CN114032236A

CN114032236A - 一种TMEM2的shRNA及其应用

Info

Publication number: CN114032236A
Application number: CN202111126255.9A
Authority: CN
Inventors: 李静; 杨磊; 王金明; 沈爱国
Original assignee: Nantong Tumor Hospital
Current assignee: Nantong Tumor Hospital
Priority date: 2021-09-24
Filing date: 2021-09-24
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2041-09-24
Also published as: CN114032236B

Abstract

本发明公开了一种TMEM2的shRNA及其应用，属于生物工程技术领域。本发明是基于结直肠癌临床治疗面临的难点即治疗后易出现复发转移，通过抗结直肠癌基因治疗途径发明了TMEM2的小干扰RNA片段，可作为药物应用在结直肠癌转移复发中。相关细胞学实验表明本发明所提供的小干扰RNA具有抑制结直肠癌细胞TMEM2的蛋白表达和抑制癌细胞增殖和迁移侵袭的重要功能。因此，本发明为肿瘤治疗开发新的靶点提供了新的技术手段，所提供的TMEM2的shRNA对于应用于肿瘤的临床治疗及靶向药物开发具有十分重要的应用价值和前景。

Description

一种TMEM2的shRNA及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体地说，涉及一种TMEM2的shRNA 及其应用。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球范围内发病率和死亡率位居第三位的恶性肿瘤，虽然手术联合术后放化疗可以调高患者生存率，但总体疗效仍不理想，其主要原因是由于CRC患者在化疗后易出现化疗抗性，转移和复发。因此，阐明肿瘤细胞产生化疗抵抗的潜在机制，寻找潜在肿瘤治疗靶点，有助于阻止癌细胞的扩散与侵袭，对于提高CRC患者的治疗效果及寻找相应的干预措施具有重要的意义。

肿瘤转移是一个复杂的过程，涉及多个阶段的变化，包括：肿瘤细胞从原发灶脱落，突破周围基质屏障，诱导肿瘤血管形成，逃避宿主抗肿瘤反应，最终在远处形成转移灶。很多因素参与肿瘤的侵袭和转移，如肿瘤微环境的改变、炎症因子的刺激和各种细胞内外信号通路的活化等。近来研究指出细胞外基质 (ECM)是围绕正常细胞和癌细胞的蛋白质网络，是肿瘤细胞微环境的重要组成部分。通过为其生长和存活提供信号，基质在肿瘤生长和进展中起重要作用。研究人员发现某些蛋白质在肿瘤和其他疾病部位周围的区域很多，但在健康组织中表达较少。这些ECM蛋白在癌症发展过程中不会发生变异。因此靶向ECM 为阻止癌细胞的扩散与侵袭提供了一种更好的方法。ECM的主要成分之一是透明质酸(HA)，这是一种巨大的大分子化合物。越来越多的证据表明，HA在各种癌症中起着重要作用。HA通过与特定的细胞表面受体(包括CD44和RHAMM) 相互作用来调节细胞的黏附、迁移和增殖。特别是，降解后产生的低分子HA 与各种癌症的恶性表型密切相关，提示HA代谢异常在癌症进展中起着重要作用。已知HA可被透明质酸酶和CEMIP降解。据报道，这些透明质酸降解酶在多种癌症中被激活。最近，与CEMIP结构相似的跨膜蛋白2(CEMIP2，CellMigration-Inducing Hyaluronidase2，又名TMEM2，基因ID：NM_013390.3)被报道为一种新的透明质酸酶，负责细胞表面HA裂解的起始步骤。在胚胎发育过程中，TMEM2通过控制HA周转来调节血管内皮细胞生长因子信号。先前的一项研究表明，TMEM2是一种SOX4调节基因，介导乳腺癌的迁移和侵袭。但 TMEM2在结直肠癌发生发展中的作用，还不是很清楚。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种 TMEM2的shRNA。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述TMEM2的 siRNA在制备抗结直肠癌药物中的应用。本发明所要解决的最后一技术问题是提供一种含有前述TMEM2的shRNA的抗结直肠癌药物。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种TMEM2的shRNA，含有的靶标序列为

或

进一步地，所述的TMEM2的shRNA核酸序列如下：

正义链：

反义链：

或

正义链：

反义链：

或

正义链：

反义链：

含有所述的TMEM2的shRNA的表达载体。

含有所述表达载体的病毒载体。

所述的TMEM2的shRNA、所述的表达载体或所述的病毒载体在制备抗结直肠癌药物中的应用。

进一步地，所述的抗结直肠癌药物是降低结直肠癌细胞增殖能力的药物。

进一步地，所述的抗结直肠癌药物是降低结直肠癌细胞迁移能力的药物。

进一步地，所述的抗结直肠癌药物是增强结直肠癌细胞对化疗药物敏感性的药物。

进一步地，所述的化疗药物是化疗药5-FU。

一种抗结直肠癌药物，含有所述TMEM2的shRNA或含有TMEM2的shRNA 的表达载体或含有TMEM2的shRNA表达载体的病毒载体。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明是基于结直肠癌易出现化疗耐药，复发转移等治疗难点，通过抗结直肠癌基因治疗途径发明TMEM2的RNA小干扰片段。本发明还通过免疫印迹实验明确TMEM2的表达，证明了本发明的TMEM2的shRNA可在结肠癌中高效干扰抑制TMEM2表达功能。并进一步利用多种功能手段分析其对结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用及对结肠癌化疗敏感性的影响，在细胞生物学层面证明了此干扰片段具有抑制结直肠癌增殖、促进结直肠癌化疗敏感性的重要抑癌功能。因此，本发明所提供的TMEM2的shRNA可作为抗结直肠癌药物的有效成分，具有较高的临床应用价值。

附图说明

图1为TMEM2在结直肠癌癌组织及正常组织中表达量图(A)及免疫印迹实验检测TMEM2小干扰片段敲低效率结果图(B)；

图2为CCK8实验检测TMEM2小干扰片段对结肠癌细胞SW620增殖能力的影响图；

图3为细胞克隆形成实验检测TMEM2小干扰片段对结肠癌细胞SW620增殖能力的影响图；

图4为细胞迁移和侵袭实验检测TMEM2小干扰片段对结肠癌细胞SW620 细胞迁移和侵袭能力的影响图；

图5为CCK8实验检测TMEM2小干扰片段对结肠癌细胞SW620化疗敏感性的影响图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1：

通过蛋白免疫印迹实验检测了TMEM2在结直肠癌癌组织及癌旁组织中的表达。收集4对结直肠癌患者新鲜的癌(T1-T4)及癌旁组织(N1-N4)，并提取蛋白， BCA蛋白定量试剂盒(购自碧云天公司)测定蛋白含量。各组取50μg的总蛋白经12％的SDS-PAGE胶电泳分离后，用湿转的方法将蛋白质转移至PVDF膜上，接着用含5％脱脂奶粉的封闭液室温封闭2h。以抗TMEM2抗体(购自 Abcam公司)为一抗室温孵育2h，再以Horseradish Peroxidase(HRP)标记的羊抗兔IgG(购自Proteintech公司)为二抗室温孵育2h。最后化学增强发光法(ECL)显带，以GAPDH为内参对照，结果见图1A上，结果发现TMEM2在癌组织中显著高表达。

通过结直肠癌组织芯片免疫组化染色检测了TMEM2在结直肠癌癌组织及癌旁组织中的表达情况。对芯片进行脱蜡水化抗原修复，使用抗体稀释液以1∶100 稀释TMEM2抗体(购自Abcam公司)原液，单张切片滴加50μL TMEM2一抗稀释液，4℃冰箱中孵育过夜。单张切片滴加50μL二抗(购自丹麦Dako公司)，室温孵育1小时，PBS溶液冲洗3次。去除PBS溶液，单张切片滴加50μL DAB 显色液(1∶50稀释)(购自丹麦Dako公司)，显微镜下观察控色。最后苏木素(购自碧云天公司)复染、脱水、透明封片。显微镜拍片后，结果显示TMEM2在癌组织中高表达(图1A下)。

实施例2：

根据Human TMEM2基因的转录本设计siRNA靶点，安排引物合成。将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体，替换掉原来的ccdB毒性基因。菌落PCR筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证。测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。实验共分以下8个主要步骤：

1、干扰靶点设计和引物合成：

根据shRNA设计的一般原则以及和元生物的丰富经验，设计siRNA靶点，安排引物合成。

具体序列如下：

TMEM2 siRNA靶序列如下：

表1 TMEM2 siRNA靶序列

Marker	Gene	Gene ID	TargetSeq
				Y14031	CEMIP2	NM_013390.3	CCACGTGTTGCTGCTCTAA
Y14032	CEMIP2	NM_013390.3	GGTTCCAGCCAAGAGGTAT
				Y14033	CEMIP2	NM_013390.3	GCACTCAGAATCTTTCTAT
GL427NC2	NC2		CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG

2、引物退火形成带粘性末端的双链片段：

将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取30μL 混合。然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5min，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链oligo片段。取1μL用于后续的连接反应，其余-20 ℃保存。

3、线性化表达载体的制备：

用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x 反应Buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，去离子水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。

4、干扰片段连接入表达载体：

所选用的干扰载体为pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE，将其插入待构建的shRNA序列。

5、感受态细胞的转化：

DH5α感受态细胞的转化，详见《精编分子生物学实验指南》。

6、菌落PCR鉴定阳性转化子：

挑取平板上长出的转化子重悬于10μL LB培养液中，取1μL做模板进行菌落PCR鉴定。

7、阳性克隆送测序：

菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。用Vector NTI软件比对测序结果，对测序结果进行分析。

最终确定合成的shRNA序列及互补序列分别为：

表2病毒载体构建框架

实施例3：小干扰片段的构建及其鉴定

根据将上述三个TMEM2小干扰慢病毒及对照病毒分别感染结直肠癌细胞系SW620细胞，病毒MOI值为50，感染96h，用浓度为2μg/mL的嘌呤霉素筛选三天后，分别提取收集各组细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(购自碧云天公司)测定蛋白含量。各组取50μg的总蛋白经12％的SDS-PAGE胶电泳分离后，用湿转的方法将蛋白质转移至PVDF膜上，接着用含5％脱脂奶粉的封闭液室温封闭2h。以抗TMEM2抗体(购自Abcam公司)为一抗室温孵育2h，再以Horseradish Peroxidase(HRP)标记的羊抗兔IgG(购自Proteimech公司) 为二抗室温孵育2h。最后化学增强发光法(ECL)显带，以GAPDH为内参对照，结果见图1B。结果表明三个针对TMEM2的shRNA序列均有抑制SW620细胞中TMEM2表达的功能，尤其是编号为Y14032的TMEM2 shRNA(sh2)，其抑制效率最显著。

实施例4：TMEM2 shRNA抗肿瘤效应的细胞学实验

1：CCK8实验证明TMEM2 shRNA细胞水平的抗肿瘤效应

将上述用编号为Y14032的TMEM2 shRNA慢病毒和对照组病毒感染的稳转 SW620细胞株分别以2000个/孔的密度接种于96孔培养板，培养24h后分别在 0h、6h、24h、48h、72h、96h后每孔加入10μL CCK-8溶液，2h后，选择波长，在酶联免疫检测仪上测定不同时间点个孔的光吸收值，记录结果。吸收值大小反映了细胞活性，根据实验数据，以时间为横坐标，吸收值为纵坐标作图。如图2所示：CCK-8结果显示与对照组相比，抑制TMEM2表达实验组显著抑制了SW620细胞的增殖能力。

2：细胞克隆形成实验检测细胞增殖活性证明TMEM2 shRNA细胞水平的抗肿瘤效应

使用上述处理的SW620结肠癌细胞株(对照组、TMEM2 shRNA(编号 Y14032)稳定敲低组)，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在完全培养基中备用；将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿 50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，转动，使细胞分散均匀；置37℃、5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养2-3周；经常观察，当肉眼可见培养皿中克隆形成时，终止培养；弃去上清液，PBS洗2 次；加4％多聚甲醛固定15min。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10-30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；肉眼直接计数克隆或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率；克隆形成率＝ (克隆数/接种细胞数)×100％。结果如图3所示，稳定敲低TMEM2后显著抑制SW620细胞克隆形成能力。

3：细胞迁移和侵袭实验证明TMEM2 shRNA细胞水平抑制结肠癌细胞转移效应

细胞划痕实验：选用状态良好的上述处理的SW620结肠癌细胞株(对照组、 TMEM2shRNA(编号Y14032)稳定敲低组)，以0.25％的胰酶消化并悬浮细胞，将细胞浓度稀释为2×10⁵/mL，接种于直径为30mm培养皿，待细胞融合度达80％左右，用10μL枪头紧贴培养皿底壁，在细胞层直线划痕，以无血清培养基洗涤细胞一次，更换新的无血清培养基；在相差显微镜下，拍摄细胞划痕的影像图片，在培养皿外底部划痕随机标记5个点作为细胞迁移参考观测点，采集细胞划痕图后置于细胞培养箱中继续培养，每12h采集图片一次，观测细胞迁移的水平变化。结果如图4A所示，结果发现相较对照组细胞，稳定敲除TMEM2的结肠癌细胞迁移能力显著减弱。

Transwell实验：选用状态良好的上述处理的SW620结肠癌细胞株(对照组、 TMEM2shRNA(编号Y14032)稳定敲低组)，消化细胞，用无血清培养基洗涤细胞三次去除血清，以血球计数板计数细胞，调整浓度为2×10⁵/mL，在transwell 下室(即24孔板底部)加入600-800μL含10％血清的培养基，上室加入400μL 细胞悬液，将培养板置于细胞培养箱中培养24h，取出小室并吸干液体，以800 μL甲醇的室温固定30分钟，取出小室，以800μL Giemsa染液室温染色30分钟。以清水冲洗浸泡数次，取出小室，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，用镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，将膜置于载玻片上并用中性树胶封片，显微镜下随机选10个不重复的视野拍摄细胞影像，统计分析各组中侵袭的细胞数目。结果如图4B所示，该实验结果与图4A一致，稳定敲低 TMEM2后显著抑制SW620细胞迁移和侵袭能力。

4：细胞化疗敏感性实验证明TMEM2 shRNA细胞水平的抗肿瘤效应

选用状态良好的上述处理的SW620结肠癌细胞(对照组、TMEM2(编号 Y14032)干扰组)，使用含10％胎牛血清的培养基配成单个细胞悬液，以每孔 3×10³个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL；待细胞贴壁后，加入不同浓度 5-FU(0μM，1.0μM，1.5μM，2.0μM)刺激48h。更换细胞培养基并添加CCK-8 溶液10μL，培养箱中继续孵育2h，终止培养，以490nm/630nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，汇总检测结果，以浓度为横坐标，相对吸光值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。结果如图5所示，稳定敲低TMEM2后显著提高结肠癌SW620细胞对化疗药5-FU的敏感性，细胞存活率下降。

序列表

<110> 南通市肿瘤医院

<120> 一种TMEM2的shRNA及其应用

<130> 100

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ccacgtgttg ctgctctaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

ggttccagcc aagaggtat 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gcactcagaa tctttctat 19

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> Y14031-F(Artificial)

<400> 4

ccggccacgt gttgctgctc taattcaaga gattagagca gcaacacgtg gttttttg 58

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> Y14031-R(Artificial)

<400> 5

aattcaaaaa accacgtgtt gctgctctaa tctcttgaat tagagcagca acacgtgg 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> Y14032-F(Artificial)

<400> 6

ccggggttcc agccaagagg tatttcaaga gaatacctct tggctggaac cttttttg 58

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> Y14032-R(Artificial)

<400> 7

aattcaaaaa aggttccagc caagaggtat tctcttgaaa tacctcttgg ctggaacc 58

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> Y14033-F(Artificial)

<400> 8

ccgggcactc agaatctttc tatttcaaga gaatagaaag attctgagtg cttttttg 58

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> Y14033-R(Artificial)

<400> 9

aattcaaaaa agcactcaga atctttctat tctcttgaaa tagaaagatt ctgagtgc 58

Claims

1.一种TMEM2的shRNA，其特征在于，含有的靶标序列为

5′-CCACGTGTTGCTGCTCTAA-3′、5′-GGTTCCAGCCAAGAGGTAT-3′或5′-GCACTCAGAATCTTTCTAT-3′。

2.根据权利要求1所述的TMEM2的shRNA，其特征在于，其核酸序列如下：

正义链：

5′-CcggCCACGTGTTGCTGCTCTAATTCAAGAGATTAGAGCAGCAACACGTGGTTTTTTg-3′；

反义链：

5′-aattcaaaaaaCCACGTGTTGCTGCTCTAATCTCTTGAATTAGAGCAGCAACACGTGG-3′；

或

正义链：

5′-CcggGGTTCCAGCCAAGAGGTATTTCAAGAGAATACCTCTTGGCTGGAACCTTTTTTg-3′；

反义链：

5′-aattcaaaaaaGGTTCCAGCCAAGAGGTATTCTCTTGAAATACCTCTTGGCTGGAACC-3′；

或

正义链：

5′-CcggGCACTCAGAATCTTTCTATTTCAAGAGAATAGAAAGATTCTGAGTGCTTTTTTg-3′；

反义链：

5′-aattcaaaaaaGCACTCAGAATCTTTCTATTCTCTTGAAATAGAAAGATTCTGAGTGC-3′。

3.含有权利要求1或权利要求2所述的TMEM2的shRNA的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的病毒载体。

5.权利要求1或2所述的TMEM2的shRNA、或权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的病毒载体在制备抗结直肠癌药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗结直肠癌药物是降低结直肠癌细胞增殖能力的药物。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗结直肠癌药物是降低结直肠癌细胞迁移能力的药物。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗结直肠癌药物是增强结直肠癌细胞对化疗药物敏感性的药物。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的化疗药物是化疗药5-FU。

10.一种抗结直肠癌药物，其特征在于，含有权利要求1或2所述TMEM2的shRNA或权利要求3所述的含有TMEM2的shRNA的表达载体或权利要求4所述的含有TMEM2的shRNA表达载体的病毒载体。