CN112501292B

CN112501292B - cFAM210A在制备肝癌诊断或术后预测试剂盒以及药物中的应用

Info

Publication number: CN112501292B
Application number: CN202011241496.3A
Authority: CN
Inventors: 余建; 杨富; 李雯; 周伟平; 丁文斌; 孙大鹏; 葛春梅; 戴智慧; 张潇文
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2040-11-09
Also published as: CN112501292A

Abstract

本发明涉及医学生物检测技术领域，提供了cFAM210A的新用途，具体是在制备肝癌诊断试剂盒以及术后预测试剂盒中的应用，以及在制备治疗肝癌药物和抗肝损伤药物中的应用，本发明进一步提供了一种利用针对cFAM210A的定量PCR检测来进行肝癌诊断或术后预测的试剂盒。本发明的试剂盒和检测方法简便，可靠，周期短，特异性高，易于临床推广。

Description

cFAM210A在制备肝癌诊断或术后预测试剂盒以及药物中的应用

技术领域

本发明涉及医学生物检测以及生物制药技术领域，涉及环状RNA-cFAM210A作为分子标志物在肝癌诊断中的应用，尤其涉及lncRNA中的cFAM210A在制备肝癌诊断试剂或试剂盒中的应用。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC，以下简称肝癌)是我国发病率及死亡率均高居前四名的恶性肿瘤，是我国主要的疾病负担之一。目前肝癌常用的治疗手段包括外科手术、放疗、化疗及靶向治疗等，但上述治疗方式对进展期肝癌的治疗仍然有限。

研究肝癌发生发展过程中的分子生物学基础发现，相应的诊断和治疗分子标志物具有重要的临床意义。环状RNA(circular RNAs,简称为circRNAs)是一种闭合环状的单链RNA分子，既往被认为是一种罕见的RNA，并且仅仅是RNA剪切过程中产生的“废物”，没有任何功能。近年来，高通量测序发现包括人类在内的哺乳动物细胞中存在大量的环状RNA。环状RNA在乳腺癌、肺癌、胶质瘤、结直肠癌以及膀胱癌等多种肿瘤中发挥了重要作用。

cFAM210A是一种环状RNA，来源于人类FAM210A基因的第3个外显子，由该外显子首尾相接，环化而成，其连接点称为“反向剪切位点”，其在CircBase数据库的编号为has_circ_0003979，在基因组上的定位为：chr18:13681603-13682104。

目前关于cFAM210A的功能研究极少，仅知其母基因FAM210A能增强骨骼和肌肉的强度(Proc Natl Acad Sci U S A.2018 Apr 17；115(16):E3759-E3768.PMID:29618611)。但FAM210A及cFAM210A在肿瘤中的发生发展机制尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于探索cFAM210A在肝中的作用，发明人通过研究发现，人类肝癌组织中cFAM210A的表达量明显低于癌旁组织，过表达cFAM210A可以抑制肝癌细胞的增殖能力，而干扰cFAM210A却可以促进肝细胞的增殖能力，由此提供了其作为肝癌的诊断标志物或治疗靶点以及制备抗肝损伤药物中的新用途。

其全长为501个碱基，其序列如下(SEQ ID NO.1)所示：

AAGCUGAAACCUAUCAACACUCUUCAAAAUGCAAUGGAAUGUACCACGGACUGUAUCUCGACUGGCACGCAGGACAUGCUUGGAACCACAUAAUGCUGGUCUCUUUGGACACUGUCAAAAUGUAAAGGGACCUUUACUUUUAUACAAUGCUGAAUCCAAAGUGGUUUUGGUACAAGGCCCUCAAAAACAAUGGUUGCAUUUAUCUGCUGCCCAGUGUGUUGCAAAGGAAAGGAGGCCAUUGGAUGCUCAUCCACCCCAACCAGGAGUCCUUCGCCAUAAGCAAGGGAAGCAACAUGUUUCAUUCAGGAGGGUUUUUUCAUCCAGUGCCACAGCUCAGGGAACUCCGGAAAAAAAGGAAGAGCCUGAUCCUUUGCAAGACAAAUCUAUUAGUCUUUAUCAACGAUUCAAGAAGACAUUUAGACAGUAUGGAAAAGUUCUGAUUCCAGUGCAUCUAAUAACUUCUGGUGUUUGGUUUGGAACAUUUUAUUAUGCAGCCUUGAA。

随后，发明人通过实时定量PCR、Sanger测序、RNase R消化实验等证实了cFAM210A的环状特性(图1)。

本发明的第一方面，提供了cFAM210A作为肝癌诊断标志物的应用。人类肝癌组织中cFAM210A的表达量明显低于癌旁组织，肝组织中cFAM210A表达量诊断肝癌的效果用ROC曲线(receiver operating characteristic curve，受试者工作特征曲线)下面积(AreaUnder Curve，AUC)表示为0.751(0.677-0.826)，能较好地区分肝癌组织和癌旁组织(图2)。

因此，本发明的第二方面，提供了cFAM210A在制备肝癌诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。所述的诊断试剂为检测生物样品中cFAM210A含量的试剂；所述的诊断试剂盒包含了检测生物样品中cFAM210A含量的试剂。

所述的检测生物样品中cFAM210A的含量的试剂，选自：对cFAM210A具有检测特异性的PCR引物。

所述的对cFAM210A具有检测特异性的PCR引物如下：

所述的生物样品选自：获自对象的肝癌组织、癌旁组织、肝细胞系或肝癌细胞系。

此外，通过研究cFAM210A在经历肝切除术的肝癌患者中的表达情况，cFAM210A低表达的肝癌患者的总体生存率和无复发生存率均低于cFAM210A高表达的肝癌患者。因此，肝癌组织中cFAM210A的表达量可以预测肝癌患者肝切除术总体生存率和无复发生存率。

本发明的第三方面，提供了cFAM210A在制备肝癌患者肝切除术后总体生存率和无复发生存率预测试剂盒中的应用。

与上述诊断试剂盒一样，所述的预测试剂盒同样包含了检测生物样品中cFAM210A含量的试剂，选自：对cFAM210A具有检测特异性的PCR引物，引物序列如SEQ ID NO:2和3所示。

对应上述应用，本发明的第四方面，提供了一种肝癌的诊断试剂盒或术后总体生存率和无复发生存率预测试剂盒，两种试剂盒中的内容物基本一致，均包含肝组织RNA的提取试剂、逆转录试剂、实时定量PCR试剂以及cFAM210A的实时定量PCR引物，引物序列如SEQID NO:2和3所示。

利用上述诊断试剂盒进行肝癌检测的方法，如下：

A.抽提肝组织总RNA；

B.对步骤A中的总RNA进行逆转录，得到cDNA；

C.采用实时定量PCR技术对cFAM210A的拷贝数进行定量检测。

数据均采用SPSS16.0处理，采用平均值±标准差的方式表示。

通过生物信息学分析，发现cFAM210A在肝癌中显著低表达。实验证明低表达cFAM210A可显著提高肝癌细胞的增殖和侵袭转移能力，促进cFAM210A的体内表达可抑制肿瘤细胞的恶性表型，从而达到抑制肝癌的效果。上述结果提示cFAM210A在肝癌细胞中的特异性和灵敏性高，具有明确的促癌的生物学功能，可应用于肝癌诊断或肝癌治疗。

本发明的第五方面，提供了cFAM210A在制备治疗肝癌药物中的应用，所述的药物为过表达cFAM210A的药物。

此外，针对cFAM210A的反向剪切位点，设计出小干扰RNA序列，如SEQ ID NO.8和9所示。将小干扰RNA瞬时转染入肝细胞(LO2和MIHA)，24小时后检测其干扰效果发现，该小干扰RNA序列可以有效降低肝细胞中cFAM210A的表达量。通过CCK-8实验提示，干扰cFAM210A表达，能够促进正常肝细胞的增殖能力，提示可用于肝损伤治疗中。

因此，本发明的第六方面，提供了cFAM210A在制备抗肝损伤药物中的应用，所述药物为抑制或沉默cFAM210A表达的试剂，具体为cFAM210A的干扰RNA，在本发明的优选实施例中，所述的cFAM210A的干扰RNA的序列如SEQ ID NO.8或9所示。

本发明的有益保障及效果如下：

申请人从合作医院取得了大量的肝癌病人的组织，为本发明的研究提供了有力的保障。

就技术而言，cFAM210A的检测本质上是一种定量PCR检测，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点，现今已越来越多地被应用于临床检验技术中。

我们所采用基本检测方法是定量PCR，这一技术在现代实验诊断学中已被证实是高灵敏度、高准确度的检测方法，试验技术已经十分成熟，并且我们采用的是这一技术中的标准曲线定量法，可以准确地对各种样品中特点核酸分子做精确定量。

此外，本发明所涉及的指标cFAM210A在肝癌组织中的表达显著下调，且差异具有统计学意义(P<0.05)，其临床参考价值和可信度较高，不仅能够提高家族性肝癌的检出率和准确率，对于家族性肝癌的临床治疗有着重大的意义。此外只需要采集检测者的血液即可获得检测结果，也避免了采用影像学手段进行检查时，患者需根据检测设备的要求提前进行准备的麻烦以及受到仪器辐射危害的风险。

本发明提供了一种以定量PCR为基础的肝癌检测试剂盒，可以通过检测病人外周血基因组RNA中cFAM210A的表达丰度来对肝癌做出诊断。其检测方法特别简便、周期短、灵敏度高，是现行检测试剂的有效补充。

附图说明

图1为cFAM210A的环状验证结果：(A)cFAM210A生成的示意图，红色箭头为cFAM210A的特异性引物；(2)cFAM210A的实时定量PCR的溶解曲线为单峰；(C)Sanger测序检测到cFAM210A的反向剪切位点；(D)RNase R不能降解cFAM210A。

附图2.cFAM210A对肝癌的诊断价值。

图2是采用qPCR检测cFAM210A基因在正常肝细胞和肝癌细胞中的表达情况结果图：(A)实时定量PCR检测cFAM210A在80对肝癌及癌旁组织中的表达量；(B)肝组织中cFAM210A表达量诊断肝癌的ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线。

图3是cFAM210A对肝癌患者预后的预测情况结果图：(A)Kaplan-Meier生存曲线显示肝癌组织中cFAM210A的表达量与肝癌患者肝切除术后总体生存率的关系；(B)Kaplan-Meier生存曲线显示肝癌组织中cFAM210A的表达量与肝癌患者肝切除术后无复发生存率的关系。

图4为cFAM210A过表达及干扰细胞系的建立：(A)实时定量PCR检测cFAM210A的过表达效果；(B)实时定量PCR检测cFAM210A的干扰效果。

图5为cFAM210A的人为干预对肝癌细胞以及正常肝细胞增殖的影响：(A)过表达cFAM210A抑制肝癌细胞的增殖能力；(B)干扰cFAM210A促进肝细胞的增殖能力。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。

实施例1：cFAM210A的环状结构验证

1.1肝组织总RNA的抽提

取绿豆大小的肝组织，加入适量(一般为1mL)的RNAiso Plus后匀浆；室温静置5分钟后，以12000g/min,4℃离心5分钟；上清液移至新的1.5mL EP管中，丢弃沉淀；加入0.2倍RNAiso Plus体积量(一般为0.2mL)的三氯甲烷，振荡混匀，室温静置5分钟；以12000g/min,4℃离心15分钟，将上清液移至新的1.5mLEP管中，加入等体积的异丙醇，室温静置10分钟；以12000g/min,4℃离心10分钟(在管底可见白色沉淀)，弃液体，留沉淀，加入RNAiso Plus等体积量(一般为1ml)的75％乙醇，以7500g/min,4℃离心5分钟，弃液体，留沉淀，干燥；加适量DEPC水溶解；测浓度，置于-80℃冰箱备用。

使用紫外分光光度计测定RNA在260nm和280nm处的光密度值，当OD260/OD280在1.8-2.0范围内认为RNA的纯度是可靠的。

1.2逆转录：

M-MLV逆转录体系过程如下所示：

1.3引物序列：

cFAM210A-forward：CACAGCTCAGGGAACTCCG(SEQ ID NO.2)；

cFAM210A-reverse：TGCGTGCCAGTCGAGATAC(SEQ ID NO.3)；

mFAM210A-forward：CCTTCGCCATAAGCAAGGGA(SEQ ID NO.4)；

mFAM210A-reverse：CCACACTGTCAGGTAACCCA(SEQ ID NO.5)；

ACTB-forward：CCACCATGTACCCTGGCATTG(SEQ ID NO.6)；

ACTB-reverse：TCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTA(SEQ ID NO.7)。

1.4.以ACTB作为内参，实时定量PCR的反应体系如表1所示：

表1实时定量PCR的反应体系

试剂	使用量
		TB Green Fast qPCR Mix(2X)	10μl
PCR Forward Primer(10μM)	0.8μl
		PCR Reverse Primer(10μM)	0.8μl
ROX Reference Dye(50X)or Dye II(50X)<sup>＊2</sup>	0.4μl
		DNA模板<sup>＊3</sup>	2μl
灭菌水	6μl
		Total	20μl<sup>＊4</sup>

PCR反应条件如下：94℃，5min预变性；95℃，15s变性；60℃，15s退火；72℃，20s延伸；40个循环。

cFAM210A的模式图以及其特异性引物如附图1A所示，其由FAM210A基因的第三个外显子组成，红色箭头指代cFAM210A的特异性引物；cFAM210A扩增后产物的溶解曲线如图1B所示，单峰提示其产物是单一的，没有其它非特异性产物；收集PCR产物进行纯化及Sanger测序，可以检测到cFAM210A首尾相连的反向剪切位点，提示该引物可以正确地检测到cFAM210A(图1C)。

1.5 RNase R处理

RNase R是一种5’→3’核酸外切酶，能特异性地消化线性RNA而保留环状RNA。我们将RNA用RNase R处理以及逆转录后检测cFAM210A以及mFAM210A(FAM210A基因生成的mRNA)的表达量。结果如附图1D所示，mFAM210A的表达量明显下降，而cFAM210A的表达量无明显下降，提示cFAM210A不易被RNase R所降解，具有环状RNA分子的特性。

实施例2肝癌与癌旁组织中cFAM210A的表达水平检测

1、样品收集

分别收集肝癌与癌旁组织样本80对，放置于-80℃冰箱中。全部病例在手术前均未接受放化疗，所有患者均签署知情同意书，该实验方案取得本单位伦理委员会同意。

肝组织RNA的抽提、逆转录以及实时定量PCR如实施例1所述。通过检测了80对肝癌及癌旁组织中cFAM210A的表达量，发现cFAM210A在肝癌组织中的表达量明显低于癌旁(图2A，Wilcoxon符号秩检验，P<0.001)。肝组织中cFAM210A表达量诊断肝癌的效果用ROC曲线(receiver operating characteristic curve，受试者工作特征曲线)下面积(Area UnderCurve，AUC)表示为0.751(0.677-0.826)，能较好地区分肝癌组织和癌旁组织。

实施例3 cFAM210A对肝癌患者预后的预测作用

肝组织RNA的抽提、逆转录以及实时定量PCR如实施例1所述。我们检测了80对肝癌及癌旁组织中cFAM210A的表达量，发现cFAM210A低表达的肝癌患者的总体生存率明显低于cFAM210A高表达的肝癌患者(图3A，Log-rank,P＝0.019)，cFAM210A低表达的肝癌患者的无复发生存率也明显低于cFAM210A高表达的肝癌患者(图3B，Log-rank,P＝0.031)。

实施例4 cFAM210A过表达及干扰细胞系的建立

4.1 cFAM210A过表达细胞系的建立：

合成FAM210A基因的第3外显子线性全序列，通过多克隆位点整合到LV-Circ过表达载体，通过测序进行鉴定，未插入序列的LV-Circ空载体为阴性对照，同时将mFAM210A也作为阴性对照。经过慢病毒包装后分别生成Lv-cFAM210A-oe(过表达)以及Lv-NC(阴性对照)慢病毒。将两种慢病毒分别转染肝癌细胞(Sk-Hep-1和Huh7)后用实时定量PCR进行检测，发现Lv-cFAM210A-oe具有明显的过表达效果(图4A和4B)。

4.2 cFAM210A干扰细胞系的建立：

我们针对cFAM210A的反向剪切位点，设计出小干扰RNA序列，如下所示：

cFAM210A-SiRNA-sense:UGCAGCCUUGAAAAGCUGATT(SEQ ID NO.8)

cFAM210A-SiRNA-antisense:UGCAGCCUUGAAAAGCUGATT(SEQ ID NO.9)。

将mFAM210A作为阴性对照。使用

3000(Invitrogen)将小干扰RNA转入肝细胞(LO2和MIHA)，24小时后检测其干扰效果。我们发现，该小干扰RNA序列可以有效降低肝细胞中cFAM210A的表达量，对mFAM210A无影响(图4C和4D)。

实施例5.cFAM210A对肝癌细胞和肝细胞的作用。

如实施例4所述，我们建立了cFAM210A的过表达及干扰细胞系。在此基础上，我们用Cell Counting Kit-8试剂盒(同仁化学研究所，货号CK04)检测了各组细胞的增殖能力。发现过表达cFAM210A可以抑制肝癌细胞(Sk-Hep-1和Huh7)的增殖能力(图5A和5B)，而干扰cFAM210A可以促进肝细胞(LO2和MIHA)的增殖能力(图5C和5D)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军海军军医大学

<120> cFAM210A在制备肝癌诊断或术后预测试剂盒以及药物中的应用

<130> 权利要求书说明书

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 501

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

aagcugaaac cuaucaacac ucuucaaaau gcaauggaau guaccacgga cuguaucucg 60

acuggcacgc aggacaugcu uggaaccaca uaaugcuggu cucuuuggac acugucaaaa 120

uguaaaggga ccuuuacuuu uauacaaugc ugaauccaaa gugguuuugg uacaaggccc 180

ucaaaaacaa ugguugcauu uaucugcugc ccaguguguu gcaaaggaaa ggaggccauu 240

ggaugcucau ccaccccaac caggaguccu ucgccauaag caagggaagc aacauguuuc 300

auucaggagg guuuuuucau ccagugccac agcucaggga acuccggaaa aaaaggaaga 360

gccugauccu uugcaagaca aaucuauuag ucuuuaucaa cgauucaaga agacauuuag 420

acaguaugga aaaguucuga uuccagugca ucuaauaacu ucugguguuu gguuuggaac 480

auuuuauuau gcagccuuga a 501

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

cacagctcag ggaactccg 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tgcgtgccag tcgagatac 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ccttcgccat aagcaaggga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ccacactgtc aggtaaccca 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ccaccatgta ccctggcatt g 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

tcatcttgtt ttctgcgcaa gtta 24

Claims

1.检测cFAM210A表达水平的试剂在制备肝癌诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的检测cFAM210A表达水平的试剂在制备肝癌诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂为检测生物样品中cFAM210A含量的试剂，所述的诊断试剂盒包含了检测生物样品中cFAM210A含量的试剂。

3.根据权利要求2所述的检测cFAM210A表达水平的试剂在制备肝癌诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测生物样品中cFAM210A含量的试剂，选自：对cFAM210A具有检测特异性的PCR引物，所述引物序列如SEQ ID NO:2和3所示。

4.检测cFAM210A表达水平的试剂在制备肝癌患者肝切除术后总体生存率和无复发生存率预测试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的检测cFAM210A表达水平的试剂在制备肝癌患者肝切除术后总体生存率和无复发生存率预测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的预测试剂盒包含了检测生物样品中cFAM210A含量的试剂，选自：对cFAM210A具有检测特异性的PCR引物，所述引物序列如SEQ ID NO:2和3所示。

6.过表达cFAM210A的制剂在制备治疗肝癌药物中的应用。