CN112921086A - Circ-CRIM1作为卵巢癌诊断标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学和肿瘤标志物医学技术领域，尤其涉及circ‑CRIM1作为卵巢癌诊断标志物及其应用。一种用于卵巢癌诊断的生物标志物，所述标志物为环状RNA CRIM(circ‑CRIM1)，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，它能够明确清楚地表征卵巢癌的发生发展，该标志物在人临床卵巢癌组织中相比对应正常卵巢组织呈现特异性高表达现象，并且在人卵巢癌细胞系中也呈现特异性高表达现象。卵巢癌诊断生物标志物环状circ‑CRIM1在制备卵巢癌诊断产品中的应用。circ‑CRIM1作为卵巢癌的诊断标志，为卵巢癌治疗的提供分子靶点，可应用于抗肿瘤的药物的制备。

Description

Circ-CRIM1作为卵巢癌诊断标志物及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和肿瘤标志物医学技术领域，尤其涉及circ-CRIM1作为卵巢癌诊断标志物及其应用。

背景技术

卵巢癌（OC）是女性生殖系统中相对常见的恶性肿瘤，并且具有最高的妇科恶性疾病死亡率。已知有许多类型的OC，其中上皮性卵巢癌（EOC）是最常见的。EOC在早期阶段没有明显症状，大多数患者在初步诊断时处于晚期，治疗效果差，5年生存率极低。临床上若能早期发现并诊断OC，并且及时合理地行根治性手术或靶向分子药物治疗等综合治疗手段，能够极大地提高OC患者的生存率、生存质量和延长生存时间。因此，深入研究OC的相关分子及信号传导通路机制具有十分重要的临床意义。

环状RNA（circRNAs）是一种内源性非编码RNA的新类别，是由pre-RNA经反向剪接后形成的，其特征在于它们的共价闭环结构不存在5'帽或3'聚A尾，使它们对核酸外切酶具有更高的耐受性。它们通常是稳定的，丰富的和保守的RNA分子，具有复杂的组织和阶段特异性表达模式。虽然涉及circRNA产生和功能的机制尚不完全清楚，但已经有报道指出它们参与调控包括心血管疾病、系统性红斑狼疮、神经系统性疾病和肿瘤等多种人类基本病理过程。越来越多的证据表明环状RNA参与调控多种肿瘤的发生，促进肿瘤细胞的增殖、调节细胞周期进程等，也有一些环状RNA参与调控肿瘤的转移。但并没有关于Circ-CRIM1在卵巢癌组织中表达情况的相关报道，并且寻找到有效的早期发病的生物标志物，以及相关的分子机制对指导卵巢癌临床诊治、治疗及预后有重要意义。总体而言，进一步研究circRNA 在妇科恶性肿瘤特别是在卵巢癌发生发展中的作用，对于卵巢癌的早期诊断以及预后都具有非常重要的帮助。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷，为寻找卵巢癌新的诊断分子标志物及治疗靶点，本发明的目的是提供circ-CRIM1作为卵巢癌诊断标志物及其应用，本发明公开的一种新的卵巢癌诊断标志物，能够明确清楚地表征卵巢癌的发生发展，该标志物在人临床卵巢癌组织中相比对应正常卵巢组织呈现特异性高表达现象；并且，在人卵巢癌细胞系中也呈现特异性高表达现象。circ-CRIM1作为卵巢癌的诊断标志，为卵巢癌治疗的提供分子靶点，可应用于抗肿瘤的药物的制备。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种用于卵巢癌诊断的生物标志物，所述标志物为环状RNA CRIM(circ-CRIM1)，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述circ-CRIM1为线性CRIM1第2-4号外显子剪切后所形成的环状RNA，CRIM1 mRNA的定位为：chr2:36668400-36749456，相应的线性基因为CRIM1(NM_016441.3)，环化序列有538个碱基，包含3个外显子。

卵巢癌诊断生物标志物环状circ-CRIM1在制备卵巢癌诊断产品中的应用。

进一步地，所述的卵巢癌诊断产品选自制剂、芯片或试剂盒，通过测定样本中circ-CRIM1的表达水平及变化进行诊断。

进一步地，所述的卵巢癌诊断产品包括来扩增特异性识别环状RNA CRIM的核酸序列的引物对。

进一步地，所述的引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

卵巢癌诊断生物标志物环状circ-CRIM1在制备治疗卵巢癌的制剂中的应用。

所述的治疗卵巢癌的制剂，包括特异性干扰环状RNA CRIM1的序列，该序列用于抑制环状RNA CRIM1的水平。

进一步地，所述的特异性干扰环状RNA CRIM1的序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.4-5中的任一种或几种所示。

与现有技术比，本发明的有益效果如下。

本发明首次发现circ-CRIM1可作为卵巢癌诊断生物标志物，其在卵巢癌肿瘤中呈特异性高表达现象，而在正常组织中没有这种特异性高表达现象；通过检测受试者体内的circ-CRIM1表达，可以快速、准确及清楚的确定卵巢癌的发生。另外，本发明的结果还表明干扰circ-CRIM1的化合物可以抑制卵巢癌的生长，为临床治疗卵巢癌提供了新的靶点，干扰circ-CRIM1的化合物可应用于抗肿瘤的药物的制备。

附图说明

图1是人卵巢癌细胞系中circ-CRIM1的Sanger测序图。

图2是circ-CRIM1在人临床卵巢癌组织中的表达情况。

图3是裸鼠皮下成瘤实验结果图，其中图3a、3b是裸鼠皮下瘤实验结束时的大体照片及肿瘤取出后的照片。图3c是稳定过表达circ-CRIM1的卵巢癌细胞裸鼠皮下瘤模型的肿瘤体积测量图。

图4是在人卵巢癌细胞系CAOV3和OVCAR3分别过表达和敲低circ-CRIM1的细胞增殖实验结果。

图5是在人卵巢癌细胞系CAOV3和OVCAR3分别过表达和敲低circ-CRIM1的伤口愈合实验结果。

图6是在人卵巢癌细胞系CAOV3和OVCAR3分别过表达和敲低circ-CRIM1的细胞侵袭实验结果。

图7是在人卵巢癌细胞系CAOV3和OVCAR3分别过表达和敲低circ-CRIM1的细胞凋亡实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中未作特殊说明的操作方法均为本技术领域常规操作方法。

实施例1 circ-CRIM1的鉴定及其在卵巢癌组织和细胞中的检测。

对人卵巢癌细胞中的对应环状RNA进行鉴定和检测。使用TRIzol reagent（Japan,Shiga, Takara）从卵巢癌组织中中提取总RNA。首先，将适量的氯仿添加到TRIzol中。离心后，将上层水相添加到新的离心管中，并添加相同体积的异丙醇以沉淀RNA。再次离心后，弃去上清液，并用75％乙醇洗涤RNA沉淀。然后将沉淀物干燥并溶解在焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水中。然后使用紫外分光光度计（中国上海，Unico）测量260 nm处的吸光度（OD），以计算RNA浓度。然后，使用avian myeloblastosis virus transcriptase和随机引物（Japan,Shiga, Takara）将2μgRNA反转录为互补DNA（cDNA）。接下来，使用SybrPrimeX EX-TAQPatent II Kit（Japan, Shiga, Takara）。最后，使用2-ΔΔCt方法比较目标基因的阈值（Ct）和18S rRNA（18 s）/ U6，以确定目标基因的相对表达水平。结果如图1所示，结果显示在人的卵巢癌细胞中也存在这个环状RNA。

收集人卵巢癌(样本数n＝130)及其对应正常卵巢组织(样本数n＝24)新鲜标本进行，实际操作过程与卵巢癌组织提取鉴定环状RNA一样检测，如图2所示，circ-CRIM1在卵巢癌组织中的水平显著高于其对应的正常卵巢组织。

以上结果都提示circ-CRIM1(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，hsa_circ_0002346|chr2: 36668400-36749456|NM_016441.3|CRIM1)可作为卵巢癌发生的诊断标志物。并且可将上述卵巢癌诊断生物标志物制备成卵巢癌诊断产品，产品选自制剂、芯片或试剂盒。产品中包括特异性识别环状RNA CRIM的引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

作为优选实施例，上游引物序列如下(SEQ ID No.2)。

Circ-CRIM上游引物：AGTGCTGTGA CCTCTATGA。

下游引物序列如下(SEQ ID No.3)。

Circ-CRIM下游引物:CTGGCTTCTC TTCTTCAATTC。

实施例2 circ-CRIM1的水平直接影响卵巢癌肿瘤生长和转移。

1.稳定细胞株的构建。

过表达质粒(pHBLV-circ-CRIM1)和circ- CRIM1短发夹RNA（shRNA）质粒由上海汉恒生物公司进行构建，Lipofectamine 3000（Invitrogen，Carlsbad，USA）用于转染。所有试剂的剂量均基于制造商的说明。使用Circ- CRIM1质粒上调circ- CRIM1表达，并使用circ-CRIM1短发夹RNA（shRNA）质粒沉默OC细胞系中的circ- CRIM1。嘌呤霉素（2μg / ml）用于选择稳定的克隆细胞系。circ- CRIM1和circ- CRIM1 shRNA的序列显示在序列图中。待细胞铺板率达到90％时进行传代，同时在培养基中添加5μg/mL嘌呤霉素以筛选被稳定转染的细胞，筛选时应保持细胞的密度不超过50％。至少筛选2周。

shRNA可使用以下序列。

sh-circ- CRIM1_001。

Top strand GATCCGTGCCAACAAGATGAGAACTGGACTTCAAGAGAGTCCAGTTCTCATCTTGTTGGCATTTTTTC。

Bottom strand AATTGAAAAAATGCCAACAAGATGAGAACTGGACTCTCTTGAAGTCCAGTTCTCATCT(SEQ ID No.4)。

sh-circ- CRIM1_002。

Top strand GATCCGACTTTGCCAACAAGATGAGAACTGTTCAAGAGACAGTTCTCATCTTGTTGGCAAAGTTTTTTTC。

Bottom strand AATTGAAAAAAACTTTGCCAACAAGATGAGAACTGTCTCTTGAACAGTTCTCATCTTGTTGGCAAAGTCG (SEQ ID No.5)。

2.实验方法。

运用构建的稳定细胞株(对照载体过表达的稳定株细胞以及circ-CRIM1过表达的卵巢癌稳定株)进行裸鼠皮下荷瘤实验（购置4周龄雌性裸鼠，将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化液消化，计数，调整密度至合适浓度，在无血清培养液中混匀，分别接种至裸鼠皮下。裸鼠皮下成瘤后每隔3d用游标卡尺测1次移植瘤长径(a)和短径(b)，并计算肿瘤体积(V)=ab²/2，绘制肿瘤生长曲线。裸鼠实验遵循动物保护和动物福利规定，并经实验动物伦理委员会批准）。

在过表达circ-CRIM1人卵巢癌细胞系CAOV3和使用circ-CRIM1短发夹RNA（shRNA）质粒沉默卵巢癌细胞系OVCAR3中进行细胞增殖（细胞重新悬浮并以每孔3000个接种在96孔板中。在细胞接种后0小时、24小时、48小时和72小时，分别用5毫克/毫升的 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐溶液（中国，北京，Solarbio）加入每个孔中，然后在5%二氧化碳中孵育2小时。然后，从每个孔中取出培养基并用150 μL二甲亚砜代替。振荡15秒后，使用微型平板分光光度计（BioTek Instruments，Winooski，VT，USA）测量490 nm处的吸光度，计算生长率并用于反映细胞活力）、迁移（细胞重新悬浮并接种在六孔板中。当细胞生长达到80%时，用200 μL移液管尖端垂直刮擦每个孔。然后用PBS（磷酸盐缓冲盐水）冲洗掉多余的悬浮细胞。然后向每个孔中加入2 mL培养基，细胞在5%二氧化碳中孵育。然后在刮擦细胞后的0小时、24小时、48小时用光学显微镜拍照，并使用Image J 软件（NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, USA）进行测量。伤口愈合率的计算公式如下：（原伤口面积-不同时间的伤口面积)/原伤口面积× 100%）、侵袭（通过分析细胞入侵基质胶的数量检测细胞入侵能力。基质凝胶化成液体后，以1∶15的比例溶解在无血清培养基中。将制备的基质凝胶均匀地分散在Transwell上室中，然后在培养箱中凝固4小时。计数重新悬浮的细胞，每个上室中包含200微升无血清培养基和50，000个悬浮细胞，并将600微升10%血清浓度的细胞培养基作为引诱剂加入下室。孵育48小时后取出24孔板。用PBS清洗3次后，用4%多聚甲醛室温下固定侵入下室的细胞30分钟。然后用PBS洗涤三次，然后用结晶紫染色15分钟。最后，使用奥林巴斯荧光显微镜(日本，东京)计数细胞，并评估细胞入侵）、凋亡(消化细胞后计数，取适量细胞，加入Annexin-V /PI染液（美国，Becton,Dickinson and Company）各2.5微升及1Xbuffer 50ul，室温下避光孵育20min，加入1Xbuffer 200ul，应用流式细胞仪检测细胞凋亡比例。

3.实验结果。

小鼠处死后皮下瘤实验的大体照片如图3a所示，肿瘤取出后的照片如图3b所示，图3a中上侧小鼠肿瘤为circ-CRIM1稳定株形成的肿瘤，下侧小鼠肿瘤为pHBLV稳定株形成的肿瘤，结果显示circ-CRIM1稳定升高后卵巢癌细胞在体内形成的肿瘤体积显著大于对照组（pHBLV）细胞；稳定过表达circ-CRIM1的卵巢癌细胞裸鼠皮下瘤模型的肿瘤体积测量图如图3c所示，图中Vector表示对照载体过表达的稳定株细胞，circ-CRIM1表示目的环状RNA过表达的卵巢癌稳定株，结果表明circ-CRIM1过表达后，卵巢癌细胞体内生长速度显著升高。

在人卵巢癌细胞系CAOV3中过表达circ-CRIM1与对照组细胞相比，促进了细胞增殖；并且在OC细胞系OVCAR3中沉默circ-CRIM1，细胞增殖减慢，如图4所示。

在人卵巢癌细胞系CAOV3中过表达circ-CRIM1与对照组细胞相比，促进了细胞迁移；并且在OC细胞系OVCAR3中沉默circ-CRIM1，细胞迁移能力减弱，如图5所示。

在过表达circ-CRIM1的OC细胞系CAOV3中与对照组细胞相比，增加了细胞侵袭能力；并且在沉默circ-CRIM1的OC细胞系OVCAR3中，细胞侵袭能力减弱，如图6所示。

在过表达circ-CRIM1的OC细胞系CAOV3中与对照组细胞相比，减少了细胞凋亡；并且在沉默circ-CRIM1的OC细胞系OVCAR3中，细胞凋亡显著增加，如图7所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>广州医科大学附属第三医院(广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院)

<120>circ-CRIM1作为卵巢癌诊断标志物及其应用

<160>5

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211>538

<212>DNA

<213>(人工序列)

<400> 1

ATGAGAACTGGACTGATGACCAACTGCTTGGTTTTAAACCATGCAATGAA 50

AACCTTATTGCTGGCTGCAATATAATCAATGGGAAATGTGAATGTAACAC 100

CATTCGAACCTGCAGCAATCCCTTTGAGTTTCCAAGTCAGGATATGTGCC 150

TTTCAGCTTTAAAGAGAATTGAAGAAGAGAAGCCAGATTGCTCCAAGGCC 200

CGCTGTGAAGTCCAGTTCTCTCCACGTTGTCCTGAAGATTCTGTTCTGAT 250

CGAGGGTTATGCTCCTCCTGGGGAGTGCTGTCCCTTACCCAGCCGCTGCG 300

TGTGCAACCCCGCAGGCTGTCTGCGCAAAGTCTGCCAGCCGGGAAACCTG 350

AACATACTAGTGTCAAAAGCCTCAGGGAAGCCGGGAGAGTGCTGTGACCT 400

CTATGAGTGCAAACCAGTTTTCGGCGTGGACTGCAGGACTGTGGAATGCC 450

CTCCTGTTCAGCAGACCGCGTGTCCCCCGGACAGCTATGAAACTCAAGTC 500

AGACTAACTGCAGATGGTTGCTGTACTTTGCCAACAAG 538

<210> 2

<211>19

<212>DNA

<213>(人工序列)

<400> 2

AGTGCTGTGA CCTCTATGA 19

<210> 3

<211>21

<212>DNA

<213>(人工序列)

<400> 3

CTGGCTTCTC TTCTTCAATTC 21

<210> 4

<211>68

<212>DNA

<213>(人工序列)

<400> 4

Top strand

GATCCGTGCCAACAAGATGAGAACTGGACTTCAAGAGAGTCCAGTTCTCATCTTGTTGGCATTTTTTC 68

Bottom strand

AATTGAAAAAATGCCAACAAGATGAGAACTGGACTCTCTTGAAGTCCAGT

TCTCATCTTGTTGGCACG 68

<210> 5

<211>70

<212>DNA

<213>(人工序列)

<400> 5

Top strand

GATCCGACTTTGCCAACAAGATGAGAACTGTTCAAGAGACAGTTCTCATC 50

TTGTTGGCAAAGTTTTTTTC 70

Bottom strand

AATTGAAAAAAACTTTGCCAACAAGATGAGAACTGTCTCTTGAACAGTTC 50

TCATCTTGTTGGCAAAGTCG 70

Claims (9)

1.一种用于卵巢癌诊断的生物标志物，其特征在于，所述标志物为环状RNA CRIM(circ-CRIM1)，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的一种用于卵巢癌诊断的生物标志物，其特征在于，circ-CRIM1为线性CRIM1第2-4号外显子剪切后所形成的环状RNA，CRIM1 mRNA的定位为：chr2:36668400-36749456，相应的线性基因为CRIM1，环化序列有538个碱基，包含3个外显子。

3.卵巢癌诊断生物标志物环状circ-CRIM1在制备卵巢癌诊断产品中的应用。

4.如权利3所述的卵巢癌诊断生物标志物环状circ-CRIM1在制备卵巢癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述的卵巢癌诊断产品选自制剂、芯片或试剂盒，通过测定样本中circ-CRIM1的表达水平及变化进行诊断。

5.如权利3所述的卵巢癌诊断生物标志物环状circ-CRIM1在制备卵巢癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述的卵巢癌诊断产品包括来扩增特异性识别环状RNA CRIM的核酸序列的引物对。

6.如权利3所述的卵巢癌诊断生物标志物环状circ-CRIM1在制备卵巢癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述的引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

7.卵巢癌诊断生物标志物环状circ-CRIM1在制备治疗卵巢癌的制剂中的应用。

8.如权利要求7卵巢癌诊断生物标志物环状circ-CRIM1在制备治疗卵巢癌的制剂中的应用，其特征在于，所述的治疗卵巢癌的制剂包括特异性干扰环状RNA CRIM1的序列，该序列用于抑制环状RNA CRIM1的水平。

9.如权利要求7所述的卵巢癌诊断生物标志物环状circ-CRIM1在制备治疗卵巢癌的制剂中的应用，其特征在于，所述的特异性干扰环状RNA CRIM1的序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.4-5中的任一种或几种所示。

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