CN108624691A - 一种用于判断前列腺疾病的标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于判断前列腺疾病的标志物及其应用，其标志物为前列腺癌特异环状RNA以及内参照。本发明提供了前列腺癌特异环状RNA以及内参照在检测前列腺病变以及前列腺癌风险评估中的应用，还提供了包括前列腺癌特异环状RNA以及内参照在内的用于判断前列腺病变风险试剂盒；该试剂盒使用方便，能够直接收集组织、血液以及其他体液样本进行检测，减少患者的组织活检取样痛苦，并且具有特异性好和灵敏度高的特点，能够用于PSA阳性患者的前列腺疾病风险评估，为后续治疗提供精确指导。

Description

一种用于判断前列腺疾病的标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于判断前列腺疾病的标志物及其应用，属于生物医学与医学诊断领域。

背景技术

前列腺病变普遍存在于中老年男性人群中。而前列腺癌发病率在西方国家位于男性恶性肿瘤第二位，死亡率第五位。近年来，我国前列腺癌发病率呈现逐年上升的趋势。目前普遍认为前列腺癌分为低风险前列腺癌与高风险前列腺癌。良性前列腺癌病变以及低风险前列腺癌患者可在无治疗的情况下存活十余年，而高风险前列腺癌患者应尽快接受治疗。目前前列腺病变的鉴别、前列腺癌的诊断及随访主要采用前列腺特异抗原(ProstateSpecific Antigen，PSA)筛查，然而PSA难以有效地从良性病变以及低风险前列腺癌患者中区分出高风险前列腺癌患者，导致过度前列腺穿刺活检，给患者带来极大痛苦及精神和经济负担。

PSA通常存在于精液中，在前列腺病理条件下，PSA会进入血液，如前列腺炎症、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等。从1991年开始，检测血清中PSA含量用于前列腺病变的诊断以及预测高风险前列腺癌。然而在血清PSA值大于4ng/ml的男性中仅有约三分之一患有高风险前列腺癌；另有报道指出，在4-10ng/ml的区域内，PSA对高风险前列腺癌的检测特异性可低至15％。目前临床对于PSA高于4ng/ml通常建议结果异常的患者进行前列腺活检。然而，这会有严重的后果。产生大量假阳性结果的PSA筛查因缺乏特异性导致全世界每年有数百万男性进行不必要的前列腺活检与手术(过度治疗)。此外，进行活检带来感染性并发症以及促进肿瘤细胞转移的重大风险。因此，在PSA升高所反映的前列腺癌病变中进行高风险前列腺癌的鉴别诊断迫切需要一种特异性更高的诊断试验，以改善前列腺癌筛查并避免大量不必要的过度治疗。

在前列腺病变的过程中，前列腺癌特异性的基因片段以及相关产物也会释放入血。因此对患者外周血中肿瘤细胞特异性标记物基因表达的检测是了解肿瘤进展的一种有效方法。因此，对外周血中微量肿瘤细胞特异基因表达检测的研究，已经引起了人们的广泛关注。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测外周血中肿瘤相关基因片段已被尝试用于临床。RT-PCR技术有着高灵敏度和高特异性的优势，为外周血中肿瘤相关基因片段的检测提供了可能。然而外周血中无论是肿瘤细胞还是肿瘤相关DNA其丰度都十分低下，难以满足RT-PCR技术检测丰度要求。肿瘤相关DNA所转录形成的mRNA具备足够的丰度，并且能够反应肿瘤相关DNA的表达程度，是理想的检测标志物，然而mRNA在外周血中稳定性十分低下，因而难以被检测到。

肿瘤相关DNA表达不但会形成线状结构的mRNA，也会形成具有环状结构的RNA，这些环状RNA因为特殊的结构使得其在外周血的稳定性大大增加。环状RNA表达量同样反应了肿瘤相关DNA表达程度，因此肿瘤相关的环状RNA有望成为优秀的肿瘤检测标志物。

发明内容

通过新一代测序技术，我们发现一种前列腺癌特异环状RNA(Prostate specificcircular RNA，PSC)，并基于此建立了评估PSA阳性患者的前列腺癌风险的方法以及相关诊断试剂盒。PSC用于诊断和预示前列腺癌风险的特异性高于PSA作为标志物。

为了实现前列腺癌的早期诊断和风险评估，本发明的目的之一在于提供用于辨别前列腺病变性质，检测和诊断前列腺癌的标志物。

本发明的目的之二在于提供所述的标志物在制备前列腺癌诊断和风险评估试剂盒中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种用于前列腺癌检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明首先提供了判断前列腺疾病的标志物，为前列腺癌特异环状RNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，本标志物还包括内参照，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明将上述标志物用于判断的所述前列腺疾病包括但不限于前列腺炎症、前列腺增生以及前列腺肿瘤。

进一步地，本发明将上述标志物用作前列腺癌的早期诊断标志物以及用于PSA检测阳性患者的前列腺病变性质判断以及前列腺癌风险评估。。

进一步地，本发明提供了一种用于检测上述标志物的检测试剂，所述前列腺癌特异环状RNA的检测试剂包括SEQ ID NO.3-8和SEQ ID NO.9-14所示的检测引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.15-19所示的任意一类Taqman探针。

进一步地，本发明提供一种用于检测内参照的检测试剂，所述内参照定量检测试剂包括如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的Taqman探针。

进一步地，本发明提供一种前列腺癌特异环状RNA和内参照在制备在制备前列腺癌病变检测试剂盒中的应用。

进一步地，本发明通过包括荧光PCR法，高通量测序法,Northern印迹法以及原位杂交法的方法获得前列腺癌特异环状RNA和内参照在样本中的表达量。所述样本包括但不限于血液、前列腺液、尿液以及组织。

优选地，上述试剂盒包括对照品，所述对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为无前列腺癌特异环状RNA含内参照的总RNA样品，阳性对照为含有前列腺癌特异环状RNA以及内参照的总RNA样品。

优选地，上述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、逆转录反应缓冲液、随机引物、dNTP、DTT、Taq酶以及逆转录酶。

优选地，用于分别扩增前列腺癌特异环状RNA与内参照的PCR扩增反应体系，每10ulPCR扩增反应体系终浓度组成为：前列腺癌特异环状RNA或内参照特异性引物50-200nΜ和用于检测扩增产物的特异性Taqman荧光探针20-100nΜ，2XPCR缓冲液5ul。

优选地，上述试剂盒还包括RNA萃取试剂和萃取装置。

本发明所达到的有益效果：

本发明公开了诊断和预示前列腺癌风险的新标志物，即PSC，其特异性和灵敏度高于使用其中现有PSA；本发明还公开了PSC检测试剂盒，该试剂盒使用方便，能够直接收集血液进行检测，不需要采集组织，减少患者的取样痛苦，并且具有特异性好和灵敏度高的特点，其诊断结果与临床诊断结果一致，为后续治疗提供指导。

附图说明

图1是实施例中的ROC曲线图以及统计检验。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例：

一、试剂盒的组成。

本实施例的环状RNA检测试剂盒，包括用于提取血清RNA的提取试剂与装置、配制反转录反应体系的试剂、用于配制Taqman PCR体系的试剂和对照体系。

1.对照体系：

对照体系的试剂包括阳性对照样品，阴性对照样品。

阳性对照样品为包含人PSC的细胞样本干粉，使用时溶解于RNA保存液中，共1ml。隐形对照样品为不包含人PSC的细胞样本干粉，使用时溶解于RNA保存液中，共1ml。

2.RNA提取体系：

包括RNA提取液A、RNA提取液B、RNA提取液C、RNA洗涤液、RNA溶解液以及RNA吸附柱。上述试剂逐瓶封装，封装的体积是100个样本的用量。

3.逆转录反应体系：

用于配制反转录反应体系的试剂包括dNTP(10nM)、随机引物(10nM)、逆转录酶、5X逆转缓冲液、DTT(100nM)和无核酸酶纯水。试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例配置成反转录反应体系，反转录反应体系为40μl/次，封装的体积是100次的用量，如表1所示。

成分	体积	使用体积
			dNTP	200ul	2ul
随机引物	200ul	2ul
			逆转录酶	100ul	1ul
DTT	400ul	4ul
			5X逆转录缓冲液	800ul	8ul

表1：逆转录体系包含成分以及单次用量

4.Taqman PCR反应体系

用于配制反转录反应体系的试剂包括PSC与内参照Taqman探针(100uM)、2XPCR反应液、PSC与内参照引物混合液(100uM)和无核酸酶纯水。试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例配置成反转录反应体系，Taqman反应体系12μl/次，封装的体积是100次的用量，如表2所示。

成分	体积	使用体积
			Taqman探针	200ul	2ul
引物混合液	200ul	2ul
			2XTaqman反应液	1200ul	6ul

5.高通量测序PCR体系

用于配置高通量测序PCR反应体系的试剂包括PCR测序缓冲液，dNTP(10nM)、MgCl(50nM)₂、DNA聚合酶、I5/I7引物(100nM)。

成分	体积	使用体积
			PCR测序缓冲液	100ul	1ul
dNTP	120ul	1.2ul
			MgCl2	60ul	0.6ul
DNA聚合酶	10ul	0.1ul
			I5/I7引物	200ul	2ul

表2：Taqman PCR反应体系包含成分以及单次用量

二、试剂盒的使用方法。

将1ml患者体液样本或阳/阴性对照品加入15ml离心管，再加入3mlRNA提取液A，充分混匀至白色絮状物均匀分布，室温静置5分钟。

加入0.2mlRNA提取液B，剧烈震荡15-30秒后室温静置3分钟。

全速离心15分钟以上。混合液会分成上层无色上清液，中层白色絮状物以及下层粉红色有机层。

取1.5ml上层无色上清液至新15ml离心管中，加入1.5mlRNA提取液C，通过颠倒均匀混合。

取750ul混合液，加入RNA吸附柱中，12000xG离心1分钟，倒空收集管中的流出液。

重复上述步骤，直至3ml的混合液全部通过RNA吸附柱。

向RNA吸附柱中加入500mlRNA洗涤液，12000xG离心30秒到1分钟，倒空收集管中的流出液。

重复上述步骤。

全速离心1分钟以清除残余RNA洗涤液，倒空收集管中的流出液。

取出RNA吸附柱插入RNA收集管，加入25ul RNA溶解液，室温静置2分钟。

将上述装置全速离心2分钟，收集管中液体即待测样本RNA。

取出22ul待测样本RNA，加入200ul PCR反应管中，再加入2ul随机引物与2uldNTP，65℃加热5分钟。

向上述反应体系中加入4ul DTT、8ul 5X逆转录缓冲液以及2ul逆转录酶。加入后进行逆转录反应，反应条件为25℃ 15分钟，90℃ 45分钟，55℃ 20分钟。反应结束后获得待测样本DNA。

可选方法A:荧光PCR法

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。检测在荧光实时定量PCR仪上进行，总体积为12ul，其中6ul PCR反应液，2ul检测样品(待测样本DNA、阳性对照和阴性对照DNA)，2ul引物(PSC，内参照)，2ul Taqman探针(PSC，内参照)。反应条件为7500-HT定量荧光PCR仪：95℃预变性3分钟，然后40循环(95℃ 25秒，60℃ 1分钟),60℃延伸5分钟后置4'C。

反应结束后，所有扩增曲线应为平滑S形或水平直线。若此时阴性对照CT值高于35，阳性对照CT值低于28则判断整体PCR结果有效。若此时样品内参照基因的CT值低于30则该样品结果有效。若此时待测样品PSC的CT值低于30，则判断为高风险前列腺癌，若待测样品PSC的CT值高于30则判断为低风险前列腺癌或良性病变。

可选方法B：高通量测序法

采用I5/I7Index Primer对纯化产物进行加Index PCR扩增10X反应体系配制：PCR测序缓冲液1ul，dNTP 1.2ul，MgCl2 0.6ul，DNA聚合酶0.1ul，I5/I7引物2ul以及前述患者样本逆转录所获得的DNA 1ul

PCR反应条件设置如下：95℃ 2min；12个循环扩增(95℃ 20秒，60℃ 30秒和72℃1分钟)，在72℃延伸2分钟，4℃保存。

按照2100bioanalyzer标准操作流程对PCR产物进行片段分析，确定产物扩增片段大小。

扩增产物进行上机测序前定量，使用Qubit Spectrophotometer对文库进行精确定量，换算浓度(nM)上机测序，最终扩增产物上样量11pM，按照MiSeq Benchtop Sequencer标准操作流程进行测序，双向测序，两端各产生150bp序列，及两端各8bp的index标签序列。并通过生物信息的分析获得PSC表达量。

三.标本检测

76例静脉血样品(12例低风险前列腺局限癌患者样品，64例高风险前列腺癌患者样品)，以及阳性、阴性参考细胞系按照具体实施步骤提取细胞总RNA并逆转录后，分别用PSC以及内参照的上下游引物在7500HT real-time PCR仪上进行PCR扩增，条件为95℃ 3分钟,40个循环(95℃ 25秒，60℃ 1分钟)，最后在60℃延伸5分钟后置4℃。同测定结果经仪器处理获得CT值。

四.结果分析

根据检测结果绘制受试者工作特征曲线(ROC)，结果表明，如图1所示，PSC曲线下面积为0.816，p值为0.007，表明PSC对于诊断高风险前列腺癌准确性较好。

为用于本申请文中的特定术语提供以下定义。

如本发明所用，“核酸”或者“核酸分子”通常指可以是未经修饰或者修饰的任何核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA)。“核酸”包括但不限于单链和双链核酸。如本发明所用，术语“核酸”还包括如上所述的包括一个或者多个修饰碱基的DNA。因此，具有因稳定性或其他原因经过修饰的主链的DNA是“核酸”。

本发明上下文中的术语“水平”或者“表达水平”指的是生物标志物存在于患者样本中的水平。通常，通过将生物标志物的表达水平与用于标准化的样本中的一个或者几个管家基因进行比较来测量生物标志物的表达水平。如果生物标志物的表达水平超过合适的对照(例如健康的组织)的相同生物标志物的表达水平设定的阈值，则来自患者的样本被认定为前列腺癌高风险。

本发明所用的术语“分析样本中核酸的存在和/或水平”或者“具体估计核酸的水平”涉及用于评估和定量核酸水平的方式和方法。一种有用的方法是，例如，RT-PCR。同样地，也可以通过例如Northern印迹法、高通量测序法、原位杂交法或者包括测量扩增后在260和280nm处吸光度的光谱技术来分析RNA水平。

如本发明所用的术语“扩增”，当其应用于核酸序列时，指的是从一个核酸模板序列产生特定核酸序列的一个或者多个拷贝的过程，优选通过聚合酶链式反应(PCR)的过程。其他的扩增方法包括，但不限于，连接酶链式反应(LCR)、基于特异性多核苷酸的扩增(NSBA)或者本领域公知的任何其他方法。

如本发明所用，关于诊断标志物或者预后标志物使用的术语“判断”将来自病人的样本中标志物的存在或者量与来自一个已知具有某种症状或者存在具有该症状风险的人的样本的标志物的存在或者表达水平相比较。患者样本中标志物的表达水平可以与已知与特定诊断相关的水平进行比较。

如本发明所用，术语“评估”涉及鉴定任何发展阶段的疾病，在本发明中指的是高风险或低风险前列腺癌，并且还包括确定受试者发展该疾病的倾向。

如本发明所用，术语“高风险前列腺癌”“低风险前列腺癌“，是指通过对患者进行组织活检，并对活检样本进行Gleason评分。Gleason评分小于或等于7者称为低风险前列腺癌，高于7者称为高风险前列腺癌。

如本发明所用，术语“荧光染料”或“荧光基团”指的是吸收特定波长的光能并以不同波长重新发光的任何化学物质。适用于标记核酸的荧光染料包括例如:FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPYTMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红、亚基马黄(YakimaYellow)、阿利克夏染料(Alexa Fluor)以及PET等等。

如本发明所用，当术语“分离”用于提及核酸时，其意指天然存在的序列从其所在的正常细胞(例如染色体)环境中去除，或者在非天然环境中合成(例如人工合成)。因此，所述“分离”序列可以在无细胞的溶液中，或者被置于不同的细胞环境中。

如本发明所用，“试剂盒”指的是一个封装的组合；该组合可选择地包括该组合的使用说明和/或使用该组合需要的其他反应物和组件。如果所述试剂盒包括核酸，所述试剂盒还可以包括所述核酸的合成或者非天然突变体。合成的或者非天然的核酸应被理解为包含任何化学、生物化学或者生物学修饰的核酸，这样的核酸并非以此形式出现于自然界中。这些修饰包括但不限于:带有荧光染料或者淬灭剂标记、生物素标签以及核酸骨架的修饰，或者将上述核酸区别于其天然对应物的任何其他修饰。上述说明同样适用于其他天然化合物例如蛋白、脂质等。

本发明所用术语“患者”指的是因为疾病或者怀疑患有疾病而正在接受医疗护理或者应该接受医疗护理的活着的人。这包括正在被调查病理征兆的尚未确定疾病的人。

本发明所用术语“引物”，指的是核酸一一无论其是纯化的限制性消化中自然出现或者以合成方式产生的，当将该核酸置于引物延伸产物合成的条件下，其可以作为合成的起始点；其与一条核酸链互补，并在核苷酸、诱导剂例如DNA聚合酶的存在下，及合适的温度和PH时被诱导。所述引物可以为单链或者双链，其必须足够长以引导所需延伸产物在诱导剂存在下合成。引物的确切长度取决于众多因素:包括温度、引物的来源以及所用方法。优选地，引物的长度为大约15-100个碱基；更优选地为大约20-50个碱基；最优选的为大约20-40个碱基。关于确定引物合适长度的因素对本领域普通技术人员而言是容易获知的。可选择地，上述引物可以是合成的元件，即其包含化学、生物化学或生物学修饰。这些修饰包括但不限于:带有荧光染料或者淬灭剂标记，或者核酸骨架中的修饰，或者将上述引物区别于其天然对应物的任何其他修饰。

术语“探针”指的是任何可用于特异性检测生物实体的元件，例如核酸、蛋白或者脂质。除了可以特异性结合生物实体的部分以外，探针上还包括允许其在试验中被检测到的至少一个修饰。该修饰包括但不限于:标记，例如荧光染料；MGB、QSY、TAMRA等淬灭集团；特别引入的放射性元素；或者生物素标签。所述探针还包括其结构上的修饰，例如锁定的核酸。

本发明所用术语“样本”指的是为了诊断、预后或者评估感兴趣的受试者，例如患者的目的而获得的体液或者组织的样本。优选的测试样本包括血液、血清、血浆、以及活检组织。此外，本领域技术人员能够认识到，一些测试样本将更容易被分析，例如将全血分离成血清或血浆组分。

因此，在本发明一优选实施例中，所述样本选自组，该组包括:血液样本、血清样本、血浆样本或者任何上述样本的提取物，以及血液或者淋巴中的循环肿瘤细胞、任何疑似含有转移的组织以及任何可能包含前列腺癌细胞或者其部分的来源，包括囊泡，例如外来体、微泡等，以及来自前列腺肿瘤细胞的游离的或与蛋白质结合的RNA分子。优选地，所述样本为血液样本，最优选地为血清样本或者血浆样本。组织样本也可以是在手术过程获得的活检标本或组织样本。

本发明所用术语“曲线下面积(AUC)”描述了接收器操作特性(ROC)曲线或者ROC曲线下的面积。AUC涉及生物标志物的特异性和灵敏度。一个完美的标记(AUC＝1.0)在ROC空间的左上角产生一个点或者坐标为(0，1)的点，这表示灵敏度为100％(无假阴性)且特异性为100％(无假阳性)。

术语“p值”涉及当零假设实际为真，即不同组的平均值之间没有差异时获得观察到的样本结果的可能性。p值越小，替代假设相比于比零假设能更好地解释观察结果的可能性越高，即替代假设更可能为真。

有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 杭州西合精准医疗科技有限公司

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<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 20

gtgacccaga ttgaaccttt ctgc 24

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 21

ggaacaccct ggtgcttcca a 21

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 22

cagagcacct cttctgtcag tctccaa 27

Claims (12)

1.用于判断前列腺疾病的标志物，为前列腺癌特异环状RNA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的标志物，其还包括内参照，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1或2所述的标志物，用于判断的所述前列腺疾病包括前列腺癌，前列腺增生，前列腺炎症。

4.如权利要求1或2所述的标志物，其用作前列腺癌的早期诊断标志物以及用于PSA检测阳性患者的前列腺病变性质判断以及前列腺癌风险评估。

5.一种用于检测权利要求1所述的标志物的检测试剂，其特征在于：所述前列腺癌特异环状RNA的检测试剂包括SEQ ID NO.3-8和SEQ ID NO.9-14所示的检测引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.15-19所示的任意一类Taqman探针。

6.一种用于检测权利要求2所述的标志物的检测试剂，其特征在于：所述内参照定量检测试剂包括如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示的Taqman探针。

7.如权利要求1或2所述的标志物在制备前列腺癌病变检测试剂盒中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：通过包括荧光PCR法，高通量测序法,Northern印迹法以及原位杂交法的方法获得如权利要求1或2所述的标志物在样本中的表达量。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括对照品，所述对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为无前列腺癌特异环状RNA含内参照的总RNA样品，阳性对照为含有前列腺癌特异环状RNA以及内参照的总RNA样品。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、逆转录反应缓冲液、随机引物、dNTP、DTT、Taq酶以及逆转录酶。

11.如权利要10所述的应用，其特征在于：用于分别扩增前列腺癌特异环状RNA与内参照的PCR扩增反应体系，每10ulPCR扩增反应体系终浓度组成为：前列腺癌特异环状RNA或内参照特异性引物50-200nΜ和用于检测扩增产物的特异性Taqman荧光探针20-100nΜ，2XPCR缓冲液5ul。

12.如权利要求10所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括RNA萃取试剂和萃取装置。