CN115851958A - 检测胰腺癌相关基因甲基化的引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的引物、探针、试剂盒及方法，涉及生物技术领域。上述检测胰腺癌相关基因甲基化的引物和探针包括检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的引物和探针。通过采用本公开的引物探针组合在进行胰腺癌检测时，显著提高了胰腺癌检测的灵敏性和特异性，可以辅助胰腺癌的早期诊断、预后、治疗反应预测和复发风险评估，在检测结果呈甲基化阴性时，能够避免不必要的镜检，整个过程可以简便的采用外周血体外检测，无创伤、简便易行。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术领域，特别涉及一种检测胰腺癌相关基因甲基化的引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术
胰腺癌是癌症死亡的第四大原因，其中五年的存活率低于5％，预计全球病例数将会不断增加。它的不良预后取决于多种复杂因素，然而一个关键的原因是大多数患者在较晚的阶段被诊断，只有大约20％的患者能够接受手术切除。CA19-9是一种经典的生物标志物，它被广泛用于胰腺癌的检测。但由于其灵敏度(41-86％)和特异性(33-100％)较低，尚不够理想。因此，目前亟需开发更有效和可靠的生物标志物来筛查可手术阶段的胰腺癌。
肿瘤会释放游离核酸片段，包括游离DNA(cfDNA)，以及mRNA和micro(mi)RNAs进入血液，它们被认为是潜在的癌症诊断的生物标志物。肿瘤特异性核酸检测与遗传和表观遗传变化，如突变、拷贝数变化和DNA甲基化，因此可以使用所谓的“液体活检”来诊断和监测肿瘤。表观遗传机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑，被认为与基因表达密切相关并反映肿瘤表型。其中，DNA甲基化标记由于其稳定性被认为是特别有效的临床上的诊断工具。
目前，早期胰腺癌的诊断“金标准”仍为内镜下组织活检，而在我国大规模开展胰腺癌筛查条件尚不具备，同时也缺乏理想的生化或者生物学标志物检测作为筛查或普查胰腺癌的手段，虽然敏感度及特异度均较高，但由于其有创性、费用较高且部分地区医疗资源有限，故不能作为大规模人群的筛查手段。在胰腺癌患者外周血液循环中的自由DNA分子与胰腺癌的进展程度呈密切的相关性。肿瘤进展程度越晚，血液循环中的肿瘤相关的游离DNA分子越多。为了提高诊断试验的灵敏度，可以通过提高甲基化检测的敏感度来实现。这种易于实施、建立在血液检测基础上的胰腺癌筛查手段，对胰腺癌的早期诊断均具有重要的意义。
因此，目前亟需一种用于检测胰腺癌相关基因甲基化的引物探针组合。
发明内容
本公开的主要目的在于提供一种检测胰腺癌相关基因甲基化的引物、探针、试剂盒及方法，以克服现有技术中的不足。
为了实现上述目的，本公开采用了以下的技术方案：
本公开实施例的第一方面，提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的引物，包括检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的引物，
检测BNC1基因的引物包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；
检测NPTX2基因的引物包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；
检测ADAMTS1基因的引物包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；
检测PCDH10基因的引物包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物；
检测DIRAS1基因的引物包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物。
本公开实施例的第二方面，提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的探针，包括检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的探针，
检测BNC1基因的探针为SEQ ID NO.11所示的探针；
检测NPTX2基因的探针为SEQ ID NO.12所示的探针；
检测ADAMTS1基因的探针为SEQ ID NO.13所示的探针；
检测PCDH10基因的探针为SEQ ID NO.14所示的探针；
检测DIRAS1基因的探针为SEQ ID NO.15所示的探针。
本公开实施例的第三方面，提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物和如上所述的探针。
在一种实施方式中，所述试剂盒还包括PCR预混液和Tag DNA聚合酶扩增体系。
本公开实施例的第四方面，提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的方法，包括：
S1、提取血浆样本中游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段；
S2、将所述游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段进行亚硫酸盐转化；
S3、利用如上所述的引物和如上所述的探针组合成的荧光PCR反应体系对亚硫酸盐转化的游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段进行PCR扩增；
S4、获取PCR扩增的Ct值，进行结果分析。
在一种实施方式中，所述提取血浆样本中游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段，具体包括：
获取外周静脉血；
从所述外周静脉血中分离血浆，得到血浆样本；
对所述血浆样本使用核酸提取试剂盒进行提取和纯化，得到游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段。
在一种实施方式中，所述PCR扩增的反应条件为95℃预变形300s，进行1个循环；95℃变形15s，55℃退火延伸35s，进行45个循环。
在一种实施方式中，所述PCR扩增时采集FAM、JOE、CY5和Texas Red四种荧光信号。
在一种实施方式中，所述结果分析，具体包括：
内参基因的Ct值≤30，BNC1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明BNC1基因检测结果为阳性，BNC1基因发生了甲基化；NPTX2基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明NPTX2基因检测结果为阳性，NPTX2基因发生了甲基化；ADAMTS1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明ADAMTS1基因检测结果为阳性，ADAMTS1基因发生了甲基化；PCDH10基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明PCDH10基因检测结果为阳性，PCDH10基因发生了甲基化；DIRAS1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明DIRAS1基因检测结果为阳性，DIRAS1基因发生了甲基化；BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因中的至少一个基因检测结果为阳性，则检测结果为甲基化阳性。
本公开实施例的第五方面，提供了检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的试剂在制备检测胰腺癌相关基因甲基化的产品中的应用。
本公开提供的上述技术方案的有益效果至少包括：
本公开的一种检测胰腺癌相关基因甲基化的引物、探针、试剂盒及方法，设计了针对于胰腺癌相关的基因甲基化的检测引物对和探针，包括BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因。本公开设计合成的引物和探针可以在疑似病例中，进行本公开的胰腺癌基因甲基化检测，检测结果显示甲基化阳性的患者，胰腺癌高风险，支持B超及纤维胃镜超声等检查进一步确诊，检测结果显示甲基化阴性的患者，表明非胰腺癌引起，低风险，可以避免镜检，进一步观察随诊。可见，通过采用本公开的引物探针组合在进行胰腺癌检测时，显著提高了胰腺癌检测的灵敏性和特异性，可以辅助胰腺癌的早期诊断、预后、治疗反应预测和复发风险评估，在检测结果呈甲基化阴性时，能够避免不必要的镜检，整个过程可以简便的采用外周血体外检测，无创伤、简便易行。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简要介绍。通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显。
图1为本公开实施例提供的BNC1基因甲基化图谱；
图2为本公开实施例提供的NPTX2基因甲基化图谱；
图3为本公开实施例提供的ADAMTS1基因甲基化图谱；
图4为本公开实施例提供的PCDH10基因甲基化图谱；
图5为本公开实施例提供的DIRAS1基因甲基化图谱；
图6为本公开实施例提供的BNC1基因和NPTX2基因未发生甲基化的图谱；
图7为本公开实施例提供的ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因未发生甲基化的图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本公开进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本公开，而不是为了限制本公开的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本公开的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本公开实施例的第一方面，提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的引物，包括检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的引物，
检测BNC1基因的引物包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；
检测NPTX2基因的引物包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；
检测ADAMTS1基因的引物包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；
检测PCDH10基因的引物包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物；
检测DIRAS1基因的引物包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物。
本公开实施例的第二方面，提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的探针，包括检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的探针，
检测BNC1基因的探针为SEQ ID NO.11所示的探针；
检测NPTX2基因的探针为SEQ ID NO.12所示的探针；
检测ADAMTS1基因的探针为SEQ ID NO.13所示的探针；
检测PCDH10基因的探针为SEQ ID NO.14所示的探针；
检测DIRAS1基因的探针为SEQ ID NO.15所示的探针。
本公开实施例的第三方面，提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物和如上所述的探针。
在一种实施方式中，所述试剂盒还包括PCR预混液和Tag DNA聚合酶扩增体系。
在一种实施方式中，所述试剂盒还包括检测内参基因ACTB的引物和探针，其中，所述检测内参基因ACTB的引物包括SEQ IDNO.16所示的上游引物和SEQ ID NO.17所示的下游引物，所述检测内参基因ACTB的探针为SEQ ID NO.18所示的探针。
本公开实施例的第四方面，提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的方法，包括：
S1、提取血浆样本中游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段；
S2、将所述游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段进行亚硫酸盐转化；
S3、利用如上所述的引物和如上所述的探针组合成的荧光PCR反应体系对亚硫酸盐转化的游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段进行PCR扩增；
S4、获取PCR扩增的Ct值，进行结果分析。具体地，将Ct值与临界值进行比较，当Ct值小于或等于临界值时为阳性，表明血浆样本中含有甲基化的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因中的至少一种。
在一种实施方式中，所述提取血浆样本中游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段，具体包括：
获取外周静脉血；
从所述外周静脉血中分离血浆，得到血浆样本；
对所述血浆样本使用核酸提取试剂盒进行提取和纯化，得到游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段。
在一种实施方式中，所述游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段保存温度为-15--25℃。
在一种实施方式中，所述PCR扩增的反应条件为95℃预变形300s，进行1个循环；95℃变形15s，55℃退火延伸35s，进行45个循环。
在一种实施方式中，所述PCR扩增时采集FAM、JOE、CY5和Texas Red四种荧光信号。
在一种实施方式中，所述结果分析，具体包括：
内参基因ACTB的Ct值≤30，BNC1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明BNC1基因检测结果为阳性，BNC1基因发生了甲基化；NPTX2基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明NPTX2基因检测结果为阳性，NPTX2基因发生了甲基化；ADAMTS1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明ADAMTS1基因检测结果为阳性，ADAMTS1基因发生了甲基化；PCDH10基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明PCDH10基因检测结果为阳性，PCDH10基因发生了甲基化；DIRAS1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明DIRAS1基因检测结果为阳性，DIRAS1基因发生了甲基化；BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因中的至少一个基因检测结果为阳性，则检测结果为甲基化阳性。
本公开实施例的第五方面，提供了检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的试剂在制备检测胰腺癌相关基因甲基化的产品中的应用。
在一种实施方式中，所述检测胰腺癌相关基因甲基化的产品包括但不限于检测胰腺癌相关基因甲基化的试剂盒。
本公开的试剂盒和方法选用TaqMan-MGB探针，MGB探针包括一个不发荧光的淬灭基团(NFQ)，极大消除传统淬灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，从而提高检验灵敏性，另外MGB(小沟结合物)分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板提高杂交稳定性，增加Tm值，使短至13个碱基的探针获得高错配区分辩别能力。
以下结合具体实施例对本公开进行详细说明：
实施例1、
一、检测胰腺癌相关基因甲基化的试剂盒的主要组成成分
检测胰腺癌相关基因甲基化的试剂盒的主要组成成分如下表所示。
注：不同批次的试剂不可混合使用。
二、检测胰腺癌相关基因甲基化的试剂盒的储存条件及有效期
试剂盒在-20±5℃存储，有效期为12个月；开封后有效期为6个月；反复冻融3次有效。
三、适用仪器
ABI 7500荧光PCR仪
四、样本要求
1.样本类型：血浆样本。
2.样本的采集：
使用K2EDTA或游离核酸采血管，按照生产厂家建议采血10mL，血样应该立即处理。K2EDTA采血管在血浆制备前，血液保存在2-8℃，不超过24小时，不要冰冻血样。游离核酸采血管在血浆制备前，可以保存在15-25℃，不超过72小时，不要冰冻血样。
3.血浆的制备和保存：
将采血管放入离心机进行离心，转速1350±150rcf，离心12分钟(禁止使用离心机的刹车功能，以防止血细胞层的破坏)；从离心机中取出采血管，用新的一次性移液管把血浆转移到聚丙烯材质，圆锥底的15mL离心管中，再次离心，转度1350±150rcf，离心12分钟。用新的一次性移液管或者血清移液管把3.5mL的血浆加入新的离心管中，标记好样本号。血浆样本可以立即用于检测，或2℃-8℃保存(不超过24h)，-15至-25℃条件下样本可保存一个月，低于-70℃条件下样本可保存六个月。参考离心机操作手册将rpm换算为rcf。
4.样本用量：3.5mL。
五、检验方法
1.试剂准备
1.1从试剂盒中取出PCR反应液，室温解冻，充分融化后，轻轻振荡混匀，并作短暂离心备用。
1.2根据待检样本数(n)，计算需要的反应数为n+3，每个反应分装PCR反应液各20μl。
2.样本处理
2.1血浆解冻
如果是冰冻的血浆样本，放置于室温(15-30℃)，融化约30分钟，上述血浆样本必须在融化60分钟内进行裂解程序。
2.2核酸提取及亚硫酸盐转化
参考所购买的商用试剂盒说明书进行操作核酸提取或纯化试剂盒，用于血浆样本中游离核酸提取及核酸亚硫酸盐转化，得到待测样本DNA。
如果处理后待测样本DNA不能立即使用，2到8度可以储存24小时，-25℃到-15℃可以储存72小时。
3.加样
加样：在准备好试剂的PCR反应管中分别加入待测样本DNA。每个PCR反应中各加30μLDNA，盖紧管盖后，瞬时低速离心。密封后的PCR板可在2-8℃最多放置4小时。如下表所示加样。
4.PCR扩增
4.1样品设置：根据样本类型设置样本编号，PCR仪的96孔加样布局见下表。表中PC代表阳性质控品(Positive Control)，NC代表阴性质控品(Negative Control)，NTC代表无模板对照(No Template Control)，S代表检测样本(sample)。
4.2荧光通道选择：BNC1/NPTX2/ACTB基因每个样本选择FAM、JOE和CY5共3个通道；ADAMTS1/PCDH10/DIRAS1/ACTB基因每个样本选择FAM、JOE、Texas Red和CY5共4个通道；参比荧光(Passive Reference)设置为none。
4.3反应条件设定如下表所示(反应体积设定为50μL)：
4.4保存文件，运行程序。
5.结果分析
反应结束后自动保存结果，使用仪器配套软件自动分析结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在2～8、End值可设在10～20，荧光阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过阴性质控品品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值显示为undet)，点击Analysis自动获得分析结果。
6.结果判定
PCR反应结果解释如下表所示。如果内参ACTB显示单个中加入DNA的量足够的话(ACTB Ct值见表1中)，那么BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因结果视为本次PCR反应结果。如果ACTB的Ct值大于表中所设的阈值，那么定义该PCR反应为“无效”。
如图1所示，当检测样本为BNC1基因甲基化时，内源对照能够检测亚硫酸盐转化的ACTB(β-actin)DNA，内参基因ACTB的Ct值≤30，样本DNA含量满足要求，针对BNC1甲基化区域设计的特异性探针和靶序列结合时，荧光PCR会出现两条扩增曲线，BNC1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，BNC1基因发生了甲基化。
如图2所示，当检测样本为NPTX2基因甲基化时，内源对照能够检测亚硫酸盐转化的ACTB(β-actin)DNA，内参基因ACTB的Ct值≤30，样本DNA含量满足要求，针对NPTX2甲基化区域设计的特异性探针和靶序列结合时，荧光PCR会出现两条扩增曲线，NPTX2基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，NPTX2基因发生了甲基化。
如图3所示，当检测样本为ADAMTS1基因甲基化时，内源对照能够检测亚硫酸盐转化的ACTB(β-actin)DNA，内参基因ACTB的Ct值≤30，样本DNA含量满足要求，针对ADAMTS1甲基化区域设计的特异性探针和靶序列结合时，荧光PCR会出现两条扩增曲线，ADAMTS1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，ADAMTS1基因发生了甲基化；
如图4所示，当检测样本为PCDH10基因甲基化时，内源对照能够检测亚硫酸盐转化的ACTB(β-actin)DNA，内参基因ACTB的Ct值≤30，样本DNA含量满足要求，针对PCDH10甲基化区域设计的特异性探针和靶序列结合时，荧光PCR会出现两条扩增曲线，PCDH10基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，PCDH10基因发生了甲基化。
如图5所示，当检测样本为DIRAS1基因甲基化时，内源对照能够检测亚硫酸盐转化的ACTB(β-actin)DNA，内参基因ACTB的Ct值≤30，样本DNA含量满足要求，针对DIRAS1甲基化区域设计的特异性探针和靶序列结合时，荧光PCR会出现两条扩增曲线，DIRAS1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，DIRAS1基因发生了甲基化。
如图6所示，若内参基因ACTB的Ct值≤30，BNC1基因的Ct值＞35或无扩增曲线，表明检测结果为阴性，BNC1基因未发生甲基化；NPTX2基因的Ct值＞32或无扩增曲线，表明检测结果为阴性，NPTX2基因未发生甲基化。
如图7所示，若内参基因ACTB的Ct值≤30，ADAMTS1基因的Ct值＞35或无扩增曲线，表明检测结果为阴性，ADAMTS1基因未发生甲基化；PCDH10基因的Ct值＞32或无扩增曲线，表明检测结果为阴性，PCDH10基因未发生甲基化；DIRAS1基因的Ct值＞35或无扩增曲线，表明检测结果为阴性，DIRAS1基因未发生甲基化。
六、阳性判断值或者参考区间
试剂盒检测胰腺癌的灵敏度为94.12％，特异为95％，能够实现胰腺癌的较高灵敏度和高特异性检测。
七、检验结果的解释
1)内参基因ACTB的Ct值≤30，BNC1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，BNC1基因发生了甲基化；NPTX2基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，NPTX2基因发生了甲基化；ADAMTS1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，ADAMTS1基因发生了甲基化；PCDH10基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，PCDH10基因发生了甲基化；DIRAS1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，DIRAS1基因发生了甲基化；其中任意一个阳性则检测结果为甲基化阳性；
2)若内参基因ACTB的Ct值＞30或无扩增，实验无效，提示加入的DNA含有PCR抑制剂，需要重新提取DNA并进行亚硫酸盐处理后检测；
3)若内参基因ACTB的Ct值≤30，BNC1基因的Ct值＞35或无扩增曲线，表明检测结果为阴性，BNC1基因未发生甲基化；NPTX2基因的Ct值＞32或无扩增曲线，表明检测结果为阴性，NPTX2基因未发生甲基化；ADAMTS1基因的Ct值＞35或无扩增曲线，表明检测结果为阴性，ADAMTS1基因未发生甲基化；PCDH10基因的Ct值＞32或无扩增曲线，表明检测结果为阴性，PCDH10基因未发生甲基化；DIRAS1基因的Ct值＞35或无扩增曲线，表明检测结果为阴性，DIRAS1基因未发生甲基化；
4)若判读检测结果为阴性，胰腺癌的风险较低，建议定期随访；若判读检测结果为阳性，患胰腺癌的风险较高，建议镜检或组织活检确认。
实施例2
首先收集10ml外周静脉血，分离出3.5ml血浆，提取血浆中的游离癌基因判断，本公开提取的癌基因包括BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因，首先进行亚硫酸盐转化，再分别设计特异性Tagman-MGB探针和特异性引物，配以必要的其他组分，组成荧光PCR反应体系，对亚硫酸盐转化后的DNA分别进行BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因扩增。对扩增结果的Ct值进行比较分析，Ct值小于临界值为阳性，提示胰腺癌高风险。
本实施例中实验样本采用已知临床信息的样本测试，如下表所示。
采用试剂盒对各样本进行检测，检测结果如下表所示。
检测结果统计如下表所示。
从上述具体实施例和应用可知：使用本公开试剂盒共检测37例样本，其中胰腺癌17例。17例胰腺癌样本中，检测为阳性的16例；20例正常人样本中，检测为阴性的19例。表明试剂盒检测灵敏度为94.12％，特异为95％。
以上说明书中描述的只是本公开的具体实施方式，各种举例说明不对本公开的实质内容构成限制，所属技术领域的普通技术人员在阅读了说明书后可以对以前所述的具体实施方式做修改或变形，而不背离本公开的实质和范围。
Claims (10)
1.一种检测胰腺癌相关基因甲基化的引物，其特征在于，包括检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的引物，
检测BNC1基因的引物包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；
检测NPTX2基因的引物包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；
检测ADAMTS1基因的引物包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；
检测PCDH10基因的引物包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物；
检测DIRAS1基因的引物包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物。
2.一种检测胰腺癌相关基因甲基化的探针，其特征在于，包括检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的探针，
检测BNC1基因的探针为SEQ ID NO.11所示的探针；
检测NPTX2基因的探针为SEQ ID NO.12所示的探针；
检测ADAMTS1基因的探针为SEQ ID NO.13所示的探针；
检测PCDH10基因的探针为SEQ ID NO.14所示的探针；
检测DIRAS1基因的探针为SEQ ID NO.15所示的探针。
3.一种检测胰腺癌相关基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物和如权利要求2所述的探针。
4.根据权利要求3所述的检测胰腺癌相关基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR预混液和Tag DNA聚合酶扩增体系。
5.一种检测胰腺癌相关基因甲基化的方法，其特征在于，包括：
S1、提取血浆样本中游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段；
S2、将所述游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段进行亚硫酸盐转化；
S3、利用权利要求1所述的引物和如权利要求2所述的探针组合成的荧光PCR反应体系对亚硫酸盐转化的游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段进行PCR扩增；
S4、获取PCR扩增的Ct值，进行结果分析。
6.根据权利要求5所述的检测胰腺癌相关基因甲基化的方法，其特征在于，所述提取血浆样本中游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段，具体包括：
获取外周静脉血；
从所述外周静脉血中分离血浆，得到血浆样本；
对所述血浆样本使用核酸提取试剂盒进行提取和纯化，得到游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段。
7.根据权利要求5所述的检测胰腺癌相关基因甲基化的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为95℃预变形300s，进行1个循环；95℃变形15s，55℃退火延伸35s，进行45个循环。
8.根据权利要求5所述的检测胰腺癌相关基因甲基化的方法，其特征在于，所述PCR扩增时采集FAM、JOE、CY5和Texas Red四种荧光信号。
9.根据权利要求5所述的检测胰腺癌相关基因甲基化的方法，其特征在于，所述结果分析，具体包括：
内参基因的Ct值≤30，BNC1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明BNC1基因检测结果为阳性，BNC1基因发生了甲基化；NPTX2基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明NPTX2基因检测结果为阳性，NPTX2基因发生了甲基化；ADAMTS1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明ADAMTS1基因检测结果为阳性，ADAMTS1基因发生了甲基化；PCDH10基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明PCDH10基因检测结果为阳性，PCDH10基因发生了甲基化；DIRAS1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明DIRAS1基因检测结果为阳性，DIRAS1基因发生了甲基化；BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因中的至少一个基因检测结果为阳性，则检测结果为甲基化阳性。
10.检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的试剂在制备检测胰腺癌相关基因甲基化的产品中的应用。
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