CN109097477A - 一种用于乳腺癌诊断的circRNA标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种用于乳腺癌诊断的circRNA标志物及其circRNA应用，与健康对照组相比，发现3种circRNA(hsa_circ_0000745、hsa_circ_0001531、hsa_circ_0001640)在乳腺癌全血中表达上调。ROC曲线分析显示其可以较好地区分乳腺癌患者与健康者，三者的曲线下面积分别为0.7998、0.8258、0.7161，敏感性分别为48.53％、92.65％、73.53％，特异性分别为100％、69.23％、69.23％。

Description

一种用于乳腺癌诊断的circRNA标志物及其应用

技术领域

本公开属于生物医学领域，具体涉及一种用于乳腺癌诊断的circRNA标志物及其应用。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，严重威胁女性健康。乳腺癌的发生、发展与许多肿瘤标志物的异常表达有关，目前研究较多的乳腺癌肿瘤标志物有：孕激素受体(PR)、血管内皮生长因子(VEGF)、雌激素受体(ER)、CD44、p53等。但其真正的临床应用都很有限。因此，进一步开发较高灵敏度和特异性的检测乳腺癌的新型非侵入性生物标志物非常重要和紧迫。

环状RNA(circRNA)是一类新的非编码RNA，是RNA领域的研究热点。circRNA分子富含microRNA互补结合位点，称为竞争性内源RNA(ceRNA)，在细胞中起到microRNA分子海绵的作用，竞争性结合并封闭microRNA与靶基因的互补结合位点，进而解除microRNA对其靶基因的抑制，上调靶基因表达与功能，这是circRNA最常见的作用机制。与线性RNA不同，circRNA形成共价闭合的连续环，它们在体液(如血液和唾液等)中被检测到，可抵抗RNA酶的降解，具有稳定性，并且有组织/发育阶段特异性表达，使其可能成为潜在的肿瘤生物标志物。目前为止，发明人尚未见乳腺癌全血中circRNA作为标记物的报道。

发明内容

针对以上背景技术，发明人经过研究得到一种用于乳腺癌诊断的全血中的circRNA标志物及其用于诊断乳腺癌的相关产品。

本公开具体采用如下技术方案：

在本公开的第一个方面，提供一种血液中用于诊断乳腺癌的标志物，所述标志物为circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合。

在本公开的第二个方面，提供所述血液中的circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合作为乳腺癌诊断标志物在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。

在本公开的第三个方面，提供检测血液中的circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。

在本公开的第四个方面，提供一种用于诊断乳腺癌的产品，该产品能够通过检测血液中的circ_0000745、circ_0001531或circ_0001640表达水平来诊断乳腺癌，高通量检测结果显示circ_0000745、circ_0001531或circ_0001640在乳腺癌组表达较正常人显著上调。

在本公开的第五个方面，提供circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

在本公开的第六个方面，提供一种用于鉴定乳腺癌抑制剂的方法，所述方法包括鉴定血液中circ_0000745、circ_0001531或circ_0001640的表达水平的物质。

与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：

目前为止，尚未见乳腺癌全血中circRNA作为标记物的报道。本公开的主要创新点：(1)样本为全血，而非血清、血浆或组织细胞；(2)前人有探索其它circRNA在乳腺癌中异常表达情况的研究，而本文涉及的3个(hsa_circ_0000745、hsa_circ_0001531、hsa_circ_0001640)未见其在乳腺癌中的报道。

与健康对照组相比，发现3种circRNA(hsa_circ_0000745、hsa_circ_0001531、hsa_circ_0001640)在乳腺癌全血中上调。ROC曲线分析显示其可以较好地区分乳腺癌患者与健康者，三者的曲线下面积分别为0.7998、0.8258、0.7161，敏感性分别为48.53％、92.65％、73.53％，特异性分别为100％、69.23％、69.23％。

附图说明

构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1：3种circRNA在乳腺癌患者及健康对照全血中进行实时定量PCR检测。

图2：3种circRNA的ROC曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，进一步开发较高灵敏度和特异性的检测乳腺癌的新型非侵入性生物标志物非常重要和紧迫。

有鉴于此，在本公开一个或一些典型的实施方式中，提供一种血液中用于诊断乳腺癌的标志物，所述标志物为circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合。

与健康对照组相比，发现3种circRNA(circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640)在乳腺癌全血中上调。

circ_0000745、circ_0001531和circ_0001640的序列信息分别如SEQ ID NO.1～3所示。

具体的，circ_0000745序列如下所示：GGGCCTTTACAACAACTAAACGGACAGGCATTCCAGCCCCACGGGAATTTTCAGTAACTGTCTCAAGAGAGAGGTCTGTGCCACGTGGTCCCTCCAACCCCAGGAAATCAGTGTCCAGTCCAACTTCTTCCAACACTCCCACTCCTACGAAACACCTGAGGACCCCTTCCACAAAGCCCAAGCAAGAGAATGAAGGTGGAGAAAAGGCTGCGCTTGAGTCCCAAGTTCGGGAACTTTTGGCAGAAGCCAAAGCAAAAGATAGTGAAATTAACAGGCTTCGAAGTGAACTAAAGAAATACAAAGAGAAAAGGACTCTGAACGCTGAGGGGACTGATGCTTTGGGCCCAAATGTCGATGGAACATCAGTCTCCCCAGGTGACACGGAACCTATGATAAGAGCTCTTGAGGAGAAGAACAAGAACTTTCAGAAAGAGCTTTCCGATCTAGAGGAAGAAAACCGGGTCCTGAAGGAGAAACTGATCTATCTTGAGCACTCCCCAAATTCAGAAGGGGCAGCAAGTCACACTGGCGACAGCAGCTGCCCAACATCCATAACTCAAGAGTCAAGCTTCGGAAGCCCAACTGGAAATCAGATGTCCAGTGACATTGATGAGTATAAAAAAAACATACATGGAAATGCATTACGGACATCAGGCTCCTCAAGTAGCGATGTTACCAAAGCTTCTTTGTCGCCAGATGCTTCCGACTTTGAGCACATTACAGCAGAGACACCCTCAAGGCCCCTGTCCTCCACCAGTAACCCCTTTAAGAGTTCAAAGTGTTCTACTGCTGGGAGTTCCCCAAACAGCGTAAGTGAATTGTCCCTGGCTTCCCTCACAGAGAAGATACAAAAGATGGAAGAAAACCACCATAGCACTGCAGAAGAACTACAGGCTACTCTACAAGAATTATCAGACCAGCAACAAATGGTACAGGAATTGACAGCTGAAAATGAGAAGCTGGTGGATGAAAAGACGATTTTAGAGACATCCTTTCATCAGCATCGAGAGAGGGCAGAGCAGCTAAGTCAAGAAAATGAGAAGCTGATGAATCTTTTACAAGAGCGAGTAAAGAATGAAGAGCCCACCACTCAGGAAGGAAAAATTATTGAACTGGAGCAGAAGTGCACAGGTATTCTTGAACAGGGCCGCTTTGAAAGAGAGAAGCTACTCAACATTCAGCAGCAGTTGACCTGTAGCTTGCGGAAGGTTGAGGAAGAAAACCAAGGAGCTTTAGAAATGATTAAACGTCTGAAGGAAGAAAATGAAAAACTGAATGAGTTTCTAGAACTGGAACGGCATAATAATAACATGATGGCCAAAACTTTGGAAGAGTGTAGAGTTACCTTGGAAGGGCTAAAAATGGAGAATGGATCTTTGAAGTCTCATTTGCAGGGTGAGAAGCAGAAAGCCACAGAGGCCAGTGCTGTGGAGCAGACGGCAGAGAGCTGCGAAGTTCAAGAAATGTTGAAAGTAGCCCGAGCAGAGAAAGATCTACTGGAACTGTCTTGCAATGAGCTCAGACAAGAATTACTAAAGGCAAACGGTGAAATTAAACATGTTTCCAGTCTGCTGGCCAAG

circ_0001531的序列如下所示：

CTCAGTTTTCAGTTCAGAAAGTCACTCCTCAGTCTGATGGCTCCAGTTCAAAAGTGAAAGTCAAAGTTCGAGTAAATGTCCATGGCATTTTCAGTGTGTCCAGTGCATCTTTAGTGGAGGTTCACAAGTCTGAGGAAAATGAGGAGCCAATGGAAACAGATCAGAATGCAAAGGAGGAAGAGAAGATGCAAGTGGACCAGGAGGAACCACATGTTGAAGAGCAACAGCAGCAGACACCAGCAGAAAATAAGGCAGAGTCTGAAGAAATGGAG

circ_0001640的序列如下所示：

CATAAGCTGTGGCCATGACTACTGAAGTAGGCTCTGTGTCTGAAGTGAAGAAGGACTCTAGCCAGTTAGGAACAGATGCAACCAAGGAAAAACCTAAAGAAGTAGCAGAAAATCAGCAGAATCAGTCTTCCGATCCAGAGGAGGAAAAAGGTTCCCAGCCACCTCCTGCAGCTGAAAGCCAAAGTAGTCTACGCCGCCAGAAGAGAGAGAAGGAAACATCGGAGAGCAGGGGTATTTCTCGGTTCATACCGCCATGGCTTAAGAAGCAAAAGTCATATACCTTAGTAGTGGCCAAAGATGGAGGAGATAAAAAAGAGCCTACCCAAGCTGTTGTTGAAGAACAGGTCTTAGATAAAGAGGAACCCCTTCCAGAAGAACAGAGACAGGCTAAGGGTGATGCTGAAGAAATGGCTCAGAAGAAACAAGAGATTAAAGTTGAAGTCAAGGAAGAAAAACCCTCAGTGAGCAAGGAAGAAAAACCCTCAGTGAGCAAAGTGGAGATGCAGCCTACTGAATTAGTAAGTAAGGAGAGAGAAGAGAAGGTAAAAGAAACACAGGAAGACAAATTAGAAGGAGGAGCAGCAAAAAGGGAGACCAAGGAAGTGCAGACCAATGAGCTGAAAGCAGAGAAGGCATCTCAAAAAGTCACCAAGAAGACCAAAACTGTCCAGTGTAAAGTGACCCTCTTAGATGGCACCGAATACAGCTGTGACCTGGAG

在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供血液中的circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合作为乳腺癌诊断标志物在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。

在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供检测circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述试剂盒至少包括：针对circ_0000745的正向引物5'-GTTGAAAGTAGCCCGAGCAG-3'和反向引物5'-ACGTGGCACAGACCTCTCTC-3'、针对circ_0001531的正向引物5'-AGATGCAAGTGGACCAGGAG-3'和反向引物5'-GATGCACTGGACACACTGAAA-3'、针对circ_0001640的正向引物5'-TGCAGACCAATGAGCTGAAA-3'和反向引物5'-CCTTGGTTGCATCTGTTCCT-3'其中的一种。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述基因芯片至少包括与circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或多种的核酸序列杂交的探针。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述产品能够通过检测血液中circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640至少一种的表达水平来诊断患者是否患有乳腺癌，circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640高表达与乳腺癌的发生发展相关。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述检测血液中circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640至少一种的表达水平的产品包括：

通过实时定量PCR、RT-PCR、原位杂交、基因芯片或基因测序检测的circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640至少一种表达水平以诊断乳腺癌的产品。

在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供一种用于诊断乳腺癌的产品，该产品能够通过检测血液中的circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640表达水平来诊断乳腺癌，高通量检测结果显示circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640在乳腺癌组表达较正常人显著上调。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述产品为芯片或检测试剂盒。

进一步的，所述检测试剂盒，检测体系包括反转录反应体系和qPCR反应体系，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制qPCR反应体系的试剂。

更进一步的，用于配制反转录反应体系的试剂至少包括反转录缓冲液、dNTP混合液、RNA酶蛋白质抑制剂和反转录酶液等。

更进一步的，用于配制qPCR反应体系的试剂至少包括针对circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或多种组合的正向引物液和反向引物液，还包括针对内参基因的正向引物和反向引物，SYBR Green混合液、无核酸酶纯水等。

进一步的，所述芯片至少包括一种与circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640的核酸序列杂交的探针。

在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述药物为circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合的抑制剂，所述circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合的抑制剂是指能够降低circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合表达水平的产品，该产品包括：通过siRNA以及CRISPR介导的基因敲低策略获得的抑制circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合表达水平的siRNA表达载体和Cas9-sgRNA共表达载体，以及降低circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合表达水平的化合物、组合物或试剂等。其中，通过敲低方法抑制环状RNA表达水平的siRNA表达载体和Cas9-sgRNA共表达载体已经商业化，也可通过常规的技术手段制备得到。

在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供一种用于鉴定乳腺癌抑制剂的方法，所述方法包括鉴定血液中circ_0000745、circ_0001531或circ_0001640的表达水平的物质。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

一种用于诊断乳腺癌的检测试剂盒，所述检测试剂盒，检测体系包括反转录反应体系和qPCR反应体系，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制qPCR反应体系的试剂。

用于配制反转录反应体系的试剂至少包括反转录缓冲液、dNTP混合液、RNA酶蛋白质抑制剂和反转录酶液等。

用于配制qPCR反应体系的试剂至少包括针对circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或多种组合的正向引物液和反向引物液，还包括针对内参基因的正向引物和反向引物，SYBR Green混合液、无核酸酶纯水等，相关引物序列见表1。

实施例2

(1)临床样本

2016年6月27日至2017年8月30日，于山东大学齐鲁医院招募了68名乳腺癌患者和13名健康对照者的外周血。所有患者和对照组均为汉族女性。

收集空腹静脉全血(2ml)，并将未处理的全血样品立即储存在液氮中直至进一步分析。所有乳腺癌血样均在手术或任何治疗之前收集。对照组样品收集于过去或现在均无恶性病史或炎症的健康女性。所有参与者均获得书面知情同意书。本研究经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准。

(2)RNA抽提

取250ul全血液体，转至1.5ml的离心管中，750μl的TRIzol LS Reagent试剂和20μl冰醋酸，手动剧烈振荡管体至混匀。匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每750μl的TRIzol LS Reagent试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIzol LS Reagent的60％。将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1mlTRIZOL试剂的此时加0.5ml的异丙醇。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃ 12,000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。移去上清液，每1ml TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7,500×g离心5分钟。去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。

(3)cDNA合成

a、配制退火混合物

混合液在65℃水浴5分钟,冰上放置2分钟。

b、短暂离心后，在离心管中依次加入RT反应液

混合后37℃恒温1分钟。

c、移液枪轻轻吸打几次混合均匀。

d、50℃温育60分钟。

e、70℃温育15分钟使酶失活。

f、cDNA置冰浴待用或-20℃保存。

(4)实时定量PCR

a.将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：

轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。

b.加样：将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中。再加入对应的2μl cDNA。小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。

c.将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)。

d.GAPDH做为内参将circRNA表达进行标准化，并使用2^-△△Ct法计算。

表1引物序列

(5)统计分析

使用GraphPad Prism 5(San Diego，CA)进行统计学分析。Student t检验用于分析两组之间的差异。接受者操作特征曲线(ROC)分析用于确定circ RNA的诊断价值。双尾P<0.05被认为具有统计学意义。

(6)结果

乳腺癌与健康对照相比，全血中3种circRNA表达上调：

实时定量PCR数据显示，与健康对照相比，3种circRNA(hsa_circ_0000745、hsa_circ_0001531、hsa_circ_0001640)在乳腺癌患者血中显著高表达(图1，P<0.05)。

差异表达的circRNA的诊断价值：

使用ROC曲线分析并计算受试者工作特征曲线下面积(AUC)来检测差异表达的circRNA的诊断性能。结果显示，3种circRNA可鉴别乳腺癌和健康对照，hsa_circ_0000745、hsa_circ_0001531、hsa_circ_0001640的AUC分别为0.7998、0.8258、0.7161(图2)。hsa_circ_0000745的敏感性和特异性分别为48.53％和100％，hsa_circ_0001531为92.65％和69.23％，hsa_circ_0001640为73.53％和69.23％。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学齐鲁医院

<120> 一种用于乳腺癌诊断的circRNA标志物及其应用

<130> 2018

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1580

<212> DNA

<213> circ_0000745

<400> 1

gggcctttac aacaactaaa cggacaggca ttccagcccc acgggaattt tcagtaactg 60

tctcaagaga gaggtctgtg ccacgtggtc cctccaaccc caggaaatca gtgtccagtc 120

caacttcttc caacactccc actcctacga aacacctgag gaccccttcc acaaagccca 180

agcaagagaa tgaaggtgga gaaaaggctg cgcttgagtc ccaagttcgg gaacttttgg 240

cagaagccaa agcaaaagat agtgaaatta acaggcttcg aagtgaacta aagaaataca 300

aagagaaaag gactctgaac gctgagggga ctgatgcttt gggcccaaat gtcgatggaa 360

catcagtctc cccaggtgac acggaaccta tgataagagc tcttgaggag aagaacaaga 420

actttcagaa agagctttcc gatctagagg aagaaaaccg ggtcctgaag gagaaactga 480

tctatcttga gcactcccca aattcagaag gggcagcaag tcacactggc gacagcagct 540

gcccaacatc cataactcaa gagtcaagct tcggaagccc aactggaaat cagatgtcca 600

gtgacattga tgagtataaa aaaaacatac atggaaatgc attacggaca tcaggctcct 660

caagtagcga tgttaccaaa gcttctttgt cgccagatgc ttccgacttt gagcacatta 720

cagcagagac accctcaagg cccctgtcct ccaccagtaa cccctttaag agttcaaagt 780

gttctactgc tgggagttcc ccaaacagcg taagtgaatt gtccctggct tccctcacag 840

agaagataca aaagatggaa gaaaaccacc atagcactgc agaagaacta caggctactc 900

tacaagaatt atcagaccag caacaaatgg tacaggaatt gacagctgaa aatgagaagc 960

tggtggatga aaagacgatt ttagagacat cctttcatca gcatcgagag agggcagagc 1020

agctaagtca agaaaatgag aagctgatga atcttttaca agagcgagta aagaatgaag 1080

agcccaccac tcaggaagga aaaattattg aactggagca gaagtgcaca ggtattcttg 1140

aacagggccg ctttgaaaga gagaagctac tcaacattca gcagcagttg acctgtagct 1200

tgcggaaggt tgaggaagaa aaccaaggag ctttagaaat gattaaacgt ctgaaggaag 1260

aaaatgaaaa actgaatgag tttctagaac tggaacggca taataataac atgatggcca 1320

aaactttgga agagtgtaga gttaccttgg aagggctaaa aatggagaat ggatctttga 1380

agtctcattt gcagggtgag aagcagaaag ccacagaggc cagtgctgtg gagcagacgg 1440

cagagagctg cgaagttcaa gaaatgttga aagtagcccg agcagagaaa gatctactgg 1500

aactgtcttg caatgagctc agacaagaat tactaaaggc aaacggtgaa attaaacatg 1560

tttccagtct gctggccaag 1580

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<211> 272

<212> DNA

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tcaaagttcg agtaaatgtc catggcattt tcagtgtgtc cagtgcatct ttagtggagg 120

ttcacaagtc tgaggaaaat gaggagccaa tggaaacaga tcagaatgca aaggaggaag 180

agaagatgca agtggaccag gaggaaccac atgttgaaga gcaacagcag cagacaccag 240

cagaaaataa ggcagagtct gaagaaatgg ag 272

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<212> DNA

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gccagttagg aacagatgca accaaggaaa aacctaaaga agtagcagaa aatcagcaga 120

atcagtcttc cgatccagag gaggaaaaag gttcccagcc acctcctgca gctgaaagcc 180

aaagtagtct acgccgccag aagagagaga aggaaacatc ggagagcagg ggtatttctc 240

ggttcatacc gccatggctt aagaagcaaa agtcatatac cttagtagtg gccaaagatg 300

gaggagataa aaaagagcct acccaagctg ttgttgaaga acaggtctta gataaagagg 360

aaccccttcc agaagaacag agacaggcta agggtgatgc tgaagaaatg gctcagaaga 420

aacaagagat taaagttgaa gtcaaggaag aaaaaccctc agtgagcaag gaagaaaaac 480

cctcagtgag caaagtggag atgcagccta ctgaattagt aagtaaggag agagaagaga 540

aggtaaaaga aacacaggaa gacaaattag aaggaggagc agcaaaaagg gagaccaagg 600

aagtgcagac caatgagctg aaagcagaga aggcatctca aaaagtcacc aagaagacca 660

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggcctccaag gagtaagacc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aggggagatt cagtgtggtg 20

Claims (10)

1.血液中的circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合作为乳腺癌诊断标志物在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。

2.检测circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征是，所述试剂盒至少包括：针对circ_0000745的正向引物5'-GTTGAAAGTAGCCCGAGCAG-3'和反向引物5'-ACGTGGCACAGACCTCTCTC-3'、针对circ_0001531的正向引物5'-AGATGCAAGTGGACCAGGAG-3'和反向引物5'-GATGCACTGGACACACTGAAA-3'、针对circ_0001640的正向引物5'-TGCAGACCAATGAGCTGAAA-3'和反向引物5'-CCTTGGTTGCATCTGTTCCT-3'其中的一种；所述基因芯片至少包括与circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或多种的核酸序列杂交的探针。

4.如权利要求2所述的应用，其特征是：所述产品能够通过检测血液中circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640至少一种的表达水平来诊断患者是否患有乳腺癌。

5.如权利要求2所述的应用，其特征是：检测血液中circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640至少一种的表达水平的产品包括：

通过实时定量PCR、RT-PCR、原位杂交、基因芯片或基因测序检测的circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640至少一种表达水平以诊断乳腺癌的产品。

6.一种用于诊断乳腺癌的产品，该产品能够通过检测血液中的circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640表达水平来诊断乳腺癌。

7.如权利要求6所述的产品，其特征是：所述产品为芯片或检测试剂盒。

8.如权利要求7所述的产品，其特征是：所述检测试剂盒，检测体系包括反转录反应体系和qPCR反应体系，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制qPCR反应体系的试剂。

9.circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合在制备治疗乳腺癌药物中的应用，其特征是：所述药物为circ_0000745、circ_0001531、circ_0001640中的一种或几种组合的抑制剂。

10.一种用于鉴定乳腺癌抑制剂的方法，其特征是：所述方法包括鉴定血液中circ_0000745、circ_0001531或circ_0001640的表达水平的物质。