CN104603292A - 用于提供前列腺癌的临床评估的方法、试剂盒和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于从受试者的生物样品提供前列腺癌临床评估的前列腺癌签名。通过对来自前列腺癌和非前列腺癌受试者的尿样进行首次基因表达研究,并使用PCA3/PSA前列腺癌测试作为性能基准,本发明人出乎意料地发现了多个在基于尿的前列腺癌测试和基于组织的测试中提供信息的签名。所述签名涉及至少两个其在尿中表达模式在本文中被证实与前列腺癌的临床评估相关(正相关或负相关)的前列腺癌标志物的组合。所述前列腺癌标志物可与生物信息学方法结合使用,以产生与前列腺癌的临床评估相关的前列腺癌评分。还描述了与上述签名相关的方法、试剂盒和组合物。
Description
发明领域
本发明涉及前列腺癌。更具体地,本发明涉及用于提供基于来自受试者的生物样品的受试者中前列腺癌的临床评估的方法、试剂盒和组合物。特别地,本发明涉及用于提供前列腺癌的临床评估、包括至少两个前列腺癌标志物的前列腺癌签名。
发明背景
前列腺癌是影响男性的最常见的癌症形式。在美国,每年有超过241,000名男性被诊断为患有前列腺癌,每年有近28,000人死于此疾病。尽管前列腺癌的终生发病风险估计为16%(该疾病致死风险估计为2.9%),尸检显示前列腺癌实际上在大约三分之二的超过80岁的男性中存在。这些结果凸显了在前列腺癌诊断领域中的一个重要问题,其中许多病例未被检测并且在临床上不明显。因此,能特别地识别具有侵袭性局部肿瘤的无症状男性的改进的筛选程序有助于降低前列腺癌发病率和死亡率。
前列腺癌存活与多种因素,特别是诊断时的肿瘤范围相关。由于目前用于前列腺癌诊断的方法的限制,性质上为进行性的前列腺癌可能在检测之前已经转移,而患有转移性前列腺癌的个体的存活率非常低。对于患有会转移而尚未转移的前列腺癌患者,手术去除前列腺通常是有疗效的。因此,确定肿瘤范围对选择最佳治疗和提高患者生存率很重要。
目前,前列腺癌的诊断一般是根据前列腺特异性抗原(PSA)血检结果升高,或者较少见地,根据异常直肠指检(DRE)而做出的。PSA是前列腺上皮细胞生产的糖蛋白,PSA测试测量血样中PSA的量。尽管升高的PSA水平不一定指示前列腺癌的存在,但大部分患有前列腺癌的男性具有升高的PSA浓度(例如高于4ng/mL),并且不存在患有前列腺癌的风险为0的PSA水平。事实上,PSA升高的最常见原因是良性前列腺增生(BPH),前列腺的非癌性增大。
有多个独立于前列腺癌,能暂时升高或降低PSA水平的因素,其中一些足够显著以至于影响PSA血检的诊断性能。例如,细菌性前列腺炎可升高PSA水平,直至6至8周后感染症状消退。射精可提高PSA水平(例如高达0.8ng/mL),直至其在48小时内回到正常。通常通过前列腺活检诊断的无症状前列腺炎也可升高PSA水平。此外,PSA水平趋向于随年龄增加,已建议可通过为老年男性设置较高的正常PSA水平改进PSA血检。另一方面,已经显示药物例如5-α还原酶抑制剂(例如非那雄胺、度他雄胺)降低PSA水平。
由于以上,只有约30%的具有升高的PSA的男性实际患有前列腺癌。上述新诊断的癌症大部分是临床上局部的,这导致根治性前列腺切除术和放疗的增加,它们是意欲治愈此类早期癌症的激进治疗。尽管多中心研究证明了早期前列腺癌诊断/筛查的效用,其中基于PSA的筛查显著降低了前列腺癌特异性死亡率(Schroder等人,Prostate-cancer mortality at 11 years of follow-up,N Engl J Med 2012;366:981-90),这种降低并非没有后果,因为PSA非常高的假阳性率导致高达75%的不必要的前列腺活检的数量。这些不必要的活检造成发病,特别是介入后的感染,造成在活检后的一个月内高达4%的再住院率(Nam等人,Increasing hospital admission rates for urologicalcomplications after transrectal ultrasound guided prostate biopsy,J Urol2010;183:963-8)。这一情况造成了另一个困境:具有升高水平的PSA但具有阴性前列腺活检结果的患者群体每年增加。由于前列腺活检在检测前列腺癌方面不是100%准确—第一次活检可能漏掉多达25%的前列腺癌—这一情况对患者造成了大量焦虑,直到最近,除了进行跟踪活检,对这一困境没有临床解决方案。
在2012年5月22日,美国预防服务工作组(U.S.PreventiveServices Task Force)签发了反对PSA筛查前列腺癌的最终建议,进一步暴露了PSA血检的不足。根据其研究工作的回顾,美国预防服务工作组作出结论,PSA筛查的预期伤害高于可能的益处。该建议基于以下事实。一方面,PSA筛查带来的前列腺癌死亡的降低非常小,因为最多只有1/1000的男性由于筛查避免了前列腺癌造成的死亡。另一方面,大部分由PSA筛查发现的前列腺癌是增殖缓慢、无致命危险的,在患者一生中不会造成任何伤害,并且目前无法确定何种癌症可能威胁人的健康,何种不能。结果,几乎所有患有PSA检测的前列腺癌的男性选择接受治疗,这在一些情况下可能是不必要或不建议的。
确定前列腺癌的精确诊断和预后在选择最适合的治疗中是关键的。所有可能的治疗疗法都具有固有的严重并发症的风险,只有该治疗具有合理的实现显著改善的临床结果,包括例如长期存活和生活质量改善的可能性,此类风险才必要。多种形式的疗法可用于治疗前列腺癌,包括但不限于:手术例如前列腺切除;肿瘤破坏疗法例如冷冻疗法;放疗例如近距放疗;和药物和其他剂疗法例如激素疗法和化疗。与现有诊断和预后方法相比,具有改善的准确性或以其他方式增强的临床评估将为前列腺癌患者提供更好的疗法选择,并产生改善的临床结果。
前列腺癌抗原3(PCA3)是一个非编码RNA,其剪接的同种型对于前列腺组织具有特异性,并且在前列腺癌中高度过表达,但在增生性(BPH)或正常前列腺组织中不过表达。尽管PCA3被广泛认为是优于PSA的前列腺癌标志物,但它目前仅被US FDA(美国食品药品监督管理局)批准作为帮助医生确定在具有先前阴性活检的男性中重复活检需求的工具(US FDA为PCA3测定签发的安全性和有效性数据概要(SSED);http://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf10/P100033b.pdf)。因此,需要比PCA3改进的前列腺癌标志物。
多年以来,以鉴别可超越PCA3用于前列腺癌诊断的性能为目标,评估了许多单分子标志物。这些标志物中的一些通过超甲基化检测检测基因表达丧失(例如GSTP1)、通过表达基因融合物检测遗传转位(例如TMPRSS2和ETS转录因子例如ERG、ETV1或ETV4)或检测其他前列腺癌中过表达的基因(例如GOLPH2或SPINK1)。遗憾的是,上述通过组织分析鉴别的标志物大部分未随后验证为有效或准确的前列腺癌标志物。事实上,上述标志物通常被证明不能用作无创生物样品的靶标。例如,Laxman等人(Cancer Res.,2008,68:645-649)证明先前被证明是组织中前列腺癌的特异性生物标志物的AMACR和TFF3 mRNA在尿样中不是统计上显著的前列腺癌预测物(P分别为0.450和0.189)。无论如何,上述分子标志物均未被验证它们在一定程度上表现优于PCA3,PCA3是至今唯一可在基于尿的测试中可靠地测量的前列腺癌标志物。因此,除了PCA3测定,没有用于用无创临床样品例如尿提供前列腺癌临床评估的可靠的方法。此外,先前的大部分试图鉴别前列腺癌标志物的研究首先集中在组织样品中的基本表达谱分析,而不是尿中的基本表达谱分析。另一个问题是可用于标准化和/或验证前列腺癌标志物检测的有效对照标志物的缺乏。
因此,仍然存在对可提供优秀的男性前列腺癌临床评估,包括但不限于改进的诊断、预后和/或肿瘤分级/分期的改进的前列腺标志物的迫切需求。也仍需要鉴别一个或多个与用于患者样品中前列腺癌临床评估的新前列腺癌标志物联合使用的对照标志物。本发明试图解决现有技术中前列腺癌标志物的至少一些缺陷。
本说明书提及多个文件,其内容在此通过引用整体并入本文。
发明概述
本发明涉及前列腺癌签名,包括至少两个其在尿中表达模式已在本文证实与前列腺癌的临床评估相关(正相关或负相关)的前列腺癌标志物的组合。传统上,前列腺癌标志物是通过对癌性和非癌性前列腺组织样品进行差异表达分析鉴别的。然而,几乎没有用这种方式鉴别的前列腺癌标志物被成功转化为基于尿的前列腺癌测试,可能归因于与尿的使用相关的多个混合因素(例如酸性环境和/或污染背景尿路细胞)。通过对来自前列腺癌和非前列腺癌受试者的尿样进行初始基因表达研究,并使用PCA3/PSA前列腺癌测试作为性能基准,本发明人出乎意料地发现了多个在基于尿的前列腺癌测试和基于组织的测试中极具信息性的前列腺癌签名。更具体地,本发明的前列腺癌标志物可与生物信息学方法(例如机器学习)结合使用,以产生与前列腺癌的临床评估相关的评分。
因此,本发明大体涉及用于提供基于来自受试者的生物样品的受试者中前列腺癌的临床评估的方法、试剂盒和组合物。更具体地,前列腺癌的临床评估可包括基于来自受试者的生物样品的诊断、分级、分期和预后。
在本发明的一方面,从受试者获得生物样品(例如尿、组织或血样),并确定至少两个本发明的前列腺癌签名中的标志物的标准化表达水平。然后对该至少两个前列腺癌标志物的标准化表达水平进行数学关联以获得一个评分,该评分用于提供受试者中前列腺癌的临床评估。
在一个实施方案中,本发明的前列腺癌签名可在提供前列腺癌的临床评估方面优于PCA3(或PCA3/PSA比例)。这在前列腺癌领域显示了显著的进步,因为PCA3到目前为止被广泛认为是最佳前列腺癌标志物。因此,能优于PCA3的前列腺癌签名(特别是在无创样品例如尿的背景下)是高度需要的。在一些情况下,使用不依赖PCA3本身的前列腺癌诊断工具可能是有用的。例如,如果对受试者用基于PCA3的测试进行前列腺癌临床评估,可需要有不依赖PCA3的单独、独立的前列腺癌临床评估。这样,本发明的前列腺癌签名可用于独立地验证基于PCA3的测试结果,反之亦然。因此,在一个具体实施方案中,本发明的前列腺癌签名不包括PCA3。
另一方面,本发明涉及提供受试者中前列腺癌临床评估的方法,所述方法包括:
(a)确定来自所述受试者的生物样品中至少两个表5或6A中列出的前列腺癌标志物或与其在前列腺癌中共调控的标志物的表达;
(b)用一个或多个对照标志物标准化所述至少两个前列腺癌标志物的表达;
(c)对所述至少两个前列腺癌标志物的经标准化的表达水平进行数学关联;
(d)从所述数学关联获得评分;和
(e)根据所述获得的评分提供所述前列腺癌的临床评估。
另一方面,本发明涉及提供受试者中前列腺癌临床评估的方法,所述方法包括:
(a)选择根据其在已知患有或不患前列腺癌的患者群体的尿中表达谱验证的至少两个前列腺癌标志物;
(b)确定所述至少两个前列腺癌标志物在来自所述受试者的生物样品中的表达;
(c)用一个或多个对照标志物标准化所述至少两个前列腺癌标志物的表达;
(d)对所述至少两个前列腺癌标志物的经标准化的表达进行数学关联;
(e)从所述数学关联获得评分;和
(f)根据所述获得的评分提供所述前列腺癌的临床评估。
另一方面,本发明涉及一种前列腺癌诊断组合物,包括:
(a)来自患有或怀疑患有前列腺癌的受试者的尿或其具有前列腺源标志物的级分;和
(b)允许检测和/或扩增至少两个表5或6A中列出的前列腺癌标志物或与其共调控的标志物的试剂。
另一方面,本发明涉及用于从来自受试者的生物样品提供受试者中前列腺癌临床评估的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)允许检测和/或扩增至少两个表5或6A中列出的前列腺癌标志物或与其共调控的标志物的试剂;和
(b)适当的容器。
在具体实施方案中,上述至少两个前列腺癌标志物是至少三个前列腺癌标志物;至少四个前列腺癌标志物;至少五个前列腺癌标志物;至少六个前列腺癌标志物;至少七个前列腺癌标志物;至少八个前列腺癌标志物或至少九个前列腺癌标志物。
在另一个实施方案中,上述至少两个前列腺癌标志物选自:
(1)CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(2)ERG或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(3)HOXC4或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(4)ERG-SNAI2前列腺癌标志物对;
(5)ERG-RPL22L1前列腺癌标志物对;
(6)KRT 15或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(7)LAMB3或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(8)HOXC6或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(9)TAGLN或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(10)TDRD1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(11)SDK1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(12)EFNA5或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(13)SRD5A2或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(14)maxERG CACNA1D前列腺癌标志物对;
(15)TRIM29或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(16)OR51E1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;和
(17)HOXC6或与其在前列腺癌中共调控的标志物。
在另一个实施方案中,上述至少两个前列腺癌标志物包括CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物。在另一个实施方案中,上述至少两个前列腺癌标志物包括CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物,以及ERG或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物。在另一个实施方案中,上述至少两个前列腺癌标志物按表7-9定义的分类器组合。
在另一个实施方案中,上述与其在前列腺癌中共调控的标志物中的一个或多个如表6B中所定义。
在另一个实施方案中,上述一个或多个对照标志物包括内源参比基因。在另一个实施方案中,上述一个或多个对照标志物还包括至少一个前列腺特异性对照标志物。在另一个实施方案中,上述一个或多个对照标志物如表2、表7A和/或表7B中所定义。在另一个实施方案中,上述前列腺特异性对照标志物包括KLK3、FOLH1、FOLH1B、PCGEM1、PMEPA1、OR51E1、OR51E2和PSCA中的一个或多个。在另一个实施方案中,上述对照标志物包括KLK3、IPO8和POLR2A。在另一个实施方案中,上述一个或多个对照标志物包括IPO8、POLR2A、GUSB、TBP和KLK3。在另一个实施方案中,上述对照标志物包括至少一个上述前列腺特异性对照标志物和IPO8和POLR2A。在另一个实施方案中,上述对照标志物包括至少一个上述前列腺特异性对照标志物以及IPO8、POLR2A、GUSB和TBP。
在另一个实施方案中,上述前列腺癌临床评估包括:(i)前列腺癌的诊断;(ii)前列腺癌的预后;(iii)前列腺癌的分期评估(iv)前列腺癌侵袭性分类;(v)治疗有效性评估;(vi)前列腺活检必要性评估;或(vii)(i)至(vi)的任意组合。
在另一个实施方案中,上述标志物是基因。在另一个实施方案中,上述标志物是蛋白。
在另一个实施方案中,上述确定所述至少两个前列腺癌标志物的表达包括确定RNA表达和/或蛋白表达。在另一个实施方案中,上述确定RNA表达包括进行杂交和/或扩增反应。在另一个实施方案中,上述杂交和/或扩增反应包括:(a)聚合酶链式反应(PCR);(b)基于核酸序列的扩增测定(NASBA);(c)转录介导的扩增(TMA);(d)连接酶链式反应(LCR);或(e)链取代扩增(SDA)。
在另一个实施方案中,上述确定RNA表达包括至少两个前列腺癌标志物的直接测序。
在另一个实施方案中,上述生物样品是尿、前列腺组织切除物、前列腺组织活检样品、精液或膀胱洗液。在另一个实施方案中,上述生物样品是全尿或粗尿。在另一个实施方案中,上述生物样品是尿级分例如尿上清液或尿细胞沉淀(例如尿沉淀物)。在另一个实施方案中,上述尿在有或没有在先的直肠指检下而获得。
在另一个实施方案中,上述进行的数学关联可以是线性和二次判别式分析(LDA和QDA)、支持向量机(SVM)、朴素贝叶斯(Bayes)或随机森林(Random Forest)的任何一个。在一个具体实施方案中,用于产生将至少两个前列腺癌标志物表达水平与前列腺癌临床评估相关的评分的统计方法是朴素贝叶斯。
在阅读下文的仅参考附图作为实施例给出的其示例性实施方案的非限制性描述之后,本发明的其他目标、优点和特征将更明显。
附图简述
在附图中:
图1显示对照标志物在患有或不患前列腺癌的受试者之间的平均表达稳定性值。
图2A显示用于在患有或不患前列腺癌的受试者之间标准化的对照标志物的最佳数量的确定。
图2B显示选择的对照标志物在来自正常个体(n=152)和前列腺癌受试者(n=109)的261份全尿样品中mRNA表达水平值(Ct)的分布。
图2C显示与男性泌尿生殖道中其他肿瘤和非肿瘤组织相比,前列腺组织样品(正常和肿瘤)中PCA3和五(5)个前列腺特异性标志物标准化的基因表达水平。
图3显示根据AUC作为标准化技术函数排序来自表1的候选基因(Exo:使用外源对照的表达水平(Ct);平均Endo:使用来自表2的5个对照标志物(HPRT1、IPO8、POLR2A、TBP和GUSB)的平均Ct;PSA:使用PSA(KLK3)的Ct;Exo+PSA:使用PSA的Ct和外源对照的Ct)。
图4(A-F)代表了使用表7A中列出的每个分类器的前列腺癌标志物和对照标志物的表达水平(Ct)对安排进行前列腺活检的来自受试者的261个全尿样品的ROC曲线分析。
图5显示分类器1的前列腺癌标志物改变的基因表达、其在前列腺癌中的相互作用网络和对无疾病存活的效果。A)150个原发性和转移性前列腺癌病例中改变的RNA表达总数的OncoPrintTM。B)分类1的前列腺癌标志物(用粗边缘表示)与被报道属于共同途径的基因的邻近网络的图表视图。C)具有改变与未改变的基因表达值的前列腺癌患者的存活分析(Z值≥1.25)。对数秩p值<0.05视作统计学上显著的。
图6显示分类器3的前列腺癌标志物改变的基因表达、其在前列腺癌中的相互作用网络和对无疾病存活的效果。A)150个原发性和转移性前列腺癌病例中改变的RNA表达总数的OncoPrintTM。B)分类器3的前列腺癌标志物(用粗边缘表示)与被报道属于共同途径的基因的邻近网络的图表视图。C)具有改变与未改变的基因表达值的前列腺癌患者的存活分析(Z值≥3.5)。对数秩p值<0.05视作统计学上显著的。
图7显示分类器4的前列腺癌标志物改变的基因表达、其在前列腺癌中的相互作用网络和对无疾病存活的效果。A)150个原发性和转移性前列腺癌病例中改变的RNA表达总数的OncoPrintTM。B)分类器4的前列腺癌标志物(用粗边缘表示)与被报道属于共同途径的基因的邻近网络的图表视图。C)具有改变与未改变的基因表达值的前列腺癌患者的存活分析(Z值≥3.5)。对数秩p值<0.05视作统计学上显著的。
图8显示分类器5的前列腺癌标志物改变的基因表达、其在前列腺癌中的相互作用网络和对无疾病存活的效果。A)150个原发性和转移性前列腺癌病例中改变的RNA表达总数的OncoPrintTM。B)分类器5的前列腺癌标志物(用粗边缘表示)与被报道属于共同途径的基因的邻近网络的图表视图。C)具有改变与未改变的基因表达值的前列腺癌患者的存活分析(Z值≥3.5)。对数秩p值<0.05视作统计学上显著的。
图9显示分类器6的前列腺癌标志物改变的基因表达、其在前列腺癌中的相互作用网络和对无疾病存活的效果。A)150个原发性和转移性前列腺癌病例中改变的RNA表达总数的OncoPrintTM。B)分类器6的前列腺癌标志物(用粗边缘表示)与被报道属于共同途径的基因的邻近网络的图表视图。C)具有改变与未改变的基因表达值的前列腺癌患者的存活分析(Z值≥3.75)。对数秩p值<0.05视作统计学上显著的。
图10显示A)训练组(n=174;101N/73T)、B验证组(n=87;51N/36T)、C)总队列(n=261;152N/109T)和D)具有高Gleason评分(≥7)的癌症患者亚组(n=204;152N/52T)的用5个对照标志物标准化的分类器3以及PCA3/PSA比例的ROC曲线比较。
图11显示A)总队列(n=261;152N/109T)和B)第一次前列腺活检前的患者组(n=220;122N/98T)的用5个对照标志物标准化的分类器3的每五分位分层性能分析。在总队列中(图11A),当考虑多基因评分低于0.4的所有患者(组1和组2)时,只有17.3%的具有阳性活检男性未被分类器3检测到,其转化为对于评分高于0.4的男性组,阴性预测值(NPV)为82.7%,阳性活检风险高6.59倍(p<0.0001)。在第一次前列腺活检前的患者组中(图11B),当考虑多基因评分低于0.4的所有患者(组1和组2)时,只有22.4%的具有阳性活检男性未被分类器3检测到,其被转化为对于评分高于0.4的男性组,阴性预测值(NPV)为77.6%,阳性活检风险高6.56倍(p<0.0001)。
图12显示A)总队列(n=261;152N/109T)和B)具有高Gleason评分(≥7)的癌症患者亚组(n=204;152N/52T)的PCA3/PSA比例、分类器3和分类器3加PCA3的ROC曲线比较。在总队列(图12A)和具有高Gleason评分(≥7)的亚组(图12B)中,单独分类器与包括PCA3标志物的分类器的面积之间的差异不是统计学上显著的(p分别为0.3040和0.4224)。
图13显示总队列(n=261;152N/109T)的分类器3与PCA3结合的每五分位分层性能分析。对于分类器3,有或没有PCA3标志物,我们观察到了等同的灵敏性、特异性和阴性预测值(NPV)。唯一的差别是在评分>0.8的男性组中较高的具有阳性活检的男性比例。
示例性实施方案的描述
定义
在本说明书中,广泛使用了多个术语。为提供对说明书和权利要求书(包括此类术语将被赋予的范围)的清楚和一致的理解,提供了以下定义。
在权利要求书和/或说明书中与术语“包括”结合使用的词汇“一(a)”或“一(an)”可表示“一个”但也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”相一致。
如本说明书和权利要求书所用,词汇“包括”(以及包括的任何形式,例如“包括”和“包括”)、“具有”(以及具有的任何形式,例如“具有”和“具有”)、“包含”(以及包含的任何形式,例如“包含”和“包含”)或“含有”(以及含有的任何形式,例如“含有”和“含有”)是包括性的或开放型的,并且不排除额外的未提及的要素或方法步骤。
在本申请中,术语“约”用于表示数值包括用于确定该数值的设备或方法的误差的标准偏差。通常,术语“约”意欲指定高达10%的可能的差异。因此,术语“约”包括一个值的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%的差异。
如通常理解和本文中所用的“分离的核酸”指核苷酸的聚合物,包括但不限于DNA和RNA。“分离的”核酸分子从其天然体内状态纯化、通过克隆获得或化学合成。核酸序列在本文中以单链按5'至3'的方向从左到右使用本领域常用并符合IUPAC IUB生物化学命名委员会推荐的单字母核苷酸符号表示。
如本文所用,“基因”意欲广泛地包括任何转录为RNA分子的核酸序列,无论该RNA是编码的(例如mRNA)还是非编码的(例如ncRNA)。本文涉及多个基因/蛋白名称和/或登录号。根据该基因/蛋白名称和/或登录号,本领域任何普通技术人员可容易地从多个公众可用的基因数据库获得相应的序列信息。此外,尽管某些基因/蛋白名称用于指本发明的具体标志物,本领域技术人员将理解,也可使用与同样的标志物(即,基因和蛋白)相关的其他名称/命名。
如本文所用,术语“标志物”(单独使用或与其他定性术语组合例如前列腺癌标志物、前列腺特异性标志物、对照标志物、外源标志物、内源标志物等)指可测量、可计算或可以其他方式获得的,与任何分子或分子组合相关,可用作生物和/或化学状态的指示物的参数。在一个实施方案中,“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因,以及编码和非编码DNA和RNA)和蛋白(例如肽、多肽)。在另一个实施方案中,“标志物”指可通过考虑来自两个或多个不同标志物(例如其在前列腺癌的背景中被共调控,被共同视作如本文定义的“标志物对”)的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。如下讨论的,根据探索的指标的类型,标志物可进一步分类为具体的组。本领域技术人员将理解,这些组可以是但不一定是相互排斥的。例如,前列腺癌标志物也可以是前列腺特异性标志物,其中区分癌症的方面是该标志物的表达水平。
如本文所用,“靶标”指根据本发明的方法,被靶标用于检测、扩增和/或杂交的标志物的具体子区域(例如在RNA标志物的情况下外显子-外显子连接处,或者在蛋白标志物的情况下具体表位)。
“前列腺癌标志物”指根据本发明的方法,可用作(单独或与其他标志物组合)受试者中前列腺癌指示物的特定类型的标志物。在一个具体实施方案中,前列腺癌标志物包括可用于提供(单独或与其他标志物组合)受试者中前列腺癌临床评估的标志物。在某些实施方案中,本发明的前列腺癌标志物包括表5或表6A中列出的标志物及根据本发明与其共调控的标志物(如表6B中所示)。尽管在本申请的某些章节说明了具体的登录号,但是涵盖与同样的靶标相关的其他登录号。
“前列腺特异性标志物”指可用作(单独或与其他标志物组合)样品中前列腺细胞(癌性或非癌性)或来自其的标志物存在或不存在的指示物的具体类型的标志物。此类标志物可帮助区分前列腺细胞和非前列腺细胞,或帮助评估样品中存在的前列腺细胞的量。在一些实施方案中,该前列腺特异性标志物可以是正常存在于前列腺细胞中,正常不存在于可能“污染”待分析的具体样品的其他组织中的分子。事实上,只在一个器官或组织中表达的标志物非常少见。因此,只要此标志物的非前列腺表达发生在通常不存在于待分析的具体样品(例如尿)中的细胞或组织/器官中,该前列腺特异性标志物也在非前列腺组织中表达不应破坏该标志物的特异性。例如,如果尿是待分析样品,该前列腺特异性标志物不应正常表达于预期存在于尿样中的其他类型的细胞(例如来自尿道系统的细胞)中。类似地,如果使用另一类型的样品(例如精子),该前列腺特异性标志物不应正常表达于预期存在于尿样中的其他类型的细胞中。在一个实施方案中,前列腺特异性标志物可用作对照标志物(即前列腺特异性对照标志物),例如用于确保样品含有足够量的前列腺细胞(例如,为了验证阴性结果)。
“内源标志物”指源自与待分析样品相同的受试者的标志物(例如核酸或多肽)。更具体地,“内源对照标志物”指可用作对照标志物(单独或与其他对照标志物组合),与待分析样品源自相同受试者的标志物。在一个实施方案中,内源对照标志物可包括一个或多个内源基因(即“对照基因”或“参比基因”),其表达相对稳定,例如在前列腺癌与非前列腺癌样品中,和/或在受试者之间。
“外源标志物”指源自与待分析样品不同的受试者的标志物(例如核酸或多肽)。更具体地,“外源对照标志物”指可用作对照标志物(单独或与其他对照标志物组合),未源自与待分析样品相同的受试者的标志物。例如,外源性对照标志物可用于对照方法本身的步骤(例如样品中存在的细胞量/起始材料、细胞提取、捕获、杂交/扩增/检测反应、其组合或可被监测以阳性地验证信号的缺失不是一个或多个步骤的缺陷的结果的任何步骤)。在一个实施方案中,该外源标志物或外源对照标志物看从不同的受试者分离,或可合成地生产,可添加至待分析的样品。在另一个实施方案中,该外源对照标志物可以是添加或加标至待分析样品中用作内部阳性或阴性对照物的分子。外源对照标志物可与一个或多个前列腺癌标志物的检测共同使用以区分“真阴性”结果(例如非前列腺癌诊断)和“假阴性”或“不提供信息的”结果(例如由于扩增反应的问题)。
“对照标志物”或“参比标志物”指用于(单独或与其他对照标志物组合)对照可能的干扰因素和/或提供关于样品质量、有效样品制备和/或适当的反应组合/进行(例如RT-PCR反应)的一个或更多指标的具体类型的标志物。在一些实施方案中,对照标志物可以是如本文中所述的内源对照标志物、外源对照标志物和/或前列腺特异性对照标志物。对照标志物可与本发明的前列腺癌标志物共检测或分别检测。对照标志物可以是一个或多个内源基因,例如管家基因或前列腺特异性对照标志物或基因的组合。
在一些实施方案中,单个标志物(例如RNA)可单独检测。在其他实施方案中,可在单个扩增反应中使用多个引物组和探针以产生特异于不同标志物的具有不同大小的扩增子。在另一个实施方案中,检测和测量至少两个本发明的前列腺癌标志物。扩增子通常具有至少50个核苷酸至超过200个核苷酸的长度。然而,也可产生1000至2000个核苷酸之间的扩增子,或多达10kb或更多的扩增子。如本领域所熟知,本发明所属领域的技术人员可改变该扩增反应,以允许更高效地产生选定大小的扩增子。
除了单独考虑本发明的标志物,在一些实施方案中,通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据以获得新的参数,该参数本身可作为新的标志物,可提高诊断或预后性能。如果考虑来自两个不同标志物的表达数据,在本文中称为“标志物对”(或者如果该标志物是生物分子,称为“生物标志物对”)。更具体地,“前列腺癌标志物对”指通过考虑来自两个前列腺癌标志物的表达数据获得,以改进本发明的方法的性能(例如诊断/预后性能)的单个参数。在一个实施方案中,该单个参数可通过考虑两个不同前列腺癌标志物的标准化表达值(例如ΔCt),确定该标志物中哪个最过表达,并选择该最过表达的标志物的标准化表达值获得。为简便,此类前列腺癌标志物对在本文中通过在考虑的两个前列腺癌标志物前插入术语“max”表示(例如“maxERGCACNA1D”)。在另一个实施方案中,该单个参数可通过计算被测量的数据组中最上调的标志物和最下调的标志物的标准化表达值(例如ΔCt)之间的差异获得。为简便,此类前列腺癌标志物对在本文中通过在考虑的两个前列腺癌标志物的名称之间插入“-”表示。例如,在标志物对“ERG-SNAI2”中,该单个参数是通过从队列中最上调的基因ERG的表达值中减去队列中最下调的基因SNAI2的表达值获得的。
如本文中所用,术语“分类器”或“前列腺癌分类器”包括本发明的前列腺癌标志物的子集或全体(优选地组合使用),其允许根据源自有或没有前列腺癌的受试者将生物样品分类(例如表7-9中各自所列的分类器(“类别1-6”))。在一个实施方案中,包括于该分类器的前列腺癌标志物可在进行数学关联以产生与前列腺癌临床评估相关的评分前用一个或多个对照标志物(例如前列腺特异性对照标志物、内源对照标志物等)标准化或验证。在一个具体实施方案中,该分类器可包括用于提供数学关联的方法(例如统计方法或可“训练”的机器学习算法),以及该临床评估评分。
如本文所用,“前列腺癌签名”包括本发明的一个分类器的前列腺标志物以及一个或多个对照标志物。在一个实施方案中,每个本发明的前列腺癌标志物和对照标志物的具体组合(例如表7-9各自列出的18个签名)代表不同的前列腺癌签名。如果本发明的前列腺癌签名中的一个或多个前列腺癌标志物涉及基因表达值,该前列腺癌签名在本文中可称为“多基因签名”或“多基因前列腺癌签名”。
“杂交”或“核酸杂交”或“杂交”通常指两个具有互补碱基序列,在适当条件下将形成热力学上稳定的双链结构的单链核酸分子的杂交。如本文所用的术语“杂交”可指在严格或非严格条件下的杂交。条件的设置在本领域技术人员的技术范围内,可根据本领域中说明的实验方案确定。术语“杂交序列”优选地指显示至少40%,优选地至少50%,更优选地至少60%,更优选地至少70%,特别优选地至少80%,更特别优选地至少90%,更特别优选地至少95%,和最优选地至少97%同一性的序列同一性的序列。杂交条件的实例在上述两个实验手册中(Sambrook等人,2000,同上和Ausubel等人,1994,同上,或者进一步在Higgins和Hames(编辑)"Nucleic acid hybridization,a practicalapproach"IRL Press Oxford,Washington DC,(1985)中)给出,且在本领域中众所周知。在杂交到硝化纤维素滤器(或其他此类支撑物例如尼龙)的情况下,例如众所周知的Southern印迹过程,硝化纤维素滤器可在代表所需严格度条件(高严格度60-65℃,中等严格度50-60℃,低严格度40-45℃)的温度下用溶于含高盐(6×SSC或5×SSPE)、5×Denhardt溶液、0.5%SDS和100μg/ml变性载体DNA(例如鲑鱼精子DNA)温育过夜的溶液中的经标记的探针。非特异性结合的探针可通过在0.2×SSC/0.1%SDS中在根据所需严格度选择的温度:室温(低严格度)、42℃(中严格度)或65℃(高严格度)下洗涤数次从滤器上洗脱。也可调整洗涤溶液的盐和SDS浓度以适应所需严格度。所选的温度和盐浓度基于DNA杂交物的熔化温度(Tm)。当然,RNA-DNA杂交物也可形成并被检测。在此类情况下,杂交和洗涤的条件可由本领域技术人员根据众所周知的方法改变。优选地使用严格条件(Sambrook等人,2000,同上)。如本领域所熟知,也可使用利用了不同退火和洗涤溶液的其他实验方案或市售可得的杂交试剂盒(例如来自BD Biosciences Clonetech的ExpressHybTM)。众所周知,探针的长度和要确定的核酸的组成决定杂交条件的其他参数。值得注意的是,通过用于抑制杂交实验中背景的备选封闭试剂的加入和/或取代可实现上述条件的变型。常见的封闭试剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑鱼精子DNA和市售可得的专有制剂。由于相容性问题,加入具体封闭试剂可能需要修改上述杂交条件。杂交核酸分子也包括上述分子的片段。此外,与上述核酸分子的任何一个杂交的核酸分子也包括这些分子的互补片段、衍生物和等位基因变体。此外,杂交复合物指两个核酸序列之间依靠互补的G和C碱基之间和互补的A和T碱基之间形成氢键的复合物;这些氢键可通过碱基堆叠相互作用进一步稳定。两个互补核酸序列以反向平行的构型形成氢键。杂交复合物可在溶液(例如Cot或Rot分析)中,或在一个存在于溶液中的核酸序列和另一个固定于固体支撑物(例如,已经例如固定了细胞的膜、滤器、芯片、针脚或载玻片)上的核酸序列之间形成。
术语“互补的”或“互补”指多核苷酸在容许的盐和温度条件下通过碱基配对天然结合。例如,序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。两个单链分子之间的互补可以是“部分的”,其中只有某些核苷酸结合,或者如果两个单链分子之间存在完全互补,互补可以是完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度有显著的影响。这在依赖核酸链之间结合的扩增反应中特别重要。所谓“充分地互补”表示能与另一序列通过在一系列互补碱基之间形成氢键而杂交的连续的核酸序列。互补碱基序列可通过使用标准碱基配对(例如G:C、A:T或A:U配对)在序列中的每个位点互补,或可含一个或多个不使用标准碱基配对互补,但允许整个序列与另一碱基序列在适当杂交条件下特异性杂交的残基(包括非碱性残基)。寡聚体的连续碱基优选地与该寡聚体特异性杂交的序列至少约80%(81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%),更优选地至少约90%互补。
在两个或更多核酸或氨基酸序列的上下文中,如本文所用的术语“同一的”或“百分比同一性”指在比较窗口上最大相符比较或比对,或在指定的区域用本领域已知的序列比较算法测量,或通过人工比对和视觉检查时,相同或具有指定的百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(例如60%或65%同一性,优选地70-95%同一性,更优选地至少95%同一性)的两个或多个序列或子序列。具有例如60%至95%或更高的序列同一性的序列被认为是基本同一的。此定义也适用于测试序列的补体。优选地,所述同一性在至少约15至25氨基酸或核苷酸长的区域上,更优选地在约50至100氨基酸或核苷酸长的区域上存在。本领域技术人员知悉如何使用例如算法,例如如本领域已知的基于CLUSTALW计算机程序((Thompson Nucl.Acids Res.2(1994),4673-4680)或FASTDB(Brutlag Comp.App.Biosci.6(1990),237-245)的算法确定序列间的百分比同一性。尽管FASTDB算法在其计算中通常不考虑序列中的内部不匹配缺失或增加,即缺口,可人工修正以避免同一性%的过高估计。然而,CLUSTALW在其同一性计算中考虑缺口。本领域技术人员也可获得BLAST和BLAST 2.0算法(AltschulNucl.Acids Res.25(1977),3389-3402)。用于核酸序列的BLASTN程序默认字长(W)为11,期望(E)为10,M=5,N=4,并比较两条链。对于氨基酸序列,BLASTP程序默认字长(W)为3,期望(E)为10。BLOSUM62评分矩阵(Henikoff Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89,(1989),10915)使用比对(B)为50,期望(E)为10,M=5,N=4,并比较两条链。此外,本发明也涉及其序列与上述杂交分子相比简并的核酸分子。根据本发明使用的术语“由于遗传密码简并”表示由于遗传密码的冗余,不同的核苷酸序列编码相同的氨基酸。本发明也涉及包括一个或多个突变或缺失的核酸分子,以及与本文说明的显示突变或缺失的核酸分子杂交的核酸分子。
“探针”意欲包括在促进杂交的条件下与核酸或其补体中的靶标序列特异性杂交,从而允许检测靶标序列或其扩增的核酸的核酸寡聚体或适体。检测可以是直接(即由直接与靶标或扩增的序列杂交的探针产生)或间接(即由与连接探针和靶标或扩增的序列的中间分子结构杂交的探针产生)的。探针的“靶标”通常指扩增的核酸序列中与至少部分探针序列通过标准氢键或“碱基配对”特异性杂交的序列。“充分地互补”的序列允许探针序列与靶标序列稳定杂交,即使该两个序列不完全互补。探针可被标记或不标记。探针可通过具体DNA序列的分子克隆生产,也可被合成。本发明所属领域的技术人员可容易地确定可在本发明的背景下设计和使用的多种引物和探针。
基因表达谱分析的方法包括基于寡核苷酸杂交分析的方法、基于多核苷酸测序的方法和确定该寡核苷酸的蛋白水平的蛋白组学方法。本领域已知的定量样品中RNA表达的示例性方法包括但不限于Southern印迹、Northern印迹、微阵列、聚合酶链式反应(PCR)、NASBA和TMA。
核酸序列可通过使用与互补序列(例如寡核苷酸探针)的杂交检测(参见美国专利号5,503,980(Cantor)、5,202,231(Drmanac等人)、5,149,625(Church等人)、5,112,736(Caldwell等人)、5,068,176(Vijg等人)和5,002,867(Macevicz))。杂交检测方法可使用探针阵列(例如在DNA芯片上)以提供关于在一个碱基不同的一组四个相关探针中选择性杂交于精确地互补的探针序列的靶标核酸的序列信息(参见美国专利号5,837,832和5,861,242(Chee等人))。
检测步骤可使用任何已知方法通过与探针寡核苷酸杂交检测核酸的存在。检测步骤的一个具体实例使用均质检测方法,例如先前在Arnold等人,Clinical Chemistry 35:1588-1594(1989)和美国专利号5,658,737(Nelson等人)和5,118,801和5,312,728(Lizardi等人)中详细说明的。
可使用探针的检测方法的类型包括Southern印迹(DNA检测)、点或槽印迹(DNA、RNA)和Northern印迹(RNA检测)。经标记的蛋白也可用于检测其结合的特定核酸分子(例如用far western技术检测蛋白:Guichet等人,1997,Nature 385(6616):548-552;和Schwartz等人,2001,EMBO 20(3):510-519)。其他检测方法包括含有在试纸(dipstick)装置上的本发明的试剂的试剂盒等。当然,优选地使用适于自动化的检测方法。其非限制性实例包括包括一个或多个(例如阵列)不同的探针的芯片或其他支撑物。
“标记”指可被检测或导致可检测信号的分子部分或化合物。标记可直接或间接地与探针/引物或待检测的核酸(例如扩增的序列)结合。直接标记可通过连接该标记和该核酸的键或相互作用(例如共价键或非共价键)进行,而间接标记可通过使用直接或间接标记的“接头”或连接部分,例如额外的寡核苷酸进行。连接部分可放大可检测信号。标记可包括任何可检测部分(例如放射性核素、配体例如生物素或亲和素、酶或酶底物、反应基团、发色团例如染料或有色分子、发光化合物包括生物发光、磷光或化学发光化合物和荧光化合物)。优选地,经标记的探针上的标记在均质测定系统中可检测,即在混合物中,结合的标记与未结合的标记相比,表现可检测的改变。已知其他标记核酸的方法,其中标记作为其片段附着在核酸链上,可用于标记待通过与固定化的DNA探针阵列杂交检测的核酸(例如参见PCT No.PCT/IB99/02073)。
如本文所用,“寡聚核苷酸”或“寡核苷酸”定义具有两个或多个核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的分子。寡核苷酸的大小将由具体条件决定,最终根据其具体用途,由本领域技术人员相应地改变。寡核苷酸可化学地合成或根据众所周知的方法通过克隆获得。尽管它们通常为单链的形式,它们可以是双链形式,甚至包括“调控区”。它们可含有天然或合成核苷酸。它们可被设计以增强选定的标准,例如稳定性。脱氧核苷酸和核糖核苷酸的嵌合物也在本发明的范围内。
术语“微阵列”指附着于固体支撑物的可杂交分子(例如寡核苷酸或多肽)的有序排列。使用微阵列技术作为基因表达谱分析工具的主要目的是同时研究某些处理、疾病和发育阶段对数以千计的基因的表达水平的影响。例如,基于微阵列的基因表达谱分析可用于识别其表达与正常个体相比在肿瘤样品中上调或下调的基因。
“固定化探针”或“固定化核酸”指与固体支撑物的捕获寡聚体直接或间接结合的核酸。固定化探针是与固体支撑物结合,促进样品中结合的靶标序列与未结合的材料分离的寡聚体。可使用任何已知的固体支撑物,例如用任何已知材料(例如硝化纤维素、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯硅烷和金属颗粒,优选地顺磁性颗粒)制成的基质或溶液中游离的颗粒。优选的支撑物是单分散顺磁性球(即大小均一,±约5%),从而提供一致的结果,固定化探针稳定地直接(例如通过直接共价连接、螯合或离子相互作用)或间接(例如通过一个或多个接头)地与其结合,允许与溶液中的另一核酸杂交。
“互补DNA(cDNA)”指通过逆转录RNA(例如mRNA)合成的重组核酸分子。
“扩增”或“扩增反应”指任何用于获得靶标核酸序列或其补体或者其片段的多个拷贝(“扩增子”)的体外过程。体外扩增指可含有少于完整靶标区序列或其补体的扩增的核酸的生产。体外扩增方法包括例如转录介导的扩增、复制酶介导的扩增、聚合酶链式反应(PCR)扩增、连接酶链式反应(LCR)扩增和链取代扩增(SDA,包括多链取代扩增方法(MSDA))。复制酶介导的扩增使用自身复制性RNA分子和复制酶例如Qβ-复制酶(例如Kramer等人,美国专利号4,786,600)。PCR扩增众所周知,使用DNA聚合酶、引物和热循环合成DNA或cDNA的两条互补链的多个拷贝(例如Mullis等人,美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159)。LCR扩增使用至少4个单独的寡核苷酸通过使用多个杂交、连接和变性的循环扩增靶标及其互补链(例如EP专利申请公开号0 320 308)。SDA是其中引物含有限制性内切酶的识别位点,允许限制性内切酶切割半修饰的DNA双链的一条包括靶标序列的链,然后在多个引物延伸和链取代步骤中扩增的方法(例如Walker等人,美国专利号5,422,252)。其他两个已知的链取代扩增方法不需要内切酶切割(Dattagupta等人,美国专利号6,087,133和美国专利号6,124,120(MSDA))。本领域技术人员将理解,本发明的寡核苷酸引物序列可容易地用于任何基于由聚合酶引起的引物延伸的体外扩增方法(总体上参见Kwoh等人,1990,Am.Biotechnol.Lab.8:14 25和(Kwoh等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1173 1177;Lizardi等人,1988,BioTechnology 6:1197 1202;Malek等人,1994,MethodsMol.Biol.,28:253 260和Sambrook等人,2000,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,第三版,CSH Laboratories)。如本领域众所周知,寡核苷酸被设计以在选择的条件下结合互补序列。
如本文所用,“引物”定义能与靶标序列退火,从而产生可在适当条件下作为核酸合成起点的双链区的寡核苷酸。引物可被例如设计为特异于某个等位基因以便用于等位基因特异性扩增系统。例如,引物可被设计以便于与差异表达的与前列腺的恶性肿瘤状态相关的RNA互补,而来自同一基因的另一差异表达的RNA与其非恶性肿瘤状态(良性)相关。引物的5'区可与靶标氨基酸序列不互补并包括额外的碱基,例如启动子序列(称为“启动子引物”)。本领域技术人员将认识到,任何可起到引物功能的寡聚体可被修饰为包括5'启动子序列,因而起到启动子引物的功能。类似地,任何启动子引物可独立于其功能启动子序列起到引物的作用。当然,从已知核酸序列设计引物是本领域众所周知的。寡核苷酸可包括多种类型的不同核苷酸。本领域技术人员可通过使用众所周知的数据库(例如GenbankTM)进行计算机比对/搜索容易地评估所选引物和探针的特异性。引物和探针可使用公众可获得的序列数据库例如NCBI参考序列(RefSeq)数据库根据mRNA转录物中存在的外显子或内含子序列设计。必要或希望时,引物和探针被设计为检测目的基因的最大转录物数量而不检测具有相似序列的基因产物例如同系物。本领域技术人员将认识到,引物和探针设计需要多个步骤例如将靶标序列定位到基因组、识别外显子-内含子结合处并在每个结合处设计引物、识别可用一组引物同时或分别检测的SNP和转录物变体。影响引物设计的其他因素包括但不限于:引物长度、熔化温度(Tm)、G/C含量、特异性、互补引物序列、引物二聚体和3'序列。对于一般用途,最佳引物和探针可用任何市售或以其他方式可公开获得的引物/探针设计软件例如PrimerExpressTM(Applied Biosystem)或Primer3TM(http://primer3.sourceforge.net)设计。与本文公开的实施例相关的每个测定使用荧光标记的Minor Groove Binder(MGB)探针和两个未标记的PCR引物。由于被设计在两步RT-PCR的通用热循环条件下工作,本文实施例中使用的引物一般长17-30碱基,含约50-60%的G+C碱基,表现50至80℃的Tm。测定使用5'核酸酶化学和整合MGB技术的探针。MGB技术通过结合DNA双螺旋的小沟增强探针Tm。此Tm增强允许使用短达13碱基的探针。更短的探针允许更好的特异性和更短的扩增子大小。表1、表2和表5提供关于本发明的引物、探针和扩增子序列的更多信息。
术语“扩增对”或“引物对”指本发明的一对寡聚核苷酸(寡核苷酸),其被选择以共同用于通过多种扩增过程中的一种扩增选定的核酸序列(例如标志物)。
以下技术包括在“扩增和/或杂交反应”的范围内。
聚合酶链式反应(PCR)。聚合酶链式反应可根据已知技术进行。参见例如美国专利号4,683,195;4,683,202;4,800,159和4,965,188(以上3个美国专利的公开内容通过引用并入本文)。通常PCR涉及在杂交条件下用用于待检测的具体序列的每条链的一个寡聚核苷酸引物处理核酸样品(例如在热稳定性DNA聚合酶存在下)。合成的每个引物的延伸产物与两条核苷酸链的每条互补,其中引物与与其杂交的具体序列的每条链充分地互补。从每个引物合成的延伸产物也可作为用相同的引物进一步合成延伸产物的模板。在足够轮数的延伸产物的合成后,分析样品以评估待检测的序列是否存在。扩增的序列的检测可通过在电泳后用溴化乙锭(EtBr)染色对DNA可视化,或使用根据已知技术的可检测标记,等等。关于PCR技术的综述(参见PCRProtocols,A Guide to Methods and Amplifications,Michael等人,编辑,Acad.Press,1990)。
基于核酸序列的扩增(NASBA)。NASBA可根据已知技术进行(Malek等人,Methods Mol Biol,28:253-260、美国专利号5,399,491和5,554,516)。在一个实施方案中,NASBA扩增以反义引物P1(含有T7 RNA聚合酶启动子)与mRNA靶标的退火开始。逆转录酶(RTA酶)随后合成互补DNA链。双链DNA/RNA杂交物被消化RNA链的RNA酶H识别,剩下单链DNA,有义引物P2可与其结合。P2作为合成第二条DNA链的RTA酶的锚定点。获得的双链DNA具有被相应的酶识别的功能T7 RNA聚合酶启动子。随后该NASBA反应可进入循环扩增阶段,包括6个步骤:(1)用T7 RNA聚合酶合成短反义单链RNA分子(每个DNA模板101至103个拷贝);(2)引物P2与该RNA分子退火;(3)用RTA酶合成互补DNA链;(4)消化DNA/RNA杂交物中的RNA链;(5)引物P1与单链DNA退火;和(6)用RTA酶产生双链DNA分子。由于NASBA是等温的(41℃),如果在样品制备过程中防止了dsDNA的变性,特异性扩增ssRNA是可能的。因此可在dsDNA背景中获得RNA而不获得由基因组dsDNA导致的假阳性结果。
转录介导的扩增(TMA)。TMA是等温的基于核酸的方法,可在数小时内将RNA或DNA靶标扩增十亿倍。TMA技术在Gen-Probe(例如参见美国专利号5,399,491、5,480,784、5,824,818和5,888,779),使用两个引物和两个酶:RNA聚合酶和逆转录酶。一个引物含有RNA聚合酶的启动子序列。在扩增的第一步中,此引物与靶标rRNA在定义的位点杂交。逆转录酶通过从该启动子引物的3'末端延伸产生靶标rRNA的DNA拷贝。获得的RNA:DNA双链中的RNA被逆转录酶的RNA酶活性降解。然后,第二个引物与该DNA拷贝结合。由逆转录酶从此引物的末端合成第二DNA链,产生双链DNA分子。RNA聚合酶识别该DNA模板中的启动子序列并起始转录。每个新合成的RNA复制子重新进入TMA过程并作为新一轮复制的模板。上述反应产生的扩增子由特异性基因探针在杂交保护测定(一种化学发光检测格式)中或使用其他探针特异性技术(例如分子信标)检测。
有或没有靶标序列扩增的测序技术例如Sanger测序、焦磷酸测序、连接测序、大量平行测序(又称为“下一代测序(NGS)”)和其他高通量测序方法可用于检测和定量样品中靶标核酸的存在。基于测序的技术可提供关于先前鉴别的基因的可变剪接和序列变异的更多信息。测序技术包括多个步骤,大体上分为模板制备、测序、检测和数据分析。现有的模板制备方法涉及将基因组DNA随机打断为较小的大小,每个片段固定于支撑物。空间上分开的片段的固定化允许数以千亿计的测序反应同时进行。测序步骤可使用本领域众所周知的多种方法中的任意一种。测序步骤的一个具体实例使用向互补链添加核苷酸以提供DNA序列。检测步骤的范围从测量合成片段的生物发光信号到单分子四色成像。NGS技术产生的大量数据需要在数据存储方面大量的信息学支持,以能从数以十亿计的测序读数进行基因组比对和组装。此组装的验证也需要严苛的跟踪和质量控制。
连接酶链式反应(LCR)可根据已知技术进行(Weiss,1991,Science254:1292)。本领域技术人员可进行该实验方案的改变以满足所需需求。链取代扩增(SDA)也根据已知技术或其满足特定需求的改变进行(Walker等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392 396和同上,1992,Nucleic Acids Res.20:1691 1696)。
靶标捕获。在一个实施方案中,靶标捕获包括于在体外扩增前提高靶标核酸的浓度或纯度的方法中。优选地,靶标捕获涉及相对简单的杂交和分离靶标核酸的方法,如在其他文献中详细说明的(例如参见美国专利号6,110,678、6,280,952和6,534,273)。一般而言,靶标捕获可分为两类,序列特异性的和非序列特异性的。在非序列特异性方法中,使用试剂(例如二氧化硅微珠)捕获非特异性核酸。在序列特异性方法中,附着于固体支撑物的寡核苷酸在适当杂交条件下与含有靶标核酸的混合物接触,以允许靶标核酸附着于该固体支撑物,以允许从其他样品组分纯化该靶标。靶标捕获可由靶标核酸与附着于固体支撑物的寡核苷酸之间的直接杂交产生,但优选地由与形成连接靶标核酸和固体支撑物上的寡核苷酸的杂交复合物的寡核苷酸的间接杂交产生。该固体支撑物优选地是可从溶液分离的颗粒,更优选地是可通过向容器施加磁场回收的顺磁性颗粒。在分离后,与该固体支撑物连接的靶标核酸被洗涤并扩增,其中该靶标序列与适当的引物、底物和酶在体外扩增反应中接触。
通常,如果捕获方法实际上是特异性的,捕获寡聚体序列包括特异性结合靶标序列的序列,以及将该复合物与固定化的序列通过杂交连接的“尾”序列。即,捕获序列包括特异性结合本发明的标志物、PSA或另一前列腺特异性标志物(例如hK2/KLK2、PMSA、转谷氨酰胺酶4、酸性磷酸酶、PCGEM1)靶标序列的序列和共价连接的3'尾序列(例如与固定化的同聚物序列互补的同聚物)。尾序列例如5至50核苷酸长,与固定化的序列杂交以连接含靶标的复合物与固体支撑物,从而从其他样品组分纯化杂交的靶标。捕获寡聚体可使用任何骨架连接,但一些实施方案包括一个或多个2'-甲氧基连接。当然,本领域熟知其他捕获方法。对帽结构的捕获方法(Edery等人,1988,gene 74(2):517-525,US 5,219,989)和基于二氧化硅的方法是捕获方法的两个非限制性实例。
如本文所用,术语“纯化的”指与其原本存在的组合物的组分分离的分子(例如核酸)。因此,例如“纯化的核酸”被纯化到天然不存在的水平。“基本纯”的分子是没有大部分其他组分的分子(例如30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%不含污染物)。相反,术语“粗的”表示未与其原本存在的组合物的组分分离的分子。为简便,单位(例如66、67…81、82、83、84、85…91、92%…)没有具体提及但仍然认为在本发明的范围内。
如本领域所熟知,本文中的术语“Gleason评分”是最常用的腺癌评分/分期和预后系统。该系统描述了2和10之间的评分,其中2是最无侵袭性的,10是最有侵袭性的。评分是发现的两个肿瘤生长的最常见模式(等级1-5)的和。模式(等级)需要占超过5%的活检样品才被计数。为准确,评分系统需要活检材料(核心活检或可操作样品);不能使用细胞制备物。如果活检确认了癌症的存在,那么确定癌症的范围和侵袭性(称为Gleason等级)。病理学家通常鉴别两个前列腺癌的结构模式,并对每个模式给予Gleason等级:第一等级与细胞外观相关,在1至5之间,第二等级与细胞排列相关,也在1至5之间。第一等级由活检样品中的癌性细胞的外观决定;如果组织外观与正常前列腺组织相似,则给予1的等级。如果组织没有正常特征,并且可在整个样品中看到癌细胞,则给予5的等级。对外观介于1和5之间的组织给予2至4的等级。第二等级数与细胞的排列相关,也类似地给予。
然后将第一和第二等级数组合在一起以形成Gleason评分。Gleason评分越高,肿瘤表现得越有侵袭性(快速生长)。如果癌组织显示第一等级3和第二等级4的肿瘤介入,组合的Gleason评分是“3加4”或7。目前,约90%的新诊断为前列腺癌的男性具有6或7的Gleason评分。小于6的Gleason评分通常称为低等级或良好分化的。6和7之间的Gleason评分称为中等等级。8和10之间的Gleason评分的肿瘤是高等级或差分化的。
Gleason博士在开发此系统时发现,通过给出他能在任何具体患者的样品中看到的两个最常见的模式的等级的组合,他能更好地预测具体患者表现好或坏的可能性。因此,尽管看起来令人困惑,医生通常向患者给出的Gleason评分实际上是两个数字的组合或加和,它足够准确以供广泛使用。这些组合的Gleason加和或评分可确定如下:
·最低的可能的Gleason评分是2(1+1),其中第一和第二模式都具有1的Gleason等级,因此加和时其总和为2。
·非常典型的Gleason评分可能是5(2+3),其中第一模式具有2的Gleason等级并且第二模式具有3的等级,或者一种纯粹模式6(3+3)。
·另一种典型的Gleason评分是7(4+3),其中第一模式具有4的Gleason等级并且第二模式具有3的等级。
·最后,最高的可能的Gleason评分是10(5+5),其中第一和第二模式都有最不正常的5的Gleason等级。
另一个对前列腺癌分期的方法是使用如美国癌症联合委员会(AJCC)在AJCC Seventh Edition Cancer Staging Manual中说明的“TNM系统”。它说明了原发肿瘤(T期)、不存在或存在扩散至邻近淋巴结(N期)和不存在或存在远距离扩散,或转移(M期)的范围。每个TNM分类的种类分为代表其特定状态的亚类。例如,原发肿瘤(T期)可分为:
·T1:肿瘤不能被直肠指检感觉到或被成像研究看到,但活检样品中存在癌细胞;
·T2:肿瘤可在DRE期间感觉到,并且癌局限于前列腺内;
·T3:肿瘤扩展到前列腺囊(围绕前列腺的纤维组织层)和/或贮精囊(前列腺旁两个储存精液的小囊),但没有其他器官受影响;
·T4:肿瘤扩散或附着到前列腺旁的组织(贮精囊以外的)。
淋巴结涉及被分为以下两类:
·N0:癌未扩散到任何淋巴结;
·N1:癌扩散到局部淋巴结(骨盆内)。
转移一般分为以下两类:
·M0:癌未转移(扩散)超出局部淋巴结;和
·M1:癌转移到远处淋巴结(骨盆外)、骨或其他远处的器官例如肺、肝或脑。
此外,T期进一步分为亚类T1a-c、T2a-c、T3a-b和T4。本领域熟知上述各个亚类的特征,可在多个教科书中找到。
对照样品。术语“对照样品”、“正常样品”或“参比样品”在本文中指可指示或代表非癌性状态(例如非前列腺癌状态)的样品。对照样品可从未罹患前列腺癌的患者/个体获得。也可使用其他类型的对照样品。在确定阈值后,也可设计提供预定的阈值的信号特征的对照样品并用于本发明的方法。诊断/预后测试特征通常为以下4个性能指标:灵敏性(Se)、特异性(Sp)、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。以下表格给出了用于计算上述4个性能指标的数据。
灵敏性指具有阳性诊断结果的受试者中真实地患有该疾病或症状的部分(Se=a/a+c)。特异性指具有阴性诊断结果的受试者中不患该疾病或症状的部分(Sp=d/b+d)。阳性预测值指诊断测试为阳性时实际患有该疾病或症状(例如前列腺癌)可能性(PPV=a/a+b)。最后,阴性预测值是诊断测试为阴性时实际不患该疾病/症状可能性的指标(NPV=c/c+d)。值通常以%表示。Se和Sp通常涉及测试的精确性,而PPV和NPV涉及其临床效用。
当指被测量的标志物时,术语“水平”和“量”在本文中可互换地使用。
本领域技术人员应当理解,在本发明的背景下可使用多种统计方法确定测试是阳性或阴性或者确定前列腺肿瘤的具体的期、等级、体积或其侵袭性。
术语“变体”在本文中指结构和生物活性与本发明的蛋白或核酸基本相似,维持至少一个其生物活性的蛋白或核酸分子。因此,只要两个分子具有共同的活性且可彼此代替,它们被视作如本文所用的变体,即使一个分子的组成或二级、三级或四级结构与另一个中存在的不同,或者氨基酸序列或核苷酸序列不一致。
如本文所用,术语“受试者”和“患者”指有前列腺的哺乳动物,优选人。受试者和患者的具体实例包括但不限于需要医学帮助的个体,特别是患有癌症例如前列腺癌的患者、被怀疑患有前列腺的患者或被监测以评估其前列腺状态的患者。
如本文所用,术语“上调”或“过表达”指在癌组织(例如在前列腺癌组织)中以相对于其他相应的组织(例如正常或非癌性前列腺组织)中的水平高的水平表达(例如RNA和/或蛋白表达)的基因。在一些实施方案中,在癌中上调的基因以比其他相应的组织(例如正常或非癌性前列腺组织)中的表达水平高至少10%,优选地至少25%,更优选地至少50%,更优选地至少100%,更优选地至少200%,最优选地至少300%的水平表达。在一些实施方案中,在前列腺癌中上调的基因是“雄性激素调控的基因”。相反,如本文所用,术语“下调”指在癌组织(例如在前列腺癌组织)中以相对于其他相应的组织(例如正常或非癌性前列腺组织)中的水平低的水平表达(例如mRNA或蛋白表达)的基因。在一些实施方案中,在癌中下调的基因以比其他相应的组织(例如正常或非癌性前列腺组织)中的表达水平低至少10%,优选地至少25%,更优选地至少50%,更优选地至少100%,更优选地至少200%,最优选地至少300%的水平表达。
确定一个或多个基因在癌组织(例如前列腺癌组织)中是上调或下调可通过比较该一个或多个基因的表达水平和不患前列腺癌的受试者的表达水平完成。在一个实施方案中,这可通过比较该表达水平与指示不患癌症(例如不患前列腺癌)的受试者中表达的一个或多个预定值完成。如本文所用,短语“确定表达”指测量本发明的任何表达产物(例如编码RNA、非编码RNA或表达的多肽)。
基因“共调控”、“共存”或“共存调控”。基因通常共同作用,因此其表达可以协调的方式“共调控,”此过程也称为“共表达调控”或“共调控”。为疾病过程例如癌症(例如前列腺癌)鉴别的“共调控的基因”或“共表达的基因”可作为肿瘤状态的生物标志物,因此可代替与其共调控的另一标志物或共同使用。如本文所用,术语“共调控的基因”等指在多名受试者中以协调的方式被上调或下调,属于相同的生物过程,例如癌症的成组的相关基因。例如,共调控的基因可在癌(例如前列腺癌)组织中被共同上调或下调。共调控的基因的含义也包括以相反的方式共调控的基因。例如,共调控的基因中一个基因可在癌组织中被上调,而其他基因可在该癌组织中被相应地下调。共调控也包括相互排斥的情况,例如,检测到一个基因与不能检测到另一个基因相关联。共调控可用可通过cBio Cancer Genomics Portal(http://cbioportal.org)获得的计算所有基因对之间的相互排斥或共存,并且通过对各个基因对进行Fisher精确检验而产生所有靶标基因的p值的二元矩阵的算法确定。两个基因间共调控的强度可以p值的方式表示。在一个实施方案中,“强共调控的基因”可指p值<0.00001的共调控的基因。在另一个实施方案中,“中等共调控的基因”可指p值<0.001的共调控的基因。在另一个实施方案中,“共调控的基因”可指p值<0.05的共调控的基因。在另一个实施方案中,“强相互排斥基因”可指p值<0.005的不共调控的基因。在另一个实施方案中,“相互排斥基因”可指p值<0.05的不共调控的基因。应当理解,本发明不应限于以上列出p值,可选择其他p值以适应本领域技术人员的具体需求。本发明还涵盖此类其他p值。
“生物样品”、“患者的样品”或“受试者的样品”意欲包括任何源自活或死亡的哺乳动物(优选地活人)的组织或材料,其可包括本发明的标志物。
如本文所用的术语“参数”也称为“过程参数”包括用于本发明的方法的一个或多个变量以确定以下的一个或多个:样品中检测到的标志物/靶标的量;一个或多个标志物/靶标的表达水平;和与一个或多个标志物/靶标的表达水平相关的临床评估值。参数包括但不限于:引物类型;探针类型;扩增子长度;物质浓度;物质质量或重量;过程时间;过程温度;过程中的活性,所述过程例如离心、转动、摇动、切割、研磨、液化、沉淀、溶解、电修饰、化学修饰、机械修饰、加热、冷却、保存(例如数天、数周、数月甚至数年)和维持静止(未搅动)状态。参数还可包括用于本发明的方法中的一个或多个数学公式中的变量。参数可包括用于确定用于或产生于本发明的方法的随后的步骤中的一个或多个参数或输出的值的阈值。在一个优选的实施方案中,该阈值是检测的靶标的最小或最大量。当然,此类参数可由本发明所属领域的技术人员调整以便于更具体地适于灵敏性、特异性、效率等具体需求。
如本文所用的短语“信号检测”指在样品或子样品中检测的一个或多个标志物的量,例如重量、体积或浓度(例如从荧光染料发射的光的浓度)的量。检测到的靶标的量可以是该靶标的量的间接或替代量度,例如来自PCR反应的Ct或拷贝数,或者当与一个或多个参比或管家基因或其他已知内部标准物标准化时,ΔCt或Δ拷贝数结果。
如本文所用的短语“表达水平”指用于靶标的确定的表达水平的连续或离散值的可能范围。表达水平可以是离散值或相对于正常细胞例如前列腺细胞中的水平确定的,例如相对于先前时间点的水平增加,或相对于预先确定的阈值水平的水平增加。
如本文所用的术语“列线图(nomogram)”指算法或其他考虑疾病因子或临床因子例如年龄;种族;癌症期;PSA水平;活检;病理分析;激素治疗的使用;辐射剂量;遗传等的组合获得结果的方法。术语“列线图”在涉及前列腺癌时广泛使用。
如本文所用的术语“临床评估”指患者的身体状况的评价和对前列腺癌的存在和/或严重程度及其进展的预测,以及根据常规病程预计的恢复前景,基于从体检和实验室检查和患者的病史收集到的信息。如本文所用的短语“结果的临床评估范围”指用于患者的临床评估的连续或离散值的可能范围。
如本文所用的术语“筛查”指一种临床评估,其中首先鉴别癌症的存在或癌症的不存在。在早期检测癌症被认为能改善治疗益处和导致的临床结果。
如本文所用的术语“诊断”指另一种临床评估,其中确认癌症的存在或癌症的不存在。
如本文所用的术语“分期”指另一种临床评估。分期通常是确定肿瘤的范围和位置以开发适当的治疗策略并估计预后。分期是预测前列腺癌的严重程度及其进展,以及根据常规病程预计恢复前景的一种方法。
如本文所用的术语“预后”指另一种临床评估。预后通常涉及确定根据常规病程或病例的特性预计的恢复前景,例如确定发生前列腺癌的可能性、确定发生侵袭性前列腺癌的可能性、确定发生转移性前列腺癌的可能性和/或确定长期存活结果。
如本文所用的术语“确定侵袭性”指另一种临床评估。确定侵袭性通常是通过确定前列腺癌的Gleason评分进行的,后者可指导选择适当的治疗方法。
如本文所用的术语“治疗计划”指另一种临床评估。治疗计划通常指建议或排除一个或多个治疗选择,包括但不限于:观察(观察性等待);手术例如根治性前列腺切除术;放疗例如外部光束辐射或近距放疗;药物或其他剂治疗例如激素治疗或化疗;睾丸酮降低治疗例如通过药物或手术移除睾丸及其组合。
如本文所用的术语“监测治疗响应”指另一种临床评估。监测治疗响应通常指直接或间接与现有患者治疗相关的一个或多个患者状况监测选择例如常规(例如以计划的频率)诊断和预后过程。可适用的诊断程序包括但不限于:对从患者获得的样品常规进行一项或多项测试例如血检或尿检;常规成像测试和常规活检。
如本文所用的术语“监控”指另一种临床评估。监控通常指一个或多个患者状况监测选择例如常规(例如以计划的频率)诊断和预后过程。监控不一定与现有患者治疗相关(例如可在进观察期间内)。可适用的诊断程序包括但不限于:对从患者获得的样品常规进行一项或多项测试例如血检或尿检;常规成像测试和常规活检。
用于提供前列腺癌的临床评估的方法、试剂盒和组合物
本发明涉及用于基于来自受试者的生物样品提供受试者中前列腺癌的临床评估的方法、试剂盒和组合物。简言之,在一个具体的实施方案中,从受试者获得生物样品(例如尿、组织或血样),并确定本发明的前列腺癌签名中至少两个前列腺癌标志物的标准化表达水平。对该至少两个前列腺癌标志物的标准化表达水平进行数学关联以获得一个评分,该评分用于提供受试者中前列腺癌的临床评估。
前列腺癌签名
本发明的前列腺癌签名涉及至少两个其在尿中表达模式与前列腺癌的临床评估相关(正相关或负相关)的前列腺癌标志物的组合。
在一个实施方案中,本发明的前列腺癌签名可包括至少两个选自表5或表6A的前列腺癌标志物。在另一个实施方案中,本发明的前列腺癌签名可包括至少两个选自以下的前列腺癌标志物:(1)CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的标志物;(2)ERG或与其在前列腺癌中共调控的标志物;(3)HOXC4或与其在前列腺癌中共调控的标志物;(4)ERG-SNAI2前列腺癌标志物对;(5)ERG-RPL22L1前列腺癌标志物对;(6)KRT15或与其在前列腺癌中共调控的标志物;(7)LAMB3或与其在前列腺癌中共调控的标志物;(8)HOXC6或与其在前列腺癌中共调控的标志物;(9)TAGLN或与其在前列腺癌中共调控的标志物;(10)TDRD1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;(11)SDK1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;(12)EFNA5或与其在前列腺癌中共调控的标志物;(13)SRD5A2或与其在前列腺癌中共调控的标志物;(14)maxERG CACNA1D前列腺癌标志物对;(15)TRIM29或与其在前列腺癌中共调控的标志物;(16)OR51E1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;和(17)HOXC6或与其在前列腺癌中共调控的标志物。
在另一个实施方案中,本发明的前列腺癌签名可包括至少两个前列腺癌标志物,其中该标志物之一是CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的标志物。在另一个实施方案中,本发明的前列腺癌签名可包括至少两个前列腺癌标志物,所述标志物是CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的标志物,和ERG或与其在前列腺癌中共调控的标志物。
在一个具体实施方案中,与上述前列腺标志物共调控的标志物在表6B中列出。在其他具体实施方案中,表6B中列出的共调控的标志物显示具有p值<0.05(“共调控”);p值<0.001(“中等共调控”);p值<0.05(“强共调控”);p值<0.05(“相互排斥”)或p值<0.005(“强相互排斥”)的共调控。
在另一个实施方案中,本发明的前列腺癌签名可包括与一个或多个对照标志物组合的至少两个本发明的前列腺癌标志物。在另一个实施方案中,该一个或多个对照标志物选自表2或表7-9中列出的那些。
在另一个实施方案中,可综合考虑来自两个或更多个不同的本发明标志物的表达数据以获得新参数,该参数本身可作为新标志物(即“标志物对”,如上文所述)。在具体实施方案中,该标志物对可以是前列腺癌标志物对,例如两个不同的前列腺癌标志物之间的最大表达水平(例如“maxERG CACNA1D”)或两个不同的前列腺癌标志物表达水平之间的差异(例如"ERG-SNAI2")。为简便,前者在本文中通过在考虑的两个前列腺癌标志物前插入术语“max”表示,后者通过在考虑的两个前列腺癌标志物的名称之间插入“-”表示。本领域技术人员可根据本文披露的前列腺癌标志物和对照标志物得出其他类型的提供信息的标志物对。
在另一个实施方案中,本发明的前列腺癌签名提供优于(即,能更好地区分前列腺癌和非前列腺癌)PCA3(例如PCA3/PSA比例)的前列腺癌临床评估。在另一个实施方案中,使用不依赖PCA3本身的前列腺癌诊断工具可能是有用的。例如,如果对受试者用基于PCA3的测试进行前列腺癌临床评估,可能需要有不依赖PCA3的单独、独立的前列腺癌临床评估。这样,本发明的前列腺癌签名可用于独立地验证基于PCA3的测试结果,反之亦然。因此,在一个具体实施方案中,本发明的前列腺癌签名不包括PCA3。
生物样品
生物样品一般从患有或怀疑患有前列腺癌的受试者获得。在多个实施方案中,受试者可患有或怀疑患有癌症(例如原发前列腺癌);可有家族前列腺癌史;可被跟踪前列腺癌发展(例如为监测癌症发展和/或癌症疗法的效力);可具有不同于前列腺癌的一种或多种病症,或表现与良性前列腺增生(BPH)、高等级前列腺上皮内瘤(HGPIN)或非典型小腺泡增殖(ASAP)相关的症状。在其他实施方案中,本发明的方法可在先前的诊断测试,例如其中PSA水平高于10ng/mL、4ng/mL、2.5ng/mL、2ng/mL或其他诊断上有用的值的PSA测试之后对来自受试者的生物样品进行。
在一个实施方案中,样品可以是肿瘤或非肿瘤组织,并且可包括例如可含有来自其的与前列腺组织相关的细胞或标志物的任何组织或材料,例如:尿;前列腺活检样品;精子/精液;膀胱洗液;血液;淋巴结;淋巴组织;淋巴液;前列腺经尿道切除物(TURP);其他体液、组织或材料;细胞系;组织切片;保存的组织例如福尔马林固定、冷冻或脱水的组织;石蜡包埋的组织;激光捕获显微解剖样品;或其任何组合,只要其含有或被认为含有前列腺来源的核酸或多肽。样品可用例如用注射器吸取流体或用棉签的方法获得。本领域技术人员将容易地认识到其他获得样品的方法。
在另一个实施方案中,本发明的样品也可包括多个子样品,其可同时或在一段时期获得(例如在不同时间收集的尿或血液,或多个活检样品(例如多个个体活检核心))。这些子样品则可同时或一起处理(例如“汇集”)。
只要保留检测本发明的标志物的能力,样品可在分析前处理。样品处理可包括防腐和储存,以及处理样品以物理破坏组织或细胞结构,从而使细胞组分释放到溶液中,该溶液可进一步含有用于准备该样品分析的酶、缓冲液、盐、去垢剂等。细胞可从流体样品分离,例如通过离心、过滤或沉淀。体液例如尿和血液可需要添加一种或多种稳定剂,例如当进一步测试在样品收集后数小时或数天进行时。样品的进一步处理可需要逆转一个或多个储存或防腐步骤,例如移除稳定剂和防腐剂。组织样品可用众所周知的技术匀浆或以其他方式准备分析,包括但不限于:超声;机械破坏;化学溶解例如去垢剂溶解及其组合。样品也可物理地分开;暴露于化学反应例如去石蜡和/或沉淀过程;暴露于分离过程例如在离心机中分离;暴露于洗涤过程;防腐;固定;冷冻等。样品,例如组织可被冷冻、脱水或用化学剂例如福尔马林防腐。固定的组织样品可包埋于石蜡中以便储存和运输,以及便于制备用于病理学家目测检查和评估样品,或在介质例如或中冷冻的切片。用于手术病理学的组织切片制备物可用标准技术冷冻和制备。可对固定的细胞进行对组织切片进行的免疫组化和原位杂交结合测定。本领域技术人员将容易地认识到可检查本发明的前列腺癌标志物的多种样品,并认识到获得、储存和防腐(如果需要)该样品的方法。
根据本发明,RNA可用多种方法从生物样品提取,例如使用有机提取或固体表面靶标捕获方法。在一个实施方案中,样品是尿,并且RNA是用以下提取试剂盒之一提取的:ZR Urine RNA IsolationKitTM(Zymo Research);TrizolTM LS(Invitrogen);Urine(ExfoliatedCell)RNA Purification Kit(Norgen Biotek目录22500);Ribo-SorbRNA/DNA提取试剂盒(Sacace);RNeasyTM迷你试剂盒(Qiagen)。在另一个实施方案中,样品是人组织,提取过程使用试剂。
本发明的优选的生物样品是尿,尽管本文已经测试并且也考虑了其他样品(例如组织)。尿便于收集并且在本文经验证允许临床评估例如诊断、预后、分级等的事实清楚地支持本发明的重要性和能力。尿样品可以或可以不在例如直肠指检、射精、前列腺按摩、活检或任何其他增加尿中前列腺细胞含量的方法的事件之后收集。本发明也可用粗的未处理的全尿进行。如本文所用,“粗尿”指从受试者收集但基本上未被进一步处理例如离心、过滤或沉淀的尿。当然,也可根据本发明使用尿级分例如尿上清液或尿细胞沉淀(例如尿沉积物)。
对于其中目标前列腺癌标志物包括核酸(RNA或DNA)的基于尿的测定,尿可在收集后尽快稳定。然后可从尿分离细胞组分(包括核酸),例如通过过滤、离心或沉淀,然后溶解分离的细胞并稳定RNA和/或DNA,例如通过使用螯合剂如硫氰酸胍。然后可移除核酸,例如通过结合于二氧化硅基质。
在使用血样的测定中,可使用全血或血清,或可从血细胞分离血浆。可筛查血浆中本发明的前列腺癌标志物,包括当一个或多个本发明的前列腺癌标志物从肿瘤细胞切离或脱落时释放到血液中的截短的蛋白。在一个实施方案中,筛查血细胞级分中前列腺肿瘤细胞的存在。在另一个实施方案中,可通过溶解细胞并检测本发明标志物(例如蛋白或基因转录物)的存在筛查存在于血细胞级分中的淋巴细胞,该标志物可由于被白细胞吞噬的前列腺肿瘤细胞而存在。
标志物表达水平检测
根据本发明,从患有或怀疑患有前列腺癌的受试者获得适当的生物样品,并确定至少两个本发明的前列腺癌标志物的表达水平。简言之,表达水平可通过检测存在于样品中的指示该前列腺癌标志物的表达水平的靶标的量,然后处理或转化此原始靶标检测数据(例如数学地、统计地或其他方法)以产生样品中该前列腺标志物的表达水平,或一些表达相关的评分而获得。
如上所述,“靶标”指本发明的标志物的被靶标用于根据本发明方法检测、扩增和/或杂交的具体子区域(其非限制性实例包括在RNA标志物的情况下选定的外显子-外显子连接处,或者在蛋白标志物的情况下选定的表位)。因此,在一个实施方案中,标志物表达水平的确定可从检测生物样品中指示/代表所述标志物存在的靶标的量开始。即,检测到的靶标的量可代表寻求其表达水平的相应标志物的量的替代。检测到的靶标的量可用以下一个或多个代表:检测到的分子/细胞数(例如循环阈值(Ct)或拷贝数);检测到的质量;检测到的浓度,例如检测到的质量与样品质量的比例或检测到的质量与患者参数例如患者体重或表面积相比的比例;或其任何组合。
靶标的量可通过测量荧光输出确定。检测到的靶标的量也可代表检测的相应标志物的量的替代,作为检测到的靶标量的关联,例如来自测量荧光输出的测试的Ct(循环阈值)值或拷贝数。
在一个非限制性实施方案中,待检测的本发明的标志物是基因。确定本发明的基因靶标的表达水平可通过定量该基因的表达产物(例如源自其的RNA或多肽)完成。RNA靶标可用任何本领域知悉的任何杂交和/或扩增反应或相关技术定量。在另一个实施方案中,该杂交和/或扩增反应(例如测序或扩增(例如PCR))可利用一个或多个与该RNA标志物(或从其产生的cDNA)充分地互补以与其特异性结合的寡核苷酸。在另一个实施方案中,该寡核苷酸可以是扩增引物或检测探针。适当的寡核苷酸(例如扩增引物和探针)和扩增/杂交反应可由本领域技术人员使用可获得的序列信息常规地设计。在另一个实施方案中,本发明包括经标记的寡核苷酸(例如用放射性标记的核苷酸标记,或者可通过可容易获得的非放射性检测系统检测)。
事实上,多种检测和定量技术可用于确定本发明的靶标的表达水平,包括但不限于:PCR、RT-PCR;RT-qPCR;NASBA;Northern印迹技术;杂交阵列;分支核酸扩增/技术;TMA;LCR;高通量测序;原位杂交技术和其后进行HPLC检测或MALDI-TOF质谱的扩增过程。在一个具体实施方案中,扩增过程用PCR进行。本文说明的标志物检测方法意欲示例本发明如何实施,而不意欲限制本发明的范围。考虑可根据本发明使用其他用于检测受试者样品中本发明的标志物存在的基于序列的方法。上文意欲包括在“扩增和/或杂交反应”的范围内。
在典型的PCR反应中,RNA或cDNA与引物、游离核苷酸和酶根据标准PCR实验方案组合,并且该混合物经历一系列温度改变。如果存在本发明的标志物或从其产生的cDNA,即如果两个引物都与同一分子的靶标序列杂交,包括引物和介于其间的互补序列的分子将被指数地扩增。扩增的DNA可用多种众所周知的方法容易地检测。如果不存在标志物,没有PCR产物会被指数地扩增。因此,PCR技术提供了检测本发明的标志物的可靠的方法。
在一个实施方案中,该PCR反应可被设置或设计为扩增具体的外显子-外显子结合处。
在一些情况下,例如当回收不寻常小量RNA并且从其产生仅小量cDNA时,可能希望或需要对第一PCR反应产物进行PCR反应。即,如果难以检测第一反应产生的扩增的DNA的量,则可进行第二PCR以制备第一次扩增的DNA的DNA序列的多个拷贝。第二PCR反应中可使用巢式引物组。
本领域技术人员熟知原位杂交技术。简言之,固定细胞,然后将含有特异性核苷酸序列的可检测探针添加到该固定的细胞。如果细胞含有互补核苷酸序列,则可检测的探针将与其杂交。使用本文提出的序列信息,可设计探针以识别表达本发明的标志物的细胞。探针优选地与对应于此类标志物的核苷酸杂交。杂交条件可被常规地优化以最小化非完全互补杂交造成的背景信号。探针优选地与其靶标序列完全互补。因为探针不与部分互补序列同样良好地杂交,通常完全互补是优选的。对于根据本发明的原位杂交,也优选地,探针用附着于该探针的荧光染料标记以可容易地用荧光检测。
在另一个实施方案中,靶标检测可通过检测由本发明的基因或RNA标志物编码的蛋白(或其表位)完成。本领域技术人员将认识到,蛋白和多肽可用本领域常规可用的方法定量。在另一个实施方案中,免疫测定可用于确定本发明的多肽标志物的表达水平。可进行技术例如免疫组化测定以确定本发明的标志物是否存在于样品中的细胞中。在另一个实施方案中,本发明的蛋白标志物可用标志物特异性抗体检测。在具体实施方案中,抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体或抗体片段。针对本发明的多肽标志物的抗体可获得或可由本领域普通技术人员容易地生产。
一旦获得本发明的靶标的量,就可确定对应的标志物的表达水平,例如产生样品中前列腺癌标志物的表达水平。
在一个实施方案中,确定本发明的标志物的表达水平可仅包括确定该标志物的存在(或其不存在)(即,“是”或“否”)。
在另一个实施方案中,确定本发明的标志物的表达水平可包括使用考虑受试者数据或其他数据的统计方法(例如逻辑回归)将原始靶标检测数据处理或转化(例如数学地、统计地或其他方式)为前列腺癌标志物的表达水平(或标准化的表达水平)。受试者数据可包括(但不限于):年龄;种族;癌症分期,例如通过组织病理学确定的分期;Gleason评分(由活检确定的)或Gleason等级(由病理学家在前列腺切除后确定的);PSA水平例如手术前PSA水平;PCA3比例或其他诊断例如HGPIN;BPH或ASAP;或此类受试者数据或其他数据的不同组合。该算法可以是或包括如上文定义的列线图。该算法也可考虑例如以下因素:受试者的不同于前列腺癌(或除了前列腺癌以外)的症状的存在、诊断和/或预后。在一个具体实施方案中,如果从受试者获得的样品是尿,该算法可考虑尿样收集相对于另一事件的时间,所述另一事件例如直肠指检查;前列腺按摩;活检;手术前列腺移除;癌症的第一次诊断或其任何组合。在另一个实施方案中,该统计方法可处理代表以下水平的靶标量:检测到的细胞数量;检测到的分子数量;检测到的质量;检测到的浓度,例如与样品或子样品的质量相比的检测到的标志物的质量;和这些的组合。在另一个实施方案中,该算法可被配置为确定该靶标的浓度(例如与另一参数相比的检测到的靶标的量)。本发明所属领域技术人员将清楚,根据上下文,本文包括的算法可使用多种数据参数和/或因素的组合以获得所需的输出。
在另一个实施方案中,确定前列腺癌标志物的水平可涉及确定此前列腺癌标志物中的一个或多个可变剪接变体的表达水平。在此实施方案中,剪接变体的存在或不存在通常由RT-PCR使用特异性结合发生可变剪接的区域旁侧的核苷酸序列的引物检测。
在另一个实施方案中,确定本发明的标志物的表达水平可包括与一个或多个阈值比较(例如高于或低于该阈值)。在另一个实施方案中,该表达水平代表定量量或定量水平或值,例如选自连续值范围的值或选自多个离散值范围的值。该表达水平可基于直接测量本发明的标志物或基于测量标准化的值。
用对照标志物标准化
在确定本发明的标志物的表达水平后,该表达水平可用例如标准化算法、数学过程或其他数据操作工具或方法使用一个或多个对照标志物(例如前列腺特异性标志物、内源对照标志物、外源对照标志物)标准化。然后可通过与一个或多个阈值比较,处理该前列腺癌标志物的标准化的表达水平,包括:分类到一个或多个离散的水平或组;与另一方法或该样品或该受试者的临床参数比较;和/或其他数学或非数学变换。
通常,如本领域技术人员所熟知,本发明的前列腺癌标志物的表达水平标准化到一个或多个对照标志物以产生标准化的表达水平。如本文所用和上文所述,“对照标志物”指用于(单独或与一个或多个对照标志物组合)对照可能的干扰因素和/或提供关于样品质量、有效样品制备和/或适当的反应组合/执行(例如RT-PCR反应)的一个或多个指标的具体类型的标志物。
在一个实施方案中,适当的本发明的对照标志物具有不受样品中癌细胞存在影响的表达,即与由于长储存期、储藏条件差或其他胁迫因素以某种方式降解的样品中前列腺癌标志物类似的行为。用如本文所示适当的对照标志物标准化前列腺癌标志物的方法为用于实现前列腺癌临床评估的目前方法提供了有用的辅助作用,因为早期检测对有效治疗和管理癌症是希望的。
在一个实施方案中,对照标志物可以是如本文所述的内源对照标志物、外源对照标志物和/或前列腺特异性标志物(例如PSA)的一个或多个。对照标志物可以是一个或多个内源基因例如管家基因或前列腺特异性对照标志物或基因的组合。
在一个实施方案中,内源对照标志物可包括一个或多个内源基因(即“内源对照基因”或“参比基因”),根据用于确定该标志物表达水平的方法,在被测试的具体样品(例如尿)中,以及当该样品/标志物进行多种处理步骤时,其表达相对稳定(例如在前列腺癌与非前列腺癌样品中,和/或在受试者之间不显著变化)。内源对照基因的表达稳定性可用例如软件(例如geNormTM)分析,该软件使用成对模型选择在样品间显示最小的表达比例变异的基因对。
在另一个实施方案中,用于标准化的对照标志物可包括一个或多个前列腺特异性对照标志物例如PSA,其可用于例如对照或验证被测试的样品中前列腺细胞的存在。可包括的前体对照标志物的实例是能提供关于提供受试者的临床评估的信息的对照标志物,例如一个或多个用于确认或排除不同于前列腺癌的疾病/病症(例如非前列腺癌细胞增殖障碍)的对照标志物,如表7B所列的。
在一个具体实施方案中,从尿样确定至少两个本发明的前列腺癌标志物的表达水平,该表达水平用一个或多个在尿中基本稳定(例如在来自患有或不患前列腺癌的受试者的尿液之间)的对照标志物标准化。在一个此类实施方案中,一个或多个对照标志物选自表2或表7-9中列出的那些。在另一个此类实施方案中,一个或多个对照标志物包括IPO8、POLR2A、GUSB、TBP、KLK3或其任何组合。
前列腺癌评分
在数据标准化后,对至少两个本发明的前列腺癌标志物的标准化表达水平进行数学关联以获得“评分”或“前列腺癌评分”,其用于提供受试者中前列腺癌的临床评估。在一个实施方案中,可从多个样品或子样品获得不同的评分,该样品或子样品可同时或在一段时期获得(例如在不同时间收集的尿或血液,或多个活检样品(例如多个个体活检核心))。不同评分可随后被比较以提供前列腺癌的临床评估。
根据本发明,进行“数学关联”、“数学变换”、“统计方法”或“临床评估算法”指帮助将来自生物样品(例如尿)的至少两个标志物的表达水平与前列腺癌的临床评估(例如预测,例如前列腺癌活检的结果或评估进行前列腺癌活检的需求)相关联的任何计算方法或机器学习方法(或其组合)。本领域普通技术人员将认识到,可选择不同的计算方法/工具用于提供本发明的数学关联,例如逻辑回归、最高分值对、神经网络、线性和二次判别式分析(LQA和QDA)、朴素贝叶斯、随机森林和支持向量机。一些统计方法需要启动最终模型前在训练数据上调整的超参数。在贝叶斯统计中,超参数是先验分布的参数(例如层数、节点数或SVM中的C参数),其数值留待使用基本过程例如交叉验证的网格搜索人工调整。用于本发明的模型的参数,例如标准化的基因表达值或ΔCt的选择是通过逐渐向交叉验证的训练组添加由其区别性p值定义的最高评分基因,并在达到最大基因数或性能(AUC)停止提高时停止添加而完成的。
如本文所用,术语“朴素贝叶斯(Naives Bayes)”指假设在基因A的ΔCt和基因B的ΔCt之间没有协变性的计算方法。给予用于此种模型中的基因的不同权重被假设彼此独立且权重相等。参数直接从训练组估计,由每个类别所选基因的平均值和方差乘以代表两个类别的2组成。样品X属于类别Y的概率用高斯分布根据从训练组估计的平均值和方差估计。给定相应函数中的属性值a1;a2;…an,朴素贝叶斯方法选择最可能的分类Vnb(例如正常或肿瘤):
其中P(ai︱vj)通常用正态分布估计,其每个类别和基因的平均值和标准差从训练组估计如下:
并且
ai=基因i的ΔCt
vj=肿瘤或正常
μvj=类别vj和基因i的平均值
σvj=类别vj和基因i的标准差
如本文所用,“线性判别式分析(LDA)”指计算方法,其是“二次判别式分析(QDA)”的子类。可从其推导出线性情况的二次型由2维(2-D)曲线组成,其中第一维度代表基因A的ΔCt,第二维度代表基因B的ΔCt。对于训练组中的全部样品,在该2-D曲线上坐标(基因A的ΔCt,基因B的ΔCt)处,对于正常样品画“X”,对于肿瘤样品画“O”。目标是找到能分开“X”和“O”的二次函数ax2+by+c(其中“+c”只在线性型中出现)。此方程通过分别计算两个类别的基因A和基因B的平均ΔCT以及每个类别的协方差矩阵获得。在线性判别式分析的情况下,对全部类别计算一个协方差矩阵而不是两个(例如每个类别一个)。此方法没有超参数。
如本文所用的术语“随机森林(Random Forest)”指基于使用多个不同的决策树计算总体最多预测的类别(众数)的计算方法。在一个具体应用中,根据多少决策树预测该样品为肿瘤或正常,该众数是肿瘤或正常。由多数预测的类别(肿瘤或正常)被选作该样品的预测类别。用于此算法的不同决策树用随机产生的训练组的子组和随机选择的变量组训练。因此此算法依靠两个超参数:使用的随机树数量和用于训练不同的树的随机变量的数量。
如本文所用的术语“支持向量机(SVM)”指与其他线性分类方法例如LDA不同,具有寻找最佳地区分两个类别(例如肿瘤和正常)的线,此线离任何训练点最远(最大边界)的目标的计算方法。该问题的定义导致了完全不同的具有有趣的概括性质(对未测试样品同样良好的性质)的费用函数。SVM有时与内核函数组合使用,后者以能简化样品的区分的方式转化数据(寻找区分样品的线)。如本文所说明,默认方案的原样使用数据的线性内核和用径向基高斯函数转化数据的高斯径向内核都可使用。在SVM方法中,错误标记的训练数据C和径向内核高斯函数的γ是超参数。上述超参数可用2-D网格搜索和交叉验证选择。
在一个实施方案中,该数学关联可产生一系列输出临床评估值,其包括连续或接近连续的范围的值,例如如上文所说明的关于本发明的表达水平算法的。可选地,该临床评估算法可产生一系列的输出临床评估值,其包括一系列离散值。在一个具体实施方案中,该系列输出临床评估值是两个离散值,例如选自或临床上相似于以下的两个临床评估值:“是”和“否”;“低”和“高”;“存在”和“不存在”例如涉及癌症的存在;“未检测到前列腺癌细胞”和“检测到至少一个前列腺癌细胞”;“轻微”和“严重”例如涉及癌症的侵袭性;“可能”和“不可能”例如涉及癌症可能的复发或初始发病;以及其他与前列腺癌受试者的临床评估相关的两个水平的输出临床评估。当然,应当理解,其他此类两个临床评估值可由本领域技术人员使用本发明的方法和试剂盒容易地选择。
在一个具体实施方案中,该临床评估算法产生一系列输出临床评估值,包括三个或更多离散值,例如与以下一个或多个相关的三个或更多值:癌症的侵袭性;未来治疗例如未来化疗的成功的预后;现有治疗例如现有化疗的成功的诊断和/或预后;未来癌症发病的可能性;癌症复发的可能性;和长期存活的可能性。在另一个实施方案中,该系列输出值是三个或更多离散值,例如选自例如选自或临床上相似于以下的值:侵袭性值例如无侵袭性、轻微侵袭性和极度侵袭性;未来发病或复发值例如未预计、中等可能性和强可能性;治疗成功值例如不可能、中等可能或非常可能;和其他与前列腺癌受试者的临床评估相关的多水平输出。多个离散值可以是如上所述的定性评估或定量范围例如0-100,其中最大和最小值代表临床评估值的界限。
在另一个实施方案中,该临床评估算法可将本发明的前列腺癌标志物的(标准化的)表达水平与一个或多个阈值比较(例如以将其分为两个或更多离散的临床评估值)。在一个具体实施方案中,该阈值可允许分类为两个或更多涉及以下的离散的临床评估值:癌症的存在与否;癌症的侵袭性;癌症的分期;癌症的位置;Gleason评分;发生癌症的可能性,例如发生侵袭性癌症的可能性;治疗成功的可能性例如涉及一个或多个化疗药物的治疗;实现长期存活的可能性;以及其他临床评估值。例如,对具体化疗剂“可能响应”的第一临床评估值可对应低于第一阈值的前列腺癌标志物表达水平,对该化疗剂“中等可能响应”的第二临床评估值课对应高于第一阈值但低于第二阈值的前列腺癌标志物表达水平。因此,对该化疗剂“不可能响应”的第三临床评估值可对应高于第二阈值的前列腺癌标志物表达水平。
在具体实施方案中,本发明的阈值优选地基于对来自具有确定的前列腺癌诊断的个体以及来自其他个体例如具有其他非前列腺癌疾病/病症和健康个体的样品(称为阳性和阴性“对照样品”或“训练样品”)的之前和可能现有的测试。通过测试已知的健康个体和具有确定的前列腺癌诊断的受试者确定前列腺癌标志物的表达水平允许临床评估算法识别一个或多个阈值的决定值,特别是其与确定前列腺癌的存在与否的阈值相关。阈值也可基于来自具有已知的以下一种或多种病史的受试者的对照样品的测试确定:癌症发病;存在高级别癌症;癌症复发;一种或多种具体疗法例如具体化疗剂临床成功;和其他已知临床结果。可选或额外地,阈值可通过测试来自根据本发明被测试的同一受试者的对照样品,例如在较早时间获得的样品而确定。优选地,测试此类对照样品以确定一个或多个阈值包括标准化检测到的前列腺癌标志物表达水平,例如用一个或多个对照标志物标准化。
在其他实施方案中,该阈值可以是0的数量,例如其中该前列腺癌标志物的任何非0表达水平关联具体临床评估值,例如癌症的存在。该阈值可以是非0最小值,例如通过测试一个或多个本发明的对照标志物确定的值。在进一步的实施方案中,一个或多个阈值可分别用于确定两个或多个临床评估值。在一个备选实施方案中,两个或多个阈值可与本发明的前列腺癌标志物和/或对照标志物的标准化表达水平比较。在其他实施方案中,每个标志物可以是要相同或不同的阈值。
前列腺癌的临床评估
本发明的“评分”或“前列腺癌评分”(或不同评分的比较)为临床医生提供关于受试者中前列腺癌状态的信息。如本文所用,“临床评估”可包括患者的身体状况的评价和对前列腺癌的存在和/或严重程度及其进展的预测,以及根据常规病程预计的恢复前景,基于从体检和实验室检查和患者的病史收集到的信息。在不同实施方案中,前列腺癌的临床评估包括以下一个或多个:前列腺癌筛查、诊断、分期、预后、侵袭性确定、治疗计划、检测治疗响应、监控和其他前列腺癌临床评估。更具体地,该临床评估可代表以下一个或多个:诊断例如癌症筛查评估、分级评估或癌症侵袭性分类;预后例如治疗计划评估、癌症发病预后(包括该癌症侵袭性之间的分化)、癌症复发预后、疗法效力预后、长期存活预后;其他前列腺癌受试者或潜在前列腺癌受试者的临床评估;及其任意组合。在另一个实施方案中,该临床评估可包括提供分层或以其他方式区分的良性前列腺增生(BPH)或一种或多种细胞增殖障碍例如前列腺癌;前列腺上皮内瘤(PIN)和小腺泡增殖(ASAP)的评估。在另一个实施方案中,该临床评估可用于确定前列腺癌治疗的临床疗程,包括但不限于:观察(观察性等待);手术例如根治性前列腺切除术;放疗例如外部光束辐射或近距放疗;药物或其他剂治疗例如激素治疗或化疗;睾丸酮降低治疗例如通过药物或手术移除睾丸及其组合。
在一个实施方案中,本发明的临床评估可转移或以其他方式提供给不同于进行该测试的实体的实体,例如由临床实验室改进修正案(CLIA)实验室将临床评估提供给医院或医生办公室。在具体实施方案中,该临床评估可以一种或多种交流方式提供,包括口头、电子和实体形式。在一个优选的实施方案中,该临床评估以纸和/或电子形式提供,例如通过有线或无线通讯方式例如因特网提供的电子形式。除了临床评估,也可提供本发明表5和表6A的前列腺癌标志物以及表6B的共调控标志物的表达水平。在另一个实施方案中,可提供由本发明的数学关联产生,用于分类表5或表6A中列出的前列腺癌标志物的表达水平的评分。在另一个实施方案中,该临床评估可允许或包括筛查有高风险患前列腺癌的,或被诊断为局部疾病和/或转移的疾病,和/或与该疾病遗传上相关的个体。在另一个实施方案中,本发明可用于监测正在或已经接受原发前列腺癌治疗的个体以确定癌症是否转移。在另一个实施方案中,本发明可用于监测正在或已经接受原发前列腺癌治疗的个体以确定癌症是否被消除。上述用途都包括在提供临床评估的范围内。
在另一个实施方案中,本发明可用于监测以其他方式易感的个体,即被识别为遗传上倾向于患前列腺癌的个体(例如通过遗传筛查和/或家族病史)。对遗传学的理解的进步和技术/流行病学的发展允许改善的关于前列腺癌的概率和风险评估。使用家族健康史和/或遗传筛查,可估计特定个体具有的发生某种类型的癌症(包括前列腺癌)的概率。此类个体被识别为倾向于患特定形式的癌症,可被监测或筛查以检测前列腺癌的证据。在发现此类证据后,可进行早期治疗以对抗该疾病。因此,可识别具有发生前列腺癌的风险的个体,并可从此类个体获得样品。在另一个实施方案中,本发明也用于监测被识别为具有包括患有前列腺癌的亲属的家族病史的个体。同样,本发明也用于监测被诊断为患有前列腺癌的个体,特别是被治疗并移除肿瘤和/或以其他方式经历减轻的个体,包括被治疗前列腺癌的个体。此外,在另一个实施方案中,本发明可用于监测被诊断为患有前列腺癌的个体,更具体地,在接收该疾病的治疗前被密切监测疾病进展的个体。上述用途都包括在提供临床评估的范围内。
在另一个实施方案中,根据本发明的前列腺癌临床评估还允许或包括确定在提供该临床评估后将给予受试者的具体或更适合的疗法。适用的疗法包括但不限于:手术(例如前列腺切除);肿瘤破坏疗法(例如冷冻疗法);放疗(例如近距放疗);和药物和其他剂疗法(例如化疗和激素疗法)。
试剂盒和组合物
在各种实施方案中,可在本发明的范围内考虑多种试剂盒配置。试剂盒可包括如本文所述的一个或多个组分、物质或设备零件。本发明还包括用作上述试剂盒的组分的试剂和组合物。在其他实施方案中,本发明涉及诊断组合物,包括用于检测本发明的前列腺癌签名的试剂。在具体实施方案中,该诊断组合物还包括从其提取的尿、血、组织或核酸。
在一个实施方案中,该试剂盒或组合物可包括至少一个与以下一个或多个杂交的寡核苷酸(例如探针或引物):
(1)根据本发明的前列腺癌标志物的核酸序列;
(2)编码本发明的前列腺癌标志物蛋白的多核苷酸;
(3)与(1)或(2)完全互补的序列;或
(4)在高严格条件下与(1)、(2)或(3)杂交的序列;
在另一个实施方案中,本发明涉及试剂盒或组合物,包括允许检测至少两个本发明的前列腺癌标志物(例如RNA标志物)的试剂。
在另一个实施方案中,本发明的试剂盒优选地包括用于运送样品的容器,例如用于运送尿或血的容器。
在另一个实施方案中,本发明的试剂盒或组合物优选地也包括至少一个与以下一个或多个杂交的寡核苷酸(例如探针或引物):
(1)根据本发明的对照标志物的核酸序列;
(2)编码本发明的对照标志物蛋白的多核苷酸;
(3)与(1)或(2)完全互补的序列;或
(4)在高严格条件下与(1)、(2)或(3)杂交的序列。
应当理解,可在不背离本申请的精神或范围的前提下使用本文说明的方法、试剂和组合物的多种其他配置。上述方法的部分可单独地视作独特的发明。考虑本文公开的说明书和本发明的实施,本发明的其他实施方案对于本领域技术人员而言是明显的。预期本说明书和实施例仅视为示例性的,本发明的真实范围和精神由权利要求书指出。此外,尽管本申请以具体顺序列出了方法或过程的步骤,在某些情况下改变一些步骤实施的顺序和/或组合一个或多个步骤是可能或者甚至有利的,并且本文说明的方法或过程的具体步骤不意欲被解释为顺序特异性的,除非在权利要求书中清楚地说明了这种顺序特异性。
表1
选择用于基因表达谱分析的候选标志物列表
表2
供基因表达标准化而评价的内源对照标志物列表
表3A
全尿样品种候选标志物的表达特征
表3B
尿沉淀物中候选标志物的表达特征
表4A
全尿样品中前列腺癌多基因签名的性能特征
表4B
确认前列腺细胞存在的尿样中前列腺癌多基因签名的性能特征
表10:序列表
通过以下非限制性实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
全尿样品的基因表达谱分析
我们确定了在患有或被怀疑患有前列腺癌的男性全尿样品中基因表达谱分析的技术可行性。在进行经直肠超声引导的前列腺活检前从进行了直肠指检(DRE)的90位男性收集尿样,活检的结果被用于将受试者分为两组:(1)患前列腺癌的男性;和(2)不患前列腺癌,有或没有良性前列腺症状的男性。活检结果用于将受试者分配如上述两组其中一个。良性前列腺癌症状包括:良性前列腺增生(BPH)、高级别前列腺上皮内瘤(HG-PIN)、非典型小腺泡增殖(ASAP)和/或非典型前列腺细胞(Atypia)。在所有情况下,样品的分类或分层基于病理学家评估的活检的解释。在根据活检结果分层后,45个尿样被鉴别为来自患有前列腺癌,具有确认的阳性活检的男性,45个尿样被鉴别为来自具有阴性活检结果的男性。
在活检前,由医生对受试者进行了细心的DRE,医师被指示进行15至30秒的彻底的前列腺触诊。在DRE后,收集最初的20至30mL排出的尿并与等体积的含硫氰酸胍的缓冲液混合。从该全尿样品基于离液剂的变性性质提取了总RNA,将核酸与二氧化硅颗粒结合,最后用缓冲的水洗脱。
基因表达水平用RT-qPCR使用基因表达测定(AppliedBiosystems)测量。基于其在前列腺或前列腺癌细胞中报道的表达预先选择了一组候选标志物。用于本研究的基因表达谱分析的候选标志物的列表在表1中给出。所有测定都选择进行标准基因表达实验,因为它们可检测到目的基因的最大转录物数而不检测具有相似序列的基因产物,例如同系物。大部分测定设计跨过外显子-外显子结合处,靶标短扩增子而不检测脱靶序列,因而增加PCR反应的效率和特异性。根据用NCBI的Entrez SNP数据库对每个测定的评估,发现对于本研究使用的一些测定,单核苷酸多态性(SNP)位于某些探针或引物序列下。每个相关的SNP的参考序列(RS)编号也列于表1。
使用从全尿样品提取的核酸和High-Capacity Archive试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA),用随机六聚体作为引物将约20μL RNA转录为单链cDNA,终体积为100μL,如制造商的实验方案所述。对表1中列出的每个候选标志物,按制造商的推荐用5μL 1:10(v/v)稀释于不含DNA酶/RNA酶的水中的cDNA反应物、Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)和基因表达测定(Applied Biosystems)以20μL的终体积在7900HT快速PCR系统(Applied Biosystems)上进行定量实时PCR(qPCR)反应。在全部qPCR反应中用两份外源性内部阳性对照(VIC探针)作为内部阳性对照(IPC)以区分由于没有靶标序列而被鉴别为阴性的样品和由于PCR抑制剂存在而被鉴别为阴性的样品。
原始数据用仪器的Sequence Detection System(SDS)软件记录。对每个候选前列腺癌标志物确定循化阈值(Ct)。此外,根据ΔCt方法计算标准化的基因表达值,其中计算每个前列腺癌标志物的Ct和表2中列出的5个对照标志物(即HPRT1、TBP、IPO8、POLR2A和GUSB)的平均Ct值的差值。数据被标准化以修正可能的技术变异和每个PCR反应中RNA完整性和量的偏差。在正常和前列腺癌受试者之间比较标准化的基因表达值。对每个单独的前列腺癌标志物,非癌症和癌症受试者之间平均表达值的差异(ΔCt)列于表3A中。根据非癌症和癌症受试者之间基于t检验的变化显著性将前列腺癌标志物排序。p值<0.05视作统计学上显著的。发现最高评分的前列腺癌标志物ERG、PCA3和CACNA1D在来自患有前列腺癌的受试者的全尿样品中比来自不患前列腺癌的受试者的样品中高度过表达。
除了基本表达谱分析,用接受者操作特征曲线下面积(以下称为AUC和ROC曲线)分析了单个前列腺癌标志物的性能以识别与全尿样品中存在前列腺癌细胞相关的基因。表3A提供了全尿样品的性能特征。可以看到,根据标准化表达,最高评分的基因也是最佳地区分尿样来自非前列腺癌受试者还是前列腺癌受试者的基因。
实施例2
尿沉淀物的基因表达谱分析
对来自77名受试者,在DRE后获得的尿样重复了实施例1中所述的研究并用定量RT-PCR分析了表1中所列基因,不同之处在于没有使用全尿,而是在核酸提取前将尿样离心以沉淀细胞。整个过程在临床离心机以2,500rpm进行了约15分钟。然后按实施例1中所述提取了获得的含有来自泌尿生殖道的上皮细胞尿沉淀物。表3B提供了各个基因的正常受试者和癌症受试者平均标准化表达值以及基于ROC曲线分析的性能特征。与前列腺癌细胞的存在显著相关的基因被上调或下调。确定了表达水平在正常受试者和前列腺癌受试者之间显著不同的基因可用于预测个体中癌症的存在或癌症的发展。
实施例3
用于研究与前列腺癌显著相关的基因的机器学习方法
在此,我们用机器学习方法分析了来自实施例1的90个全尿样品的标准化基因表达数据以根据其区分前列腺癌患者和非前列腺癌个体的能力选择和加权单个基因、基因对或成组基因。有多种不同的组合单独地最佳分离大量数据源的基因的方法,其中一种是根据预先选定的基因子集设计类别预测(也称为分类器)。我们用一组通过取两个ΔCt的最大值(例如"maxERG CACNA1D")或通过两对基因的ΔCt相减(例如ERG-SNAI2)获得的成对基因特征补充了该组单个基因特征。尽管实施例1和2中发现了一些选定基因与癌症和/或前列腺的联系,其与前列腺癌标志物PCA3的联系未被先前记载。
我们选择了5个机器学习算法:朴素贝叶斯、线性判别式分析(LDA)、二次判别式分析(QDA)、随机森林、使用径向和线性内核的支持向量机(SVM)。上述不同的机器学习算法都在本领域普遍认可并广泛使用,但其设计差别足够显著以允许我们覆盖大范围的数学模型,确保我们找到至少一个最佳模型。通过用机器学习算法对含有一组候选标志物的标准化的基因表达值(例如ΔCt)的数据组训练计算模型,我们能够定义能提供前列腺癌临床评估的多基因签名,其中调整了最佳参数以实现最佳临床性能。
为评估该模型的性能,使用了双样品移除交叉验证。简言之,从数据组移除一个癌症和一个非癌症样品,对其余的数据组训练模型的参数。在训练期后,将该模型应用于取出的样品。使用交叉验证,由于测试模型的样品未被用于训练,能获得该多基因签名性能的无偏估计。此交叉验证步骤的结果是交叉验证的接受者操作特征(ROC)曲线,我们能计算该ROC曲线下面积(AUC)。表4A说明了每个多基因签名的最高评分的机器学习算法及其相应的临床性能。使用ΔCt方法基于选自表2的5个内源对照基因的平均表达值的数据标准化允许我们用机器学习算法产生多基因签名。我们观察到随机森林和朴素贝叶斯分类器代表了两个最佳性能的机器学习方法。AUC与PCA3比PSA的比例相比的变化也被定量,用DeLong检验产生了p值。p值<0.05视作提供最佳总体检验的统计证据。
总共发现了53个优于PCA3比PSA测试的多基因前列腺癌签名,一些签名使用少至两个前列腺癌标志物(表4A)。使用同样的方法,我们将选择的机器学习算法应用于包括全尿样品和尿沉淀物,具有由KLK3基因表达水平评估确认前列腺细胞存在的一组样品(表4B)。此分析的结果用于验证通过使用机器学习算法产生的选择的前列腺癌签名能准确地提供含有不一定来自前列腺癌细胞的污染前列腺细胞背景的生物样品(例如全尿或尿沉淀物)中前列腺癌的临床评估。
表5提供可在多种前列腺癌签名中作为前列腺癌标志物的25个单个基因的列表。有趣的是,我们观察到KRT15、ERG、CACNA1D和LAMB3在最高评分的前列腺癌签名中反复存在。
实施例4
前列腺组织中选定基因的表达谱分析
在快速改变的技术环境中开发诊断测定是有挑战性的。存在能区分正常、良性和恶性前列腺组织和预测前列腺癌的范围和恶性的新标志物的紧迫需求。尽管基于尿的标志物可能对活检前筛查特别需要,在经活检的前列腺组织或手术切除的前列腺中的基因表达评估也可用于诊断和预后前列腺疾病。因此,本研究用定量RT-PCR考察了参比(表2)和前列腺癌相关基因(表6A)构成的一组36个基因的基因表达水平。本研究总共使用了9个来自前列腺切除物;5个来自正常组织和4个来自前列腺癌组织的样品。样品的分类基于由病理学家评估的Gleason评分、TNM分期系统和肿瘤相关百分比的解读。用20份重悬于1mL试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)的5μm从新鲜冷冻的前列腺组织提取RNA。核酸(RNA和少量DNA)的提取按制造商的建议提取并重悬于60μL不含DNA酶/RNA酶的水中。
提取的核酸的量和质量用Quant-iTTM RNA测定试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)和NanodropTM ND-1000分光光度计(Thermo Scientific,Wilmington,DE)评估。使用最少250ng从前列腺组织提取的核酸和用随机六聚体作为引物的High-Capacity Archive试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA),将RNA转录为单链cDNA,终体积为50μL,如制造商的实验方案所述。基因表达水平使用 基因表达测定测量。如表2和表6A中列出的,准备两份,和TaqM外源性内部阳性对照一起按制造商的推荐用5μL 1:10(v/v)稀释于不含DNA酶/RNA酶的水中的cDNA反应物、Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)和基因表达测定(Applied Biosystems)以20μL的终体积在7900HT快速PCR系统(AppliedBiosystems)上进行定量实时PCR反应。所有分析对用来自5个参比基因(HPRT1、TBP、IPO8、POLR2A和GUSB)的平均Ct值标准化的基因表达水平进行。
对每个单独的基因,正常组织和前列腺癌组织之间平均表达值的差异(ΔCt)列于表6A中。根据正常受试者和癌症受试者之间基于Student's T-检验的变化显著性将基因排序。基本表达谱分析显示同源异型盒家族的成员HOXC6和HOXC4在前列腺癌中被上调。同源异型盒基因是一个相似基因的大家族,其在早期胚胎发育中指导许多身体结构的形成。同源异型盒家族的基因在发育中参与多种重要活性,在培养的细胞中,其表达促进细胞转化。也观察到CRISP3、TDRD1和PCA3表达的差异,但差异不显著。此外,也发现多个基因在前列腺癌组织中被显著地下调。其中有多个已知的前列腺癌相关基因,例如TRIM29、EFNA5和LAMB3。参与上皮细胞中原癌基因转化的转录抑制因子SNAI2也被发现在前列腺癌中显著下调。
因此,我们提供其表达水平能区分前列腺癌、正常前列腺组织和良性前列腺症状的基因的子集(或分类器)。也观察到基因通常共同作用,其表达可被以协调的方式共调控,此过程也称为共存(或共调控)。为疾病过程例如癌症鉴别的共调控的基因可作为肿瘤状态的生物标志物,因此可代替与其共表达的测定基因或与与其共表达的测定基因共同使用。用含有来自150个患有前列腺癌的患者的log2全转录物mRNA表达值的公共数据组(GSE21032)进行了26个选择的与前列腺癌存在相关的基因的相互排斥和共表达分析(表6B)。用Human Exon 1.0 ST Array(Affymetix,Santa Clara,CA)进行原发和转移前列腺癌组织的基因表达谱分析。
某些癌症基因以共存或相互排斥的方式在肿瘤发生中起作用。在此,一个目标是鉴别在多个患者中上调或下调,属于相同的生物过程,例如癌症发生和发展的成组的相关基因。基本原理是被相似途径调控的基因应当比在预先配置的根据多种相似性的测量类别的成组基因中预期的更频繁地共存。因此,预期其表达被相似的信号调控的基因在不同的基因表达签名中显著地共存,并与不同的生物途径形成强相关的网络。显示此类性质的成组基因极可能驱动癌症发展。可通过cBio癌症基因组学入口(http://cbioportal.org)获得的算法计算所有基因对之间的相互排斥或共存,通过对各个基因对进行Fisher精确检验,产生所有靶标基因的p值的二元矩阵(表6B)。使用此方法,单个基因以及整个签名可分配到途径例如癌症发生和发展,其中基因签名的组成完全由与途径分配一致的共同基因组特征确定。在此过程后,我们鉴别了两对基因FLNC:TAGLN和HOXC4:HOXC6,其表现统计学上显著的强共存倾向,p值<0.00001。大量基因也显示了显著的共存倾向。例如,其中一个最高评分基因CRISP3被发现与9个其他基因共表达。观察到的对CRISP3最强的相关是TDRD1、ERG和CACNA1D(全部p值<0.001)。尽管在癌症组织中只是少量下调,参与雄性激素代谢途径的SRD5A2基因是最普遍的共调控基因之一,被发现与18个测试的其他基因显著地共表达。在搜索相互排斥成组基因时,只发现6个具有强相互排斥倾向的基因。PCA3/KLK3基因对有最高的相互排斥p值(p=0.0045)。其他两个高评分对包括ERG:HOXC6(p=0.02)和OR51E1:RASSF1(p=0.018)。
实施例5
用于准确标准化尿样中大量基因表达数据的基因的选择
为最小化误差和样品间变异,来自定量RT-PCR的基本表达谱分析通常基于具体核酸序列与内部标准物的相对定量进行。使用RT-qPCR平台或其他相关扩增方法的相对基因表达精确和准确的标准化需要评估临床样品中稳定的对照标志物。用于与前列腺癌标志物结合使用检测患者样品中前列腺细胞的内源对照标志物应当理想地具有不受组织或血液中癌细胞的存在显著影响的表达,以及在取自不同个体的样品中或在胁迫因素例如碱性条件下具有相似的行为。
为鉴别在可含有前列腺细胞的样品中具有稳定表达适当的对照标志物,确定了来自的152个非前列腺癌受试者、109个前列腺癌受试者的全尿样品和9个冷冻前列腺组织(5个非癌症,4个癌症)中10个候选内源参比基因的表达。RT-qPCR按上文实施例1中说明的进行,每个反应板包括使用市售可得的人通用RNA(Clonetech)的外源对照反应。
理想的参比基因应当在来自前列腺癌和非前列腺癌受试者的尿样中维持恒定的表达。表达稳定性用geNormTM软件分析。大体上,geNormTM使用逐对比较模型选择在样品中显示最小表达比例变异的基因对。该软件为每个内源参比基因计算基因稳定性度量(M)。图1说明了一些测试的基因的M值。两个基因(IPO8和POLR2A)显示了低于geNormTM默认阈值1.5的M值。尽管选择的参比基因具有变化的M值,其在前列腺癌中的表达本身不被去调控。此外,尽管POLR2A和IPO8被鉴别为最稳定的基因对,TBP和GUSB在尿样中显示了其mRNA表达更少的变化(图1)。
对于RNA表达标准化,在定量PCR中使用单个基因是标准实践。然而,我们的研究发现参比基因表达可相当大地改变。这说明使用多个参比基因可提高相对定量研究的准确性。因此,需要鉴别用于待测试的样品(例如尿)的适当的对照标志物的组合。为确定定量PCR标准化所需的最佳参比基因数量,geNorm软件对每个依次增加数量的参比基因计算了逐对变异V。图2A说明了由geNorm软件计算的逐对变异的曲线。geNorm V值0.3用作确定最佳基因数量的阈值。此分析显示,在使用的条件下,在使用提取自全尿样品的RNA时,内源参比基因的最佳数量是4个(POLR2A、IPO8、GUSB和TBP)(图2A)。
例如,列于表2中的对照标志物在癌症前列腺组织中与非癌症前列腺组织相比未显示显著不同的表达水平,其表达在取自不同患者的相同组织类型中也非常地恒定(图2B)。尽管一个或多个基因的基因表达谱分析通常在组织样品中测量,改变的基因的表达水平也可在从远离原发肿瘤组织的位点,例如远侧器官、循环肿瘤细胞和体液(例如尿、精液、血和血级分)收集的细胞中测量。为此目的,我们用由来自10个人细胞系的总RNA组成的人通用RNA进一步评估了源自不同于前列腺的其他恶性肿瘤的细胞系中的参比基因表达水平。此人通用RNA被设计用于基因谱分析实验。
除了上述4个内源参比基因,需要使用特异于前列腺细胞的标志物,例如PSA(也称为KLK3)以对照源自样品中前列腺细胞的核酸的存在。为证明使用前列腺特异性标志物用于尿样中基因表达数据标准化的可能性,在男性泌尿生殖道肿瘤和非肿瘤组织中鉴别了列于表2中的(5)个前列腺特异性对照标志物的组织特异性(图2C)。全部基因显示了在前列腺组织中比测试的全部其他组织高数个数量级的表达水平。此类前列腺特异性对照标志物的高特异性允许识别源自非前列腺细胞中前列腺上皮细胞的核酸的存在。因此,此类前列腺特异性对照标志物可代替PSA(也称为KLK3)或与其共同用于样品可含有来自非前列腺细胞的核酸的基因表达水平标准化。
因此,第二步是测试不同的标准化方法并评估各个前列腺特异性对照标志物对AUC的影响。我们测试了用4种不同方法的标准化:(1)使用外源内部阳性对照双份PCR的Ct(“Exo”);(2)使用5个内源参比基因的平均值(“平均Endo”);(3)使用PSA(“PSA”);和(4)同时使用PSA和外源内部阳性对照(“Exo+PSA”)。通过将单个标志物的分类的AUC作为不同标准化方法的函数在图3中画图,我们验证了性能的差异。水平线对应95%预期随机性能,表示高于此线的全部标志物具有显著高于随机预测的性能。使用此类条件,我们观察到在测试大量基因表达数据组(例如150个基因或更多)时,使用(5)个内源参比基因的平均值的方法对单个基因给出了更可再现的AUC。
实施例6
根据用RT-qPCR分析的全尿样品(包括来自正进行治疗的患者的尿)
验证前列腺癌分类器
列于表5中的前列腺癌标志物的选择基于t检验p值的不同阈值和ROC曲线下面积(AUC)。AUC用作性能度量以确定基因是否有与来自尿样的前列腺癌临床评估正或负相关的表达模式。在建立基因子集后,用贝叶斯规则组合最佳前列腺癌标志物(根据从尿样中前列腺癌的检测排序)。为验证用第一方法定义的多基因前列腺癌签名,我们组合了两个数据组以评估选择数量的多基因前列腺癌签名的性能,随机分配的样品组作为训练组,其余样品作为验证组。用174个全尿样品(包括73个来自前列腺癌受试者患者的样品和101个来自非前列腺癌受试者的样品)训练获得的朴素贝叶斯分类器随后被用于预测生物样品中前列腺癌的可能性。给定属性值a1;a2;…an,该朴素贝叶斯分类器选择最可能的分类Vnb(例如正常或肿瘤)。在此实例中,Vnb可以是肿瘤或正常,属性值ai代表对应由RT-qPCR提供的标准化的基因表达水平(ΔCt)的真实值。这导致相应的分类器:
我们通常用正态分布估计P(ai︱vj),其每个类别和基因的平均μvj值和标准差σvj从训练组估计如下:
其中
ai=基因i的ΔCt
vj=肿瘤或正常
μvj=类别vj和基因i的平均值
σvj=类别vj和基因i的标准差
例如,对于5基因朴素贝叶斯分类器,我们需要从训练组估计2×5×2(代表平均值和标准差)=20个参数。在应用此类机器学习算法时,强烈建议加入交叉验证步骤,因为在一些情况下,算法可良好分类训练组中的样品,但在独立的测试组中产生较差的结果。这一现象称为过拟合。为在模型选择中避免过拟合,前列腺癌标志物的选择用训练组内20个重复的10倍交叉验证进行。对于本分析,我们使用了“取出两个”交叉验证,其涉及移除一个癌症样品和一个非癌症样品以训练该算法,然后用该取出的样品回测。不同模型的性能用AUC比较。用200个重复选择参数数量以最大化AUC,最小化批次间随机变异。对训练组计算得到最高平均交叉验证的AUC的参数鉴别为最佳参数。用作朴素贝叶斯参数的真值是前列腺癌标志物的标准化表达水平(ΔCt)或从一对基因计算的参数。例如,分类器3包括基因对作为朴素贝叶斯参数。在此具体实例中,ERG-SNAI2参数代表在测试的全体中最上调的基因ERG和最下调的基因SNAI2之间的差异表达,通过从ERG的ΔCt值减去SNAI2的ΔCt值计算。在另一个分类器中,朴素贝叶斯参数是从由共调控的基因ERG和CACNA1D组成的集合中选择的最过表达的基因,在本文中在分类器4中称为maxERG CACNA1D。
最后,在训练组合格的选择的分类器应用于验证组中的87个生物样品。表7A说明了在来自患有或被怀疑患有前列腺癌的男性的174个全尿样品的训练组和87个全尿样品的验证组中18个前列腺癌签名性能特征。我们使用DeLong检验验证在训练和验证组中从给定的分类器观察到的AUC与PCA3/PSA比例相比的差异。也对由活检样品中高Gleason评分定义的前列腺癌侵袭性分析了每个个体的性能。与Gleason评分相关的p值列于表7A中。所有选择的用此方法产生的多基因签名能根据前列腺癌的存在与否显著地区分受试者(图4A-F)。AUC评分说明该18个前列腺癌签名在训练组和验证组中能多准确地相对全部其他症状检测前列腺癌。
在本文中,我们评估了3个不同的标准化方法,其中前列腺特异性标志物例如PSA用作对照标志物以标准化与尿样中前列腺上皮细胞的存在相关的基因表达数据。我们的结果表明增加标准化基因的数量提高分类器的总体性能(表7A)。如实施例5中所述,不同于PSA的前列腺特异性标志物可用于标准化步骤,以对照源自样品中前列腺细胞的核酸的存在。表7B说明了选择的使用不同于PSA的前列腺特异性对照标志物的分类器的性能特征。接受者操作特征(ROC)曲线的分析确认了将该前列腺特异性对照标志物加入其它对照标志物而获得的提高的诊断准确性(表7B)。
我们也是想验证本发明的前列腺癌分类器也能用于正在进行不同于前列腺癌的良性症状,例如BPH的治疗的男性群体中。因此,对51个服用5-α-还原酶抑制剂,例如度他雄胺(AvodartTM)或非那雄胺(ProscarTM、PropeciaTM),或者α-1肾上腺素受体拮抗剂例如坦索罗辛(FlomaxTM)或阿夫佐辛(XatralTM)的个体的组进行了ROC曲线分析。表8提供了使用来自14位具有确认的前列腺癌的患者的尿样与来自非前列腺癌受试者的37份样本相比的前列腺癌分类器的性能特征,所有受试者都正在服用BPH药物。为比较目的,提供了来自相似的已知不服用BPH药物的队列的结果。该18个前列腺签名的性能特征在服用BPH药物的组优于已知不服用BPH药物的队列。
据文献报道,BPH药物(例如5-α-还原酶抑制剂)能降低发生前列腺癌的概率。BPH药物的这一可能的额外效果可解释选择的分类器在此队列中与未服用BPH药物的个体相比较好的整体性能。上述结果说明在服用BPH药物的男性中用本发明的基因签名筛查前列腺癌是防止前列腺癌发生的实用的方法。
此外,通过进一步估计其致命性前列腺癌的风险,从而指导治疗决定以改善结果并减少过度治疗,该签名似乎也在Gleason7的男性中有临床应用。用来自以下的全尿样品进行了比较:(1)非前列腺癌受试者;和(2)具有最高Gleason评分(≥7)模式的前列腺癌受试者。用此204个尿样子集分析了该18个前列腺癌签名的每一个。表9提供了使用朴素贝叶斯算法的前列腺癌分类器在来自52名Gleason评分≥7的患者的全尿样品与来自非前列腺癌受试者的152份样品相比的性能特征。使用与上述相同的实验设置,每个分类器能根据尿样分析准确地区分具有高Gleason评分(≥7)的癌症受试者和非前列腺癌受试者。增加标准化基因的数量也增加了该分类器的整体性能。
表9也提供了前列腺癌分类器在个体子集中的性能特征,其中该测试用在DRE后,但在第一次活检前收集的最初的20至30mL排出的尿进行。总共筛查了220个个体,122具有随后的阴性活检结果,而98个具有前列腺癌的确诊。重要的是,全部分类器能准确地识别具有增加的具有第一个阳性活检结果风险的患者,其性能特征列于表9。
实施例7
与前列腺癌存在显著相关的基因的预后能力
对于一些应用,不仅基于概率评分诊断受试者中癌症的存在,而且能使用该评分预测受试者治疗后的结果可以是有用的。如实施例6中所述,某些分类器中选择的一些前列腺癌标志物与高Gleason评分相关(表7A和表9),因此可用于预测疾病发展和不良结果。因此,我们选择从(5)个分类器选择了一个子集的基因并通过测试进行了根治性前列腺切除术的前列腺癌受试者测试它们是否具有预后能力。我们使用了含有来自150个前列腺癌组织样品的基因表达数据的公共数据组(GSE21032)测试此子集的基因的基因表达水平改变是否与增加的发生侵袭性癌症的风险相关,因而与不良结果相关。每名受试者的基因表达数据用Human Exon 1.0 ST Array(Affymetix,SantaClara,CA)产生,包括对每名受试者的临床数据注释。我们根据5个选择的与前列腺癌的存在相关的基因签名通过cBio癌症基因组学入口(http://cbioportal.org)进行了无疾病存活分析。作为说明性实例,图5A展示了两个包括于分类器1的前列腺癌标志物的OncoPrintTM。在此情况下,我们观察到,此分类器内基因的mRNA表达改变在超过50%的病例中存在。该入口也支持存在于该分类器的基因与被报道属于共同途径的基因之间的网络相互作用的可视化(图5B)。
图5-9的C部分展示了前列腺切除后无疾病存活的卡普兰-梅尔曲线。对每个选择的分类器,根据mRNA表达Z值,在基因表达改变的受试者中与基因未改变的患者相比进行无疾病存活分析。全部5个分类器能预测具有改变的mRNA表达的患者中更差的存活。对该5个测试的分类器,基因在至少一半的病例中改变,其中一些分类器在150个前列腺癌患者中有超过100个具有改变的基因表达的病例。总体上,在这些分类器中选择的基因集合在前列腺癌中被上调或下调,是前列腺切除后结果的有用的预测工具。本发明强调和证明了基于选择的多基因签名的诊断方法,以及作为改进的前列腺癌预后和治疗分层的工具的潜在价值。
因此,本发明的分类器和签名不仅涉及前列腺癌的诊断,也涉及预后、级别确定、患者结果等。因此,本发明的分类器和签名是前列腺癌的极有力的临床评估工具。
实施例8
合并PCA3标志物的前列腺癌多基因签名的性能特征
使用如上所述的相同的实验设置,进行了一系列实验以确定将PCA3标志物加入本发明的没有PCA3的前列腺癌多基因签名中对性能特征的影响。性能标准是ROC曲线下面积(AUC),其中ROC曲线是灵敏性作为特异性的函数的曲线。AUC量度分类器在不影响具体阈值的情况下监测灵敏性/特异性权衡的良好程度。对此测定,我们使用了分类器3(类别3;表7A)多基因签名和5个对照标志物(IPO8、POLR2A、GUSB、TBP、KLK3)以评估加入PCA3标志物的影响。两个方法之间的区别只是将PCA3非编码RNA作为已知前列腺癌标志物加入该多基因签名以预测生物样品中前列腺癌的可能性。
出乎意料的是,我们的结果证明将PCA3非编码RNA加入本发明的前列腺癌分类器不提高该分类器的总体性能(图12A)。总体上,面积之间的差异没有导致队列中特异性的灵敏性增加(图13)。如实施例6中所述,该分类器能根据尿样分析准确地区分具有高Gleason评分(≥7)的癌症受试者和非前列腺癌受试者。同样,将PCA3非编码RNA包括到该前列腺癌标志物集合未导致AUC统计学上显著的改善,AUC为0.807,而没有PCA3的AUC为0.791(DeLong p值=0.4224)(图12B)。
尽管本发明在上文中以其具体实施方案的方式说明,它可在不背离如所附权利要求书定义的本发明的精神和本质的前提下修改。
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Claims (75)
1.一种提供受试者中前列腺癌临床评估的方法,所述方法包括:
(a)确定来自所述受试者的生物样品中至少两个表5或6A中列出的前列腺癌标志物或与其在前列腺癌中共调控的标志物的表达;
(b)用一个或多个对照标志物标准化所述至少两个前列腺癌标志物的表达;
(c)对所述至少两个前列腺癌标志物的经标准化的表达水平进行数学关联;
(d)从所述数学关联获得评分;和
(e)根据所述获得的评分提供所述前列腺癌的临床评估。
2.一种提供受试者中前列腺癌临床评估的方法,所述方法包括:
(a)选择根据其在已知患有或不患前列腺癌的患者群体的尿中表达谱验证的至少两个前列腺癌标志物;
(b)确定所述至少两个前列腺癌标志物在来自所述受试者的生物样品中的表达;
(c)用一个或多个对照标志物标准化所述至少两个前列腺癌标志物的表达;
(d)对所述至少两个前列腺癌标志物的经标准化的表达进行数学关联;
(e)从所述数学关联获得评分;和
(f)根据所述获得的评分提供所述前列腺癌的临床评估。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中所述至少两个前列腺癌标志物是至少三个前列腺癌标志物;至少四个前列腺癌标志物;至少五个前列腺癌标志物;至少六个前列腺癌标志物;至少七个前列腺癌标志物;至少八个前列腺癌标志物或至少九个前列腺癌标志物。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法,其中所述至少两个前列腺癌标志物选自:
(1)CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(2)ERG或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(3)HOXC4或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(4)ERG-SNAI2前列腺癌标志物对;
(5)ERG-RPL22L1前列腺癌标志物对;
(6)KRT 15或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(7)LAMB3或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(8)HOXC6或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(9)TAGLN或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(10)TDRD1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(11)SDK1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(12)EFNA5或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(13)SRD5A2或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(14)maxERG CACNA1D前列腺癌标志物对;
(15)TRIM29或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(16)OR51E1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;和
(17)HOXC6或与其在前列腺癌中共调控的标志物。
5.如权利要求1至4任一项所述的方法,其中所述至少两个前列腺癌标志物包括CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物。
6.如权利要求1至4任一项所述的方法,其中所述至少两个前列腺癌标志物包括CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物,以及ERG或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物。
7.如权利要求4所述的方法,其中所述前列腺癌标志物按如表7-9所定义的分类器组合。
8.如权利要求1至7任一项所述的方法,其中所述与其在前列腺癌中共调控的标志物中的一个或多个如表6B所定义。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法,其中所述一个或多个对照标志物包括内源参比基因。
10.如权利要求1至8任一项所述的方法,其中所述一个或多个对照标志物包括至少一个前列腺特异性对照标志物。
11.如权利要求1至8任一项所述的方法,其中所述一个或多个对照标志物如表2、表7A和/或表7B所定义。
12.如权利要求10所述的方法,其中所述前列腺特异性对照标志物包括KLK3、FOLH1、FOLH1B、PCGEM1、PMEPA1、OR51E1、OR51E2和PSCA中的一个或多个。
13.如权利要求10所述的方法,其中所述对照标志物包括KLK3、IPO8和POLR2A。
14.如权利要求10所述的方法,其中所述一个或多个对照标志物包括IPO8、POLR2A、GUSB、TBP和KLK3。
15.如权利要求1至14任一项所述的方法,其中所述前列腺癌的临床评估包括:
(i)前列腺癌的诊断;
(ii)前列腺癌的预后;
(iii)前列腺癌的分期评估;
(iv)前列腺癌侵袭性分类;
(v)治疗有效性评估;
(vi)前列腺活检需求的评估;或
(vii)(i)至(vi)的任意组合。
16.如权利要求1至15任一项所述的方法,其中所述标志物是基因。
17.如权利要求1至15任一项所述的方法,其中所述标志物是蛋白。
18.如权利要求1至15任一项所述的方法,其中所述确定所述至少两个前列腺癌标志物的表达包括确定RNA表达和/或蛋白表达。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述确定RNA表达包括进行杂交和/或扩增反应。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述杂交和/或扩增反应包括:
(a)聚合酶链式反应(PCR);
(b)基于核酸序列的扩增测定(NASBA);
(c)转录介导的扩增(TMA);
(d)连接酶链式反应(LCR);或
(e)链取代扩增(SDA)。
21.如权利要求19或20所述的方法,其中所述确定RNA表达包括至少两个前列腺癌标志物的直接测序。
22.如权利要求1至21任一项所述的方法,其中所述生物样品是尿、前列腺组织切除物、前列腺组织活检样品、精液或膀胱洗液。
23.如权利要求1至21任一项所述的方法,其中所述尿是全尿或粗尿。
24.如权利要求1至21任一项所述的方法,其中所述生物样品是尿沉淀物。
25.如权利要求23或24所述的方法,其中所述尿在有或没有在先的直肠指检下获得。
26.一种前列腺癌诊断组合物,包括:
(a)来自患有或怀疑患有前列腺癌的受试者的尿或其具有前列腺源标志物的级分;和
(b)允许检测和/或扩增至少两个表5或6A中列出的前列腺癌标志物或与其共调控的标志物的试剂。
27.如权利要求26所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述至少两个前列腺癌标志物是至少三个前列腺癌标志物;至少四个前列腺癌标志物;至少五个前列腺癌标志物;至少六个前列腺癌标志物;至少七个前列腺癌标志物;至少八个前列腺癌标志物或至少九个前列腺癌标志物。
28.如权利要求26或27所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述至少两个前列腺癌标志物选自:
(1)CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(2)ERG或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(3)HOXC4或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(4)ERG-SNAI2前列腺癌标志物对;
(5)ERG-RPL22L1前列腺癌标志物对;
(6)KRT 15或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(7)LAMB3或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(8)HOXC6或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(9)TAGLN或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(10)TDRD1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(11)SDK1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(12)EFNA5或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(13)SRD5A2或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(14)maxERG CACNA1D前列腺癌标志物对;
(15)TRIM29或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(16)OR51E1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;和
(17)HOXC6或与其在前列腺癌中共调控的标志物。
29.如权利要求26至28任一项所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述至少两个前列腺癌标志物包括CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物。
30.如权利要求26至28任一项所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述至少两个前列腺癌标志物包括CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物,以及ERG或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物。
31.如权利要求28所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述前列腺癌标志物按如表7-9所定义的分类器组合。
32.如权利要求26至31任一项所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述与其在前列腺癌中共调控的标志物中的一个或多个如表6B所定义。
33.如权利要求26至32任一项所述的前列腺癌诊断组合物,还包括允许检测和/或扩增一个或多个对照标志物的试剂。
34.如权利要求33所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述一个或多个对照标志物包括内源参比基因。
35.如权利要求33所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述一个或多个对照标志物包括至少一个前列腺特异性对照标志物。
36.如权利要求33所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述一个或多个对照标志物如表2、表7A和/或表7B所定义。
37.如权利要求35所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述前列腺特异性对照标志物包括KLK3、FOLH1、FOLH1B、PCGEM1、PMEPA1、OR51E1、OR51E2和PSCA中的一个或多个。
38.如权利要求33所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述一个或多个对照标志物包括KLK3、IPO8和POLR2A。
39.如权利要求33所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述一个或多个对照标志物包括IPO8、POLR2A、GUSB、TBP和KLK3。
40.如权利要求26至39任一项所述的前列腺癌诊断组合物,用于提供基于来自受试者的尿样的前列腺癌临床评估,其中所述临床评估包括:
(i)前列腺癌的诊断;
(ii)前列腺癌的预后;
(iii)前列腺癌的分期评估;
(iv)前列腺癌侵袭性分类;
(v)治疗有效性评估;
(vi)前列腺活检需求的评估;或
(vii)(i)至(vi)的任意组合。
41.如权利要求26至40任一项所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述标志物是基因。
42.如权利要求26至40任一项所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述标志物是蛋白。
43.如权利要求26至40任一项所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述试剂允许确定RNA表达和/或蛋白表达。
44.如权利要求26至41任一项所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述试剂允许通过以下检测和/或扩增所述至少两个标志物:
(a)聚合酶链式反应(PCR);
(b)基于核酸序列的扩增测定(NASBA);
(c)转录介导的扩增(TMA);
(d)连接酶链式反应(LCR);或
(e)链取代扩增(SDA)。
45.如权利要求26至41、43或44任一项所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述允许检测和/或扩增所述至少两个标志物的试剂包括允许检测和/或扩增所述至少两个标志物或所述与其共调控的标志物的寡核苷酸。
46.如权利要求26至45任一项所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述尿是全尿或粗尿。
47.如权利要求26至45任一项所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述尿是尿沉淀物。
48.如权利要求25或46任一项所述的前列腺癌诊断组合物,所述尿在有或没有在先的直肠指检下获得。
49.一种用于从来自受试者的生物样品提供受试者中前列腺癌临床评估的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)允许检测和/或扩增至少两个表5或6A中列出的前列腺癌标志物或与其共调控的标志物的试剂;和
(b)适当的容器。
50.如权利要求49所述的试剂盒,其中所述至少两个前列腺癌标志物是至少三个前列腺癌标志物;至少四个前列腺癌标志物;至少五个前列腺癌标志物;至少六个前列腺癌标志物;至少七个前列腺癌标志物;至少八个前列腺癌标志物或至少九个前列腺癌标志物。
51.如权利要求49或50所述的试剂盒,其中所述至少两个前列腺癌标志物选自:
(1)CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(2)ERG或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(3)HOXC4或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(4)ERG-SNAI2前列腺癌标志物对;
(5)ERG-RPL22L1前列腺癌标志物对;
(6)KRT 15或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(7)LAMB3或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(8)HOXC6或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(9)TAGLN或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(10)TDRD1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(11)SDK1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(12)EFNA5或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(13)SRD5A2或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(14)maxERG CACNA1D前列腺癌标志物对;
(15)TRIM29或与其在前列腺癌中共调控的标志物;
(16)OR51E1或与其在前列腺癌中共调控的标志物;和
(17)HOXC6或与其在前列腺癌中共调控的标志物。
52.如权利要求49至51任一项所述的试剂盒,其中所述至少两个前列腺癌标志物包括CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物。
53.如权利要求50至51任一项所述的试剂盒,其中所述至少两个前列腺癌标志物包括CACNA1D或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物,以及ERG或与其在前列腺癌中共调控的前列腺癌标志物。
54.如权利要求51所述的试剂盒,其中所述前列腺癌标志物按如表7-9所定义的分类器组合。
55.如权利要求49至54任一项所述的试剂盒,其中所述与其在前列腺癌中共调控的标志物中的一个或多个如表6B所定义。
56.如权利要求49至55任一项所述的试剂盒,还包括允许检测和/或扩增一个或多个对照标志物的试剂。
57.如权利要求56所述的试剂盒,其中所述一个或多个对照标志物包括内源参比基因。
58.如权利要求56所述的试剂盒,其中所述一个或多个对照标志物包括至少一个前列腺特异性对照标志物。
59.如权利要求56所述的试剂盒,其中所述一个或多个对照标志物如表2、表7A和/或表7B所定义。
60.如权利要求58所述的试剂盒,其中所述前列腺特异性对照标志物包括KLK3、FOLH1、FOLH1B、PCGEM1、PMEPA1、OR51E1、OR51E2和PSCA中的一个或多个。
61.如权利要求56所述的试剂盒,其中所述一个或多个对照标志物包括KLK3、IPO8和POLR2A。
62.如权利要求56所述的试剂盒,其中所述一个或多个对照标志物包括IPO8、POLR2A、GUSB、TBP和KLK3。
63.如权利要求49至62任一项所述的试剂盒,其中所述临床评估包括:
(i)前列腺癌的诊断;
(ii)前列腺癌的预后;
(iii)前列腺癌的分期评估;
(iv)前列腺癌侵袭性分类;
(v)治疗有效性评估;
(vi)前列腺活检需求的评估;或
(vii)(i)至(vi)的任意组合。
64.如权利要求49至63任一项所述的试剂盒,其中所述标志物是基因。
65.如权利要求49至63任一项所述的试剂盒,其中所述标志物是蛋白。
66.如权利要求49至63任一项所述的试剂盒,其中所述试剂允许确定RNA表达和/或蛋白表达。
67.如权利要求48至63任一项所述的试剂盒,其中所述试剂允许通过以下检测和/或扩增所述至少两个标志物:
(a)聚合酶链式反应(PCR);
(b)基于核酸序列的扩增测定(NASBA);
(c)转录介导的扩增(TMA);
(d)连接酶链式反应(LCR);或
(e)链取代扩增(SDA)。
68.如权利要求49至64、66或67任一项所述的试剂盒,其中所述允许检测和/或扩增所述至少两个标志物的试剂包括允许检测和/或扩增所述至少两个标志物或所述与其共调控的标志物的寡核苷酸。
69.如权利要求49至68任一项所述的试剂盒,其中所述生物样品是尿、前列腺组织切除物、前列腺组织活检样品、精液或膀胱洗液。
70.如权利要求49至68任一项所述的试剂盒,其中所述尿是全尿或粗尿。
71.如权利要求49至68任一项所述的试剂盒,其中所述生物样品是尿沉淀物。
72.如权利要求70或71任一项所述的试剂盒,其中所述尿在有或没有在先的直肠指检下获得。
73.如权利要求1-25任一项所述的方法,其中所述至少两个前列腺癌标志物不包括PCA3。
74.如权利要求26-48任一项所述的前列腺癌诊断组合物,其中所述至少两个前列腺癌标志物不包括PCA3。
75.如权利要求49-72任一项所述的试剂盒,其中所述至少两个前列腺癌标志物不包括PCA3。
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