CN108823307B

CN108823307B - Pd‐l1剪接体b作为指导抗pd‐l1/pd1免疫治疗的用药的标志物的应用

Info

Publication number: CN108823307B
Application number: CN201810471310.XA
Authority: CN
Inventors: 张红河; 王超彦; 翁梦涵; 来茂德
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2038-05-17
Also published as: CN108823307A

Abstract

本发明在正常和突变型的结直肠癌细胞系中观察到PD‑L1的三个不同的可变剪接体的表达，通过构建三个剪接体的真核表达载体，转染不表达或低表达PD‑L1的肿瘤细胞中；本发明还发现isoform b过表达的肿瘤细胞系与免疫细胞共培养时，促进了免疫细胞的凋亡，抑制了免疫细胞细胞因子的分泌，提示其具有抑制患者体内免疫反应，临床样本检测证实PD‑L1的isoform b是肿瘤不良预后的监测靶点。

Description

PD‐L1剪接体B作为指导抗PD‐L1/PD1免疫治疗的用药的标志物的应用

技术领域

本发明涉及一种PD-L1剪接体在指导肿瘤免疫治疗用药中的应用，属于生物医药领域，具体为肿瘤的免疫治疗领域。

背景技术

近年来，抗程序性死亡生长因子-1(programmed death-1，PD-1/CD279)/程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1，PD-L1/CD274)通路的免疫检查点阻断剂是抗肿瘤治疗的研究热点。目前已有Atezolizumab、nivolumab、pembrolizumab等试剂应用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌(colorectal cancer，CRC)等恶性肿瘤的临床试验，并且取得了一定的治疗效果[1]。其中，结直肠癌为世界第三大高发癌症，且其致死率居恶性肿瘤第四位，对其适用的诊疗研究迫在眉睫。

PD-L1作为潜在的CRC诊疗指标，已有较多研究对其蛋白表达水平进行检测，以期探究PD-L1与CRC间存在的关联。早在2013年，Shi等就对143例CRC患者样本进行免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)检测。结果显示，PD-L1在CRC中呈高表达，且与细胞分化程度及TNM分期有关，甚至可作为判断预后的独立因素[2]。之后，Matthew等对181 例CRC患者IHC样本进行更为细致的分析。研究进一步证实了，PD-L1高表达状态与肿瘤的分期分型及预后相关[3]。同时，大量研究结合CRC患者的PD-L1表达水平与预后情况进行了相关性的统计学分析。Zhu等以结直肠锯齿状腺癌为研究对象，分析了120例IHC样本后发现，PD-L1高表达率为25％，且该部分患者预后较差[4]。而近期的其它研究还表明，肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating immune cells，TILs)内的PD-L1表达量越高，患者的无病生存期越短、预后越差[5-7]。与此一致的是，在Roy S等针对抗PD-L1单抗药物 MPDL3280A的研究中，PD-L1在IHC中的表达量(尤其是在TILs中)与患者的疾病缓解率成正比[8]。除此之外，Tony等的研究还证实，错配修复缺失型患者(mismatch repair-deficient，MMR-D)的PD-L1表达量要高于错配修复完善型患者(mismatch repair-proficient，MMR-P)，这将有助于筛选出可进行免疫治疗的适用患者[9]。不仅如此， PD-L1表达量还与CRC肿瘤微环境中的调节性T细胞数量[10]、肿瘤的各项病理参数及基因突变情况等相关[11]。总体而言，对PD-L1蛋白水平进行及时和准确的检测对指导CRC 患者的治疗非常有利。

现有技术中已经公开了PD-L1存在三个可变剪接体(isoform)，即Isoform a，Isoform b， Isoform c，但是仅仅公开了三个剪接体的存在，未曾有研究表明三个剪接体在体内的作用及其机理，也未有研究表明其在一种具体癌症中的作用。本发明的技术方案首次在肿瘤细胞中发现了PD-L1可变剪接体的作用，以及讲所述的作用机理应用与肿瘤免疫治疗的用药。

发明内容

本发明的一个方面，是发现了在结直肠癌细胞系中差异表达的PD-L1。在一个具体的实施例中，所述的结直肠癌细胞系是RKO，差异表达的PD-L1的细胞系中是RKO-MUT(由浙江大学医学院病理学与病理生理学实验室保存，承诺向公众20年内免费提供)。在另外一个具体的实施例中，所述的差异表达是指采用RNAi干扰后，PD-L1在RKO-MUT细胞系中与RKO细胞系中的分子量差异，具体如图2所示。

本发明的另一个方面是检测了结直肠癌细胞系中PD-L1各个变异体的表达情况。在一个具体的实施例中，所述的结直肠癌细胞系是RKO细胞与RKO-MUT细胞；在另外一个具体的实施例中，所述的检测RT-qPCR检测，结果如图3所示。

本发明的另外一个方面是构建了PD-L1的三个变异体的表达载体。在一个具体的实施例中，所述的表达载体是pcDNA3.1(+)。在一个具体的实施例中，所述的isoform a的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示；在另外一个具体的实施例中，所述的isoform b的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示；在另外一个具体的实施例中，所述的isoform c的核苷酸序列为SEQID NO:5所示。

本发明的另外一个方面是将上述构建的表达载体转染到了不表达或低表达PD-L1的肿瘤细胞系中，并进行瞬时表达后观察所述的变异体在细胞内表达情况。在一个具体实施例中，所述的肿瘤细胞系为结直肠癌细胞，优选为HT29，HCT116；在一个具体的实施例中，检测 HT29细胞系中isoform a/b/c的表达；在一个具体的实施例中，检测HCT116细胞系中isoform a/b/c的表达，具体如图4所示。

本发明的另外一个方面是发现了表达PD-L1剪接体后的肿瘤细胞系对于免疫细胞的影响。在一个具体的实施例中，表达isoform b的肿瘤细胞系与免疫细胞共培养后，促进免疫细胞的凋亡，降低免疫细胞细胞因子的分泌量；在具体的实施方式中，所述的肿瘤细胞系为结直肠癌细胞系，优选为HT29，HCT116；在一个具体的实施方式中，所述的免疫细胞为T细胞，优选为CD3+T细胞；在另外一个具体的实施方式中，所述的细胞因子选自IL-2、IFN-γ、 TNF-α或他们的组合，具体如图5所示

本发明的另外一个方面是构建了可以稳定表达三个剪接体的肿瘤细胞系。所述的细胞系是通过慢病毒载体转染肿瘤细胞系后稳定筛选获得，优选的，所述的肿瘤细胞系是HT29， HCT116。在另外一个实施例中，上述的稳定转染的肿瘤细胞系对免疫细胞有促进凋亡的作用，所述的免疫细胞优选的是T细胞，更优选的是CD3+T细胞，具体如图6所示。

本发明的另外一个方面，对结直肠癌患者的组织cDNA样本进行基因表达的荧光定量 PCR检测，并对样本来源病理进行随访，统计分析不同的剪接体与5年生存的关系，结果发现，高表达isoform b和isoform c的结直肠癌患者的5年生存率与低表达组具有明显的统计学差异，提示isoform b和isoform c是结直肠癌肿瘤患者不良预后的标志物，结果如图7 所示。

附图说明

图1本领域已经公开的PD-L1的三个间接体的关系，图1a是显示PD-L1的三个变异体的序列长度，图1b是三个变异体的序列对比，其中中间部分是共同的序列。

图2将Isoform a，Isoform b，Isoform c的CDS区域分别构建至pcDNA3.1(+)过表达载体的示意图。

图3通过Western-Blot方法检测PD-L1的在RKO,RKO-MUT细胞系中的表达情况，其中图3a是检测了结直肠癌常见细胞系的PD-L1的表达情况，发现在RKO,RKO-MUT中 PD-L1是高表达的，其他细胞系不表达；图3b是经过siRNA干扰后的RKO/RKO-MUT的 PD-L1表达情况，发现在RKO-MUT细胞系中RNAi后的蛋白条带无论从表达量还是条带位置均与RKO细胞系有较大差别。

图4通过RT-qPCR的方法检测结直肠癌细胞系中PD-L1各个剪接体的mRNA转录情况。

图5pcDNA3.1(+)的表达载体转染HT29/HCT116细胞后的三个剪接体的表达情况，图 5a是HT29的三个剪接体的表达情况，图5b是HCT116的三个剪接体的表达情况。

图6表达isoform b的结直肠癌肿瘤细胞系对于T细胞的影响，其中图6a显示了表达 isoform b的HT29细胞系促进CD3+T细胞的凋亡，降低T细胞的细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α的分泌；图6b显示了表达isoform b的HCT116细胞系促进CD3+T细胞的凋亡，降低T细胞的细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α的分泌。

图7显示了慢病毒稳定转染结直肠癌细胞系对于T细胞的影响，其中第一排显示了表达isoform b的HT29细胞系促进了CD3+T细胞的凋亡；第二排显示了表达isoform b的HCT116细胞系促进了CD3+T细胞的凋亡。

图8临床样本检测与结直肠癌5年生存率的关系，其中isoform b和isoform c高表达的病例与低表达病例在5年生存率上有显著差异，即高表达组具有不良的预后。

具体实施方式

本发明的技术方案采用了本领域中常规的实验技术，以下内容以及本领域技术人员可以根据所述内容直接毫无疑义获得的技术方案均包含在本申请的发明内容之内。本发明列举的实施方式并不对本发明的发明构思构成限制。

实验材料：

1、细胞系：RKO,RKO-MUT，HT29，HCT116结直肠癌细胞系为本实验室所有。

2、pcDNA3.1(+)为本实验室所有

3、PD-L1抗体

Abcam公司：Anti-PD-L1抗体[28-8](ab205921)

具体实验方法

1、细胞培养

1.1 细胞复苏

从液氮罐中取出细胞，迅速放入37℃水浴，并不时摇动使其尽快融化；用酒精擦拭消毒后，用吸管吸出细胞悬液，加入离心管中，再补加10倍体积的完全培养液，混匀后，1000rpm低速离心5min弃去上清，加入完全培养基适当稀释后，混匀后移入培养瓶中，置 37℃、5％CO₂培养箱培养，次日更换一次培养基后继续培养。

1.2 细胞传代

贴壁培养的细胞生长至高密度时，倒掉培养瓶内旧的培养基，加1-2ml PBS柔和洗2遍；加入胰酶覆盖所有细胞表面，消化2-3min后置于显微镜下观察，当细胞间瞭增大，胞质回缩，细胞变圆时加入完全培养基中和胰酶，终止消化；用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液，吹打细胞动作要轻，尽量避免出现气泡而损伤细胞；计数后，接种于新的培养瓶内，置37℃、5％CO₂培养箱培养。

1.3 细胞冻存

选取对数生长期的细胞，冻存前一天换液；倒掉培养瓶内的旧培养基，加柔和洗遍；用胰酶将细胞消化下来，收集于离心管，800rpm离心5min，离心去除上清，加入2ml 10％DMSO 的冻存液，用吸管轻轻吹打重悬细胞，分装入无菌冻存管，放入异丙醇冻存盒，过夜后转入液氣冻存。

2、RNAi干扰实验

siRNA转染采用Powerfect转染试剂，步骤如下：

(1)按照每孔3.0～5.0×10⁵的细胞均匀接种六孔板。24小时后观察细胞状

态，细胞密度达到30-50％，细胞状态良好的情况下准备转染。

(2)细胞转染前30min，1.0ml PBS洗涤6-well内细胞，加入2.0ml含10％血

清的培养液。

(3)5μl siRNA与100μl 1×Powerfect transfection buffer轻吹混匀，再加入2.4μl Powerfect reagent，漩涡振荡10s使之混匀，室温条件下静置10min。

(4)将上述siRNA-转染试剂的混合物加入细胞培养上清中，轻微晃动六孔板，于37℃， 5％CO2湿化培养箱中培养。

(5)48h后提取细胞RNA检测目的基因表达，提取细胞蛋白检测目的蛋白表达，以确认目的基因干扰效率。

3、western-blot

3.1 制胶：根据检测目的蛋白的分子量大小配制所需浓度的胶。

3.2 样品准备：取样本蛋白或浓缩上清，加入等体积2×样品缓冲液，99℃煮min，在冰水中冷却后，12000rpm离心，按预定顺序上样。

3.3 电泳：先80V稳压电泳至分离胶，然后上调到100V至溴酴蓝达到底部边缘停止电泳。

3.4 转膜：将硝酸纤维素膜、滤纸、纤维垫预先在转膜缓冲液中浸泡，将胶在转膜缓冲液中平衡后，按照从阴极到阳极的顺序放入纤维垫滤纸凝胶膜滤纸纤维塾，转膜。

3.5 取出硝酸纤维素膜，将其置入缓冲液中洗涤。

3.6 封闭：将膜放入5％脱脂奶粉封闭液中，室温温和振荡2h。

3.7 —抗孵育：将膜孵育在稀释于牛奶封闭液的抗体中(浓度依据各抗体说明书)，室温下温和震荡30min，4℃孵育过夜。

3.8 从4℃冰箱取出膜，室温下温和振荡。

3.9 洗膜：TBST震荡10min/次，洗三次。

3.10 二抗孵育：将膜孵育于稀释于牛奶封闭液的抗兔或抗鼠的二抗中，温和震荡。

3.11 洗膜：TBST震荡10min/次，洗三次。

3.12 读取：取出膜，用双色红外激光系统进行检测。

4、RT-PCT

收集实验室所培养的结直肠癌细胞系，提取RNA。步骤如下：

细胞置于1.5ml RNase free EP内，离心后PBS清洗2次，加入1ml TRIzol(Invitrogen)，振荡5min使其充分混匀，加入200μl三氯甲烷，振荡10min使其充分混匀，12000rpm 4℃离心15min，轻轻吸取上层水相置于一新1.5ml RNase free EP管内，加入500μl异丙醇，颠倒混匀后静置10min，12000rpm 4℃离心10min，弃液，沉淀即为RNA。1ml 75％乙醇吹打清洗RNA沉淀，7500rpm，4℃离心5min，弃液，干燥，待白色RNA沉淀变为半透明，加入100μl 0.1％DEPC ddH₂O溶解RNA。取2μl RNA溶液用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定其浓度及OD值(以溶解RNA所用0.1％DEPC ddH₂O调零)。

对所提取RNA使用

RT Regent Kit(Takara,Dalian,China)进行反转录。反应体系如下：

总RNA 1μg

RNase Free ddH2O补至10μl

混匀后，37℃45min，85℃5min，4℃保存。反转产物cDNA经1:5稀释后用于后续Q-RT-PCR。

对cDNA使用

Premix Ex Taq(Takara,Dalian,China)进行Q-RT-PCR，使用β-actin作为内参基因。反应体系如下：

混匀后置ABI7900荧光定量PCR仪上，反应条件为：94℃2min；94℃15sec， 60℃45sec扩增40个循环，溶解曲线分析。基因相对表达使用2-ΔΔCt方法计算。

ΔCt实验组基因＝实验组目标基因的Ct值-实验组β-actin Ct值

ΔCt对照组基因＝对照组目标基因的Ct值-对照组β-actin Ct值

ΔΔCt＝ΔCt实验组基因-ΔCt对照组基因

5、真核表达载体pcDNA3.1(+)的构建

PD-L1的3个变异体Isoform a，Isoform b，Isoform c过表达载体的构建

将Isoform a，Isoform b，Isoform c的CDS区域分别构建至pcDNA3.1(+)过表达载体。 pcDNA3.1(+)载体信息如图2

构建过程如下：

①根据Isoform a(NM_014143.3)，Isoform b(NM_001267706.1)，Isoform c (NM_001314029.1)的CDS序列设计引物，上游引物后面分别添加Flag序列、HA序列、 Myc序列。引物两端添加了BamH I或Xho I酶切位点，使用该引物扩增目的基因。

PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s(30个循环)； 72℃5min；4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并进行切胶回收PCR产物。

②用BamH I，XhoI双酶切pcDNA3.1(+)和胶回收纯化的PCR产物，

反应体系如下：

对酶切后的体系进行切胶回收。

③回收BamH I，XhoI酶双酶切后的pcDNA3.1(+)、目的基因序列，进行连接

反应；反应体系如下：

ddH₂O补至10μl。

22℃反应30min。

④将连接产物转化至DH5α感受态大肠杆菌。提取质粒，琼脂糖凝胶电泳验证后送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否正确。

6、慢病毒载体构建及转染

pLent-CD274-Isoform a，pLent-CD274-Isoform b，pLent-CD274-Isoform c过表达载体由山东维真生物科技有限公司构建，采用pLent-EF1a-FH-CMV-Puro表达载体。

慢病毒包装与感染

pLVX慢病毒载体的包装

(1)将处于对数期生长的、状态良好的Lenti 293FT细胞，用其培养基-含10％胎牛血清的DMEM培养基将细胞吹下来后，1×PBS清洗2-3遍，计数，取适量细胞数均匀铺于10cm的无菌培养皿中，加入适量含此慢病毒包装系统专用的tet system approved的血清配置的10％的DMEM培养基，进行培养；

(2)当细胞密度达到80％～90％时，即可用于后续的包装。进行包装前，细胞需换10ml新鲜的tet system approved血清配置10％的DMEM培养基，放置培养箱中备用；

(3)准备两个1.5ml的EP管，按下述操作完成。

Tube 1(Plasmid DNA)：

557μl Xfect Reaction Buffer

36μl Lenti-X HTX Packaging Mix

7μl Lenti-X Vector DNA(1μg/μl)

600μl Total Volume

Tube 2(Polymer)：

592.5μl Xfect Reaction Buffer

7.5μl Xfect Polymer

600μl Total Volume

(4)每管加完后都用枪头充分混匀后，将tube2加入到tube1中，同样充分轻柔混匀10s以上；

(5)将混匀好的试剂放置室温静置孵育10min，使纳米颗粒复合物充分形成；

(6)将整管1200ul体积的混合物均匀一滴一滴的滴入到Lenti293T的培养基中，将培养皿前后晃动以充分混匀；

(7)放置在37℃孵箱内孵育；

(8)10h～12h之后，延培养皿侧壁，轻柔更换10ml新鲜的tet system approved 血清配置的10％的DMEM培养基，继续37℃孵箱内孵育48h；

(9)24h左右观察培养基的颜色变化情况，过黄则加入适量的tet systemapproved 的血清，以保证细胞的正常生长；

(10)48h后收慢病毒上清，此时上清中即是包装好的所需慢病毒，约10ml左右，用0.45um的滤器过滤掉细胞碎片等杂质，测慢病毒上清滴度，1ml每管分装，标记好对应信息，存于-80℃冰箱备用。

慢病毒的感染

(1)取对数生长期，状态良好的目的细胞，消化，清洗，计数后均匀铺好，待细胞密度达到约50-60％时，即可进行后续感染；

(2)感染前24-48h，据细胞培养基的体积，加入合适浓度的polybrene与细胞培养基中；

(3)根据目的细胞内所加入的培养基的体积不同，取适量体积新鲜慢病毒血清或融解好的冻存的慢病毒上清，均匀匀速滴入细胞培养基中，前后晃动混匀后置于 37℃孵箱中培养；

(4)6h后更换新鲜的目的细胞的培养基，继续在37℃孵箱内孵育；

(7)24h～48h后，提取细胞RNA或者蛋白进行检测，以确定转染效果。

7、细胞瞬时转染

7.1 细胞准备

细胞在含小牛血清的培养液常规培养，转染前一天胰酶消化细胞并计数，将细胞按一定的密度均匀接种在六孔板里(孔，此数值依细胞大小和生长速度而定，后观察细胞状态，细胞密度状态良好的情况下准备转染。

7.2 转染

釆用Invitrogen公司提供的LipofectamineTM2000进行转染，具体步骤参照说明书。 250μL无血清培养基与4μg质粒混匀，另250μL无血清培养基与10μLLipofectamineTM2000 混匀，涡旋振荡10sec，室温静置5min后将两者混合，轻轻混匀后室温静置20min以便质粒与转染试剂形成转染复合物，复合物可在室温保持6h稳定。PBS温和清洗细胞两次，加入1.5ml无血清的培养基。将上述质粒与转染试剂的混匀物滴滴加入细胞培养上清中，轻微摇晃六孔板，轻轻混匀，之后放入37℃5％CO₂湿化培养箱中培养。无血清培养6h后更换含10％小牛血清的RPMI1640培养液，24h后荧光显微镜观察，计数表达GFP的细胞以确定转染效率，根据具体实验，取转染的细胞进行分析。

8、细胞增殖、迁移以及侵袭实验

8.1 CCK8细胞细胞增殖实验

(1)将处于对数生长期，状态良好的细胞胰酶消化，PBS清洗2-3遍后，计数；

(2)每种细胞设置4～5个副孔(即重复4～5次)，将一定细胞(一般2000～5000个为宜) 加入到96孔板中，用含10％胎牛血清的培养基补足体积至100ul/孔，剩余的孔可加入PBS 以减少蒸发带来的误差，同时设置不同时间点的空白对照组，即不加细胞只加含10％胎牛血清的培养基组；

(3)在96孔板盖子上标记好对应的每个孔的细胞种类，时间点，放置37℃、5％CO2孵箱中培养，计时；

(4)3h后，严格按照博士德细胞增殖检测试剂盒(CCK8)的操作说明，每孔加入CCK8试剂10ul，充分混匀，计时开始；

(5)同样3h后将每孔上清吸取100ul，至另外一个96孔板中(保证每个孔中吸出的体积相等且没有气泡，若有气泡，可将96孔板适度离心或烧热枪头将气泡点掉)，酶标仪上机检测OD值的大小，此时的时间记为0h，记录实验结果；

(6)以后以0h时加入CCK8的时间为准，分别间隔24h后加入10ul CCK8，3h后上机检测，直至96h或据试验需求的时间进行调整(需要注意的是原加入96孔板中只有100ul 的培养基，时间长了培养基营养下降将影响细胞的生长从而影响后续时间点的测定，建议每个副孔加CCK8之前24h更换100ul新鲜培养基，除了保证CCK8加入培养基中的浓度稳定外，还可以确保细胞的正常生长)；

(7)实验重复三次，分析结果，取其平均值作图。

8.2 细胞迁移试验：

取2μg/ml的纤维连接蛋白(Fn)均匀涂在Transwell小室(Costar Corp.,Cambridge,MA) 滤膜背面，超净台内晾干。使用胰酶消化状态良好，处于对数生长期的细胞，3000g转速离心细胞，加入适量无FBS培养基重悬细胞沉淀。细胞计数，Transwell小室中接种1×10⁵个细胞，Transwell小室下层加600μl含10％FBS的培养液，上层加100μl无FBS培养基，置于37℃5％CO2孵箱内培养。48h-72h后取出Transwell小室，弃去Transwell孔内培养基，使用PBS清洗2次，用棉签轻轻擦净膜上层细胞，使用4％多聚甲醛浸泡Transwell，固定 20min，PBS洗3次，0.1％结晶紫染色15min，PBS洗3次，倒置显微镜观察拍照。拍照后使用33％冰醋酸可洗脱Transwell下层染上的结晶紫，570nm波长进行分光光度检测。数值代表了细胞迁移能力的大小。

8.3 细胞侵袭实验

Matrigel(BD Biosciences,Bedford,MA)预置于4℃过夜。取2μg/ml的纤维连接蛋白(Fn) 均匀涂在Transwell小室滤膜背面，超净台内晾干。4℃预置过夜的Matrigel一般按照1:5的比例稀释(使用预冷的无FBS培养基进行稀释)，取50μl稀释后的Matrigel加入Transwell 小室内，37℃培养箱中静置1h使其包被Transwell小室。使用胰酶消化状态良好、处于对数生长期的细胞，3000g转速离心细胞，加入适量无FBS培养基重悬细胞沉淀。计数细胞后，在Transwell小室中接种1×105个细胞，Transwell小室下层加600μl含10％FBS的培养液， Transwell上层加100μl无FBS的培养基，置于37℃5％CO2孵箱内培养。48h-72h后取出 Transwell小室，弃去Transwell孔内培养基，使用PBS清洗2次，用棉签轻轻擦净膜上层细胞，使用4％多聚甲醛浸泡Transwell，固定20min，PBS洗3次，0.1％结晶紫染色15min， PBS洗3次，倒置显微镜观察拍照。拍照后使用33％冰醋酸可洗脱Transwell下层染上的结晶紫，570nm波长处进行分光光度检测。数值代表了细胞侵袭能力的大小。

9、肿瘤细胞与T细胞的共培养实验

检测分别过表达PD-L1的3个变异体Isoform a，Isoform b，Isoform c的肿瘤细胞对外周血T细胞凋亡的影响(FCM法)

(1)选用12孔板，每组各设置3个复孔。

(2)实验组：过表达肿瘤细胞1×10⁵，T细胞5×10⁵；

对照组：转染空载体的肿瘤细胞1×10⁵，T细胞5×10⁵。

提前铺入肿瘤细胞，待肿瘤细胞贴壁生长后更换新鲜培养基并加入T细胞。

(3)体外共培养48h后，收集上清中的细胞进行细胞凋亡分析。

10、流式细胞实验

用流式细胞仪进行细胞凋亡分析

1).收集过表达PD-L1变异体的肿瘤细胞与T细胞共培养上清中的细胞。

2).用预冷PBS离心洗涤细胞2次，弃上清。

3).用双蒸水稀释5×Binding Buffer为1×工作液，取适量预冷1×BindingBuffer重悬细胞沉淀，使细胞浓度为1×106-1×107个细胞/ml。

4).每个样品管中加入100μl细胞悬液，约1×105-1×106个细胞/每管。

5).每管加入5μl抗人CD3FITC抗体，轻轻混匀，室温避光孵育25min.。用PBS洗涤 1次，弃上清。

6).用100μl 1×Binding Buffer重悬细胞，每管加入5μl Annexin V-PE和10μl7-AAD。

7).轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15min。

8).无需洗涤，每管加入380μl预冷1×Binding Buffer。

9).上流式细胞仪进行凋亡分析，圈出CD3+的细胞进行凋亡分析，仪器设置与操作由浙江大学医学院公共技术平台技术人员完成。

11、荧光定量PCR实验(Real Time PCR)

对临床组织cDNA样本使用

Premix Ex Taq(Takara,Dalian,China)进行qPCR，使用

β-actin作为内参基因。反应体系如下：

ΔCt实验组基因＝实验组目标基因的Ct值-实验组β-actin Ct值

ΔCt对照组基因＝对照组目标基因的Ct值-对照组β-actin Ct值

ΔΔCt＝ΔCt实验组基因-ΔCt对照组基因

实施例1 PD-L1在结直肠癌细胞系中的表达情况分析

收集实验室所有的结直肠癌细胞系进行了PD-L1western bolt检测，结果如图3a所示。其中PD-L1的抗体为Abcam公司：Anti-PD-L1抗体[28-8](ab205921)。由图中可以看出在结直肠癌的常见细胞系中，仅有RKO和RKO-MUT细胞系中有PD-L1的表达。其中 RKO-MUT细胞为RKO细胞的突变细胞，由浙江大学医学院病理学实验室保存，发明人承诺该细胞可以自专利申请日起20年内免费为公众提供该细胞系。

实施例2 RNAi干扰RKO/RKO-MUT的PD-L1的表达

RNAi RKO/RKO-MUT细胞系的PD-L1的表达检测，其中使用的siRNA序列如下表所示：

结果如图3b所示。图中可以看出，经过RNAi后，RKO/RKO-MUT细胞中的PD-L1的表达量均有所下降，RKO细胞系PD-L1的表达量下降较RKO-MUT细胞系更加显著。另外，令人惊奇的是，发明人观察到RKO-MUT细胞系中PD-L1的条带位置与RKO细胞系不同，提示PD-L1可能存在多种可变剪接体。经过检索,智人的PD-L1蛋白存在天然的三个可变剪接体，即isoforma/b/c，其编码的核苷酸序列之间的对比关系可参见图1所示，其编码的多肽序列可参见NCBI登录号NCBI Reference Sequence:NP_054862.1，NCBI Reference Sequence:NP_001254635.1，NCBI Reference Sequence:NP_001300958.1。由此可见，PD-L1 可变剪接体的存在导致了RKO和RKO-MUT细胞系中PD-L1蛋白表达的条带位置差异，即 2者的PD-L1可变剪接体的表达情况是不同的。。

实施例3 RT-qPCR检测三个剪接体在不同的结直肠癌细胞系中的表达

在3个变异体的公共序列区设计了引物，能把3个变异体都测到；分别针对3个变异体设计引物，只能特异性测到某个变异体。对3个变异体的mRNA表达情况进行了qPCR检测，其中的引物序列如下表所示：

引物名称	序列(5'to3')	SEQ ID NO:
			PDL1-qPCR-F	GCCGAAGTCATCTGGACAAG	10
PDL1-qPCR-R	AGTGTGCTGGTCACATTGAA	11
			PDL1-a-F	ATGCTGCACTTCAGATCACAGA	12
PDL1-a-R	TCACATCCATCATTCTCCCTTTT	13
			PDL1-b-F	GGCATTTGCTGAACGCCCC	14
PDL1-b-R	TGCTTGTCCAGATGACTTCGG	15
			PDL1-c-F	TGATCAGCTATGGTGGTGCC	16
PDL1-c-R	GTGCTAGGGGACAGTGTTAGA	17
			β-actin-F	GTCATTCCAAATATGAGATGCGT	18
β-actin-R	GCTATCACCTCCCCTGTGTG	19

结果如图4所示，与western-blot的结果类似，除RKO与RKO-MUT细胞系中有PD-L1表达外，其余结直肠癌细胞系中仅有痕量的PD-L1的mRNA被转录并检测得到。另外，在 RKO和RKO-MUT的细胞系中没有检测得到isoform b的表达情况。

实施例4 isoform a/b/c在不表达PD-L1的结直肠癌细胞系中的表达

选取不表达PD-L1的HT29或者仅有痕量表达PD-L1的HCT116作为宿主细胞，分别过表达PD-L1的3个变异体，采用瞬时转染的方法(具体操作见具体实验方法7)用于研究转染后48h马上进行实验。构建了pcDNA3.1(+)-Isoform a，pcDNA3.1(+)-Isoform b， pcDNA3.1(+)-Isoform c共3个过表达载体(载体结构如图2所示)，载体由南京金斯瑞生物科技有限公司构建，转染方法：采用LipofectamineTM 2000(Invitrogen)转染试剂进行转染。该实验是在转染表达质粒48小时后对细胞系中的PD-L1三个剪接体的mRNA转录以及蛋白表达情况进行检测，结果如图5所示，其中图5a显示的是HT29细胞中三个剪接体的mRNA 以及蛋白的表达情况；图5b显示的是HCT116细胞中三个剪接体的mRNA以及蛋白的表达情况。

实施例5 过表达三个剪接体的肿瘤细胞对于免疫细胞的影响

采用前述具体实验方法9的方法，将过表达变异体的肿瘤细胞与T淋巴细胞共培养，检测其对T细胞功能的影响，具体采用流式细胞仪检测T细胞凋亡、采用酶联免疫吸附(ELISA)检测细胞因子(具体为IL-2、IFN-γ和TNF-α)分泌。结果如图6所示。具体为：图a/b分别显示了过表达isoform b的HT29细胞和HCT116细胞对于T细胞的影响，表现为促进了T细胞的凋亡以及抑制了T细胞细胞因子的分泌。

实施例6 稳定转染并表达三个剪接体的结直肠癌肿瘤细胞系对于免疫细胞的影响

采用前述具体实验方法6的操作构建三个剪接体的慢病毒载体，分别过表达PD-L1的3 个变异体在低表达PD-L1的结直肠癌细胞株HT29和HCT116中的表达，用Puro筛选出了稳转细胞株。具体为：构建了pLent-Isoform a，pLent-Isoform b，pLent-Isoform c共3个慢病毒过表达载体，载体由山东维真生物科技有限公司构建，转染方法：慢病毒转染。过表达变异体的肿瘤细胞与T淋巴细胞共培养，检测T细胞凋亡，结果如图7所示，图中可以看出过表达isoform b的HT29细胞核HCT116细促进了T细胞的凋亡，提示isoform b剪接体可以抑制了T细胞，抑制了肿瘤微环境中免疫细胞对于肿瘤的杀伤。

实施例7 临床样本检测

采用荧光定量PCR的方法对医院来源的样本进行检测并对其对应的病例的临床样本进行5年生存统计分析，结果发现，高表达isoform b和isoform c的组较低表达组有显著差异，提示高表达isoform b和isoform c的结直肠癌患者具有不良的预后，具体如图8所示，其中所述的高表达是值isoform b的cutoff值高于0.000013，所述的isoform c的cutoff值高于 0.000331。

参考文献

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SEQUENCE LISTING

<110> 申请人浙江大学

<120> PD-L1 剪接体B作为指导抗PD-L1/PD1免疫治疗的用药的标志物的应用

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 873

<212> DNA

<213> PD-L1 isoform a

<400> 1

atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact gtcacggttcccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc aaattcccag tagaaaaacaattagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag gataagaaca ttattcaatt tgtgcatggagaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccctgggaaatgc tgcacttcag atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcagctatggtggt gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaagaattttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac cccaaggccgaagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc accaccaatt ccaagagagaggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac acaacaacta atgagatttt ctactgcacttttaggagat tagatcctga ggaaaaccat acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatcctccaaatga aaggactcac ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacattcatcttccgt ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaagaagcaaagtg atacacattt ggaggagacg taa 873

<210> 2

<211> 290

<212> PRT

<213> PD-L1 isoform a

<400> 2

MetArgIlePheAlaValPheIlePheMetThrTyrTrpHisLeuLeuAsnAlaPheThrValThrValProLys

5 10 15 20 25

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30 35 40 45 50

AlaAlaLeuIleValTyrTrpGluMetGluAspLysAsnIleIleGlnPheValHisGlyGluGluAspLeuLys

55 60 65 70 75

ValGlnHisSerSerTyrArgGlnArgAlaArgLeuLeuLysAspGlnLeuSerLeuGlyAsnAlaAlaLeuGln

80 85 90 95 100

IleThrAspValLysLeuGlnAspAlaGlyValTyrArgCysMetIleSerTyrGlyGlyAlaAspTyrLysArg

105 110 115 120 125

IleThrValLysValAsnAlaProTyrAsnLysIleAsnGlnArgIleLeuValValAspProValThrSerGlu

130 135 140 145 150

HisGluLeuThrCysGlnAlaGluGlyTyrProLysAlaGluValIleTrpThrSerSerAspHisGlnValLeu

155 160 165 170 175

SerGlyLysThrThrThrThrAsnSerLysArgGluGluLysLeuPheAsnValThrSerThrLeuArgIleAsn

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ThrThrThrAsnGluIlePheTyrCysThrPheArgArgLeuAspProGluGluAsnHisThrAlaGluLeuVal

205 210 215 220 225

IleProGluLeuProLeuAlaHisProProAsnGluArgThrHisLeuValIleLeuGlyAlaIleLeuLeuCys

230 235 240 245 250

LeuGlyValAlaLeuThrPheIlePheArgLeuArgLysGlyArgMetMetAspValLysLysCysGlyIleGln

255 260 265 270 275

AspThrAsnSerLysLysGlnSerAspThrHisLeuGluGluThr

280 285 290

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<212> DNA

<213> PD-L1 isoform b

<400> 3

atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgccccatac aacaaaatcaaccaaagaat tttggttgtg gatccagtca cctctgaaca tgaactgaca tgtcaggctg agggctaccccaaggccgaa gtcatctgga caagcagtga ccatcaagtc ctgagtggta agaccaccac caccaattccaagagagagg agaagctttt caatgtgacc agcacactga gaatcaacac aacaactaat gagattttctactgcacttt taggagatta gatcctgagg aaaaccatac agctgaattg gtcatcccag aactacctctggcacatcct ccaaatgaaa ggactcactt ggtaattctg ggagccatct tattatgcct tggtgtagcactgacattca tcttccgttt aagaaaaggg agaatgatgg atgtgaaaaa atgtggcatc caagatacaaactcaaagaa gcaaagtgat acacatttgg aggagacgta a 531

<210> 4

<211> 176

<212> PRT

<213> PD-L1 isoform b

<400> 4

MetArgIlePheAlaValPheIlePheMetThrTyrTrpHisLeuLeuAsnAlaProTyrAsnLysIleAsnGln

5 10 15 20 25

ArgIleLeuValValAspProValThrSerGluHisGluLeuThrCysGlnAlaGluGlyTyrProLysAlaGlu

30 35 40 45 50

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55 60 65 70 75

LeuPheAsnValThrSerThrLeuArgIleAsnThrThrThrAsnGluIlePheTyrCysThrPheArgArgLeu

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AspProGluGluAsnHisThrAlaGluLeuValIleProGluLeuProLeuAlaHisProProAsnGluArgThr

105 110 115 120 125

HisLeuValIleLeuGlyAlaIleLeuLeuCysLeuGlyValAlaLeuThrPheIlePheArgLeuArgLysGly

130 135 140 145 150

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155 160 165 170 175

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<212> DNA

<213> PD-L1 isoform c

<400> 5

atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact gtcacggttcccaaggacct

atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc aaattcccag tagaaaaaca attagacctggctgcactaa

ttgtctattg ggaaatggag gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca

gcatagtagc tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag

atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt gccgactaca

agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga attttggttg tggatccagtcacctctgaa

catgaactga catgtcaggc tgagggctac cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag

tcctgagtgg taagaccacc accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact

gagaatcaac acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccatacagctgaat

tggtcatccc aggtaatatt ctgaatgtgt ccattaaaat atgtctaaca ctgtccccta gcacctag738

<210> 6

<211> 245

<212> PRT

<213> PD-L1 isoform c

<400> 6

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30 35 40 45 50

AlaAlaLeuIleValTyrTrpGluMetGluAspLysAsnIleIleGlnPheValHisGlyGluGluAspLeuLys

55 60 65 70 75

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80 85 90 95 100

IleThrAspValLysLeuGlnAspAlaGlyValTyrArgCysMetIleSerTyrGlyGlyAlaAspTyrLysArg

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<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

uucuccgaac gugucacguu u 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

ccagcacacu gagaaucaau u 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

ggauccaguc accucugaau u 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

gccgaagtca tctggacaag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

agtgtgctgg tcacattgaa 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

atgctgcact tcagatcaca ga 22

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

tcacatccat cattctccct ttt 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 14

ggcatttgct gaacgcccc

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 15

tgcttgtcca gatgacttcg g 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

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tgatcagcta tggtggtgcc 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

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gtgctagggg acagtgttag a 21

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 18

gtcattccaa atatgagatg cgt 23

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 19

gctatcacct cccctgtgtg 20

Claims

1.特异性检测PD-L1可变剪接体b(isoform b)的试剂在制备预测肿瘤是否响应免疫治疗的试剂中的应用，其中isoform b高表达时，所述肿瘤患者响应免疫治疗，所述的肿瘤为结直肠癌，其中isoform b的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。

2.特异性检测PD-L1可变剪接体b(isoform b)的试剂在制备预测肿瘤是否具有不良预后的试剂中的应用，其中isoform b高表达时，所述的肿瘤患者具有不良的预后，所述的肿瘤为结直肠癌，所述的PD-L1 isoform b的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。