CN109908369B - 一种新的环状RNA circCRKL在前列腺癌治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开环状RNA circCRKL或其增效剂在制备药物中的应用，所述药物用于治疗前列腺癌。本发明首次发现circCRKL与前列腺癌的相关性，通过细胞功能学实验，发现过表达circCRKL以后，可以显著的抑制前列腺癌的增殖、侵袭、迁移和集落形成能力，表明circCRKL在前列腺癌的发生发展过程中起到重要的调节作用。同时，裸鼠成瘤实验表明circCRKL过表达显著抑制了前列腺癌细胞在动物体内的生长，进一步证明circCRKL对于前列腺癌细胞的抑制作用。circCRKL对于前列腺癌的增殖、迁移、侵袭和集落形成的生物学行为具有显著的抑制作用，有望为前列腺癌患者提供新的治疗靶标和方向。

Description

一种新的环状RNA circCRKL在前列腺癌治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种新的环状RNA circCRKL在前列腺癌治疗中的应用。

背景技术

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，2019年美国肿瘤协会预测新诊断前列腺癌174650例，占男性肿瘤的20％，位于男性肿瘤发病率第一位；死亡31620例，位于男性肿瘤死亡率第二位。在我国，近年来随着生活水平的提高以及前列腺特异性抗原(prostatespecific antigen，PSA)筛查的普及，前列腺癌发病率呈上升趋势，而发病年龄随年份增加有所降低。同时，年龄标准化的死亡率从2000年到2011年一直呈上升趋势。

虽然PSA检测广泛用于前列腺癌的筛查和诊断，但是因其导致的过度诊断和治疗，现在PSA检测已经不被专家推荐。因此，寻找更加准确和特异的生物标记物已经成为人们日益迫切的需求。目前，几种类型的生物标志物被专家推荐应用于前列腺癌患者的诊断和预后监测，包括基于血液的

尿液样本为基础的PCA3,

ExoDx Prostate

以组织样本为基础的

然而，这些生物标记物仍缺乏有力的证据被纳入前列腺癌的常规筛查和治疗流程中。

前列腺癌发病机制复杂，许多基因都参与其发病过程，如PTEN、AR、GOLPH3、PAK1等基因，其中雄激素及雄激素受体(androgen receptor,AR)信号通路在前列腺癌发生发展过程中占据重要的地位。早期局灶性前列腺癌可通过根治性手术、放射性粒子植入或外放射达到治愈效果，但晚期前列腺癌的治疗仍以去雄激素治疗(androgen deprivationtherapy,ADT)为主，最终前列腺癌会不可逆地转化为去雄抵抗前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。由于前列腺癌的异质性和发病机制复杂性，临床治疗手段疗效有限，患者会很快进展到前列腺癌不可治愈阶段，给患者本人的健康及家庭造成了严重的危害。因此，深入探讨前列腺癌的发病机制，寻找新的治疗靶点已经成为临床治疗的迫切需要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供环状RNA的新用途。

第一个方面，本发明提供环状RNA circCRKL或其增效剂在制备药物中的应用，所述药物用于治疗前列腺癌。

在上述应用中，作为一个优选方案，所述增效剂为circCRKL过表达质粒载体。

第二个方面，本发明提供环状RNA circCRKL或其增效剂在制备药物中的应用，所述药物用于抑制前列腺癌恶性生物学行为。

在上述应用中，作为一个优选方案，所述恶性生物学行为是指前列腺癌的增殖，过表达circCRKL能够抑制前列腺癌的增殖。

在上述应用中，作为一个优选方案，所述恶性生物学行为是指前列腺癌的迁移，过表达circCRKL能够抑制前列腺癌的迁移。

在上述应用中，作为一个优选方案，所述恶性生物学行为是指前列腺癌的侵袭，过表达circCRKL能够抑制前列腺癌的侵袭；

在上述应用中，作为一个优选方案，所述恶性生物学行为是指前列腺癌的集落形成，过表达circCRKL能够抑制前列腺癌的集落形成。

第三个方面，本发明提供一种治疗前列腺癌的药物组合物，所述药物组合物包括如上所述的环状RNA或增加所述环状RNA的表达量的试剂中的至少一种。

第四个方面，本发明提供一种治疗前列腺癌的表达载体，所述表达载体表达如上所述的环状RNA。

所述的载体包括病毒载体和真核载体。其中病毒载体可以是任意适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体等。真核载体可以是任意适当的载体，包括但不限于pCMT-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA6.0表达载体、pEGFP表达载体、PefBos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者是在已公开表达载体的基础上经改造获得的载体。

本发明中，所述的增效剂包括了激动剂、上调剂、稳定剂等，是指任何能够促进circCRKL的表达、或促进circCRKL的活性、或促进circCRKL的有效作用时间、或促进circCRKL的稳定性的物质。其中增效剂的靶标不限于circCRKL本身，还可以是circCRKL的上下游。例如可以是编码circCRKL的基因组序列、circCRKL的靶基因、调控circCRKL的蛋白或基因。

本发明中，所述的药物还可以包含药学上可接受的载体，例如可以是药物稀释剂、缓冲剂、赋形剂等。所述药物可以按照常规方法制备成各种剂型，包括显微注射剂，或适于转染的注射液、片剂等。所述的药物可以单独施用，或者与其他能够治疗前列腺癌的药物进行组合物使用，受试者可以是人类或其他哺乳动物。

本发明首次发现circCRKL与前列腺癌的相关性，使用慢病毒包装质粒并转染前列腺癌细胞DU145和PC-3细胞，构建了过表达circCRKL的稳转细胞和阴性对照细胞。通过细胞功能学实验，我们发现过表达circCRKL以后，可以显著的抑制前列腺癌的增殖、侵袭、迁移和集落形成能力，表明circCRKL在前列腺癌的发生发展过程中起到重要的调节作用。同时，裸鼠成瘤实验表明circCRKL过表达显著抑制了前列腺癌细胞在动物体内的生长，进一步证明了circCRKL对于前列腺癌细胞的抑制作用。上述体内和体外的功能学实验证实circCRKL对于前列腺癌的增殖、迁移、侵袭和集落形成的生物学行为具有显著的抑制作用，有望为前列腺癌患者提供新的治疗靶标和方向。

附图说明

图1.质粒示意图。

图2.质粒转染后circCRKL表达量。

图3.扩增产物Sanger测序峰图。

图4.CircCRKL在前列腺细胞系的表达。通过实时定量PCR在多种细胞系中检测circCRKL的表达，包括RWPE-1、PC-3、DU145和LNCaP细胞(每种细胞系重复n＝3次)。结果用平均值±标准误表示。*P值<0.05，**P值<0.01。

图5.前列腺癌稳转细胞系构建。图中显示了在第五次传代时过表达circCRKL的DU145细胞(第一二行)和PC-3细胞(第三四行)的光镜图像、荧光图像和合并图像。大约90％的细胞是GFP阳性的。通过实时定量PCR检测，在稳转过表达细胞中(右侧上方为DU145细胞，右侧下方为PC-3细胞)，circCRKL过表达组(circCRKL oe)中circCRKL表达量高于阴性对照(NC)细胞组。结果用平均值±标准误表示。*P值<0.05，**P值<0.01，***P值<0.001。

图6.过表达circCRKL对于前列腺癌增殖能力的影响。DU145细胞和PC-3细胞分别转染空质粒病毒和circCRKL过表达病毒构建稳转细胞系。CCK-8试剂盒检测circCRKL过表达组(circCRKL oe)和阴性对照组(NC)的细胞增殖活性。(A)DU145细胞。(B)PC-3细胞。数据结果用折线图表示。组间比较采用独立样本t检验。结果用平均值±标准误表示。实验重复次数n＝3。*P值<0.05，**P值<0.01，***P值<0.001。

图7.过表达circCRKL对于前列腺癌细胞迁移能力的影响。使用Transwell迁移实验测定过表达circCRKL细胞组(circCRKL oe)和阴性对照细胞(NC)组的迁移能力。(A)DU145细胞。(B)PC-3细胞。计数有效的迁移细胞并拍照。原始放大倍数为200倍。数据结果使用直方图显示。组间比较采用独立样本t检验。结果用平均值±标准误表示。实验重复次数n＝3。*P值<0.05，**P值<0.01，***P值<0.001。

图8.过表达circCRKL对于前列腺癌细胞侵袭能力的影响。使用Transwell侵袭实验测定过表达circCRKL细胞组(circCRKL oe)和阴性对照细胞组(NC)的侵袭能力。(A)DU145细胞。(B)PC-3细胞。计数有效的侵袭细胞并拍照。原始放大倍数为200倍。数据结果使用直方图显示。组间比较采用独立样本t检验。结果用平均值±标准误表示。实验重复次数n＝3。*P值<0.05，**P值<0.01。

图9.过表达circCRKL对于前列腺癌细胞集落形成能力的影响。(A)DU145细胞。(B)直方图显示集落统计结果。组间比较采用独立样本t检验。结果用平均值±标准误表示。实验重复次数n＝3。*P值<0.05，**P值<0.01。

图10.CircCRKL在体内对前列腺癌细胞成瘤能力的影响。将circCRKL过表达和阴性对照的DU145细胞分别接种于裸鼠右侧腋窝皮下(n＝5)。(A-B)裸鼠于接种后第42天处死后，分组拍照裸鼠及取出的瘤体。(C)不同时间点测量统计的裸鼠皮下肿瘤体积，结果用折线图表示。(D)两组瘤体重量比较，结果用直方图表示。NC，阴性对照组；CircCRKL oe，过表达circCRKL组。两组间使用独立样本t检验进行比较。结果用均数±标准误表示。*P值<0.05，**P值<0.01，***P值<0.001。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例

一、CircCRKL(hsa_circ_001206)过表达质粒载体构建

过表达质粒载体构建由中国广州吉赛生物科技有限公司完成。

1)引物设计

C1206-F:cgGAATTCTGAAATATGCTATCTTACAGGTATCCAAGCCCACCAATGGGAT

C1206-R:gatcCATATGTCAAGAAAAAATATATTCACCTCTAATGCCAAGGCAGTCTTG

设计引物，扩增序列，全长466bp，扩增模板为的293T细胞的基因组DNA(gDNA)，扩增的序列通过EcoRI和BamHI连接到空质粒载体(pLCDH-ciR)上。质粒结构如图1所示。

2)细胞转染

细胞转染共分为3组，分别是circCRKL过表达质粒组、空质粒组(pLCDH-ciR)即NC组和Control组(空白对照组)，转染48h后收集293T细胞。

3)实时定量PCR验证

首先提取收集细胞的总RNA，然后逆转录成cDNA,再分别以β-actin、circCRKL的特异引物进行实时定量PCR验证。同时还需要设计测序引物，PCR之后要回收其产物，通过测序验证产物的环化位点接头。

使用circCRKL过表达质粒和空质粒PLCDH转染293T细胞48h，收集细胞提取RNA检测hsa_circ_1206表达量，验证过表达效率，结果见图2。

4)PCR产物测序

设计测序引物，PCR回收条带测序验证环化位点接头(图3)。

circbase中的环化位点序列如下：

ACTGCCTTGGCATTAGAGGTATCCAAGCCC

二、慢病毒的包装

1)传代：将293T细胞以合适的比例用10cm培养皿进行传代，放在CO₂培养箱中培养。在第2天，如果细胞融合度长到了70％至80％，则可准备进行转染。

2)换液：转染前2h给293T细胞换液，丢弃旧培养基，加入12mL新鲜培养基。

3)配置转染体系：准备一个无菌的1.5mL EP管，按下表配制转染体系并混匀，室温静置20min，然后用移液器均匀加到培养皿中，继续放在培养箱中培养。

表1转染体系

4)换液：在转染19h后，轻柔吸取旧培养基，然后向培养皿内加入15mL新鲜的RPMI-1640培养基，放在培养箱中继续培养。

5)病毒收集：换液48h后，吸取293T细胞培养上清，加入到灭菌50mL离心管中，4℃条件下，4500×g离心5分钟，上清需经滤器过滤后再加入到新的灭菌离心管中。然后再将滤液加入到浓缩装置中，继续离心10分钟(4℃，4500×g)，丢弃下层的液体，再次离心20分钟(4℃，4500×g)，滤器上层液体则为需要的病毒浓缩液。

6)将病毒液分装，保存于-80℃冰箱以备后续使用。

三、慢病毒滴度测定

1)在第1天，将293T细胞常规胰酶消化和计数后，接种于96孔板(每孔8000个细胞，放在37℃度培养箱中培养过夜。

2)在2天准备进行转染，细胞融合度最好达到50％左右。用含有10％FBS的RPMI-1640培养基对病毒液按照下面的梯度进行稀释：

1号病毒稀释液：10μL原病毒液+90μL含有10％FBS的1640培养基；

2号病毒稀释液：10μL 1号稀释液+90μL含有10％FBS的1640培养基；

3号病毒稀释液：10μL 2号稀释液+90μL含有10％FBS的1640培养基；

4号病毒稀释液：10μL 3号稀释液+90μL含有10％FBS的1640培养基；

5号病毒稀释液：10μL 4号稀释液+90μL含有10％FBS的1640培养基；

6号病毒稀释液：10μL 5号稀释液+90μL含有10％FBS的1640培养基；

……。

3)丢弃原90μL旧培养基，加入90μL混匀过的慢病毒稀释液，继续放入37℃细胞培养箱中培养。

4)第3天，丢弃原含慢病毒的旧培养基，再加入100μL的含有10％FBS的1640完全培养基。

5)第5天，在荧光显微镜下仔细观察96孔板中各孔携带绿色荧光的细胞数量，病毒滴度的计算方法为携带荧光的细胞数与相应的稀释倍数相乘。

6)慢病毒液滴度测定：

1号孔：1号病毒稀释液，含有10×10^-3mL慢病毒原液；

2号孔：2号病毒稀释液，含有10×10^-4mL慢病毒原液；

3号孔：3号病毒稀释液，含有10×10^-5mL慢病毒原液；

4号孔：4号病毒稀释液，含有10×10^-6mL慢病毒原液；

5号孔：5号病毒稀释液，含有10×10^-7mL慢病毒原液；

6号孔：6号病毒稀释液，含有10×10^-8mL慢病毒原液。

四、细胞铺板

将生长状态良好、融合度在80～90％作用的细胞取出，经过清洗、消化、离心和重悬传代后接种在六孔培养板上。保证细胞在24h后转染时密度达到50-60％左右，并且分布均匀，有利于提高慢病毒的转染效率。

五、稳转细胞株构建

1)前列腺癌细胞DU145和PC-3提前一天接种于六孔板中，铺板密度约50％。

2)感染前，将慢病毒液从-80℃冰箱取出，在冰上融化后用新鲜完全培养基稀释成所需浓度。

3)丢弃旧的培养基，将稀释好的病毒液加入细胞中。

4)同时加入Polybrene液，其终浓度为8μg/mL，继续培养。

5)感染24h后，丢弃含慢病毒的培养基，更换为新鲜的完全培养基。

6)为了进行后续的细胞筛选，向每孔中加入嘌呤霉素(终浓度6μg/mL)。

7)继续培养48～72h后，在荧光显微镜下观察每个孔的感染效率。根据需要收集细胞，提取RNA或蛋白，后续检测目的基因表达。

六、细胞增殖检测实验(CCK-8试剂盒法)

CCK-8试剂盒是一种应用非常广泛的检测细胞增殖活力的试剂盒。其特点是效率高、毒性低、速度快。

1)细胞铺板：将生长状态良好、融合度在80～90％的circCRKL稳定过表达细胞和阴性对照细胞(NC，空质粒慢病毒感染)消化传代后，接种在96孔板上。DU145细胞：5000个/孔，PC-3细胞：5000/孔(预实验时摸索好合适的细胞数目)。实验分为2组：NC组，circCRKL过表达组。每组设置5个复孔。培养板外圈每孔加入PBS溶液，防止蒸发效应，减少实验误差。

2)加检测试剂：注意避光。在指定时间点开始检测生长良好、已贴壁的细胞的增殖活力。按照CCK-8试剂盒说明书，每孔加入10μL CCK-8试剂，轻轻摇匀，注意避免产生气泡。然后放入37℃培养箱中孵育2h(预实验时摸索好合适的时间点)。

3)检测结果：用核酸蛋白测定仪测定96孔板中各孔的吸光度(波长设定值为450nm)。

4)数据处理：计算各组吸光度的平均值。统计分析并作图。

七、细胞Transwell迁移实验

Transwell是一种用来研究细胞迁移和侵袭的实验技术，其材料主要为Transwell小室。Transwell小室的滤膜是聚碳酸酯膜，具有一定的通透性，孔径大小约为8.0μm，将Transwell小室放入配套的24孔板中，则可分为上室和下室。可向上下室装入不同的液体，上室内的细胞能够透过聚碳酸酯膜进入下室，因此通常情况下计算下室内的细胞数目就可以间接反映培养细胞的迁移和侵袭能力。

1)细胞准备：取对数生长期的circCRKL稳转细胞和NC细胞经过常规清洗、胰酶消化、离心、细胞计数。

3)Transwell小室安放：将Transwell小室放入提前准备好的配套的24孔板中。以DU145细胞(circCRKL稳转细胞和NC细胞)5万/孔，PC-3细胞(circCRKL稳转细胞和NC细胞)10万/孔接种于上室，向上室内补充无血清培养基至100μL，然后向下室内加入含血清完全培养基650μL，注意避免产生气泡，置于37℃细胞培养箱孵育48h。

4)清洗：取出Transwell小室，丢弃上层培养液。用医用棉签轻轻擦拭以去除滤膜上层没有迁移的细胞。再用PBS溶液清洗3遍，注意避免损伤细胞。

5)固定：晾干后将小室放入4％多聚甲醛中浸泡20min。

6)染色：经PBS溶液洗3次晾干后再用结晶紫染料染色30min，注意避光。

7)清洗：继续用PBS溶液清洗，连续3次。

8)结果统计：用倒置显微镜(×200倍)进行拍照，随机选择3个视野计数。计数后求各个视野的平均值进行统计分析并作图。

八、细胞Transwell侵袭实验

细胞Transwell侵袭实验的操作步骤与Transwell迁移试验的步骤相类似，其不同点在于向上室内加入细胞之前需提前加入Matrigel胶(一种有生物活性的材料，可用于体外实验，研究细胞的侵袭能力，4℃时为液态，37℃时为凝胶态)。

操作方法如下：

1)从-20℃冰箱中将Matrigel胶取出，放置在冰上解冻。用预冷的无血清培养液稀释Matrigel胶，使其终浓度变为250μg/mL，混匀。向Transwel小室的上层加入100μLMatrigel胶，在37℃培养箱中放置4h，待其成为凝胶状后方可取出使用。

2)其余步骤与上述Transwell迁移实验相同。

九、细胞集落形成

1)从培养箱中取出处于对数生长期的circCRKL稳转细胞和NC细胞(DU145和PC-3)，经常规PBS清洗、胰酶消化、离心(1000rpm，5min)后，用配制好的完全培养基重悬细胞。

2)细胞计数：步骤同前。

3)取一个干净的六孔板，根据细胞悬液浓度每孔铺细胞1000个，完全培养基加入各孔，使每孔总体积达到2mL。

4)将六孔板放在CO₂培养箱中培养14天左右，期间每隔两天换液一次。

5)当发现六孔板内出现肉眼可辨的细胞集落时即可终止培养。

6)丢弃旧的培养基，轻柔加入PBS溶液清洗两次。

7)用4％多聚甲醛固定15min。

8)用结晶紫染色30min。

9)PBS溶液洗涤3次，每次1min。

10)显微镜下进行细胞计数，当单个集落的细胞数达到50个以上时，可视为一个克隆。

十、裸鼠移植瘤模型

1)购买4周龄BALB/c雌性裸鼠。

2)给每只裸鼠打耳标，标记清楚后随机分组，5只/组。

3)细胞准备：取对数生长期的过表达circCRKL的DU145稳转细胞和携带空质粒的DU145稳转细胞，常规消化离心后，用无血清培养基进行重悬细胞，显微镜下计数，调整细胞浓度至2×10⁷/mL。

4)用一次性无菌注射器，在右侧腋下采用皮下注射，每只小鼠注射细胞悬液200μL。

5)每7天给小鼠称量体重，用游标卡尺测量瘤的最长径和垂直径，作好记录。

6)给小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，处死后将皮下瘤取出，并按分组拍照。然后将皮下瘤平分切成两半，一半放于液氮罐中迅速冷冻，然后存放于-80℃冰箱，另一半采用4％多聚甲醛固定，室温保存。

十一、统计学分析方法

本研究中收集的所有数据应用SPSS22.0和Prims 5软件进行统计分析。统计结果均用平均值±标准误表示。两组数据之间的差异比较根据数据分布采用Student's t检验或者Mann-Whitney U检验。相关性分析采用皮尔逊法(Pearson)或是斯皮尔曼法(Spearman)。当P值＜0.05时认为差异有统计学意义。

结果与分析

一、CircCRKL在前列腺癌细胞系中的表达及稳转细胞系构建

为了研究circCRKL在前列腺癌中的功能，我们在正常前列腺上皮细胞系RWPE-1和前列腺癌癌细胞系PC-3、DU145和LNCaP中检测其表达。实时定量PCR结果表明circCRKL在前列腺癌细胞系(PC-3、DU145和LNCaP)中显著下调(图4)。通过使用过表达circCRKL的慢病毒，我们选取circCRKL表达差异显著的DU145和PC-3细胞，构建了稳定的circCRKL过表达细胞系和阴性对照细胞系(含空质粒)。因为慢病毒包装的质粒含有绿色荧光蛋白(GFP)，我们发现在传代5次后约90％的细胞是绿色的(图5)。通过实时定量PCR也证实了circCRKL的过表达效率(图5)。

二、CircCRKL抑制人前列腺癌细胞增殖能力

通过CCK-8实验检测阴性对照细胞组(NC)与circCRKL过表达细胞组(circCRKLoe)的细胞增殖能力。结果显示，与对照细胞(NC)相比，过表达circCRKL的DU145细胞在48、72和96小时观察到细胞增殖能力显著降低(图6A)。过表达circCRKL的PC-3细胞在24、48、72和96小时观察到细胞增殖能力显著降低(图6B)。

三、CircCRKL抑制人前列腺癌细胞迁移能力

为了研究CircCRKL对于前列腺癌细胞迁移能力的影响，我们做了Transwell肿瘤迁移实验。结果显示，过表达circCRKL显著抑制了前列腺癌细胞DU145(图7A)和PC-3(图7B)的细胞迁移能力，差异具有统计学意义。

四、CircCRKL抑制前列腺癌细胞侵袭能力

我们通过Transwell实验进一步观察过表达circCRKL对于前列腺癌细胞侵袭能力的影响。实验结果表明，过表达circCRKL的DU145和PC-3细胞，穿过Matrigel胶和Transwell小室的滤膜的数量均较对照组细胞明显减少(图8)，差异具有统计学意义。

五、CircCRKL抑制前列腺癌细胞集落形成能力

我们通过细胞集落实验探讨过表达circCRKL对于前列腺癌细胞集落形成的影响。实验结果表明，过表达circCRKL的DU145细胞形成的集落数量较对照组细胞明显减少(图9)，差异具有统计学意义。

六、CircCRKL能在体内抑制前列腺癌细胞的生长

为了探讨circCRKL在体内对前列腺癌生长的影响，我们将circCRKL过表达的DU145细胞和阴性对照的DU145细胞分别接种于裸鼠右侧腋下。裸鼠均为4周龄，体重、生活习性、健康状况无明显不同。每周测量皮下肿瘤的最长径及垂直径，计算肿瘤体积。肿瘤细胞接种后第42天，处死小鼠，剥离皮下瘤，circCRKL过表达组和阴性对照组分组拍照(图10A-B)，统计肿瘤体积和重量并分析。统计结果显示，自接种后21天起，circCRKL过表达组的肿瘤体积明显小于阴性对照组。肿瘤称量显示circCRKL过表达组肿瘤重量显著低于阴性对照组，差异具有统计学意义。裸鼠成瘤实验结果表明，过表达circCRKL可在体内抑制前列腺癌细胞的生长。

讨论

前列腺癌是一种男性高发的恶性肿瘤。由于其高度的异质性，前列腺癌的发病机理目前仍未明确。circRNAs被证明在多种癌症中都起到重要的调节作用。迄今为止，前列腺癌中circRNA的表达谱和潜在功能仍未研究清楚。为了研究前列腺癌中circRNA表达谱及其在前列腺癌发生发展中的作用，寻找新的诊断标志物和治疗靶点，我们选取了5例前列腺癌患者，采用了微阵列(microarray)芯片技术同时检测前列腺癌组织和癌旁正常组织中差异表达的circRNA和mRNA分子。Microarray芯片可同时检测成千上万个基因的表达，是基因功能分析的最重要高通量技术之一。随着microarray技术在临床的广泛应用，microarray高通量筛选已经成为多种疾病研究生物标记物和治疗靶标重要研究手段。我们将circRNA的microarray和mRNA的microarray芯片结合起来研究前列腺癌。通过对两种RNA的综合分析，在整体水平上探讨前列腺癌中差异表达的circRNAs与mRNAs的相互调节作用。

通过芯片筛查，我们鉴定出显著差异表达的95种circRNA和785种mRNA(变化倍数≥2倍且P值＜0.05)。GO分析表明差异表达的mRNA在染色体分离、有丝分裂核分裂、细胞外基质、细胞周期过程等GO基因集上富集，这些都与前列腺癌的发病机制密切相关。

我们通过实时定量PCR验证了circCRKL在前列腺癌组织中显著下调。环状RNA分子circCRKL是来源于CRKL基因的第二外显子环状转录产物，circCRKL序列如SEQ ID NO:3所示，全长466bp。CRKL基因位于人类第22号染色体，编码CRKL蛋白。CRKL蛋白与肿瘤的恶性转化有关，在多种恶性肿瘤中呈高表达。另外，CRKL蛋白介导的信号传导可能诱导去势抵抗性前列腺癌的发生发展。本发明首次发现circCRKL在前列腺癌组织中低表达。

本发明使用慢病毒包装质粒并转染前列腺癌细胞DU145和PC-3细胞，构建了过表达circCRKL的稳转细胞和阴性对照细胞。通过细胞功能学实验，我们发现过表达circCRKL以后，可以显著的抑制前列腺癌的增殖、侵袭、迁移和集落形成能力，表明circCRKL在前列腺癌的发生发展过程中起到重要的调节作用。同时，裸鼠成瘤实验表明circCRKL过表达显著抑制了前列腺癌细胞在动物体内的生长，进一步证明了circCRKL对于前列腺癌细胞的抑制作用。

通过上述体内和体外的功能学实验证实circCRKL对于前列腺癌的增殖、迁移、侵袭和集落形成的生物学行为具有显著的抑制作用，有望为前列腺癌患者提供新的治疗靶标和方向。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属金山医院

<120> 一种新的环状RNA circ CRKL在前列腺癌治疗中的应用

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cggaattctg aaatatgcta tcttacaggt atccaagccc accaatggga t 51

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatccatatg tcaagaaaaa atatattcac ctctaatgcc aaggcagtct tg 52

<210> 3

<211> 466

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtatccaagc ccaccaatgg gatctgtctc agcacccaac ctgcctacag cagaagataa 60

cctggaatat gtacggactc tgtatgattt tcctgggaat gatgccgaag acctgccctt 120

taaaaagggt gagatcctag tgataataga gaagcctgaa gaacagtggt ggagtgcccg 180

gaacaaggat ggccgggttg ggatgattcc tgtcccttat gtcgaaaagc ttgtgagatc 240

ctcaccacac ggaaagcatg gaaataggaa ttccaacagt tatgggatcc cagaacctgc 300

tcatgcatac gctcaacctc agaccacaac tcctctacct gcagtttccg gttctcctgg 360

ggcagcaatc acccctttgc catccacaca gaatggacct gtctttgcga aagcaatcca 420

gaaaagagta ccctgtgctt atgacaagac tgccttggca ttagag 466

Claims (6)

1.环状RNA circCRKL或其过表达质粒载体在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物用于治疗前列腺癌，所述环状RNA circCRKL的序列如SEQ ID NO:3。

2.环状RNA circCRKL或其过表达质粒载体在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物用于抑制前列腺癌恶性生物学行为，所述环状RNA circCRKL的序列如SEQ ID NO:3。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物用于抑制前列腺癌的增殖。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物用于抑制前列腺癌的迁移。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物用于能够抑制前列腺癌的侵袭。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物用于抑制前列腺癌的集落形成。

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