CN107012207B - Lrp5作为临床诊断和抑制消化系统肿瘤的应用 - Google Patents

Lrp5作为临床诊断和抑制消化系统肿瘤的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及LRP5作为临床诊断和抑制消化系统肿瘤的应用。LRP5作为临床诊断消化系统肿瘤的应用，是通过荧光定量PCR检测LRP5在消化系统肿瘤中的表达情况，根据LRP5的表达情况，将LRP5作为消化系统肿瘤早期诊断的分子标志物。LRP5作为抑制消化系统肿瘤的应用，步骤为以LRP5为目标调控基因，构建干扰LRP5基因表达的载体；利用构建的载体，制备用于离体施用或体内施用的药物。本发明通过大量的实验数据证明，LRP5在消化系统肿瘤的发生和发展过程中起着重要的调控作用，干扰LRP5基因表达显著抑制消化系统肿瘤细胞的增殖和迁移，LRP5可望成为新的制备防治消化系统肿瘤的药物。

Description

LRP5作为临床诊断和抑制消化系统肿瘤的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及LRP5作为临床诊断和抑制消化系统肿瘤的应用。
背景技术
随着社会经济发展和饮食结构的改变，肿瘤的发病率明显上升。其中消化系统肿瘤有着较高的发病率和死亡率，严重威胁人类的生命健康。消化道肿瘤主要包括肝癌、胃癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌。消化系统作为人体的主要系统之一，其肿瘤的发生有着相似的生理基础，但其发病原因和确切的分子机制尚不完全明确，具体某一类型的肿瘤而言也并不相同，目前多认为是环境、遗传、免疫及内分泌等多重因素共同作用的结果。其中胃癌的发生与幽门螺杆菌感染密切相关，约65%的胃癌患者幽门螺杆菌检测呈阳性；食管癌的发生多与亚硝胺类物质、某些微量元素及维生素的缺乏相关；结直肠癌发生的主要原因是高脂肪饮食及纤维素摄入不足；胆结石等胆囊疾病的慢性刺激是胆囊癌发生的重要致病因素；乙肝病毒和丙肝病毒感染、酒精、肝硬化、亚硝胺类物质及黄曲霉素等与肝癌的发生相关；胰腺癌的致病因素尚不明确，但慢性胰腺炎及糖尿病患者的发病风险较高。
在消化系统肿瘤发生的早期阶段，通过外科手术并联合应用放、化疗技术能够有效治疗肿瘤。常规的胃镜、食管镜、肠镜检查，B超及CT检查也能有效的发现早期消化系统肿瘤，因此近几十年来消化系统肿瘤的发生率呈下降趋势。但消化系统肿瘤起病隐匿，早期症状多不明显，病人被确诊时多已进展至中晚期，治疗难度极大且生存率低。因此筛查有效的生物标志物或药物靶点对于消化系统肿瘤的早期诊断和治疗具有重要意义。
癌症的发生和转移与原癌基因的激活密切相关。大量研究表明，经典的Wnt/ β-catenin信号通路在癌症的发生和转移方面起着重要作用。Wnt蛋白家族成员通过与frizzled蛋白家族成员及LRP5或LRP6结合，增加胞内水平β-catenin蛋白的水平，后者进入核内与转录因子TCF/Lef家族成员结合，引起c-myc，Cyclin D1等原癌基因的转录激活，刺激细胞的增殖，引起癌症的发生。
LRP5与LRP6均能介导Wnt/β-catenin信号转导，但LRP5在癌症发生过程的作用更强。LRP5基因突变或表达水平的改变与老年痴呆症、动脉粥样硬化、退行性关节炎等疾病的发生密切相关。有研究表明乳腺癌和甲状旁腺癌组织中能检测到异常形式的LRP5蛋白；恶性骨肉瘤组织中的LRP5蛋白表达水平也明显升高，而LRP5基因突变能够抑制骨肉瘤Saos-2细胞中β-catenin蛋白入核的水平，并明显降低细胞的侵袭能力；敲除前列腺癌细胞中的LRP5基因能够抑制癌细胞的迁移及动物体内恶性肿瘤的体积，另外，在发生转移的胰腺癌细胞中也检测到LRP5水平的异常升高，提示LRP5可能起着致癌基因的作用，但LRP5与消化系统肿瘤发生的关系还未曾有报道。
因此本发明将检测LRP5基因在不同类型的消化系统肿瘤组织中的表达情况，旨在为消化系统肿瘤检测及风险提示提供新的诊断标志物，并在此基础上研究LRP5基因缺失及与消化系统肿瘤发生的关系，为消化系统肿瘤和其它肿瘤的治疗提供新的药物靶向，并对提升消化道系统肿瘤的早期发现率及改善消化系统肿瘤患者的生存状况起到新的推动作用。
发明内容
为提高消化道肿瘤的早期诊断率，有效抑制消化系统肿瘤的发生的技术难题，本发明公开了LRP5作为消化系统肿瘤早期诊断的分子标志物及其抑制消化系统肿瘤的应用。
为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：
LRP5作为临床诊断消化系统肿瘤的应用，步骤如下：通过荧光定量PCR检测LRP5在消化系统肿瘤中的表达情况，根据LRP5的表达情况，将LRP5作为消化系统肿瘤早期诊断的分子标志物。
所述荧光定量PCR中LRP5的正向引物如SEQ ID NO：1所示，LRP5反向引物如SEQ IDNO：2所示；所述荧光定量PCR的程序为：50 °C 20s；95 °C 10min；95 °C 1min；60 °C 1min，重复40个循环，测得LRP5扩增的CT值，并以内参基因β-actin的CT值进行标准化校正。
LRP5作为抑制消化系统肿瘤的应用，步骤如下：
a.以LRP5为目标调控基因，构建干扰LRP5基因表达的载体；
b.利用步骤a中的载体，制备用于离体施用或体内施用的药物。
所述步骤a中，干扰LRP5表达的基因包括敲除或沉默LRP5编码基因，抑制或降低LRP5的转录和翻译功能以及干扰LRP5蛋白功能发挥的一种或多种基因；所述载体为病毒载体或非病毒基因沉默载体。
所述病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体或疱疹病毒载体。
所述非病毒基因沉默载体为CRISPR/Cas9系统基因敲除载体、RNAi系统基因沉默载体或在此基础上改造的载体。
所述消化系统肿瘤是人类的消化系统肿瘤组织，具体而言包括肝癌、胃癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌。
本发明的有益效果在于：
第一：本发明通过可靠的荧光定量PCR方法，筛选发现LRP5 在多种类型的消化系统肿瘤组织中的表达均发生明显升高，该方法的灵敏度高，特异性强，可作为消化系统肿瘤临床早期诊断的标志物。
第二：本发明通过大量的实验数据证明，LRP5在消化系统肿瘤的发生和发展过程中起着重要的调控作用，干扰LRP5基因表达能够显著抑制消化系统肿瘤细胞的增殖和迁移，LRP5可望成为新的制备防治消化系统肿瘤的药物。
附图说明
图1为荧光定量PCR分析LRP5在不同类型消化系统肿瘤组织中的表达；（图A）其中胃癌组织来源于胃癌患者的癌组织（n=14），癌旁组织来源于胃癌患者的癌旁正常组织（n=14）；（图B）其中结直肠癌组织来源于结直肠癌患者的癌组织（n=14），癌旁组织来源于结直肠癌患者的癌旁正常组织（n=14）；β-actin作为LRP5的内参对照基因。
图2为荧光定量PCR分析，A：在胃癌MGC-803细胞内转染LRP5干扰质粒(LRP5-siRNA)后，细胞内LRP5基因mRNA水平的变化；B：在胃癌MGC-803细胞内转染LRP5干扰质粒(LRP5-siRNA)后，细胞内LRP5基因蛋白表达水平的变化。
图3为干扰LRP5基因对胃癌MGC-803细胞增殖的影响，胃癌MGC-803细胞转染LRP5-siRNA干扰质粒24，48，72小时后，癌细胞的增殖情况。
图4为划痕实验分析干扰LRP5基因对胃癌MGC-803细胞迁移的影响；A：胃癌MGC-803细胞转染LRP5-siRNA干扰质粒24、48小时后，癌细胞的迁移情况；B：胃癌MGC-803细胞转染LRP5-siRNA干扰质粒24，48小时后，癌细胞的迁移能力示意图。
具体实施方式
LRP5作为临床诊断消化系统肿瘤的应用，步骤如下：通过荧光定量PCR检测LRP5在消化系统肿瘤中的表达情况，根据LRP5的表达情况，将LRP5作为消化系统肿瘤早期诊断的分子标志物。
所述荧光定量PCR中LRP5的正向引物如SEQ ID NO：1所示，LRP5反向引物如SEQ IDNO：2所示；所述荧光定量PCR的程序为：50 °C 20s；95 °C 10min；95 °C 1min；60 °C 1min，重复40个循环，测得LRP5扩增的CT值，并以内参基因β-actin的CT值进行标准化校正。
LRP5作为抑制消化系统肿瘤的应用，步骤如下：
a.以LRP5为目标调控基因，构建干扰LRP5基因表达的载体；
b.利用步骤a中的载体，制备用于离体施用或体内施用的药物。
所述步骤a中，干扰LRP5表达的基因包括敲除或沉默LRP5编码基因，抑制或降低LRP5的转录和翻译功能以及干扰LRP5蛋白功能发挥的一种或多种基因；所述载体为病毒载体或非病毒基因沉默载体。
所述病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体或疱疹病毒载体。
所述非病毒基因沉默载体为CRISPR/Cas9系统基因敲除载体、RNAi系统基因沉默载体或在此基础上改造的载体。
所述消化系统肿瘤是人类的消化系统肿瘤组织，具体而言包括肝癌、胃癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌。
本发明所述的干扰LRP5基因表达包括敲除LRP5的编码基因，干扰LRP5基因的转录或翻译，以及干扰LRP5蛋白功能发挥的整个生物过程，虽然干扰的具体机制尚未完全清楚，但并不妨碍“干扰”的实现。
在一些具体的实施方式中，所述药物可以加入一种或多种药学上可接受的佐剂，包括但不限于颗粒剂、缓冲剂、表面活性剂等公知的药物佐剂。
在一些具体的实施方式中，所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型，这些剂型可以按照药学领域常规的方法制备。
以下通过实施例进一步描述本发明，其中包括使用材料及具体来源。但应当理解的是，这些只是示例性的，而非限制本发明。与如下组织、细胞、试剂、仪器的类型及型号、或性质或功能相似或相同的材料均可以用于本发明的实施。
下述示例中的方法如无特殊说明均为普通方法。
主要材料：
Figure 978176DEST_PATH_IMAGE002
注：除非另有所指，本发明中用到的试剂可以是任何合适的市售试剂；细胞系均可以通过市售获得。
一、 LRP5的组织表达分析检测
1. 癌症临床样品的采集
胃癌及癌旁正常组织，结直肠癌及癌旁正常组织由河南大学附属淮河医院普外科提供。整个采集及后续实验过程符合医学伦理道德要求并严格遵循病例资料的保密原则。组织样品经手术取出后，迅速切成小块于冻存管中置于液氮中保存备用。
2. RNA抽提
每100 mg组织加入1 mL Tri reagent，置于冰上充分匀浆破碎组织块，室温下静置5分钟后，加入1/10倍Tri reagen体积的的BCP溶液，涡旋混匀15秒后室温静置10分钟。4°C，13,400g室温离心15分钟；将上清液转移至新的1.5 mL离心管，加入等倍上清体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀数次后，室温静置10分钟，4 °C，13400g离心10分钟后，吸除上清，加入500 μl的75%乙醇水溶液，轻吹悬浮清洗RNA，4 °C，13400g离心5分钟沉淀RNA。吸除上清后，置于室温通风处晾干，干燥5分钟左右。加入适量无RNA酶水并置于55 °C水浴10分钟，待充分溶解后测定OD260和OD280吸收值。一般认为A260/A280在1.8-2.1之间可以初步判定总RNA质量较好。
3. 荧光定量PCR检测LRP5水平
取2 μg RNA将其反转录成cDNA。以cDNA为模板，使用针对LRP5的引物及PCR 2×SYBR Green qPCR Mixture，在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行扩增。PCR条件为：50 °C 20秒；95 °C 10分钟；95 °C 10秒；60 °C 1分钟，重复40个循环；测得样本LRP5扩增的CT值，以内参基因β-actin的CT值进行标准化校正。所得CT值使用2-Δ∆CT法进行计算，比较不同样本间LRP5含量的差异。所用LRP5正向引物如SEQ ID NO：1所述；LRP5反向引物如SEQ ID NO：2所述。内参对照β-actin正向引物如SEQ ID NO：3所述；内参对照β-actin反向引物如SEQ IDNO：4所述。
结果：如图1所示，与癌旁正常组织相比，LRP5在胃癌组织（P=0.002）及结直肠癌组织（P=0.003）中的表达水平均明显上升。表明LRP5的异常升高与消化系统肿瘤的发生密切相关。
二、干扰LRP5基因表达可以明显抑制胃癌细胞的增殖和迁移
1. 细胞培养
人胃癌细胞系MGC-803细胞在DMEM培养基（Thermo, USA）中进行培养。培养基中含有10%胎牛血清（Gibco, USA）、青霉素（100 U/mL）和链霉素。所有细胞置于37 °C培养箱、5%CO2条件下培养。
2. 细胞转染
MGC-803细胞铺板约20小时后至60%左右密度后开始转染，转染设置LRP5-siRNA干扰组、NC-siRNA通用阴性对照组。所用转染试剂为脂质体2000（Invitrogen），转染方法参照说明书进行。
3. 细胞内LRP5基因转录水平的检测
转染后继续培养24 小时，收集细胞。按照实施例1中的方法，抽取细胞的总RNA，反转录后利用荧光定量PCR的方法，检测转染后MGC-803细胞内LRP5基因转录水平的变化。
4. 细胞内LRP5基因表达水平的检测
转染后继续培养48小时，消化后离心收集细胞。加100μL细胞裂解液裂解细胞，13,400g，4 °C离心15分钟，提取细胞总蛋白；检测蛋白浓度后，每组样本取20μg样本与4×SDS-PAGE loading buffer混合，95°C加热处理5min。用10%的SDS-PAGE胶分离蛋白；电泳结束后，在Transfer Buffer中转膜60分钟；使用5%脱脂牛奶封闭印迹膜1小时，TBST洗涤3次后加稀释的一抗，4°C温育过夜；TBST洗涤3次后，加入适当的二抗稀释液，室温孵育1小时。TBST再次洗涤3次；经显影定影处理后，凝胶成像系统拍照，使用Image J软件对条带进行灰度分析处理。
结果：如图2所示，荧光定量PCR分析显示（A），转染LRP5-siRNA可显著抑制MGC-803细胞内LRP5的转录水平（P＜0.05），并可抑制其蛋白表达水平（P＜0.01）（B）。该结果表明通过外源性方法干扰胃癌细胞内异常升高的LRP5的水平是切实可行的。
三、干扰LRP5基因可以抑制胃癌细胞的增殖
采用直接计数法检测细胞的增殖情况。将4 × 104 个MGC-803细胞铺于6孔培养皿中，按照实施例2中的方法，转染LRP5-siRNA及NC-siRNA通用阴性对照。 于转染后第二天消化细胞，使用0.05%的台盼蓝溶液染色对每孔活细胞进行计数，连续计数5天。每个转染组设置三个重复孔。
结果：如图3所示，与对照组相比，转染LRP5-siRNA干扰质粒1天后，MGC-803细胞开始出现增殖减慢，但此时两组细胞生长速度无统计学差异（P＞0.05）。但在转染2天时，LRP-5基因干扰组细胞的相对生长速度显著低于对照组（P＜0.05）。且随着时间的延长，对胃癌细胞增殖的抑制效应愈加明显。表明干扰内源性LRP5基因可以有效抑制胃癌细胞的增殖，干扰消化系统肿瘤组织内LRP5基因的表达或可有效抑制癌细胞的增殖。
四、干扰LRP5基因可以抑制胃癌细胞的迁移能力
将MGC-803细胞铺于6孔培养皿中，转染前细胞生长至60%左右密度为宜，按照实施例三中的方法，转染LRP5-siRNA及NC-siRNA通用阴性对照。转染24小时后用200 μL无菌移液枪枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，PBS清洗三次去除划下的细胞，加入不含血清的培养基继续培养细胞。按0，24，48小时在倒置显微镜下拍照。用Image Pro Plus 6.0软件测量划痕的面积和宽度。细胞的愈合率：(宽度1-宽度2)/ 宽度1，宽度1和宽度2分别为划痕在0小时和24/48小时的宽度，划痕宽度是划痕面积与长度的比值。
结果：如图4所示，与对照组相比，转染LRP5-siRNA干扰质粒24小时后，癌细胞的迁移能力即发生降低，但并无统计学差异（P＞0.05），转染48小时后胃癌细胞的迁移能力明显降低（P＜0.05），表明转染LRP5-siRNA干扰质粒能够显著抑制胃癌细胞的迁移能力，干扰消化系统肿瘤组织内LRP5基因的表达或可有效抑制癌细胞的扩散及转移。
统计学分析：所有数据取三次独立重复实验的平均值，标准差（SD）利用GraphPadPrism 5中的方法进行数据分析。P < 0.05认为具有统计学意义。
本发明请求保护的范围并不局限于具体实施方式的描述。
<110> 河南大学
<120> LRP5作为临床诊断和抑制消化系统肿瘤的应用
<160> 4
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<400> 4
gccgatccac acggagtac 19

Claims (1)

1.一种检测LRP5的荧光定量PCR引物在制备用于诊断结直肠癌诊断试剂中的应用，其特征在于：所述荧光定量PCR中LRP5的正向引物如SEQ ID NO：1所示，LRP5反向引物如SEQID NO：2所示；所述荧光定量PCR的程序为：50 °C 20s；95 °C 10min；95 °C 1min；60 °C1min，重复40个循环，测得LRP5扩增的CT值，并以内参基因β-actin的CT值进行标准化校正。
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