除上清液，沉淀留作研究。收集9例卵巢癌患者的22例标本进行RNA测序。

表1.患者情况

1.2 RNA测序分析

用RNAiso Plus(Takara，日本)提取总RNA。使用安捷伦生物分析仪(Thermo，美国)检查质量。所有样品的RNA完整性数(RIN)均大于7。Illumina TruSeq双链RNA样品制备试剂盒(Illumina，USA)用于文库制备。然后使用Illumina NovaSeq 6000(Illumina，USA)进行测序，并进行成对的末端2×150核苷酸读取。使用Trimomatic v.0.32和默认参数过滤和修剪FASTQ文件中的低质量读取和残馀适配序列。使用HTSeq计算每RNA的读取计数。为了避免总读数排序引起的差异，原始读计数被归一化为每个样本的总读计数。对归一化读取计数执行Log2转换。为了避免出现零对数，在进行对数转换之前，所有读取计数都加1。使用默认参数用Find_CIRC算法检测和识别circRNA。采用归一化读数矩阵，利用主成分分析(PCA)强调31例原发部位、转移部位和腹水标本之间的差异和相似性。应用BioConductor R程序包“DESeq2”算法，通过Foldchange>2和p值<0.05鉴定差异表达的circRNA(DECS)和mRNA，并用grepel、gglot和pheatmap程序包绘制火山图和DECS和DECS的热图。用V-ENN图表示DERNAs的交集。

利用主成分分析分析了mRNA表达谱的综合表达情况，图1中的每个点代表一个降维的光谱。PC1和PC2的变异水平分别为21.96％和13.05％。所有数据按样本类型分开，自动组合更能反映不同组织细胞的性质。

结果显示，腹水组与原发部位组和转移部位组非常不同。原发灶和转移灶的数据集重叠。主成分分析结果表明，腹水中的基因表达与原发肿瘤组和转移灶组有显著差异。

1.3单样本基因集富集分析(ssGSEA)

从GO数据库(http://geneontology.org/)获得的EMT基因符号(gene symbol)的富集分数。下表2列出了用于计算ssGSEA评分的M表型上皮基因集(n＝54)和E表。型间质基因集(n＝31)的基因符号，如下表2所示。在R包GSVA中进行ssGSEA分析，可以计算每个基因集的归一化富集分数。

表2.E表型基因集和M表型基因集

接下来用ssGSEA方法分析这些样本的组织学类型。本实施例选取两组EMT相关基因(分别为上皮表型和间质表型)，以验证卵巢癌经腹水转移中的生物学过程。

结果显示，腹水中上皮表型的富集程度明显低于原发部位和转移部位。相反，间质表型在腹水中明显高于转移灶，结果如图2所示。原发部位上皮和间质表型无明显差异，这可能是由于卵巢表面上皮表现为上皮和间质特征所致。

最后上皮细胞向间质细胞的转变(epithelial to mesenchymal transition，EMT)相关所有基因在卵巢癌经腹水转移中的表达情况相关热图如图3所示。以上分析结果提示在卵巢癌腹水转移过程中，可能发生EMT生物学过程。

实施例2：筛选卵巢癌经腹水转移中差异表达的circRNA

本实施例为了验证卵巢癌腹水中特异的circRNA，共检测了3658个circRNA，并去除了表达值为0的50％circRNA。

2.1R语言分析

利用R语言DESeq2软件包分析比较这3组(腹水组、原发部位组和转移部位组)组织中circRNA表达水平的差异性，对差异的判断我们选取了两个判断标准：一是计算FoldChange，即计算卵巢癌原发部位组织，腹水肿瘤组织以及转移部位组织中每个circRNA表达情况之间的差异倍数；二是对每个circRNA的表达情况进行P值的计算，FoldChange>2或P<0.05视为有意义，统计结果以log₂FoldChange的散点图形式表示。

在本实施例中，共有68个circRNA(包括67个下调和5个上调)在T-ASC组差异表达，71个circRNA(包括14个下调和57个上调)在ASC-M组差异表达，如图4和图5所示。

2.2Mfuzz时间聚类分析

同时，为了确定circRNAs在卵巢癌从原发肿瘤(T)到腹水产生(ASC)和转移(M)过程中的表达趋势，使用Mfuzz软件包进行了软聚类分析。具体步骤为：基于circRNA和mRNA的表达数据，计算各组表达矩阵的平均值。应用R软件((http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Mfuzz.html，Version 2.50.0中的Mfuzz软件包对原发灶、腹水和转移灶表达矩阵的circRNA和mRNA进行软聚类分析。如果标准偏差(SD)<0.4，簇核心＝0.5，则消除circRNA和mRNA数据。在此过程中，采用模糊C均值聚类方法，根据时间的变化和表达水平的变化进行聚类分析。最后，获得多个聚类结果，并将表达变化一致的结果归入同一组。根据表达值的不同，确定组内DEG和DECS(以P<0.05为界值)。

Mfuzz分析共获得6个circRNA表达簇。簇之间的重叠分析可以将这6个簇分为两大类，分别是簇E(上皮表型，包括簇1，2，5)和簇M(间质表型，包括簇4)，如图6所示。E簇的circRNA在T和M中高表达，ASC中低表达，而M簇中的circRNA在T和M中低表达，ASC中高表达。簇3和簇6中的circRNA表现出不一致的趋势，这些簇中的基因被移除。共筛选到133个E型circRNA和8个M型circRNA。

2.3腹水转移差异性表达circRNA

同时，为了详尽分析腹水引起卵巢癌转移的相关模块，将差异表达的circRNAs(differentially expressed circRNAs，DECs)与2个簇circRNA相交。筛选出表达模式与簇变化趋势一致的DECs。总共鉴定出10个DECs，其中8个在簇E中，2个在簇M中，如图7和图8所示。热图显示了所选circRNA的表达水平，如图9所示。

Hsa_circ_0000048、hsa_circ_0000137、hsa_circ_0002925、hsa_circ_0005325、hsa_circ_0031584和hsa_circ_0081207等circRNA在T-asc组下调，在asc-M组上调，hsa_circ_0000497和hsa_circ_00918在T-asc组上调和下调。hsa_circ_0000497和hsa_circ_00918在腹水中表达量最高，因此选为卵巢癌腹水相关的生物标志物进行后续研究。筛选的circRNA的基本信息如下表3所示。

表3.筛选的circRNA信息

实施例3：沉默hsa_circ_0000918/0000497抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力

在上述实施例的初步实验筛选中，图2中ssGSEA分析结果提示卵巢癌经腹水转移中间质性标志物高表达，因此选择hsa_circ_0000497和hsa_circ_00918，共筛选出两个circRNA，分别为hsa_circ_0000497和hsa_circ_0000918。

3.1hsa_circ_0000497和hsa_circ_0000918序列及结构

利用CSCD，一个全面的癌症特异性circRNA数据库，研究DECS的基本结构模式。hsa_circ_0000497由其宿主基因SLAIN1的5-13个外显子组成，位于Chr13：78293666-78327493，如图10所示。hsa_circ_0000918由其宿主基因GMIP的16-18个外显子组成，位于Chr19：1975089319751380，如图11所示。hsa_circ_0000497的长度为788个核苷酸(Nt)，hsa_circ_0000918的长度为299nt。

hsa_circ_0000497的核苷酸序列(SEQ ID No.1)为：

GTTATACATTGGCTCTTCAAAGACGTTCACCTCATCAGAGAAATCCCTGACTCCTTTGCAGTGGTGTAGACATGTCCTAGATAACCCAACTCCTGAGATGGAAGCAGCGAGACGTTCCCTGTGCTTTAGACTGGAGCAAGGTAATTCTAGCCGATGGCGGAGTCTCTTCTCTTCAACTGCCTCACTGGCTTTTCCTTATAGTCCTGTTGCAAGACTCAGCCCTTATAGCAATGGCATTAATACTCCCAGCTTCTCTAAAACCTCAAATAAAGCAATACTAACACCTGAAAAAACAGGTTACACTTCCAGGGGCTCCCCACTCAGTCCCCAGTCATCTATCGACAGTGAGCTGAGTACTTCAGAATTGGAGGATGATTCTATCTCCATGGGATATAAATTACAGGACCTCACTGATGTTCAGATCATGGCTCGTCTGCAAGAAGAAAGTCTCAGGCAAGATTATGCTTCTACTTCAGCATCTGTATCAAGACATAGTTCCAGTGTGTCATTGAGTTCAGGAAAAAAAGGGACATGTAGTGATCAAGAATATGACCAATACAGTCTGGAGGATGAAGAGGAATTTGATCATTTGCCACCACCTCAGCCTCGTCTTCCAAGATGTTCCCCTTTCCAAAGAGGAATTCCCCATTCACAGACTTTCTCCAGCATTCGGGAGTGTAGGAGGAGCCCCAGTTCCCAGTATTTTCCTTCAAATAATTACCAGCAGCAACAGTATTATTCACCTCAAGCCCAAACTCCAGATCAGCAACCAAATAGGACCAATGGAGATAAGCTCCGAAGAAGTATGCCTAACCTAGCCCGGATGCCAAGTACAACTGCCATTAGTAGCAACATTAGTTCTCCGGTCACCGTGCGAAATAGTCAGAGTTTTGACTCAAGCTTGCATGGAGCTGGAAATGGAATTTCAAGAATACAATCTTGTA；

hsa_circ_0000918的核苷酸序列(SEQ ID No.2)为：

GGGAGGAACTGGACTTGCGGCTCATTCGGACAAAGGGGGGTGTGGACGCAGCCCTGGAATATGCCAAGACCTGGAGCCGCTATGCCAAGGAACTGCTTGCCTGGACTGAAAAGAGAGCCAGCTATGGTGAGGACCTCTTCCGCCCAGCCCCAGTTACCAGGCAGTCCCCAGACCCCAGCTAGACCCAGAGCCCGGCTCTCTCTTCCCCCAGAGCTGGAGTTTGCTAAGAGCACCATGAAGATCGCTGAAGCTGGCAAGGTGTCCATTCAACAGCAGAGCCACATGCCTCTGCAGTACATCTACACCCTGTTTCTGGAGCACGATCTCAGCCTGGGAACCCTGGCCATGGAGACAGTGGCCCAGCAGAAAAGAGACTACTACCAG。

3.2总RNA提取和实时定量PCR

利用对筛选出的2个circRNA进行初步引物设计，并通过实时荧光定量(qRT-PCR)的熔解曲线方式对引物的特异性加以验证。

按生产厂家说明书用RNAiso Plus(日本高原市)完成总RNA提取。随后通过NanoDrop2000(Thermo Science，Wilmington，DE，USA)测量所有RNA样品的浓度和纯度。使用PrimeScript RTMaster Mix(Takara，日本)将1ug总RNA转换为cDNA。逆转录后，使用SYBRPreMix ExTaq试剂盒(Takara，志贺，日本)在QuantStudio Dx(ABI，美国)上进行定量实时PCR(qRT-PCR)。用2^-CT法计算相对表达量。所有引物序列如下表4所示。

表4.引物序列

由于circRNA特殊的环状结构，其3’端与5’端相互衔接，因此引物设计需采用反向设计的方法，达到扩增剪接位点的目的。熔解曲线呈现独立单峰形态时提示引物的特异性较好，实验中使用GAPDH作为内参对照。Sanger测序显示hsa_circ_0000497和hsa_circ_0000918由两个外显子反向剪接形成闭环结构，分别如图12和图13所示。

3.3沉默hsa_circ_0000918/0000497对卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响

为了进一步验证hsa_circ_0000497和hsa_circ_0000918在卵巢癌细胞增殖生长中的作用，我们选用了SKOV3人类卵巢癌细胞株进行体外验证。

(1)预测miRNA结合位点和miRNA：

基于TargetScan(http://www.targetscan.org)和miRDB(http://mirdb.org/)预测miRNA结合位点和miRNA与mRNA之间的靶基因相互作用。只有被两个数据库识别的mRNAs被认为是候选mRNAs，并确定与DEG的交叉点以筛选出DEmiRNAs靶向的DEG。同时，利用CircBase(http://www.circbase.org/)作为候选的CircRNA靶向miRNA进行研究。

(2)质粒构建和转染：

针对hsa_circ_0000497和hsa_circ_0000918连接序列和对照siRNA的小干扰RNA(SiRNA)由GenePharma(中国)公司设计合成，如下表5所示。SKOV3按照生产厂家的说明用脂质体3000试剂(Invitgen，美国)转染。

表5.hsa_circ_0000497/hsa_circ_0000918的siRNA序列

本实施例使用相应的siRNA将hsa_circ_0000497和hsa_circ_0000918在SKOV3细胞系中进行转染后培养，然后将si-NC作为对照组图。研究了沉默hsa_circ_0000497和hsa_circ_0000918是否影响细胞的迁移和侵袭性。实时荧光PCR证实了沉默效率，如图14所示。

(3)细胞划痕实验：

每孔1×10～5个SKOV3细胞接种于6孔板中。转染24小时后，待细胞融合度接近100％时，200μl枪头垂直孔板面并沿孔板直径轻轻压垂直画一条线，弃去原来的培养基，PBS清晰2次，补2ml含1％FBS的培养基中培养细胞，用显微镜成像系统拍摄0h的图像和24h的图像。最后R语言统计其差异，p<0.05视为差异有统计学意义。

结果显示，hsa_circ_0000497和hsa_circ_0000918的沉默影响了EOC细胞系的迁移，如图15所示。

(4)Transwell迁移和侵袭实验：

采用24孔Transwell平板进行细胞侵袭和迁移实验。Transwell板(美国康宁)在加迁移分析或侵袭分析Matrigel^TM基质(354,234，美国康宁)情况下铺板。转染24小时后，SKOV3(1×10⁵)细胞经胰酶消化、PBS洗涤2次后，再悬浮于200μl无血清培养基中，缓慢滴入预涂好的小室中，在含20％胎牛血清的24孔板中孵育48h，48h后用棉签擦拭细胞膜上表面的基质和细胞，去除通过膜迁移并贴壁的侵袭性细胞。使用倒置显微镜成像量化视野系统(放大倍率：100；尼康，日本)拍摄并计数侵袭细胞的数量。

在Transwell实验中，包括迁移和侵袭，结果显示了沉默hsa_circ_0000497和hsa_circ_0000918显著抑制SKOV3细胞的迁移和侵袭能力，如图16所示。

(5)Western blot实验：

用含有1％coctail通用蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(GenePhrma，中国)冰冻提取蛋白质，然后在4℃，12000g/15min的条件下离心，去掉沉淀物。用Beyotime(中国)BCA蛋白分析试剂盒检测蛋白质浓度，然后用Beyotime Biotechnology(Beyotime Biotechnology)6倍SDS负载缓冲液加热(95℃)变性10min。用SDS-PAGE电泳将样品转移到PVDF膜上，用5％脱脂牛奶溶液封闭1h 40min，然后与一抗在4℃孵育过夜。最后，将膜与二抗在室温下孵育1h，用Immobilon ECL底物(Epichyme，中国)和amersham Imager 600(美国Cytiva)进行信号检测和图像采集。本研究中使用的抗体列如下表6所示：

表6.使用的抗体详情

Western blot结果显示，hsa_circ_0000497和hsa_circ_0000918在SKOV3细胞中过表达，N-cadherin和vimentin的表达增加，而上皮标志物ZO-1和E-cadherin的表达降低。综上所述，hsa_circ_0000497和hsa_circ_0000918过表达可促进卵巢癌细胞在体外的增殖、迁移、侵袭和上皮转移。hsa_circ_0000918和hsa_circ_0000497基因敲除后，卵巢癌细胞Ecadherin和ZO-1表达上调，vimentin和N-cadherin表达下调，如图17所示。

综上所述，这些结果提示沉默hsa_circ_0000918和hsa_circ_0000497可以预防卵巢癌细胞的迁移和侵袭过程中起重要作用。

实施例4：临床诊断验证

本实施例选取了上海市第十人民医院妇产科确诊为卵巢癌患者作为研究对象，取8位卵巢癌患者的配对的肿瘤原发部位组织，腹水肿瘤细胞，转移部位组织进行qPCR实验验证hsa_circ_000918的表达情况。这些患者均由本研究由上海市第十人民医院肿瘤研究所伦理委员会批准，肿瘤原发灶和转移灶的病理学分类由资深病理学家确认。腹水样本以3000转/分离心5min，然后小心去除上清液，沉淀留作研究。

qPCR实验结果提示hsa_circ_0000918在卵巢癌患者原发灶、腹水肿瘤细胞和转移灶组织中表达情况与我们测序结果一致，在腹水肿瘤细胞中异常高表达，具有显著差异性，如图18所示。该circRNA在卵巢癌腹水中高表达，进一步提示该circRNA在卵巢癌经腹水转移中起重要作用。同时，该circRNA可用于卵巢癌腹水转移的诊断，在至少6名患者中检测出显著性的差异表达，具有较高的检测准确率。因此，可以通过检测患者体内的hsa_circ_0000918和hsa_circ_0000497的表达情况即可判断卵巢癌患者是否发生腹水转移，可以实现卵巢癌病程发展的情况的早期检测和监控，以及提供新的安全有效的检测手段和提高检测准确性。

本发明主要提供了一种用于卵巢癌腹水转移的生物标志物circRNA，该circRNA在卵巢癌腹水中高表达；本发明通过利用高通量测序技术对收集的卵巢癌原发组织，腹水肿瘤细胞和转移灶组织标本进行分析，筛选出在卵巢癌腹水中表达存在异常的2种circRNA，实验确认该2种circRNA能够促进卵巢癌经腹水转移，因此，通过检测该circRNA的表达能够诊断卵巢癌的复发及愈后情况，抑制该circRNA的表达能够预防或治疗卵巢癌的腹水转移；本发明利用生物信息分析能够有效地进行分子水平检测来判断卵巢癌患者发生转移的标志，进而为个体化治疗这些疾病提供便利，同时对后续临床研究的开展具有重要的指导意义。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

序列表

<110> 上海市第十人民医院

<120> 一种卵巢癌生物标志物及其在制备用于卵巢癌腹水转移疾病的药物或试剂盒中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 944

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttatacatt ggctcttcaa agacgttcac ctcatcagag aaatccctga ctcctttgca 60

gtggtgtaga catgtcctag ataacccaac tcctgagatg gaagcagcga gacgttccct 120

gtgctttaga ctggagcaag gtaattctag ccgatggcgg agtctcttct cttcaactgc 180

ctcactggct tttccttata gtcctgttgc aagactcagc ccttatagca atggcattaa 240

tactcccagc ttctctaaaa cctcaaataa agcaatacta acacctgaaa aaacaggtta 300

cacttccagg ggctccccac tcagtcccca gtcatctatc gacagtgagc tgagtacttc 360

agaattggag gatgattcta tctccatggg atataaatta caggacctca ctgatgttca 420

gatcatggct cgtctgcaag aagaaagtct caggcaagat tatgcttcta cttcagcatc 480

tgtatcaaga catagttcca gtgtgtcatt gagttcagga aaaaaaggga catgtagtga 540

tcaagaatat gaccaataca gtctggagga tgaagaggaa tttgatcatt tgccaccacc 600

tcagcctcgt cttccaagat gttccccttt ccaaagagga attccccatt cacagacttt 660

ctccagcatt cgggagtgta ggaggagccc cagttcccag tattttcctt caaataatta 720

ccagcagcaa cagtattatt cacctcaagc ccaaactcca gatcagcaac caaataggac 780

caatggagat aagctccgaa gaagtatgcc taacctagcc cggatgccaa gtacaactgc 840

cattagtagc aacattagtt ctccggtcac cgtgcgaaat agtcagagtt ttgactcaag 900

cttgcatgga gctggaaatg gaatttcaag aatacaatct tgta 944

<210> 2

<211> 384

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggaggaact ggacttgcgg ctcattcgga caaagggggg tgtggacgca gccctggaat 60

atgccaagac ctggagccgc tatgccaagg aactgcttgc ctggactgaa aagagagcca 120

gctatggtga ggacctcttc cgcccagccc cagttaccag gcagtcccca gaccccagct 180

agacccagag cccggctctc tcttccccca gagctggagt ttgctaagag caccatgaag 240

atcgctgaag ctggcaaggt gtccattcaa cagcagagcc acatgcctct gcagtacatc 300

tacaccctgt ttctggagca cgatctcagc ctgggaaccc tggccatgga gacagtggcc 360

cagcagaaaa gagactacta ccag 384

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

auacaaucuu guaguuauat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uauaacuaca agauuguaut t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agacuacuac caggggaggt t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccuccccugg uaguagucut t 21

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtcaccgtg cgaaatag 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcaaaggagt cagggatt 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggcaaggtgt ccattcaa 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgagccgcaa gtccagtt 18

Claims

1.一种抑制卵巢癌生物标志物表达的siRNA在制备预防和/或治疗卵巢癌腹水转移疾病的药物中的应用，其中，所述卵巢癌生物标志物为circRNA，所述circRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。

2.一种检测卵巢癌生物标志物的引物对在制备诊断卵巢癌腹水转移疾病的试剂盒中的应用，其中，所述卵巢癌生物标志物为circRNA，所述circRNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒能够定性或定量地检测所述circRNA的表达。

4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述定性或定量地检测所述circRNA的表达包括：通过qPCR检测circRNA的水平。

5. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包含：核苷酸序列如SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示的引物对；和/或

核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的引物对。

6. 一种预防和/或治疗卵巢癌腹水转移的药物，其特征在于，所述药物为靶向沉默卵巢癌生物标志物的siRNA，其中，所述卵巢癌生物标志物为circRNA，所述circRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；

所述siRNA包含：核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的序列对；和/或核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的序列对。