CN105420366B - Adamts-2基因及其表达产物在诊治胃癌中的应用 - Google Patents

Adamts-2基因及其表达产物在诊治胃癌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及ADAMTS‑2基因及其表达产物在诊治胃癌中的应用。发明人整合已有的基因表达芯片数据，通过对GEO数据库检索筛选得到6套胃癌表达数据，利用生物学信息分析工具对数据进行重新加工分析，筛选出ADAMTS‑2基因，进一步进行了分子生物学验证，RT‑PCR结果显示，ADAMTS‑2基因在胃癌组织中高表达，干扰实验表明，ADAMTS‑2‑siRNA1能有效降低ADAMTS‑2基因的表达。本发明提供了一个新的胃癌诊治靶点，具有重要的临床应用价值。

Description

ADAMTS-2基因及其表达产物在诊治胃癌中的应用
技术领域
本发明涉及肿瘤标志物，具体涉及ADAMTS-2基因及其表达产物在诊治胃癌中的应用。
背景技术
胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，在世界范围内，胃癌的发病率居第四位，死亡率居第二位，仅次于肺癌，我国是胃癌的高发大国，而且胃癌已经呈现年轻化趋势。目前治疗胃癌的主要方式有手术、化疗和放疗。尽管随着医学科技的发展，早期胃癌的治疗效果己有很大的提高，但是进展期胃癌患者生存率仍然很低，5年生存率低于30％，术后复发和远处转移是胃癌患者死亡的主要原因。寻求更新的胃癌治疗手段特别是基因靶向治疗迫在眉睫，胃癌的发生是多因素，多基因共同参与的过程，其中癌基因的激活和过度表达在胃癌发生发展过程中起着关键的作用。
人类含Ⅰ型血小板结合蛋白基序(TSP)的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)家族由19个分泌型多结构域锌指金属蛋白酶组成，参与多种生理或病理学过程，包括胞外基质的组装和降解、止血过程、器官生成、人类遗传性疾病、关节炎和癌症等。已有报道显示在非小细胞肺癌中ADAMTS-1基因下调，在头颈鳞状癌中，ADAMTS-1、ADAMTS-8和ADAMTS-15蛋白酶的表达明显升高，并且ADAMTS-1、ADAMTS-5、ADAMTS-8、ADAMTS-9和ADAMTS-15蛋白酶的基因表达与肿瘤侵袭有关。但是有关ADAMTS-2基因的功能研究较少。
随着生物技术的发展，实验研究产生了大量的基因芯片数据，并通过基因表达芯片来筛选出影响疾病发生发展的基因及信号通路，已鉴别出大量差异表达的基因。但是不同的实验平台及样本的差异导致各个基因芯片的分析结果存在很多不一致性，整合分析可对同一个问题所发表相关研究报告的结果进行收集、统计上的整合，以期获得更准确或更多的结果。这个分析能产生很多显著的差异表达基因，能避免单个研究带来的不正确性。发明人通过对GEO数据库检索筛选得到6套胃癌表达数据，利用各种生物学信息分析工具对数据进行重新加工分析，筛选出ADAMTS-2基因，进一步进行了分子生物学验证，RT-PCR结果显示，ADAMTS-2基因在胃癌组织中高表达，干扰实验表明，ADAMTS-2-siRNA1能有效降低ADAMTS-2基因的表达。本发明提供了一个新的胃癌诊治靶点，具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胃癌诊断制剂，所述胃癌诊断制剂是检测ADAMTS-2基因和/或ADAMTS-2基因的表达产物的诊断制剂。
进一步，所述胃癌诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测胃癌组织中ADAMTS-2基因的表达，优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增ADAMTS-2基因的引物；所述的基因芯片中包括与ADAMTS-2基因的核酸序列杂交的探针，更优选的，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测ADAMTS-2基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10。
进一步，直接检测外周血和/或组织中ADAMTS-2基因和/或基因的表达产物。
进一步，所述的胃癌的诊断制剂采用免疫方法检测胃癌组织中ADAMTS-2基因的表达产物，优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。
进一步，所述检测ADAMTS-2表达产物的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市售的ADAMTS-2单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被ADAMTS-2单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
进一步，所述检测ADAMTS-2蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的ADAMTS-2单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗ADAMTS-2单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
本发明的目的在于提供上述胃癌诊断制剂在制备胃癌诊断工具中的应用。
本发明的目的在于提供一种治疗胃癌的制剂，所述制剂中含有抑制ADAMTS-2基因的转录或表达的试剂或化合物。优选的，制剂中含有药剂学可接受的载体。
进一步，所述治疗胃癌的制剂中含有激活ADAMTS-2的抑制基因、激活抑制ADAMTS-2表达的蛋白、导入抑制ADAMTS-2转录或表达的siRNA、激活促进ADAMTS-2 mRNA降解的microRNA、导入促进ADAMTS-2蛋白降解的分子、抑制促进ADAMTS-2表达的因子及蛋白的表达。
优选的，所述治疗胃癌的制剂含有下列中的一组或几组siRNA：SEQ ID NO.1和SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。更优选的，所述治疗胃癌的制剂含有siRNA序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
本发明的目的在于提供上述治疗胃癌的制剂在制备胃癌治疗药物或试剂中的应用。
为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基因ADAMTS-2基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了ADAMTS-2基因与胃癌的关系：ADAMTS-2基因在外周血中高表达，与胃癌具有很好的相关性，可用于制备胃癌辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。
本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。
RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。
荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。
本发明的目的在于提供一种检测胃癌的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测基因ADAMTS-2，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10。
进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。所述内参为ACTIN。
所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
本发明目的是提供了一种胃癌蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测ADAMTS-2蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
本发明目的是提供了一种检测胃癌的基因芯片，所述的基因芯片包括与ADAMTS-2基因的核酸序列杂交的探针。
本发明的药剂学上可接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methylcellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油(mineral oil)等，但并非局限于此。
本发明的药剂学可接受的载体除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。
本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。
本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。
本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。
附图说明
图1干扰后各组ADAMTS-2 mRNA相对表达量
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1 GEO数据的筛选及分析
限制研究类型为“expression profiling by array”符合以下标准的数据集将纳入我们的研究中：
①所选数据集必须是全基因组的表达谱测序数据；
②这些数据来自于胃癌病例组和/或对照组(无药物刺激或被转染)样本；
③本研究均考虑经标准化或者原始数据集。
最后，有6套芯片数据集纳入我们的研究。结果详见表1。
表1胃癌数据集的基本情况
将所有的数据集整合得到17481个基因。根据芯片注释将探针ID转换为基因ID，筛选所有表达谱共有基因，对于每套表达谱进行缺失数据填充，并标准化数据。利用limma软件包分析差异表达基因。筛选方法：计算p-value并计算False Discovery rate(FDR)，FDR<0.01为差异表达基因。共筛选出2327个差异表达基因，通过人工筛选，上调表达差异明显的ADAMTS-2基因纳入我们的研究范围。
实施例2病例的收集
所有组织标本均来医院2012年11月至2014年6月经确诊的胃癌患者。取材时，分别取癌中央部位组织和癌旁正常胃粘膜组织，标本迅速放入小型液氮罐中保存。
实施例3提取样本中的总RNA
1)样本组织小块放在培养皿中，加入1ml Trizol，剪碎后移至匀浆器中匀浆；
2)匀浆完成后，取出匀浆液置于EP管中，定容至lml，可冻存与-70℃；
3)15-30℃放置5min，加入200μl氯仿，剧烈震荡15sec，15-30℃放置10min；
4)2-8℃，低于12000g/min离心l 0min，弃上清，加入lml 75％乙醇，低于7500g/min离心5min，弃上清后，点离；
5)待沉淀干燥(呈半透明状，不用完全干燥，否则会降低稳定性)，用RNase-freewater 55-60℃溶解，冻存于-70℃。
实施例4胃癌组及癌旁组ADAMTS-2基因表达情况
一、材料和方法
1、材料
选取67例胃癌患者癌组织及癌旁组织，对其进行分组及编号。
2、方法
2.1 RNA的提取
见实施例3。
2.2逆转录合成cDNA
采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.3 Real-Time PCR
2.3.1仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
2.3.2引物设计
采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_014244.4(ADAMTS-2)，内参选ACTIN，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
ADAMTS-2基因扩增引物：
上游引物：5’-TTAGCAGATGAAGCAGTT-3’(SEQ ID NO.9)
下游引物：5’-GTATCGGTAAGCCAGAAT-3’(SEQ ID NO.10)
扩增长度107bp。
操作过程如下：
(一)反应体系：用PowerGreen PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增：2×mix 10μl；10uM的上游引物和下游引物各0.5μl；模板2μl，加入灭菌蒸馏水补平至25μl。
扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，55℃45sec)×35个循环。
(二)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(三)样品RealTimePCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
二、实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较ADAMTS-2基因在胃癌组和癌旁组中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中ADAMTS-2基因在胃癌组中的表达水平为癌旁组的约2.5倍，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析ADAMTS-2基因在胃癌患者中高表达的结果。
实施例5 RNAi干扰ADAMTS-2表达及对MGC803细胞的影响
一、材料
1.细胞及细胞培养
人类胃癌MGC803细胞，购自中国科学院上海细胞库，用含10％胎牛血清、2mM左旋谷氨酰胺的RPMI1640培养液置37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱培养，细胞呈单纯贴壁生长，每3-5天传代1次。传代时用0.25％胰蛋白酶消化2-3min，用培养液吹打制成细胞悬液，按所需浓度接种，接种前经台盼蓝拒染法检测细胞活力。
2.siRNA设计与合成
依据在线设计软件，根据基因序列参照NCBI:NM_014244.4(ADAMTS-2)，设计相应的siRNA，具体序列见表2。设计后送往上海吉玛制药技术有限公司合成，采用化学合成法，同时合成随机阴性对照序列和标有荧光标记的通用随机阴性序列，用于计算转染率。
表2 siRNA序列表
二、实验方法
1.细胞分组
A组：空白对照；B组：转染siRNAnc的阴性对照组；C1组：转染特异性的ADAMTS-2-siRNA1组；C2组：转染特异性的ADAMTS-2-siRNA2组；C3组：转染特异性的ADAMTS-2-siRNA3组。
2.siRNA瞬时转染
按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent提供的步骤进行。荧光显微镜下观察发绿色荧光的转染阳性细胞。转染效率为荧光镜与光镜视野中的细胞数量的比值，细胞的转染效率均达到90％以上，方可以进行后续的实验。计算公式如下：
转染效率＝发荧光细胞的数量/相同视野下的细胞数量×100％
取对数生长期的MGC803细胞，接种在24孔培养板上，细胞数1×105/孔，分成空白对照组、转染siRNAnc的阴性对照组、转染特异性的ADAMTS-2-siRNA1、转染特异性的ADAMTS-2-siRNA2、转染特异性的ADAMTS-2-siRNA3。每孔总体积为500ul，37℃、5％CO2、饱和湿度下培养24h后的提取mRNA进行检测。
3.应用Real-time PCR方法检测转染前后ADAMTS-2基因表达的变化
(1)标准曲线的构建：选取在50mI培养瓶中正常培养的内皮祖细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于104-100copies/ul的DNA模板，分别加入ADAMTS-2基因引物和内参引物，配制25u1反应体系，使用Real-time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到ADAMTS-2和内参的标准曲线。
(2)Real-time PCR方法检测转染前后ADAMTS-2基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进ADAMTS-2和内参的Real-time PCR反应，实验重复三次。
(3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
三、实验结果
分别观察各组siRNA转染内皮祖细胞，结果显示在大量内皮祖细胞内发现绿色荧光，证明内皮祖细胞内已经得到了siRNA的转染，然后在荧光镜和光镜下观察内皮祖细胞数量，进行转染效率的检测，结果显示转染率均达到80％以上。
Real-time PCR结果显示，空白对照组和转让非特异性的siRNA的阴性对照组对内皮祖细胞中ADAMTS-2基因表达无明显抑制作用，二者统计上无显著差异，转染的3个ADAMTS-2基因siRNA组都对内皮祖细胞中ADAMTS-2基因表达起到一定抑制作用，其中ADAMTS-2-siRNA1抑制效果最明显，抑制率达64％，具体见图1。

Claims (9)

1.检测ADAMTS-2基因和/或基因的表达产物的诊断制剂在制备胃癌诊断工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测胃癌组织中ADAMTS-2基因的表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增ADAMTS-2基因的引物；基因芯片中包括与ADAMTS-2基因的核酸序列杂交的探针；免疫方法中含有ADAMTS-2抗体。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测ADAMTS-2基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQID NO.10。
5.含有抑制ADAMTS-2基因的转录或表达的试剂或化合物在制备胃癌治疗药物或试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的胃癌治疗药物或试剂中含有抑制ADAMTS-2转录或表达的siRNA。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的胃癌治疗药物或试剂中含有下列中的一组或几组siRNA：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的胃癌治疗药物或试剂中含有序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的siRNA。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，胃癌治疗药物或试剂中含有药剂学可接受的载体。
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