CN102105487A

CN102105487A - 靶向crkl的肽

Info

Publication number: CN102105487A
Application number: CN2009801292540A
Authority: CN
Inventors: W·阿拉普; P·J·门茨; R·帕斯夸里尼
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2008-06-20
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2011-06-22
Also published as: PE20110309A1; EP2303913A4; JP2011525491A; WO2009155556A2; ECSP10010729A; CA2728763A1; EP2303913A2; IL210053A0; CO6331291A2; BRPI0915718A2; WO2009155556A3; CR20110034A; MX2010014173A; US20110189095A1; CL2010001498A1

Abstract

本发明通过使用靶向肽提供了用于选择性靶向CRKL的方法和组合物。通过使用靶向肽选择性靶向分泌的CRKL可用于例如癌症的治疗，以将化疗化合物、融合蛋白或融合构建体递送至癌细胞或组织。

Description

靶向CRKL的肽

本申请要求2008年6月20日提交的美国申请号61/074,423的优先权，其全部公开内容无所放弃地特别通过引用方式全文并入本文。

本发明是在美国政府的支持下在国家健康研究所和国防部的基金PC050442下作出的。政府享有本发明的一些权利。

发明背景

1.发明领域

本发明涉及分子医学和治疗及检测试剂的靶向输送的领域。更具体地，本发明涉及选择性靶向癌症以治疗并检测癌症的新的肽序列的鉴定。

2.相关领域的描述

很多人类疾病状态的治疗性处理受到所用的治疗剂的全身性毒性的限制。癌症治疗剂尤其显示出非常低的治疗指数，并且在试剂浓度不比用于杀死肿瘤细胞的浓度高很多时，迅速生长的正常组织例如皮肤和骨髓通常会受到影响。通过开发用于向癌细胞靶向输送的组合物和方法，更具体而言，就是通过使用与存在于癌细胞表面但不存在于正常组织中的靶标结合的抗体或肿瘤归巢肽(tumor-homingpeptide)，可以极大地促进癌症的治疗和诊断。此类靶标必须与其它细胞表面分子具有最小的同源性，其是难以被发现的。

最近，使用噬菌体显示文库开发了一种体内选择系统，以鉴定小鼠模型系统中的器官或组织靶向肽。此类文库可以这样产生：将随机寡核苷酸插入编码噬菌体表面蛋白的cDNA中，产生以多达10⁹个排列显示独特肽的噬菌体颗粒的集合(Pasqualini and Ruoslahti，1996，Arap等人，1998；Pasqualini等人，2001)。向携带肿瘤的小鼠静脉内施用噬菌体显示文库之后，从肿瘤异种移植物中回收噬菌体，并且表征能够选择性向肿瘤归巢的靶向肿瘤的肽。基于噬菌体外表面表达的特异性靶向肽的序列，回收能够选择性地向不同小鼠器官或组织的血管床归巢的噬菌体(Pasqualini and Ruoslahti，1996)。那些肿瘤归巢肽中的每一个都结合至在肿瘤细胞表面选择性表达或上调的受体。

治疗剂与靶向肽的连接引起该试剂选择性地输送到小鼠模型系统中的想要的器官或组织。化疗剂和促调亡肽向位于肿瘤血管形成性脉管系统中的受体的靶向输送引起治疗功效的显著升高和携带肿瘤的小鼠模型中全身性毒性的下降(Arap等人，1998a，1998b；Ellerby等人，1999)。

CRKL(激酶样蛋白的鸡肿瘤病毒10号调节剂)是一种衔接蛋白(adapter protein)，其是癌基因v-crk的同源物。其包含1个SH2结构域和2个串联的SH3结构域。细胞内的CRKL参与MAP激酶和整联蛋白介导的途径(Li等人，2003；Uemura等人，1999)。此外，CRKL具有致癌的潜在性。

目前，使用全身性化疗和放疗法常规治疗癌症患者。但是，此类疗法经常受到众所周知的副作用和有限的功效的困扰。显然需要用于靶向输送治疗和诊断剂的新的组合物和方法。

发明内容

本发明通过使用靶向肽提供了用于选择性地靶向分泌的CRKL的方法和组合物，从而克服了现有技术中的缺陷。通过使用靶向肽选择性靶向分泌的CRKL可用于例如癌症的治疗，以便向癌细胞或组织输送化疗化合物、融合蛋白或融合构建体。

为了获得关于癌症中跨细胞膜信号传导机理方面的认识，本发明人开始揭示肿瘤异种移植模型中的功能蛋白相互作用。本发明人推论：组合方法(Hajitou等人，2006；Arap等人，2002；Arap等人，1998；Arap等人，2004；Pasqualini and Ruoslahti，1996)，例如在体内从噬菌体显示随机肽文库连续选择可能提供线索，这通过仿效肿瘤微环境情况下的无偏差的配体-受体结合来进行。如以下实施例中所示，观察到细胞内信号传导蛋白CRKL和调节性(而不是配体结合性)β₁整联蛋白细胞外结构域之间的特异性相互作用。令人惊奇的是，本发明人发现CRKL靶向β₁整联蛋白的位于细胞外的丛状蛋白-脑信号蛋白-整联蛋白(plexin-semaphorin-integrin，PSI)结构域，激发MAP激酶并促进细胞生长和存活。不希望被任何理论束缚，这些结果支持以下观点：在激活MAP激酶途径的过程中，对于细胞内调节剂(例如含SH3的蛋白质)，存在尚未认识的整联蛋白介导的由外至内的功能。

本发明的一个方面涉及包含CRKL结合基序的分离的靶向肿瘤的肽，所述基序定义为：长度为6-20个氨基酸，与β₁整联蛋白(SEQ IDNO：47)的相应最佳拟合序列比对的相似性程度为至少25％；并且其中所述靶向肽的长度是100个氨基酸或更少的氨基酸，并且在生理条件下结合至表达CRKL的细胞。所述CRKL结合基序与β₁整联蛋白(SEQ ID NO：47)的最佳拟合序列比对的相似性程度可以是至少40％、至少50％或至少60％。在一些实施方式中，所述肽具有不同于与β₁整联蛋白(SEQ ID NO：47)的最佳拟合序列比对的序列。在一些实施方式中，所述CRKL结合基序可以具有与β₁整联蛋白(SEQ IDNO：47)PSI结构域区域的最佳拟合序列比对。所述CRKL结合基序可以具有与β₁整联蛋白(SEQ ID NO：47)PSI结构域区域的最佳拟合序列比对，所述PSI结构域区域选自氨基酸6至10；10至29；15至34；18至37；36至55；39至58；45至64；94至113；196至215；198至213；203至222；244至263；330至349；377至396；379至398；380至399；398至417；400至419；413至432；447至466；460至479；460至479；464至483；469至488；474至493；475至494；512至533；519至538；551至570；574至593；577至596；579至598；590至609；596至615；613至632；615至634；616至635；644至663；648至667；663至682；674至693；682至701；721至740；727至746；和779至798。在一些实施方式中，CRKL结合基序具有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：46的序列。

在一些实施方式中，分离的肽可以进一步定义为：能够以环状形式制备的环肽，例如在两个末端具有半胱氨酸残基(“C”)的肽，当需要时，可以通过例如形成二-半胱氨酸(即胱氨酸)而以环状形式提供所述肽。此类环肽可以具有特别重要的意义：肽中的二硫键使其对于化学、热或酶促降解具有显著稳定性。此类环肽在治疗和诊断应用中可能具有特别重要的意义，其中涉及到可利用性差、易于发生蛋白水解和体内半衰期短的问题。

所述肽可以连接至分子；例如，所述分子可以是蛋白，并且所述肽可以缀合或融合至所述蛋白以形成蛋白缀合物，其中所述蛋白缀合物不是天然存在的蛋白。肽可以位于蛋白的末端。所述分子可以是促细胞调亡试剂、抗血管生成剂、细胞因子、细胞毒性试剂、药物、化疗剂、激素、生长因子、抗生素、抗体或其片段或单链、存活因子、抗细胞调亡剂、激素拮抗剂、抗原、肽、蛋白、诊断剂、放射性同位素或成像剂。所述分子可以是选自下列的促细胞调亡剂：短杆菌肽、爪蟾抗菌肽(magainin)、mellitin、防御素、天蚕素(cecropin)、(KLAKLAK)₂(SEQ ID NO：48)、(KLAKKLA)₂(SEQ ID NO：49)、(KAAKKAA)₂(SEQ ID NO：50)、(KLGKKLG)₃(SEQ ID NO：51)、Bcl-2、Bad、Bak、Bax和Bik。在一些实施方式中，所述促细胞调亡剂是(KLAKLAK)₂(SEQ ID NO：48)。SEQ ID NO：48可以由D氨基酸组成。

在其它实施方式中，所述分子可以是选自下列的抗血管生成试剂：血小板反应素、血管抑素、色素上皮衍生的因子、血管紧缩素、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活剂抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、血小板反应素、2-甲氧基雌甾二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧胺三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素2、除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、三羧氨基喹啉(Linomide)、萨立多胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、多烯紫杉醇、聚胺、蛋白酶体抑制剂、激酶抑制剂、信号传导肽、accutin、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4、二甲胺四环素、内皮抑素XVIII、内皮抑素XV、基质金属蛋白酶-2的C-末端血红素结合蛋白结构域、人类纤溶酶原的kringle 5结构域、内皮抑素和血管抑素的融合蛋白、内皮抑素和人类纤溶酶原的kringle 5结构域的融合蛋白、干扰素-γ诱生的单核因子(Mig)、Mig与IP10的融合蛋白、可溶性FLT-1(fins样酪氨酸激酶1受体)、或激酶插入子结构域受体(KDR)。所述分子可以是选自下列的细胞因子：白细胞介素1(IL-1)、IL-2、IL-5、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18、干扰素-γ(IF-γ)、IF-α、IF-β、肿瘤坏死因子、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。

所述肽可以连接至大分子复合物，例如病毒、噬菌体、细菌、脂质体、微颗粒、磁性珠子、酵母细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述肽连接至病毒，例如慢病毒、乳多空病毒、腺病毒、逆转录病毒、AAV、痘苗病毒或疱疹病毒。所述肽可以连接至固体载体，例如微量滴定皿或微芯片。

本发明的另一个方面涉及制备构建体的方法，其包括：获得本发明的肽，并将所述肽连接至分子以制备所述构建体。

本发明的另一个方面涉及将肽、分子或蛋白的递送靶向表达CRKL的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：获得或通过上述方法制备根据本发明的肽，并将所述肽施用至细胞群体，其中所述群体包括表达CRKL的细胞，从而将分子或蛋白输送至所述细胞。表达CRKL的细胞可以在受试者中，肽或蛋白融合构建体可以配制在药学上可接受的组合物中，所述组合物可以施用至受试者。所述受试者可以人类受试者。在一些实施方式中，该方法进一步定义为检测方法，所述方法还包括检测已经被输送至细胞的肽、分子或蛋白。所述受试者可以患有疾病或病症，所述方法可以进一步定义为治疗方法。所述受试者可以具有癌症，例如前列腺癌、乳腺癌、肉瘤、牙龈癌、舌癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、肾癌、眼癌、脑癌、白血病、间皮瘤、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、胰腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌和膀胱癌。

在本发明的方法和/或组合物的上下文中讨论的实施方式可以应用于本文描述的任何其它方法或组合物。因此，涉及一种方法或组合物实施方式也可应用于本发明的其它方法和组合物。

在本文的说明书中，″一个(a)″或″一个(an)″可以指一个或多个。在本文的权利要求中，当与单词″包含(comprising)″一起使用时，单词″一个(a)″或″一个(an)″可以指一个或一个以上。

除非明确说明是仅指替代物或者替代物互不相容，否则权利要求中使用的术语“或”用于指“和/或”，虽然本公开支持仅指替代物和“和/或”的定义。本文使用的“另一个”可以指至少另外一个或多个。

在本申请中，术语“大约”用于表示数值，包括设备、用于测定该数值的方法的误差的固有差异，或存在于研究受试者中的差异。

本发明的其它目标、特征和优点将通过以下详细描述变得明显。但是，应该理解，虽然指明本发明的优选实施方式，但是仅以解释方式给出详细描述和具体实施例，因为从该详细描述出发，本发明精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员将是明显的。

附图说明

以下附图是本说明书的一部分，包括这些附图是为了进一步说明本发明的某些方面。可以通过参照附图并结合本文提供的具体实施方式的详细描述更好地理解本发明。

图1A-C：癌细胞中肽的靶向和内在化。图1A，噬菌体肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)结合至DU145细胞的细胞表面。显示序列RGD-4C的噬菌体克隆(Arap等人，1998)用作阳性对照；fd-tet(无插入子)用作阴性对照。条柱代表一式三份涂板的平均值±标准偏差。图1B，非通透化的KS1767细胞的细胞表面上肿瘤归巢噬菌体的免疫定位。图1C 和D，合成肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHAGG(SEQ ID NO：67)-_D(KLAKLAK)₂使得在DU145细胞内发生内在化，如使用WST-1试剂和抗-annexin-VFITC抗体通过细胞存活性所测

图2A-C：肿瘤归巢肽和β₁整联蛋白(SEQ ID NO：13)的序列比对。图2A，肿瘤归巢肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ IDNO：1)与丛状蛋白-脑信号蛋白-整联蛋白(PSI)结构域(序列区域26-78残基)(SEQ ID NO：12)匹配。图2B，所有8个β整联蛋白-亚基(SEQ IDNO：14-21)与YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)肽序列的序列比对。图2C，所有肿瘤归巢肽(表1)与β₁整联蛋白(SEQ IDNO：13)的序列比对。

图3A-D：肽与受体的结合。图3A，重组His-标签CRKL(rCRKL)、rCRKL-SH3(N)结构域和rCRKL-SH3(C)结构域结合至肿瘤归巢肽-YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)。图3B，重组His-标签rCRKL、rCRKL-SH3(N)结构域和rCRKL-SH3(C)结构域结合至对应于PSI结构域中的区域的合成肽NSTFLQEGMPTSA(SEQ ID NO：23)。图3C，制备了整个PSI结构域(残基22-82.SEQ ID NO：71-CLKANAKSCGECIQAGPNCGWCTNSTFLQE GMPTSARCDDLEALKKKGC)的重组gst融合蛋白、线性gst-PSI(残基48-62，SEQ ID NO：72-TNSTFLQEGMPTSAR)、环式gst-PSI(残基26-74，SEQ ID NO：72-CTNSTFLQEGMPTSARC)，以用于结合测定。线性和环式PSI衍生的区域都结合至CRKL。图3D，肿瘤归巢肽与rCRKL-SH3(C)结构域的结合活性被肿瘤归巢肽(YRCTLNSPFFWEDMTHECHA；SEQ ID NO：1)、PSI衍生的肽(NSTFLQEGMPTSA；SEQ ID NO：23)或显示SEQ ID NO：1的肿瘤归巢噬菌体抑制。条柱代表来自一式三份孔的平均值±标准偏差。

图4A-D：CRKL和结合肽之间的相互作用。图4A，rCRKL-SH3(C)与肿瘤归巢肽的结合特性。SEQ ID NO：1中的Pro-＞Ala表示为SEQ ID NO：25。CRKL SH3(C)结构域的突变分析。图4B，肿瘤归巢噬菌体(其显示YRCTLNSPFFWEDMTHECHA；SEQ ID NO：1)和PSI衍生的噬菌体(其显示CNSTFLQEGMPTSA C；SEQ ID NO：23)结合至重组的CRKL。条柱代表来自一式三份孔的平均值±标准偏差。图4C，CRKL SH3(C)结构域(SEQ ID NO：24)和作为His-标签化重组蛋白产生的对照删除突变体的图示。制备并测试了4种突变体：Δ1(删除残基236-256)、Δ2(删除残基257-277)、Δ3(删除残基278-293)和ΔSH3(C)(删除残基236-293)。图4D，结合区域位于SH3(C)结构域的残基236-277之间。

图5：CRKL和β1整联蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用。重组gst-PSI蛋白以浓度依赖性方式抑制CRKL与β₁整联蛋白的结合(直至800nm)。整联蛋白αvβ3和αvβ5用作对照。显示了来自一式三份孔的平均值的标准偏差。

图6A-B：CRKL的细胞表面定位。图6A，DU145细胞上的CRKL的流式细胞术分析。使用单克隆抗-CRKL(^＊＊)、抗-β₁整联蛋白(^＊)和抗-AHSG抗体(c，对照)进行免疫标记。图6B，CRKL的透射电镜(TEM)分析显示了细胞表面上的单个CRKL-金颗粒(箭头)。将用于研究的DU145细胞固定但不通透化。研究中使用抗-CRKL多克隆抗体。标明了比例尺。

图7A-C：CRKL的分泌。图7A，在无血清培养基(SFM)中培养的各种类型的癌细胞分泌未磷酸化形式的CRKL。图B和C，CRKL抗体中和培养基中细胞外形式的CRKL并影响细胞增殖和迁移。使用的对照抗体如下：抗-IL11受体、抗-AHSG、抗-grb2、抗α₆整联蛋白和预免疫的抗体。条柱代表来自一式两份孔的平均值±标准偏差。

图8A-D：siRNA敲低CRKL的效应。显示了细胞增殖(图8A)、粘附(图8B)和迁移(图8C)。显示了来自一式三份孔的平均值的标准偏差。图8D，在细胞增殖测定中，重组CRKL挽救CRKL siRNA敲低的细胞。使用CRKL siRNA转染DU145细胞48小时，然后向孔中外源地加入重组CRKL。使用WST-1试剂测定细胞增殖。

图9A-D：肿瘤靶向和机械模型。图9A，肿瘤归巢噬菌体或对照噬菌体(无插入子，突变体(YRCTLNSAFFWEDMTHECHA；SEQ IDNO：25)，或混杂的噬菌体(#1：YRFCTSPFHEWHLENTDMCA；SEQID NO：26，#2：YRECTDSPHEFHLWNTMCAF；SEQ ID NO：27))在rCRKL上的体外结合。图9B-D，靶向噬菌体或对照噬菌体构建体在携带不同类型肿瘤小鼠中的体内归巢。当与对照比较时，肿瘤归巢噬菌体优先定位于肿瘤。显示了来自两个独立实验的代表性数据。

图10：携带肿瘤的小鼠中的靶向抑制。使用对照gst或重组gst-CRKL预先温育肿瘤归巢噬菌体，然后向携带尺寸匹配的人类肿瘤(衍生自DU145)的裸鼠施用。观察到重组CRKL对于预处理的肿瘤归巢噬菌体的抑制。显示了来自两个独立实验的结果。

图11：以合成的肿瘤归巢促细胞调亡肽处理肿瘤异种移植物。使用携带人类前列腺癌异种移植物(衍生自DU145)的尺寸匹配的裸鼠的队列。在使用合成的肿瘤归巢促细胞调亡肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHAGG(SEQ ID NO：67)-_D(KLAKLAK)₂处理的携带肿瘤的小鼠中观察到显著减少的肿瘤生长。与未经处理的动物相比，等摩尔量的YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ IDNO：1)或_D(KLAKLAK)₂没有显示出肿瘤体积上的差异(Student t-检验，p＜0.001)。

具体实施方式

本发明提供了支持关于细胞内信号传导蛋白CRKL的重要性和功能的证据，还提供了靶向CRKL的肽。细胞膜已经进化为在细胞内物质和细胞外环境之间行成紧密的和间隔化的控制(Conner andSchmid，2003；Cho and Stahelin，2005)。为了保持这种动态平衡，跨膜受体家族通过转导级联的复杂的空间和时间架构而介导跨越细胞表面的双方向的信号传导(Martin等人，2002；Manning等人，2002)。因此，参与信号转导的蛋白的定位对于提供细胞应答的特异性具有关键意义(Cho and Stahelin，2005；Mochly-Rosen，1995)。例如，在典型的机械转导的环境下，通过配体的结合引发细胞表面受体例如整联蛋白发生构象变化，从而实现与信号转导级联例如有丝分裂原激活的蛋白(MAP)激酶途径的交互通讯；常规的整联蛋白配体包括针对其细胞外结构域的细胞外基质(ECM)蛋白以及针对其细胞内结构域的细胞骨架蛋白(Martin等人，2002；Manning等人，2002；Hunter，2000；Pawsonand Scott，1997；Blume-Jensen and Hunter，2001)。

为了获得关于癌症中跨细胞膜信号转导机理方面的认识，本发明人开始揭示肿瘤异种移植物模型中的功能蛋白相互作用。本发明人推论：组合方法(Hajitou等人，2006；Arap等人，2002；Arap等人，1998；Arap等人，2004；Pasqualini and Ruoslahti，1996)，例如在体内从噬菌体显示随机肽文库连续选择可能提供线索，这通过仿效肿瘤微环境情况下的无偏差的配体-受体结合来进行。以下数据表明，在细胞内的信号传导蛋白CRKL和调节性(而不是配体结合性)β₁整联蛋白细胞外结构域之间存在特异性相互作用。令人惊奇的是，本发明人发现CRKL靶向β₁整联蛋白的位于细胞外的丛状蛋白-脑信号蛋白-整联蛋白(plexin-semaphorin-integrin，PSI)结构域，激发MAP激酶并促进细胞生长和存活。这些结果提示了细胞内的调节剂(例如含SH3的蛋白质)在激活MAP激酶途径中的尚未认识到的整联蛋白介导的由外至内的功能。

与本工作中呈现的累积的功能数据一致，细胞外的CRKL有可能在肿瘤微环境中具有尚未被揭示的作用：其通过引发细胞增殖和迁移而发挥此作用。由于CRKL的细胞内部分本身也被添加的外源rCRKL磷酸化，所以人们可以推论细胞外的CRKL(分泌的和/或释放的)可能可以作为肿瘤内的自分泌或旁分泌因子发挥作用。这些结果建立了信号传导分子和细胞粘附受体之间的不寻常的新型关联，其中它们在细胞表面的关系可以引发来自细胞外环境的信号传导事件。

不希望被任何理论所束缚，基于整联蛋白激活的“弹簧刀(switchblade)”结构模型(Takagi等人，2002)，本发明人假设了一种替代性途径，其中细胞外的CRKL能够通过结合至β1整联蛋白链的PSI结构域而激活整联蛋白(从无活性的弯曲构象变成有活性的伸展构象)。在本文呈现的多步模型(图6)中，以下数据证明细胞内的未磷酸化的CRKL被非经典的活性转运子分泌(可能通过ABC-转运子)，和/或通过细胞死亡被释放到肿瘤微环境中(步骤1)，其中它的SH3结构域特异性结合肿瘤细胞表面上的β1整联蛋白的PSI结构域(步骤2)。结合之后，β1整联蛋白的构象从弯曲变成伸展(活性的)，从而引发整联蛋白介导的途径中下游的靶蛋白的磷酸化(步骤3和4)和/或MAP激酶途径(步骤5-7)，并最终影响肿瘤细胞的迁移和增殖(步骤8)。与这些发现一致，最近有数篇关于其它的也能够在细胞表面被检出的细胞内分子，包括多种核蛋白(Sinclair and O’Brien，2002；Hovanessian等人，2000)、转录因子(Monferran等人，2004)和应激应答伴侣(Arap等人，2004；Shin等人，2003；Mintz等人，2003)。除了在以下实施例中显示的一个功能性配体-受体相互作用之外，在作用于细胞外环境的分泌的和/或释放的信号传导分子与细胞粘附受体之间可能存在其它的功能性配体-受体相互作用，并且可能具有一般的生物学意义。

本发明提供了分离的靶向肿瘤的肽，其包含CRKL结合基序，所述基序定义为，例如长度为6-20个氨基酸，与β₁整联蛋白(SEQ IDNO：47)的相应最佳拟合序列比对的相似性程度为例如至少25％；并且其中所述靶向肽长度可以是100个氨基酸或更少的氨基酸，并且在生理条件下结合至表达CRKL的细胞。所述CRKL结合基序与β₁整联蛋白(SEQ ID NO：47)的最佳拟合序列比对的相似性程度可以是至少40％、至少50％或至少60％。在一些实施方式中，所述肽具有不同于与β₁整联蛋白(SEQ ID NO：47)的最佳拟合序列比对的序列。在一些实施方式中，所述CRKL结合基序可以具有与β₁整联蛋白(SEQ IDNO：47)PSI结构域区域的最佳拟合序列比对。所述CRKL结合基序可以具有与β₁整联蛋白(SEQ ID NO：47)PSI结构域区域的最佳拟合序列比对，所述PSI结构域区域选自氨基酸10至29；15至34；18至37；36至55；39至58；45至64；94至113；196至215；198至213；203至222；244至263；330至349；377至396；379至398；380至399；398至417；400至419；413至432；447至466；460至479；460至479；464至483；469至488；474至493；475至494；512至533；519至538；551至570；574至593；577至596；579至598；590至609；596至615；613至632；615至634；616至635；644至663；648至667；663至682；674至693；682至701；721至740；727至746；和779至798。在一些实施方式中，CRKL结合基序具有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：46的序列。在一些实施方式中，本发明的分离的肽可以进一步定义为环肽。

本发明可以使用多种CRKL结合肽。以下提供了CRKL结合肽的非限制性列举(SEQ ID NO：1-46)。

表1.与β1整联蛋白具有相似性的肿瘤归巢肽

定义

术语“靶向部分”包括可用于增强物质向动物中的特定位置的定位或增强物质与动物中特定位置的结合的多种类型的亲和性试剂，所述特定位置包括器官、组织、特定的细胞类型、患病组织或肿瘤。靶向部分可以包括肽、肽模拟物、多肽、抗体、抗体样分子、核酸、适体、及其片段。在一些实施方式中，靶向部分将增强物质向在细胞外表达CRKL(即CRKL与细胞表面结合或与周围的细胞外基质结合)的细胞的定位。本发明的靶向部分(例如靶向肽及其变体和片段)的选择性结合是：靶向部分结合靶标(例如CRKL)并且不与不相关蛋白显著结合。即使靶向部分也与那些实质上与靶标不同源的其它蛋白结合，只要此类蛋白与抗体的肽靶标的片段或结构域具有同源性，则该靶向部分仍被认为是选择性结合。在这种情况下，应该理解，虽然有一定程度的交叉反应性，靶向部分与靶标的结合仍然是选择性的。通常而言，可以确定交叉反应性的程度并且与和靶标的结合区分开。

“靶向肿瘤的肽”是包含CRKL结合基序的肽，所述基序定义为：长度为6-20个氨基酸，与β₁整联蛋白(SEQ ID NO：47)的相应最佳拟合序列比对的相似性程度为至少25％；并且其中所述靶向肽的长度是100个氨基酸或更少的氨基酸，并且其特征在于在生理条件下选择性定位于器官、组织或细胞类型，这包括与细胞外CRKL特异性结合。可以通过例如下文公开的方法测定选择性定位，其中假定的靶向肽序列结合至显示于噬菌体外表面的蛋白。

“受试者”一般是指哺乳动物。在一些优选实施方式中，受试者是小鼠或兔子。在更优选的实施方式中，受试者是人。

CRKL(激酶样蛋白的鸡肿瘤病毒10号调节剂)

慢性骨髓性白血病(CML)是血液系统恶性疾病，其中发生不受控制的粒细胞增殖。其特征通常是：染色体9和22的相互易位，这会将Ableson(abl)原癌基因转位至断裂点丛集区(bcr)的3’末端。这会产生嵌合的bcr-abl基因，其编码p210.sup.bcr-abl融合蛋白，该蛋白是致瘤性的，并且对于CML细胞的生长是必需的(Szczylik等人，1991；Skorski等人，1994；Tari等人，1994；McGahon等人，1994；Bedi等人，1994)。

bcr-abl蛋白可以在存在于bcr的第一外显子的177位酪氨酸氨基酸处发生自身磷酸化。当磷酸化时，bcr-abl蛋白的bcr结构域结合至生长因子受体结合的蛋白2(Grb2)接头蛋白的SH2结构域。通过SH3结构域，Grb2结合至人SOS1(Son of sevenless 1，hSos1)GDP/GTP交换因子，这导致ras蛋白的激活。bcr-abl蛋白还可以磷酸化存在于正常bcr蛋白中的177位酪氨酸氨基酸。相信当正常bcr蛋白在177位氨基酸发生酪氨酸磷酸化时，它也将与Grb2复合。当bcr-abl蛋白被表达时，p46和p52Shc(Puil等人，1994)蛋白也发生酪氨酸磷酸化。还已经表明这些Shc蛋白与Grb2稳定地复合。因此，Grb2似乎在bcr-abl蛋白介导的肿瘤发生中具有非常重要的作用(Puil等人，1994；Pendergast等人，1993)。

还已经发现，另一种接头蛋白Crk样(CRKL)结合至bcr-abl。与Grb2不同，CRKL通过abl结构域结合至bcr-abl。通过它的SH3结构域，CRKL还可以结合至hSos1，这也会导致Ras蛋白的激活(tenHoeve等人，1994a和1994b)。因此，通过Grb2和CRKL接头蛋白，bcr-abl蛋白与ras的激活关联起来，已知ras的激活会导致肿瘤发生。当ras蛋白的表达被抑制时，CML细胞的增殖也被抑制。因此，bcr-abl蛋白促进CML增殖的主要途径之一是通过激活ras蛋白(Skorski等人，1994和1995)。

本发明人发现，在细胞内的信号传导蛋白CRKL和调节性(而非配体结合性)β₁整联蛋白细胞外结构域之间观察到特异性相互作用。令人惊奇的是，本发明人发现，通常已知为细胞内接头的CRKL靶向β₁整联蛋白的位于细胞外的丛状蛋白-脑信号蛋白-整联蛋白(plexin-semaphorin-integrin，PSI)结构域，激发MAP激酶并促进细胞生长和存活。不希望被任何理论束缚，这些结果支持以下观点：在激活MAP激酶途径的过程中，对于细胞内调节剂(例如含SH3的蛋白质)，存在尚未认识的整联蛋白介导的由外至内的功能。

序列比对分析

序列相似性定义为两个核苷酸序列之间的序列同一性，但并不必然表示这两个序列具有共同祖先。例如，25％的相似性意思是在两个核苷酸序列中，100个核苷酸位置上有25个是相同的。本发明中的“最佳拟合序列比对”定义为这样的序列分析：通过使用本领域普通技术人员已知的序列比对方法来发现两个或更多个序列的最佳匹配的分段(局部)或全局比对。本领域技术人员将知晓，可以使用多种算法进行序列比较，例如BLAST比对等。

可以使用本文公开的技术来分析肿瘤归巢噬菌体肽和β₁整联蛋白之间的序列比对。本发明人使用的是基于RELIC50的Perl 5.8.1中编撰的肽匹配软件(Peptide Match software)。该程序基于预先确定的残基窗口大小，以从N至C蛋白末端逐个残基移位的方式，计算亲和选择的肽序列和靶蛋白序列之间的相似性。基于BLOSUM62氨基酸置换矩阵(进行修改以考虑稀有氨基酸的表示)计算每个残基的肽-蛋白相似性得分。可以将阀值设定为肽和蛋白区段之间至少4个相同的残基，以区分与非特异性背景匹配的显著相似性。

蛋白和肽

在一些实施方式中，本发明涉及包含至少一种蛋白或肽的新型组合物。本文使用的蛋白或肽一般是指但不限于，从基因翻译而来的大约200个氨基酸以上的蛋白，直至全长序列；大约100个氨基酸以上的多肽；和/或大约3至大约100个氨基酸的肽。为了方便起见，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中相互替换地使用。

在一些实施方式中，至少一种蛋白或肽的大小可以包括但不限于，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，大约110，大约120，大约130，大约140，大约150，大约160，大约170，大约180，大约190，大约200，大约210，大约220，大约230，大约240，大约250，大约275，大约300，大约325，大约350，大约375，大约400，大约425，大约450，大约475，大约500，大约525，大约550，大约575，大约600，大约625，大约650，大约675，大约700，大约725，大约750，大约775，大约800，大约825，大约850，大约875，大约900，大约925，大约950，大约975，大约1000，大约1100，大约1200，大约1300，大约1400，大约1500，大约1750，大约2000，大约2250，大约2500或更多个氨基酸残基。例如，靶向肽可以存在于融合蛋白中以产生蛋白。

在一些方面，本发明中定义的靶向肿瘤的肽的大小可以包括但不限于5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20个氨基酸残基。在其它方面，靶向肿瘤的肽的大小可以包括但不限于5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30个氨基酸残基，或可从其中衍生的任何范围。在一些实施方式中，可以使用长度小于或等于20个氨基酸的肽，或者长度是6-10个氨基酸的肽。

本文使用的“氨基酸残基”是指任何天然存在的氨基酸，任何本领域已知的氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在一些实施方式中，蛋白或肽的残基是连续的，没有任何非氨基酸打断氨基酸残基的序列。在其它实施方式中，序列可以包含一个或多个非氨基酸部分。在具体的实施方式中，蛋白或肽的残基的序列可以被一个或多个非氨基酸部分打断。

相应地，术语“蛋白或肽”包括含有天然存在的蛋白质中发现的20种常见氨基酸的至少一种或至少一种修饰的或非常规氨基酸的氨基酸序列，所述修饰的或非常规氨基酸包括但不限于，Aad，2-氨基己二酸；EtAsn，N-乙基天冬酰胺；Baad，3-氨基己二酸；Hyl，羟基赖氨酸；Bala，β-丙氨酸，β-氨基-丙酸；AHyl，别-羟基赖氨酸；Abu，2-氨基丁酸；3Hyp，3-羟基脯氨酸；4Abu，4-氨基丁酸，哌啶酸；4Hyp，4-羟基脯氨酸；Acp，6-氨基己酸；Ide，异赖氨素；Ahe，2-氨基庚酸；AIle，别-异亮氨酸；Aib，2-氨基异丁酸；MeGly，N-甲基甘氨酸，肌氨酸；Baib，3-氨基异丁酸；MeIle，N-甲基异亮氨酸；Apm，2-氨基庚二酸；MeLys，6-N-甲基赖氨酸；Dbu，2，4-二氨基丁酸；MeVal，N-甲基缬氨酸；Des，赖氨素；Nva，正缬氨酸；Dpm，2，2’-二氨基庚二酸；Nle，正亮氨酸；Dpr，2，3-二氨基丙酸；Orn，鸟氨酸；和EtGly，N-乙基甘氨酸。

可以通过本领域技术人员已知的任何技术制备蛋白或肽，包括通过标准分子生物学技术表达蛋白、多肽或肽，从天然来源分离蛋白或肽，或化学合成蛋白或肽。以前已经公开了对应于多种基因的核苷酸和蛋白、多肽和肽序列，可以从本领域普通技术人员已知的计算机化数据库中找到。一种这样的数据库是National Center forBiotechnology Information’s Genbank and GenPept数据库(网址是ncbi.nlm.nih.gov)。可以使用本文公开的技术或本领域普通技术人员已知的技术扩增和/或表达已知基因的编码区。或者，蛋白、多肽和肽的多种商售制品对本领域技术人员是已知的。

融合蛋白

蛋白缀合物的其它实施方式涉及融合蛋白。这些分子一般具有靶向肿瘤的肽的全部或实质部分，在N或C末端连接至第二多肽或蛋白的全部或一部分。例如，融合物可以利用来自其它物种的引导序列以允许在异源宿主中重组表达蛋白。另一种有用的融合物包括添加免疫学活性结构域，例如抗体表位，以便例如促进融合蛋白的纯化。在融合接合处或其附近加入切割位点将促进纯化后外来多肽的去除。其它有用的融合物包括连接功能性结构域，例如来自酶的活性位点、糖基化结构域、细胞靶向信号或跨膜区。在优选的实施方式中，本发明的融合蛋白包含连接至治疗蛋白或肽的靶向LRP的肽。可以掺入到融合蛋白中的蛋白或肽的例子包括抑制细胞的蛋白、杀细胞的蛋白、促细胞调亡试剂、抗血管生成剂、激素、细胞因子、生长因子、肽药物、抗体、Fab片段抗体、抗原、受体蛋白、酶、凝集素、MHC蛋白、细胞粘附蛋白和结合蛋白。这些例子不是意在限定，考虑到在本发明的范围内，实际上可以将任何蛋白或肽掺入到包含靶向肽的融合蛋白中。产生融合蛋白的方法是本领域技术人员熟知的。此类蛋白可以这样生产，例如：使用双官能交联剂通过化学连接、从新合成完整融合蛋白，或将编码靶向肽的DNA序列连接至编码第二肽或蛋白的DNA序列，然后表达完整的融合蛋白。

蛋白纯化

在一些实施方式中，蛋白或肽可以是分离的或纯化的。蛋白纯化技术是本领域技术人员熟知的。这些技术包括，在一个水平上，将细胞、组织或器官匀浆化并粗分离为多肽和非多肽组份。可以使用色谱法和电泳技术进一步纯化目标蛋白或多肽，以达到部分或完全纯化(或纯化至匀质)。特别适合于制备纯肽的分析方法是离子交换色谱、凝胶排除色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和色谱、免疫亲和色谱和等电聚焦。通过亲和色谱纯化受体蛋白的实例公开于美国专利5,206,347，其全部内容通过引用并入本文。纯化肽的特别有效的方法是快速液相色谱(FPLC)，或高效液相色谱(HPLC)。

纯化的蛋白或肽意指可以与其它成分分离的成分，其中相对于其天然可获得的状态，所述蛋白或肽被纯化至任何程度。因此，分离的或纯化的蛋白或肽还指游离于其可以天然存在的环境的蛋白或肽。一般而言，“纯化的”指的是经历分离以除去各种其它组分的蛋白或肽组合物，并且所述组合物实质上保持其表达的生物活性。当使用术语“实质上纯化的”时，该术语是指这样的组合物，其中蛋白或肽构成该组合物的主要成分，例如构成该组合物中大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约95％或更多的蛋白。

根据本公开，各种用于定量蛋白或肽的纯化程度的方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括例如，测定活性级份的比活性，或通过SDS/PAGE分析评估级份内的多肽的量。用于评估级份的纯度的优选方法是计算该级份的比活性，将其与最初提取物的比活性进行比较，由此计算其纯化程度，通过“-倍数纯化数”进行评估。当然，用于表示活性的量的实际单位将取决于选择的用于进行纯化的特定分析技术，以及表达的蛋白或肽是否表现出可检测的活性。

适合用于蛋白纯化的各种技术是本领域技术人员熟知的。这些包括，例如，使用硫酸铵、PEG、抗体等物质或通过热变性进行沉淀，然后进行：离心；色谱步骤，例如离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些与其它技术的组合。如本领域一般所知晓，相信进行各个纯化步骤的顺序可以改变，或者可以省略某些步骤，并且仍然产生用于制备实质上纯化的蛋白或肽的适当方法。

没有关于“总是以最纯化的状态提供蛋白或肽的”一般性要求。确实，考虑到较低程度的实质上纯化的产物将在一些实施方式中具有应用。可以使用较少的组合的纯化步骤，或通过利用不同形式的相同的一般性纯化方案来完成部分纯化。例如，认识到，使用HPLC设备进行的阳离子交换柱色谱一般将产生比使用低压色谱系统的相同技术更大的“-倍数”纯化。显示出较低程度的相对纯化的方法可能在蛋白产物的总回收方面、或在保持表达的蛋白的活性方面，具有优点。

亲和色谱是依赖于待分离的物质与其可以特异性结合的分子之间的特异性亲和力的色谱程序。这是受体-配体类型的相互作用。柱材料是通过将结合对的成员之一与不溶性基质共价偶联而合成的。然后，所述柱材料能够从溶液中特异性吸附物质。通过将条件改变为不会发生结合的条件(例如，改变pH、离子强度、温度等)进行洗脱。基质应当是本身不以任何明显程度吸附分子，并且具有相当广泛的化学、物理和热稳定性的物质。配体应该以不影响其结合特性的方式进行偶联。配体也应该提供相对紧密的结合。还应该可以以不破坏样品或配体的方式洗脱物质。

合成的肽

由于其相对较小的大小，可以根据常规技术在溶液中或者在固体载体上合成本发明的靶向肽。多种自动化合成器可从商业渠道获得，并且可以根据已知的程序使用。参见，例如Stewart and Young，1984；Tam等人，1983；Merrifield，1986；Barany and Merrifield，1979，以上文献皆通过引用并入本文。可以通过此类方法容易地合成短的肽序列，通常是大约6至大约35-50个氨基酸。或者，可以应用重组DNA技术，其中编码本发明的肽的核苷酸序列被插入到表达载体中，转化或转染进入合适的宿主细胞，并且在适合于表达的条件下培养。

治疗或诊断缀合物

使用这些方法鉴定的靶向部分可以偶联或结合至多种物质，包括治疗或诊断剂，用于将缀合物选择性递送至小鼠模型系统中的想要的器官、组织或细胞类型。本发明的实施方式涉及疾病或病症、优选癌症的治疗。本发明的靶向肿瘤的肽可以连接至分子；例如，所述分子可以是蛋白，并且所述肽可以与该蛋白缀合或融合以形成蛋白缀合物，其中所述蛋白缀合物不是天然存在的蛋白。所述肽可以置于所述蛋白的末端。所述分子可以是促细胞凋亡试剂、抗血管生成试剂、细胞因子、细胞毒性试剂、药物、化疗剂、激素、生长因子、抗生素、抗体或其片段或单恋、存活因子、抗细胞凋亡剂、激素拮抗剂、抗原、肽、蛋白、诊断剂、放射性同位素或成像试剂。

靶向肿瘤的肽可以连接至大分子复合物，例如病毒、噬菌体、细菌、脂质体、微球体、磁性珠子、酵母细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述肽连接至病毒，例如慢病毒、乳多空病毒、腺病毒、逆转录病毒、AAV、痘苗病毒或疱疹病毒。所述肽可以连接至固体载体，例如微量滴定皿或微芯片。

A.程序性细胞死亡的调节剂

细胞凋亡，或程序性细胞死亡，是正常的胚胎发育、维持成人组织中的动态平衡，和抑制癌发生的必不可少的过程(Kerr等人，1972)。已经证明Bcl-2家族的蛋白和ICE-样蛋白酶是其它系统中的细胞凋亡的重要调节剂和效应子。Bcl-2蛋白(在与滤泡性淋巴瘤相关的情况下被发现)在控制针对各种细胞凋亡刺激的细胞凋亡和增强细胞存活中具有重要作用(Bakhshi等人，1985；Cleary and Sklar，1985；Cleary等人，1986；Tsujimoto等人，1985；Tsujimoto and Croce，1986)。现在认识到，进化上保守的Bcl-2蛋白是相关蛋白家族的成员，其可被分类为死亡激动剂或死亡拮抗剂。

发现Bcl-2之后，证明了Bcl-2起到抑制多种刺激引发的细胞死亡的作用。同样，现在还明确知道，存在Bcl-2细胞死亡调节剂蛋白家族，它们具有共同的结构和序列同源性。已经表明这些不同的家族成员要么与Bcl-2具有相似的功能(例如，Bcl_XL、Bcl_W、Bcl_S、Mcl-1、A1、Bfl-1)，要么抵消Bcl-2的功能并促进细胞死亡(例如，Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。

促细胞凋亡剂的实例有：短杆菌肽、爪蟾抗菌肽(magainin)、mellitin、防御素、天蚕素(cecropin)、(KLAKLAK)₂(SEQ ID NO：48)、(KLAKKLA)₂(SEQ ID NO：49)、(KAAKKAA)₂(SEQ ID NO：50)、(KLGKKLG)₃(SEQ ID NO：51)、Bcl-2、Bad、Bak、Bax和Bik。在一些实施方式中，所述促细胞调亡剂是(KLAKLAK)₂(SEQ IDNO：48)。SEQ ID NO：48可以由D氨基酸组成。

B.血管生成抑制剂

肿瘤细胞的增殖很大程度上依赖于大量的肿瘤血管新生，其伴随癌症的进展。因此，使用抗血管生成试剂抑制新血管的形成和现有血管的靶向破坏已经被提出作为有效的和相对无毒性的治疗肿瘤的方法(Arap等人，1998；Arap等人，1998；Ellerby等人，1999)。多种抗血管生成试剂和/或血管抑制剂是已知的(例如，Folkman，1997；Eliceiri andCheresh，2001)。

在一些实施方式中，本发明可以采纳可操作地偶联至抗血管生成试剂的靶向部分的施用，所述抗血管生成试剂是例如，血小板反应素、血管抑素、色素上皮衍生的因子、血管紧缩素、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活剂抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、血小板反应素、2-甲氧基雌甾二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧胺三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素2、除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、三羧氨基喹啉(Linomide)、萨立多胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、多烯紫杉醇、聚胺、蛋白酶体抑制剂、激酶抑制剂、信号传导肽、accutin、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4、二甲胺四环素、内皮抑素XVIII、内皮抑素XV、基质金属蛋白酶-2的C-末端血红素结合蛋白结构域、人类纤溶酶原的kringle 5结构域、内皮抑素和血管抑素的融合蛋白、内皮抑素和人类纤溶酶原的kringle 5结构域的融合蛋白、干扰素-γ诱生的单核因子(Mig)、Mig与IP10的融合蛋白、可溶性FLT-1(fins样酪氨酸激酶1受体)、或激酶插入子结构域受体(KDR)。所述分子可以是选自下列的细胞因子：白细胞介素1(IL-1)、IL-2、IL-5、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18、干扰素-γ(IF-γ)、IF-α、IF-β、肿瘤坏死因子、或GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。

C.细胞毒性试剂

化疗(细胞毒性)试剂可以偶联至本发明的靶向肽并用于治疗多种过度增殖性或肿瘤形成性疾病状态，包括癌症。具有潜在用途的化疗(细胞毒性)试剂包括但不限于，5-氟尿嘧啶、博莱霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、氮芥、马法兰、丝裂霉素、诺维本、亚硝基脲、普卡霉素、甲基苄肼、雷洛昔芬、它莫西芬、紫杉醇、替莫唑胺(DTIC的水形式)、反式铂、长春碱和甲氨蝶呤、长春新碱，或上述这些的任意类似物或衍生变体。多数化疗剂落在下列范畴内：烷基化试剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、皮质甾类激素、有丝分裂抑制剂和亚硝基脲类、激素试剂、杂项试剂，及其任意类似物或衍生变体。

化疗剂以及给药方法、剂量等是本领域技术人员熟知的(参见，例如“Physicians Desk Reference”，Goodman&Gilman’s“ThePharmacological Basis of Therapeutics”以及见“Remington’sPharmaceutical Sciences”，第15版，第1035-1038和第1570-1580页，通过引用将相关部分并入本文)，并且可以根据本文的公开内容与本发明联合使用。当然，取决于被治疗的受试者的状况，剂量会发生一些变化。在任何情况下，负责给药的人员将确定用于个体受试者的合适剂量。当然，本文描述的所有剂量和试剂都是示例性的而非限制性的，对于特定的患者或应用，技术人员可以使用其它剂量或试剂。另外预期这些点之间的所有剂量或由其衍生的范围也可用于本发明。

D.烷基化试剂

烷基化试剂是与基因组DNA直接相互作用以阻止细胞增殖的药物。这类化疗药物代表影响细胞周期的所有阶段的试剂，即，它们不是阶段特异性的。烷基化试剂可以包括但不限于，氮芥、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、烷基磺酸盐、亚硝基脲或三嗪。它们包括但不限于：白消安、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(cyclophosphamide、cytoxan)、达卡巴嗪、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine、mustargen)和马法兰。

E.抗代谢物

抗代谢物破坏DNA和RNA的合成。与烷基化试剂不同，它们特异性地影响细胞周期的S期。抗代谢物可以分成不同的类别，例如叶酸类似物、嘧啶类似物和嘌呤类似物，以及相关的抑制性化合物。抗代谢物包括但不限于，5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、氟达拉滨，吉西他滨和甲氨蝶呤。

F.天然产物

天然产物一般是指最初从天然资源分离而来并且鉴定为具有药理学活性的化合物。此类化合物、其类似物及衍生物可以分离自天然资源，通过化学合成，或通过任何本领域技术人员已知的技术重组产生。天然产物包括例如以下类别：有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、酶和生物应答修饰剂。

有丝分裂抑制剂包括植物生物碱和其它能够抑制细胞分裂或有丝分裂所需的蛋白合成的天然试剂。它们在细胞周期的特定阶段发挥作用。有丝分裂抑制剂包括，例如，多烯紫杉醇、依托泊苷(VP16)、替尼泊甙、紫杉醇(paclitaxel)、紫杉醇(taxol)、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。

类毒素(taxoid)是从灰树短叶红豆杉(学名：Taxus brevifolia)的树皮中分离而来的一类相关的化合物。类毒素包括但不限于化合物，例如多烯紫杉醇和紫杉醇。紫杉醇结合微管蛋白(其结合位点与长春花生物碱所用的位点不同)并促进微管的组装。

长春花生物碱是一种植物生物碱，其被鉴定为具有药学活性。它们包括诸如长春碱(VLB)和长春新碱的化合物。

G.抗生素

一些抗生素同时具有抗微生物和细胞毒性活性。这些药物还通过化学地抑制酶和有丝分裂或改变细胞膜而干扰DNA。这些试剂不是阶段特异性的，所以它们在细胞周期的所有阶段都发挥作用。细胞毒性的抗生素的实例包括但不限于，博莱霉素、更生霉素、柔红霉素、阿霉素(doxorubicin、Adriamycin)、普卡霉素(光神霉素)和依达比星。

H.杂项的细胞毒性试剂

不落入以上范畴的杂项的细胞毒性试剂包括但不限于，铂配合物复合物、蒽二酮、取代的脲、甲基肼衍生物、安吖啶、L-天冬酰胺酶和维甲酸。铂配合物复合物包括诸如卡铂和顺铂(顺式DDP)的化合物。示例性的蒽二酮是米托蒽醌。示例性的取代的脲是羟基脲。示例性的甲基肼衍生物是甲基苄肼(N-甲基肼，MIH)。这些实例不是限制性的，考虑到在本发明的范围内，任何已知的细胞毒性、抑制细胞的或杀细胞的试剂可以连接至靶向肽并且施用至靶向的器官、组织或细胞类型。

I.成像试剂和放射性同位素

在一些实施方式中，本发明的靶向部分可以连接至用于成像和诊断多种患病器官、组织或细胞类型的成像试剂。很多合适的成像试剂以及用于将其连接至蛋白或肽的方法是本领域已知的(参见，例如美国专利5,021,236和4,472,509，二者通过引用并入本文)。一些连接方法包括使用金属螯合复合物，例如有机的螯合剂例如连接至蛋白或肽的DTPA(美国专利4,472,509)。蛋白或肽还可以在存在偶联剂例如戊二醛或高碘酸盐的情况下与酶反应。在存在这些偶联剂的情况下或者通过与异硫氰酸盐反应来制备与荧光素标志物的缀合物。

潜在的可用作成像剂的顺磁性离子的非限制性实例包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(IIII)，其中钆是特别优选的。在其它情况例如X射线成像中有用的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)、特别是铋(III)。

潜在可用作成像或治疗剂的放射性同位素包括砹²¹¹、¹⁴碳、⁵¹铬、³⁶氯、⁵⁷钴、⁵⁸钴、铜⁶⁷、¹⁵²Eu、镓⁶⁷、³氢、碘¹²³、碘¹²⁵、碘¹³¹、铟¹¹¹、⁵⁹铁、³²磷、铼¹⁸⁶、铼¹⁸⁸、⁷⁵硒、³⁵硫、锝^99m和钇⁹⁰。在一些实施方式中，¹²⁵I通常是优选使用的，锝^99m和铟¹¹¹也通常是优选的，因为它们能量低并且适合用于广范围的检测。

可以根据本领域熟知的方法产生本发明的放射性标记的蛋白或肽。例如，它们可以通过与碘化钠或碘化钾以及化学氧化剂例如次氯酸钠，或者酶促氧化剂例如乳过氧化物酶接触而进行碘化。可以通过配体交换方法，使用锝^99m标记本发明的蛋白或肽，例如：使用锡溶液还原高锝酸盐(pertechnate)、将还原的锝螯合至Sephadex柱并将肽应用至该柱；或者通过直接标记技术，例如通过温育高锝酸盐、还原剂例如SNCl₂、缓冲液例如邻苯二甲酸钠-钾溶液和肽。通常用于将以金属离子存在的放射性同位素结合至肽的中间体官能团是二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和乙烯二胺四乙酸(EDTA)。还考虑到使用荧光标记物，包括若丹明、荧光素异硫氰酸盐和肾造影剂。

在一些实施方式中，要求保护的蛋白或肽可以连接至第二结合配体或连接至在与发色底物接触后会产生有色产物的酶(酶标签)。合适的酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素和亲和素或链霉亲和素化合物。此类标记物的使用是本领域技术人员熟知的，并且描述于例如美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241，每篇皆通过引用并入本文。

在其它实施方式中，靶向部分可以可操作地偶联至纳米颗粒。纳米颗粒包括但不限于胶体金和银纳米颗粒。金属纳米颗粒在可见光谱区域显示出颜色。相信这些颜色是金属颗粒中表面等离子共振的激发的结果，并且这些颜色对于颗粒的大小、形状和聚集态、周围介质的绝缘性、离子在该颗粒表面的吸附是极其敏感的(参见，例如美国专利申请20040023415，通过引用并入本文)。

J.交联剂

交联剂也可以包括在包含靶向CRKL的肽的融合蛋白或其它构建体中；例如，交联剂可用于将靶向肽缀合至脂质体或治疗性化合物。双官能的交联剂已经广泛用于多种目的，包括制备亲和基质、修饰并稳定各类结构、鉴定配体与受体的结合位点、以及结构研究。携带两个相同官能团的同双官能试剂被证明可高度有效地诱导相同和不同的大分子或大分子的亚基之间的交联，并且将多肽配体连接至它们的特异性结合位点。异双官能试剂含有两个不同的官能团。通过利用两个不同官能团的不同反应活性，可以选择性地和有次序地控制交联。可以根据双官能交联剂的官能团的特异性对其进行分类，例如，氨基、巯基、胍基、吲哚、羧基特异性基团。在这些中，涉及游离氨基的试剂是特别受欢迎的，这是由于它们的商业可获得性、合成的容易性以及应用它们的反应条件是温和的。多数异双官能交联剂含有伯胺反应性基团和硫醇反应性基团。

用于交联配体与脂质体的示例性方法描述于美国专利5,603,872和5,401,511，每篇皆特别通过引用全文并入本文。可以通过胺残基的交联将多种配体共价结合至脂质体表面。已经通过成熟的程序制备了脂质体，特别是多层囊泡(MLV)或单层囊泡，例如微乳化脂质体(MEL)和大的单层脂质体(LUVET)，每个含有磷脂酰乙醇胺(PE)。在脂质体中加入PE提供了活性功能残基伯胺，其位于脂质体表面，用于交联的目的。已经成功地将诸如上皮生长因子(EGF)的配体连接至PE-脂质体。配体共价地结合至脂质体表面上的不连续的位点。这些位点的数目和表面密度由脂质体的配方和脂质体的类型决定。脂质体表面还可以具有用于非共价结合的位点。为了形成配体与脂质体的共价缀合物，已经就有效性和生物相容性对交联剂进行了研究。交联剂包括戊二醛(GAD)、双官能环氧乙烷(OXR)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)和水溶性碳二亚胺，优选1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。通过交联剂的络合物化学，建立了识别物质的胺残基与脂质体的连接。

在另一个实例中，描述了异双官能交联剂和使用交联剂的方法(美国专利5,889,155，特别通过引用全文并入本文)。交联剂将亲核的酰肼残基与亲电子的马来酰亚胺残基组合，允许例如醛与游离硫醇的偶联。可以对交联剂进行修饰以交联不同的官能团。

核酸

根据本发明的核酸可以编码靶向肽、靶向抗体、治疗性多肽、融合蛋白或其它蛋白或肽。核酸可以源自基因组DNA、互补性DNA(cDNA)或合成的DNA。

本文使用的“核酸”包括单链的和双链的分子，以及DNA、RNA、化学修饰的核酸和核酸类似物。考虑到本发明范围内的核酸可以是几乎任意大小，部分取决于编码的蛋白或肽的长度。

考虑到靶向肽和融合蛋白可以由编码合适的氨基酸序列的任意核酸序列编码。使用标准的密码子表，设计和产生编码想要的氨基酸序列的核酸是本领域技术人员熟知的。在优选的实施方式中，可以改变所选的用于编码每个氨基酸的密码子，以使目标宿主细胞中核酸的表达优化。

基因治疗载体的靶向输送

在一些实施方式中，靶向肽可以偶联至基因治疗载体，以便选择性或优先靶向在细胞表面表达CRKL的细胞，例如一些肿瘤细胞。存在多个可以将基因治疗载体导入细胞的方法。在本发明的一些实施方式中，所述基因治疗载体包括病毒。一些病毒的“通过受体介导的细胞内吞作用进入细胞、整合进入宿主细胞基因组或保持游离、并且稳定和有效地表达病毒基因”的能力使其成为将外来基因转移进入哺乳动物细胞的良好候选物(Ridgeway，1988；Nicolas and Rubinstein，1988.；Baichwal and Sugden，1986；Temin，1986)。优选的基因治疗载体一般是病毒载体。用作基因治疗载体的DNA病毒包括乳多空病毒(例如，猿病毒40、牛乳头瘤病毒和多瘤病毒)(Ridgeway，1988；Baichwal andSugden，1986)和腺病毒(Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986)。

优选的用于体内递送的方法之一包括使用腺病毒表达载体。虽然已知腺病毒载体整合进入基因组DNA的能力较低，但是该特征被这些载体提供的高效基因转移所弥补。“腺病毒表达载体”包括但不限于这样的构建体，所述构建体包含足以(a)支持构建体的包装并且(b)表达在其中所克隆的反义或正义多核苷酸的腺病毒序列。

腺病毒载体已经用于真核基因的表达(Levrero等人，1991；Gomez-Foix等人，1992)和疫苗开发(Grunhaus and Horwitz，1992；Graham and Prevec，1991)。关于将重组腺病毒施用至不同组织的研究包括气管滴注(Rosenfeld等人，1991；Rosenfeld等人，1992)、肌肉注射(Ragot等人，1993)、外周静脉内注射(Herz and Gerard，1993)和立体定位接种至脑(Le Gal La Salle等人，1993)。

在优选的实施方式中，可以通过将治疗分子或物质偶联至靶向肿瘤的肽(其靶向在表面表达并携带CRKL的细胞，例如肿瘤细胞)而获得一些益处。具体而言，已经将归巢至肿瘤脉管系统的部分偶联至细胞毒性药物或促细胞凋亡肽，以产生在携带肿瘤异种移植物的实验小鼠模型中相对于母体化合物更加有效且毒性较低的化合物(Arap等人，1998；Ellerby等人，1999)。将RGD-4C肽插入到腺病毒的表面蛋白中产生了腺病毒载体，其可用于靶向肿瘤的基因治疗(Arap等人，1998)。

通过例如包含本发明的靶向部分，和/或针对细胞表面结合位点的配体，肽基序允许进行细胞靶向。肽基序任选可以包含其它用于细胞靶向的元件(例如，单链抗体序列)。可以通过插入的方式产生肽结合基序，其可以包括例如天然和非天然序列，或者完全由非天然序列组成。由于向嵌合纤维蛋白中插入非天然氨基酸序列而产生的肽基序可以是高亲和性的肽(即，当以相对低的浓度提供时，与其同源结合位点例如CRKL结合的肽)，或者是低亲和性的肽(即，当以相对高的浓度提供时，与其同源结合位点例如CRKL结合的肽)。但是，优选地，所产生的肽基序是高亲和性的基序，特别是那些由于在腺病毒纤维蛋白内的限制而对其同源结合位点具有高亲和性的肽基序。

其它的基因转移载体可以从逆转录病毒构建(Coffin，1990)。为了构建逆转录病毒载体，将编码目标蛋白的核酸插入病毒基因组中替换某些病毒序列，以产生自我复制缺陷型的病毒。为了产生病毒，构建了包含gag、pol和env基因但不含LTR和装配组分的装配细胞系(Mann等人，1983)。当把包含cDNA以及逆转录病毒LTR和装配序列的重组质粒导入该细胞系时(通过例如磷酸钙沉淀)，装配序列允许重组质粒的RNA转录物装配进入病毒颗粒，然后其被分泌到培养基中(Nicolas and Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等人，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。但是，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等人，1975)。

其它病毒载体可用作靶向基因治疗载体。可以应用衍生自病毒例如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986)、腺相关病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986；Hermonatand Muzycska，1984)和疱疹病毒的载体。

在本发明的进一步的实施方式中，基因治疗构建体可以装配在脂质体中。脂质体介导的核酸递送和外源DNA的体外表达已经相当成功。Wong等人(1980)证明了脂质体介导的外源DNA递送和在培养的鸡胚胎、HeLa和肝细胞癌细胞中表达的可行性。Nicolau等人(1987)成功进行了静脉内注射之后的大鼠中的脂质体介导的基因转移。

本发明的基因治疗载体可以包含多种转基因，其通常是表达载体的编码DNA或RNA。基因治疗可用于治疗性基因的表达、VEGFR-1/NRP-1的表达以增强血管新生或用于抑制VEGFR-1/NRP-1的表达，以治疗与血管新生有关的疾病状态。DNA的形式可以是cDNA、体外聚合的DNA、质粒DNA、质粒DNA的一部分、衍生自病毒的遗传材料、线性DNA、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、重组DNA、染色体DNA、寡核苷酸、反义DNA、或这些组的衍生物。RNA的形式可以是寡核苷酸RNA、tRNA(转运RNA)、snRNA(小的核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、体外聚合的RNA、重组RNA、嵌合序列、反义RNA、siRNA(小干扰RNA)、核酶、或这些组的衍生物。反义多核苷酸是干扰DNA和/或RNA的功能的多核苷酸。反义多核苷酸包括但不限于：吗啉基寡核苷酸(morpholinos)、2′-O-甲基多核苷酸、DNA、RNA等。siRNA包括双链结构，通常含有15-50个碱基对，优选21-25个碱基对；并且具有与细胞内的表达的靶基因或RNA相同或几乎相同的核苷酸序列。干扰可能导致表达的抑制。此外，DNA和RNA可以是单链、双链、三链或四链的。

药物组合物

本发明的药物组合物包含有效量的一种或多种所述的靶向肿瘤的肽或另外的溶解于或分散于药学上可接受的载体中的试剂。词语“药学上或药理学上可接受的载体”是指，当向动物例如人施用时(视需要)，不产生不利的、变应性的或其它不良反应的分子实体和组合物。包含至少一种本发明的靶向肿瘤的肽或另外的活性成分的药物组合物的制备是本领域技术人员根据本公开可获知的，如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack Printing Company，1990中所例示，其通过引用并入本文。此外，对于向动物(例如人)的施用，应该理解的是，制剂应该满足FDA生物标准办公室(Office ofBiological Standards)所要求的无菌性、致热性、一般安全性和纯度标准的规定。

本文使用的“药学上可接受的载体”包括任意和所有的溶剂、分散介质、包被物、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸附延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、香味剂、染料等材料及其组合，如本领域普通技术人员已知的(参见，例如Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，第1289-1329页，通过引用并入本文)。除非是与活性成分不相容的任何常规载体，否则考虑到其用于药物组合物。

组合物可以包含不同类型的载体，这取决于其是否以固体、液体或气雾剂的形式施用，以及其是否需要是无菌的以用于诸如注射的给药途径。本发明可以通过以下方式给药：静脉内、皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、表面、肌肉内、皮下、粘膜、口、表面、局部、吸入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、持续输注、局部灌注浴直接靶向细胞、通过导管、通过灌洗、以霜的形式、以脂组合物的形式(例如脂质体)，或通过任何其它方法或前述的任意组合，如本领域普通技术人员已知的(参见，例如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第21版，Mack Printing Company，2005，通过引用并入本文)。

另外，根据本发明，在含有或不含惰性稀释剂的药学上可接受的载体中提供适合施用的本发明的组合物。所述载体应该是可吸收的，并且包括液体、半固体即糊，或固体载体。除非是对接受者或者对其中包含的组合物的治疗有效性有害的任何常规介质、试剂、稀释剂或载体，否则其在用于实施本发明的方法的可施用的组合物中的应用是合适的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐溶液、脂类、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等，或其组合。组合物还可以包含多种抗氧化剂以阻止一种或多种成分被氧化。另外，防腐剂可以阻止微生物的作用，所述防腐剂是例如抗细菌和抗真菌剂，包括但不限于尼泊金(例如尼泊金甲酯、尼泊金丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

根据本发明，组合物与载体以任何常规和实用的方式混合，即，通过溶液、悬浮液、乳化、混合、封装、吸附等。此类程序是本领域技术人员常规使用的。

组合治疗

为了增加包含CRKL结合基序的分离的靶向肿瘤的肽的有效性，可能需要将这些组合物与其它试剂或治疗方法例如抗癌试剂联合。“抗癌”试剂能够消极地影响受试者中的癌症，例如，通过杀死癌细胞、诱导癌细胞的细胞凋亡、降低癌细胞的生长速率、减少转移的发生率或次数、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少向肿瘤或癌细胞的血液供给、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、阻止或抑制肿瘤的进展、或增加患癌症的受试者的寿命。更一般地，将以足以杀死细胞或抑制其增殖的组合量提供这些其它成分。该方法可以包括将细胞与表达构建体和试剂或多个因子同时接触。这可以这样实现：将细胞与单一组合物或包括两种试剂的药理学制剂接触，或者将细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触，其中一种组合物包含表达构建体，另一种包含第二试剂。

肿瘤细胞对化疗和放疗试剂的抗性是临床肿瘤学遇到的一个主要问题。目前的癌症研究的目标之一是找到通过将化疗和放疗与基因治疗相结合而改进其功效的方式。例如，当通过逆转录病毒载体系统把单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HS-tK)基因输送到脑肿瘤时，成功地诱导了对抗病毒试剂更昔洛韦的敏感性(Culver，等人，1992)。在本发明的上下文中，考虑到除了其它促细胞凋亡或细胞周期调节剂之外，靶向肿瘤的肽可以类似地与化疗、放疗或免疫疗法联合使用。

或者，可以在其它试剂治理之前或之后进行基因治疗，间隔为数分钟至数周。在分别向细胞施用其它试剂和表达构建体的实施方式中，人们一般将确保有作用的时间段不会在每次输送的时间之间失效，从而所述试剂和表达载体仍将能够在细胞中发挥有利的组合效应。在这样的情况下，考虑到，可以在彼此间隔大约12-24小时内、更优选彼此间隔大约6-12小时内将细胞与两种用药方式接触。在一些情况下，可能需要显著延长治疗的时间段，但是，在各次给药之间间隔数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

可以应用多种组合，靶向肿瘤的肽是“A”，第二试剂例如放疗或化疗是“B”：

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

向患者施用本发明的治疗性表达构建体将按照用于施用化疗剂的一般程序，考虑到载体的毒性(如果有的话)。预期如果需要的话，将重复治疗周期。还考虑到可以与所描述的过度增殖性细胞治疗联合应用多种标准治疗以及手术干预。

a.化疗

癌症治疗还包括多种与基于化学的和放射的治疗组合的治疗。组合治疗包括，例如，顺铂(CDDP)、卡铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、马法兰、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、它莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇、吉西他滨、诺维本、法尼基蛋白转移酶抑制剂、反式铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤，或前述各项的任意类似物或衍生变体。

b.放疗

引起DNA损伤并且已经被广泛使用的其它因素包括，通常被称为γ-射线、X-射线和/或将放射性同位素定向输送至肿瘤细胞。还考虑到其它形式的DNA损伤因素，例如微波和UV-辐射。最有可能的是，所有这些因素对于DNA、对于DNA的前体、对于DNA的复制和修复、以及对于染色体的组装和维持，具有多种损伤效应。X-射线的剂量范围是：50-200伦琴的每日剂量(对于延长的时间段(3至4周))至2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化非常大，其取决于同位素的半衰期、发射的射线的强度和类型，以及肿瘤细胞的摄取情况。

当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露于”在本文中用于描述“将治疗性构建体和化疗或放疗试剂输送至靶细胞或使其与靶细胞直接毗邻”的过程。为了实现细胞杀死或抑制，按照有效杀死细胞或阻止其分裂的组合数量将两种试剂输送至细胞。

c.免疫治疗

一般而言，免疫治疗依赖于使用免疫效应子细胞和分子以靶向并破坏癌细胞。所述免疫效应子可以是例如对于肿瘤细胞表面上的一些标志物特异性的抗体。所述抗体可单独用作治疗效应子，或者其可以募集其它细胞以进行实际上的细胞杀灭。抗体还可以缀合至药物或毒素(化疗、放射性核素、篦麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并仅用作靶向试剂。或者，效应子可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应子细胞包括：细胞毒性T细胞和NK细胞。

因此，免疫治疗可用作组合治疗的一部分，与使用靶向肿瘤的肽的治疗联合。组合治疗的一般方法在下文讨论。一般地，肿瘤细胞必须携带一些易于被靶向的标志物，即，不存在于多数其它细胞上的标志物。存在很多肿瘤标志物，并且这些标志物的任意项可能适合于本发明上下文的靶向。常见的肿瘤标志物包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿系统肿瘤相关抗原、胚胎抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化的路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。

d.基因

在另一个实施方式中，第二治疗是基因治疗，其中在包括含有CRKL结合基序的分离的靶向肿瘤的肽的第一治疗试剂之前、之后或与之同时施用治疗性多核苷酸。治疗性试剂与编码以下基因产物之一的第二载体的联合递送将具有对靶组织的组合的抗-过度增殖效应。

e.手术

大约60％患有癌症的患者将接受某些类型的手术，包括预防性的、诊断性的或分期性的、根治性的和治标性的手术。根治性的手术是可以与其它治疗(例如本发明的治疗、化疗、放疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代性治疗)联合使用的癌症治疗。

根治性的手术包括切除术，其中全部或一部分癌性组织被物理除掉、切除和/或破坏。肿瘤切除是指物理除去至少一部分肿瘤。除了肿瘤切除之外，通过手术进行的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制的手术(莫氏手术)。还考虑到本发明可以与去除表浅性癌症、前期癌或偶发数量的正常组织联合使用。

切除一部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤之后，可能在体内形成腔。可以通过灌注、直接注射或将另外的抗癌治疗局部施用至该区域来完成治疗。此类治疗可以重复进行，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以是不同的剂量。

f.其它试剂

考虑到其它试剂可以与本发明联合使用以改善治疗的治疗性功效。这些另外的试剂包括，免疫调节剂、影响细胞表面受体的上调和GAP接合点的试剂、抑制细胞的试剂和分化试剂、细胞粘附的抑制剂，或增加过度增殖的细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的试剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β、γ；IL-2和其它细胞因子；F42K和其它细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其它趋化因子。还考虑到细胞表面受体或其配体例如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL的上调将通过建立对于过度增殖细胞的自分泌或旁分泌效应而加强本发明的细胞凋亡诱导能力。通过增多GAP接合点的数目增强细胞间信号传导将会增强对邻近的过度增殖的细胞群体的抗-过度增殖效应。在其它实施方式中，抑制细胞的试剂和分化试剂可与本发明联合使用以改善治疗的抗-过度增殖功效。考虑到细胞粘附的抑制剂会改善本发明的功效。细胞粘附的抑制剂的实例是粘附斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还考虑到增加过度增殖的细胞对细胞凋亡的敏感性的其它试剂，例如抗体c225，可与本发明联合使用以改善治疗功效。

激素治疗也可与本发明联合或与上文描述的任何其它癌症治疗组合使用。激素可用于治疗某些癌症，例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌，以降低某些激素例如睾丸激素或雌激素的水平或阻断其效应。这种治疗通常与至少一种其它癌症治疗联合作为治疗选择或为了减少转移的风险。

实施例

包括了以下实施例以进一步解释本发明的各个方面。本领域技术人员将认识到，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实施本发明时效果良好的技术和/或组合物，因此，可以考虑其构成本发明实施的优选模式。但是，本领域技术人员根据本公开将认识到，不脱离本发明的精神和范围，可以对于公开的具体实施方式进行很多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。

实施例1体内选择肿瘤归巢肽

向携带人DU145-衍生的前列腺癌异种移植物的nu/nu(裸)鼠静脉内施用噬菌体显示随机肽文库(Arap等人，1998；Pasqualini andRuoslahti，1996；Pasqualini等人，2001)，在24小时循环期之后，回收肿瘤。经过三轮选择之后，回收靶向肿瘤的噬菌体的富集群体，将对应于各个噬菌体克隆显示的肽插入子的DNA进行测序(表1)。选择显性的肽进行功能表征，其氨基酸序列为YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)。首先，在携带DU145-衍生的肿瘤的小鼠中体内评估YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)肽的肿瘤靶向特异性。经过全身性静脉内施用单一的显示YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)的噬菌体克隆之后，观察到显著的向肿瘤异种移植物的归巢(无插入子的噬菌体作为阴性对照)，在几个对照器官中没有见到或几乎没有可检测的噬菌体定位。与此相一致，通过使用水相与有机相分离测定法(Giordano等人，2001)和基于噬菌体的免疫荧光测定法(KS1767细胞)，在体外同样靶向了DU145前列腺癌细胞，并且发现显示肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)的噬菌体与肿瘤细胞表面的结合远远大于不显示肽插入子的阴性对照噬菌体与其的结合(图1A，B)。

表1

接下来，评估了所选肽的内化能力。为此，将特异性靶向真核细胞线粒体膜的促细胞凋亡肽(Arap等人，2004；Javadpour等人，1996；Ellerby等人，1999；Kolonin等人，2004；Zurita等人，2004)融合至肿瘤归巢肽。相对于对照的靶向的细胞杀灭(图1C)表明肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)介导配体指导的内化。通过annexin-V染色测定法确认了程序性细胞死亡(图1D)。值得注意的是，促细胞凋亡肽的选择性靶向和内化为靶向模块的基于拟肽的抗肿瘤治疗(Arap等人，2004；Ellerby等人，1999；Kolonin等人，2004；Zurita等人，2004)的设计提供了可能性。综上，这些结果显示，肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)靶向肿瘤细胞并能够内化。

试剂

所有的细胞系都来自美国典型细胞库(American Tissue TypeCollection，ATCC)。本文描述的研究中使用以下抗体：抗-CRKL(Santa Cruz，Cell Signaling，Epitomics or Upstate Biotechnology)、抗-磷酸化-CRKL(Cell Signaling)、抗β₁整联蛋白(Chemicon or BDTransduction Laboratories)、抗-IL11R(Santa Cruz)、抗-β₃和抗-β₅整联蛋白47、抗-EGFR48、抗-grb2(Santa Cruz)、抗-α6整联蛋白(Chemicon)、抗-AHSG/Feutin A(R&D Systems)、预免疫血清(Jackson Laboratory)、抗-FAK(Upstate)、抗-组蛋白H1(Santa Cruz)、抗-磷酸化-桩蛋白(Cell Signaling)、抗-磷酸化-130Cas(Santa Cruz)、抗-磷酸化-Erk1/2(Cell Signaling or Biosource)、抗-磷酸化-Elk-1(CellSignaling)、抗-His(Santa Cruz)、抗-gst(Santa Cruz)和抗-GAPDH(Ambion)。根据我们的说明书(AnaSpec)合成肽并进行环化。6周龄的雄性裸鼠通过商业渠道获得(Harlen)，按照Arap等人，2004；Marchio等人，2004的描述制备肿瘤异种移植物。德克萨斯大学安德森肿瘤中心(UTMDACC)的机构动物管理和使用委员会(IACUC)审查并批准了所有实验程序。

噬菌体显示随机肽文库的选择

按照描述(Arap等人，1998；Arap等人，2004；Pasqualini andRuoslahti，1996；Pasqualini等人，2001)进行体内噬菌体筛选。向携带衍生自人DU145前列腺癌细胞的肿瘤异种移植物的无胸腺裸鼠全身施用(尾部静脉)显示具有一般排列X₂CX₁₂CX₂(C，半胱氨酸；X，任意残基)的插入子的随机噬菌体文库，使其循环24小时。将小鼠进行深度麻醉，切除肿瘤异种移植物、称重、回收并处理结合的噬菌体群体(Arap等人，1998；Arap等人，2004；Pasqualini and Ruoslahti，1996；Pasqualini等人，2001)。进行3个连续轮次的体内选择。

实施例2肿瘤归巢肽序列类似于调节性的整联蛋白细胞外结构域

为了确定鉴定的肽序列是否类似于天然蛋白，进行YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)以及其它所选肽序列的相似性搜索。通过使用针对在线数据库的标准blast搜索、然后进行蛋白序列比对，发现所有的独特的噬菌体显示的肽都类似于存在于β₁整联蛋白上的序列。始料未及的是，显性的肽序列YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)与β₁整联蛋白链的丛状蛋白-脑信号蛋白-整联蛋白(PSI)细胞外结构域(残基26-78)具有相似性(图2A)；此外还发现，其它所选的肽也出现在相同区域(图2C)。然后，确定了所选肽序列YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ IDNO：1)的相似性是否是β₁整联蛋白序列的PSI结构域特异性的，或者对于其它已知的整联蛋白β链是共同的。进行拟合分析和分子模拟之后，得出结论：YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)与β₁整联蛋白的PSI结构域之间的序列同一性确实是最佳比对(图2B)。

序列比对分析

通过使用基于RELIC50的Perl 5.8.1中编撰的肽匹配软件分析肿瘤归巢噬菌体肽与β₁整联蛋白之间的序列比对。该程序基于预先确定的残基窗口大小，以从N至C蛋白末端逐个残基移位的方式，计算亲和选择的肽序列与靶蛋白序列之间的相似性。基于BLOSUM62氨基酸置换矩阵(进行修改以考虑稀有氨基酸的表示)计算每个残基的肽-蛋白相似性得分。将阀值设定为肽和蛋白区段之间至少4个相同的残基，以区分与非特异性背景匹配的显著相似性。

实施例3细胞质接头蛋白作为PSI结构域样肿瘤归巢肽的受体

已经就调节活性很好地表征了整联蛋白的PSI结构域(Shi等人，2005；Mould等人，2005；Arnaout等人，2005；Juliano等人，2004)。根据选择结果，PSI结构域似乎也可能作为β₁整联蛋白内的配体-受体结合位点发挥作用。有鉴于此，使用亲和色谱来鉴定肿瘤归巢肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)的结合伴侣。首先，通过对照肽柱预先清理DU145衍生的细胞提取物，然后将预先清理的提取物通过肿瘤归巢YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)肽柱，然后进行酸性洗脱。检测到从柱洗脱下来的对应于～40-KDa蛋白的特异性凝胶带。

质谱和数据库分析揭示了该凝胶带蛋白的身份是激酶样蛋白的鸡肿瘤病毒10号调节剂，登记号NP005198(SEQ ID NO：22)(ten Hoeve等人，1993)(称为CRKL)。通过抗-CRKL抗体与纯化蛋白的免疫印迹验证了这些结果。接下来，设计并构建了CRKL的重组His-标签融合蛋白(rCRKL)及其3个对应的结构域rCRKL-SH2、rCRKL-SH3(N)和rCRKL-SH3(C)，以用于结合测定。发现肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)优选通过该蛋白的2个SH3结构域结合至rCRKL；与此相反，几乎没有或检测不到通过SH2结构域的结合以及与对照蛋白的结合(图3A)。当在相似的实验条件下测试时，显示不相关肽序列的几个噬菌体克隆没有显示出结合。还使用直接衍生自β₁整联蛋白的天然PSI结构域(序列NSTFLQEGMPTSA(SEQ ID NO：23)；残基50至62)的合成肽(其与噬菌体显示选择的肽序列在天然PSI区域内重叠)进行了结合研究(图2A，C)。同样地，β₁整联蛋白PSI-衍生肽NSTFLQEGMPTSA(SEQ IDNO：23)结合至rCRKL、rCRKL-SH3(N)结构域和rCRKL-SH3(C)结构域(图2B)。此外，从PSI结构域制备了环形和线性肽序列，发现PSI结构域中存在的环形二硫键对于与CRKL的结合不是必需的(图3C)。最后，显示了SH3(C)结构域与肿瘤归巢肽之间的相互作用被对应的合成肽和噬菌体克隆本身特异性抑制(图3D)。这些发现显示：肿瘤归巢肽和β₁整联蛋白特异性的PSI结构域类似物YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)靶向CRKL的SH3结构域。

亲和色谱和质谱

通过EDC和DADPA固定树脂(Pierce)制备标准的肽亲和柱。制备DU145肿瘤细胞提取物并使其首先通过非特异性对照肽柱，然后通过肿瘤归巢肽柱。彻底洗涤柱，然后使用甘氨酸(pH 2.2)洗脱，通过SDS-PAGE分析。然后，将凝胶进行考马斯染色。检测到～40KDa的带，将其切下来，在UTMDACC Proteomic Core Facility通过质谱进行蛋白测序。该蛋白被鉴定为CRKL。从无血清条件培养基进行CRKL的亲和纯化，并使用表达肿瘤归巢肽或突变体对照肽(Pro-＞Ala)的重组gst-tag融合蛋白进行确认。浓缩大约200ml的无血清条件培养基(培养48小时)以进行亲和纯化。将重组融合蛋白偶联至gst-树脂珠并装载至柱。将浓缩的无血清条件培养基加至偶联柱并温育过夜。洗涤几次之后，洗脱结合的CRKL以进行Western印迹分析。使用抗-gst和抗-CRKL抗体探测印迹。

噬菌体结合和蛋白-蛋白测定

按照描述(Giordano等人2001)进行纯化的蛋白的噬菌体结合测定。按照以前的描述(Cardo-Vila等人，2003；Smith and Scott，1993)将重组蛋白包被至微量滴定孔。简而言之，在4℃将50μl蛋白(1μg/ml，处于PBS中)固定于微量滴定孔中过夜。使用PBS将孔洗涤2次，使用含3％BSA的PBS在室温封闭2个小时，使用50μlPBS(含1.5％BSA)中的下列噬菌体进行温育：10⁹T.U.野生型肿瘤归巢噬菌体(YRCTLNSPFFWEDMTHE CHA；SE Q ID NO：1)、零乱噬菌体(YRFCTSPFHEWHLENTDMCA(SEQ ID NO：26)、YRECTDSPHEFHLWNTMCAF(SEQ ID NO：27)、YRCETDSPHEFHLWNTMCAF(SEQ ID NO：29)、YRCETDSPHEFHLWNTFCAM(SEQ ID NO：30))、突变噬菌体(YRCTLNSAFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：25)、YRCTLNSPAAAEDMTHECHA(SEQ ID NO：28))、PSI衍生的环状噬菌体(CNSTFLQEGMPTSAC；SEQ ID NO：23)或fd-tet噬菌体。在室温进行1个小时之后，使用PBS将孔洗涤10次，通过细菌感染回收噬菌体。使用多克隆抗-CRKL进行的ELISA证实了孔中CRKL重组蛋白的存在和浓度。为了检测肿瘤归巢噬菌体与含SH3的蛋白的结合，在4℃使用250ηg/ml重组gst-SH3结构域(CRKL-D1、CRKL-D2、grb2-D1、grb2-D2、Lyn、src；Pronomics)、rCRKL蛋白和阴性对照gst或BSA包被微量滴定孔过夜。对于SH3(C)突变体结合研究，包被2μg/ml的His-标签重组野生型SH3-C和突变体SH3(C)结构域。向每个孔中加入肿瘤归巢噬菌体(10¹⁰T.U.)或fd-tet噬菌体(无插入子)，并按照上文的描述进行结合测定。在包被了1μg/孔的α5β1、αvβ3或αvβ5整联蛋白(Chemicon)的孔中进行CRKL与整联蛋白β₁之间的蛋白-蛋白相互作用实验。为了评估gst-PSI对于CRKL与β₁整联蛋白的结合的抑制，将CRKL与浓度渐增的gst-PSI或gst在室温预温育15分钟，然后加入到包被的孔中。3小时后，通过使用抗-CRKL抗体、然后使用HRP-缀合的抗-兔子IgG来检测CRKL与整联蛋白的结合。为了确认相同量的整联蛋白结合至平板，使用1∶1500稀释的抗-整联蛋白抗体(Amersham Pharmacia)进行平行实验。

零乱和突变体肿瘤归巢噬菌体的设计和构建

为了产生用于研究CRKL蛋白的结合特性的噬菌体克隆，从所选的结合CRKL的肿瘤归巢噬菌体肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)设计并构建了显示零乱的肽序列的噬菌体和突变体(Pro-＞Ala和Phe-Phe-Trp-＞Ala-Ala-Ala)。将零乱肽序列(YRFCTSPFHEWHLENTDMCA(SEQ ID NO：26)、YRECTDSPHEFHLWNTMCAF(SEQ ID NO：27)、YRCETDSPHEFHLWNTMCAF(SEQ ID NO：29)、YRCETDSPHEFHLWNTFCAM(SEQ ID NO：30))、突变体(YRCTLNSAFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：25)和YRCTLNSPAAAEDMTHECHA(SEQ ID NO：28))或天然PSI衍生的噬菌体(CNSTFLQEGMPTSAC；SEQ ID NO：23)克隆进入SfiI-消化的fUSE5载体(Smith and Scott，1993)。简而言之，使用引物组5’GTGAGCCGGCTGCCC 3’(SEQ ID NO：68)和5’TTCGGCCCCAGCGGC 3’(SEQ ID NO：69)(Sigma-Genosys)和2.5U的Taq-DNA聚合酶(Promega)(体积为20μl)，通过PCR扩增将500ηg对应于显示的肽的每种合成寡核苷酸模板(Sigma-Genosys)转化为双链DNA，扩增程序为：94℃，2分钟；然后35个循环：94℃、30秒，60℃、30秒，72℃，30秒；然后72℃，5分钟。使用QIAquick核酸酸消除试剂盒(Qiagen)纯化在插入子侧翼区包含BglI限制性位点的双链DNA序列，并洗脱。在37℃使用BglI将寡核苷酸消化2个小时、重新纯化、并连接进入SfiI-消化的fUSE5载体。通过PCR扩增产生噬菌体克隆以验证正确的插入和核苷酸序列。在噬菌体结合测定中测试各个噬菌体克隆。

肽结合和内化测定

将合成的肿瘤归巢肽(YRCTLNSPFFWEDMTHECHA；SEQ IDNO：1)或PSI衍生的肽(NSTFLQEGMPTSA；SEQ ID NO：23)包被至微量滴定板，然后封闭并洗涤。向包被的平板中加入下列重组His-标签蛋白：rCRKL、rCRKL-SH2结构域、rCRKL-SH3(N)结构域和rCRKL-SH3(C)结构域。不相关对照蛋白(α2-Heremans-Schmid糖蛋白；AHSG)作为阴性对照。将混合物温育、洗涤、并使用合适的抗体进行标记。加入缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的二抗，然后加入TMB底物(Calbiochem)，并通过自动化ELISA读数器(Bio-Tek)进行分析。为了确定肿瘤归巢肽的抑制活性，将PSI衍生的肽或显示相应的肿瘤归巢肽的噬菌体克隆与rCRKL-SH3(C)结构域一起温育。不相关的环肽序列和无插入子的噬菌体(fd-tet)用作阴性对照。将混合物温育并加入到经过肿瘤归巢肽包被的孔中。温育之后，洗涤孔，使用合适的抗体进行标记，并按照上文的描述进行处理。

按照描述(Arap等人，2004；Ellerby等人，1999；Kolonin等人，2004；Zurita等人，2004)测定经由甘氨酰甘氨酸桥融合至促细胞凋亡序列的肿瘤归巢肽的内化能力。合成缀合的肿瘤归巢肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHAGG(SEQ ID NO：67)-_D(KLAKLAK)₂或非靶向的对照肽_D(KLAKLAK)₂，并将渐增的等摩尔浓度的肽加入到DU145细胞中。通过WST-1试剂(Roche)测定细胞存活性，通过annexin-V染色测定细胞凋亡(Zurita等人，2004；Cardo-Vila等人，2003)。对于肿瘤归巢噬菌体的定位研究，将细胞与10⁹T.U.的肿瘤归巢肽(YRCTLNSPFFWEDMTHECHA；SEQ ID NO：1)或阴性对照(fd-tet)噬菌体一起温育6和24个小时。使用20mM甘氨酸洗涤孔以除去非特异性的细胞表面结合的噬菌体，然后使用4％的多聚甲醛固定。将非通透化的细胞与兔子抗-fd噬菌体抗体(Sigma)在室温一起温育2个小时，然后与Cy3-标记的抗-兔子IgG抗体(JacksonImmunoResearch)一起温育1个小时。再次使用4％的多聚甲醛固定细胞，并在存在DAPI(Vector Laboratories)的情况下封片，使用Olympus荧光显微镜获取图像。

实施例4与CRKL相互作用的表征

其它研究已经表明，除了与含有单个Pro残基的基序结合之外，SH3结构域还与PXXP和非PXXP基序结合(Mayer，2001；Sicheri等人，1997；Kang等人，2000；Kato等人，2000；Xu等人，1997)。由于SEQID NO：1所示的序列不含任何此类已知基序，所以使用定点诱变来评估肿瘤归巢肽的结合特性。这些研究的结果显示：与CRKL-SH3(C)结构域的结合依赖于肿瘤归巢肽中存在的Pro残基以及环形Cys-Cys二硫桥(图4A)；fd-tet无插入子的噬菌体和不相关的合成环肽作为阴性对照。还进行了CRKL SH3(C)结构域的突变分析，结果显示结合区域在残基Gly₂₃₆与Trp₂₇₇之间(图4C，D)。此外还显示，肿瘤归巢噬菌体(SEQ ID NO：1)和PSI衍生的噬菌体(SEQ ID NO：23)都与重组CRKL结合(图4B)。此外，通过使用亲和色谱确定了可以从DU145无血清条件培养基中纯化CRKL，在相同的实验条件下在可检测的水平，使用肿瘤归巢肽的突变体形式制备的对照柱不再与CRKL结合。通过使用膜组分进行的相互免疫共沉淀测定，确定了CRKL与β₁整联蛋白形成细胞表面复合物；相反，针对不相关跨膜受体产生的对照抗体(包括抗-IL11受体、抗-EGF受体)或针对其它整联蛋白产生的抗体(抗-β₃和抗-β₅)未显示出与CRKL或β₁整联蛋白的结合。最后，证明了以重组蛋白形式表达的PSI结构域可以以剂量依赖性方式抑制CRKL与β₁整联蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用(IC₅₀＝20ηm)；与免疫共沉淀研究的结果一致，对照整联蛋白未显示出结合(图5)。

突变体的构建

所有的引物组总结于表2。通过PCR扩增全长CRKL cDNA(Invitrogen)的开放读码框并克隆进入pET28a(Novagen)表达载体。通过PCR扩增对应于每个SH结构域的cDNA，并克隆进入所述载体的Sac I和Xho I限制性位点。通过限制性消化和DNA测序验证所有的构建体，将其转化进入BL21(Stragene)细菌菌株，在His-标签柱(Qiagen)上纯化重组蛋白。通过考马斯染色以及使用抗-CRKL和抗-His抗体通过Western印迹分析来验证纯化的重组蛋白

通过PCR诱变产生在SH3结构域(羧基末端)发生突变的CRKL突变体。将引物组设计为除去60bp(Δ1和Δ2)以及54bp(Δ3)并保留读码框。对于PSI结构域构建体，制备了PSI结构域的环状和线性肽形式。与PSI寡核苷酸退火之后(表2)，使用EcoRI进行消化之后，使用核苷酸去除试剂盒(QIAGEN)纯化双链寡核苷酸，然后克隆进入pGEX4T-1载体。为了显示CRKL蛋白寡聚化，将浓度渐增的重组gst-CRKL与固定的CRKL蛋白(His-标签重组形式的)或固定的BSA在4℃温育过夜，然后洗涤3次。通过使用针对gst的抗体检测蛋白-蛋白相互作用。

表2：PCR引物(SEQ ID NO：32-53)

实施例5分子成像显示CRKL可以定位于细胞外侧

与以上呈现的证据相一致，分子成像证明CRKL与β₁整联蛋白共定位。联合起来，这些研究表明在细胞表面上，CRKL与β₁整联蛋白之间的特异性分子相互作用。由于肿瘤归巢肽结合至DU145前列腺癌细胞的表面，所以研究了“CRKL可能也定位于细胞膜外侧”的可能性。DU145细胞的FACS分析显示了相对于对照的经抗-CRKL抗体标记的细胞表面(图6A)。还通过在非通透化条件下进行的免疫荧光染色和共聚焦成像研究证实了细胞表面标记情况。还在非通透化条件下通过扫描和透射电镜在超结构水平上研究了细胞表面定位情况(TEM；图6B)。这些经典的成像技术再次产生了CRKL的细胞表面标记情况(图6B)。还使用了另外两种生化方法证实了CRKL的细胞膜定位：通过生物素化进行的细胞表面标记和去污剂膜分离。通过这两种独立方法，发现CRKL存在于细胞膜上。对于这些研究，针对不相关的细胞内蛋白的抗体用作阴性对照。综上，这些结果显示：除了众所周知的存在于细胞质中之外，CRKL蛋白还定位于细胞表面。

细胞表面和膜定位

按照描述(Monferran等人，2004)进行使用生物素的细胞表面标记。简而言之，使用膜非透过性生物素-LC-LC-NHS EZ link(Pierce)标记DU145细胞。将生物素化的膜蛋白洗涤、溶解并使用链霉亲和素珠(Pharmacia)通过免疫沉淀使其澄清。使用所示的合适抗体进行Western印迹分析。按照描述，通过生物淘筛和对筛选出的反应配体的快速分析(BRASIL)方法(Giordano等人，2001)在DU145细胞上进行噬菌体细胞表面结合测定。按照描述(Mintz等人，2003)，进行膜分离。使用所示的合适抗体探测免疫印迹。在LSM 510(Carl Zeiss)共聚焦显微镜上获取共聚焦图像。使DU145细胞生长于纤连蛋白包被的玻片上，使用4％的多聚甲醛(PFA)固定并使用合适的抗体(多克隆CRKL抗体和单克隆AHSG抗体)进行标记。在High Resolution ElectronMicroscopy Core Facility(JSM 5900扫描和JEM 1010透射电子显微镜)获取电子显微镜图像。通过在硼酸钠中混合20-25ηm或40-45ηm的金来制备金纳米颗粒抗体-缀合物。通过TEM分析验证金偶联的纳米颗粒。在冰上使用合适的抗体(单克隆抗-CRKL、抗-β₁整联蛋白和抗-AHSG抗体)标记DU145细胞，然后通过缀合的荧光二抗标记，并通过FACS分析。

实施例6功能研究和潜在的CRKL转运机制

由于CRKL不具有经典的跨膜结构域，所以进行了研究以评估CRKL是否从肿瘤细胞分泌而来。结果显示，在无血清培养基中培养的DU145细胞确实分泌无磷酸化的形式的CRKL。与此相反，在对照细胞培养基中检测不到CRKL：如使用抗-CRKL或使用几种对照抗体进行的免疫沉淀所示。为了评估这些观察结果的一般性，研究了无血清培养基中的一组肿瘤细胞系，并且发现它们也分泌无磷酸化的CRKL(图7A)，因此表明：这种现象不是细胞种类特异性的。接下来，进行了研究以确定CRKL的分泌对于细胞增殖和迁移是否具有任何可检测的效应。为了证明特异性，向DU145细胞培养物的无血清培养基中加入抗-CRKL中和抗体。结果显示，抗-CRKL抗体的确中和细胞外的CRKL并且减少细胞增殖(图7B)和细胞迁移(图7C)；几种对照抗体或预免疫的血清没有产生对于细胞增殖或迁移的可检测效应(图7B、C)。为了进一步理解CRKL在肿瘤细胞环境中的生物作用，使用了siRNA技术敲低CRKL；同样发现，当CRKL的表达减少时，引起细胞增殖、粘附和迁移显著降低(图8A-C)。作为另外的对照，显示可以通过外源CRKL挽救细胞增殖的减少(图8D)，在CRKL siRNA敲低细胞或无血清培养基培养的细胞中，仅检测到背景水平的细胞凋亡(小于1％)。还发现，通过siRNA敲低细胞中的CRKL会降低肿瘤归巢噬菌体与细胞的结合，这说明肿瘤归巢噬菌体可能通过分泌的CRKL进行结合。

鉴于CRKL不具有疏水性N-末端序列以经由内质网和高尔基体依赖性的分泌途径进行蛋白分泌(Walter等人，1984)，所以测定了经典的分泌抑制剂是否阻止CRKL的细胞释放。这些研究的结果显示：抑制剂例如布雷菲德菌素A(Brefeldin A)和毒胡萝卜素(thapsigargin)不抑制CRKL的分泌；与此相反，发现三磷酸腺苷结合盒(ABC)转运蛋白的抑制剂格列苯脲(glybenclamide)的确阻止CRKL的释放。至少有4种已知的过程实现“无经典信号肽的蛋白(包括某些生长因子和细胞因子)的分泌”(Nickel，2003；Prudovsky等人，2003)。这些数据说明CRKL可能通过ABC转运蛋白经由非经典的输出途径被分泌。值得注意的是，其它生物活性生长因子例如白细胞介素-1β和巨噬细胞迁移抑制因子也使用ABC-转运蛋白系统(Marty等人，2005；Flieger等人，2003；Hamon等人，1997)，这提出了可能的活性转运方式的假设。但是，本文提供的结果不排除以下可能性：细胞死亡-无论是作为恶性进展过程中克隆选择的一部分，还是细胞毒性化疗之后-也可以在肿瘤微环境中产生细胞外CRKL。为了获得关于此蛋白复合物的进一步了解，设计了结合测定以详细描述CRKL、β₁整联蛋白和PSI结构域类似肽之间的生化相互作用。通过使用两种不同形式的重组CRKL(即gst和his-标签)，结果说明CRKL实际上可以同二聚化，可能是通过SH3结构域进行(Kishan等人，1997；Kristensen等人，2006)。由于细胞内的CRKL参与MAP激酶和整联蛋白介导的途径(Li等人，2003；Uemura等人，1999)，所以检测了这2种途径中的磷酸化蛋白。当在体外向肿瘤细胞添加重组CRKL时，发现了数种磷酸化的蛋白，包括桩蛋白、p130Cas、Erk1、Erk2和Elk1，甚至还有CRKL本身。此外，当向β₁整联蛋白siRNA敲低细胞中添加外源的重组CRKL时，发现了减少的磷酸化的Erk1和Erk2蛋白，这表明外源rCRKL对ERK途径的激活依赖于β₁整联蛋白的表达。阳性对照有丝分裂原用于激活MAP激酶依赖性的途径并刺激DU145肿瘤细胞，以便显示在CRKL siRNA敲低细胞中，仍然维持细胞信号传导机制的总体功效。这些结果证明分泌的CRKL可以激活整联蛋白介导的和MAP激酶途径。

siRNA研究

CRKL(mRNA登记号NM_005207)、β₁整联蛋白(mRNA登记号NM_002211)和对照siRNA购自Santa C ruz，Ambion and Dharmacon。siRNA寡核苷酸序列和对应的生产商总结于表3。使用Oligofectamine(Invitrogen)或DharmaFect(Dharmacon)将siRNA转染进入DU145细胞(1-2x10⁵个细胞/孔)。处理之前将转染的细胞温育48-72小时。在转染的细胞中未观察到细胞死亡或细胞凋亡，如通过Annexin-V染色(Roche)所测定。收取转染的细胞并在存在蛋白酶抑制剂的情况下进行裂解。还在CRKL敲低细胞中检测了肿瘤归巢噬菌体的结合活性。对于挽救实验，向CRKL siRNA转染的细胞外源地加入达1.5μg的重组CRKL。外源的His-标签重组CRKL蛋白(400ηg/ml)或对照蛋白(EGF，200ηg/ml；MIF，300ηg/ml；PMA，300ηg/ml)用于β₁整联蛋白敲低实验。装载等量的蛋白并通过SDS-PAGE分离，然后使用合适的抗体通过Western印迹分析。使用WST-1(Roche)进行细胞增殖测定。使用Boyden小室测定法(Corning)进行细胞迁移测定。

表3：siRNA

Santa Cruz，CRKL：
	GUCGUAUUGUCAAAGAGUATT(SEQ ID NO：54)
GUAGCAGACAACACACAAATT(SEQ ID NO：55)
	CAGCAGACCUAGAAAUGUATT(SEQ ID NO：56)
Dharmacon，CRKL：
	CCGAAGACCUGCCCUUUAAUU(SEQ ID NO：57)
GAAGAUAACCUGGAAUAUGUU(SEQ ID NO：58)
	GUCACAAGGAUGAAUAUAAUU(SEQ ID NO：59)
AAUAGGAAUUCCAACAGUUUU(SEQ ID NO：60)
	Ambion，CRKL：
GGUAUCCAAGCCCACCAAUTT(SEQ ID NO：61)
	GGAUGAAUAUAAAUGGCCATT(SEQ ID NO：62)
Santa Cruz，β₁整联蛋白：
	GAGAUGAGGUUCAAUUUGATT(SEQ ID NO：63)
GAUGAGGUUCAAUUUGAAATT(SEQ ID NO：64)
	GUACAGAUCCGAAGUUUCATT(SEQ ID NO：65)
Dharmacon，对照：
	AUGAACGUGAAUUGCUCAAUU(SEQ ID NO：66)

免疫沉淀测定

将细胞在RPMI无血清培养基中同步24-48小时，然后通过离心沉淀下来，并通过0.22μm的滤纸过滤，预吸附至对照抗体。向回收的上清液中加入等体积的PBS，然后使用合适的抗体进行免疫沉淀。布雷菲德菌素A、格列苯脲和毒胡萝卜素用于分泌抑制研究。在无血清培养基中将细胞与化合物一起温育9个小时，然后使用合适的抗体进行免疫沉淀。在免疫沉淀研究中不使用去污剂。通过使用如上所述的方法，发现CRKL处在游离的可溶状态而不是处于囊泡中。

实施例7CRKL介导的配体指导的肿瘤靶向

接下来评估了在携带肿瘤的小鼠中结合CRKL的噬菌体的肿瘤靶向特性。首先，设计并产生了显示所选的结合CRKL的肽或一组对照肽(突变体或零乱的)的噬菌体构建体。在人类肿瘤异种移植物(卡波西肉瘤KS1767细胞和前列腺癌DU145细胞)和同基因的小鼠肿瘤模型(EF43-FGF4乳腺癌)中测试了噬菌体克隆。在全身施用结合CRKL的噬菌体之后，观察到显著的和特异性的肿瘤归巢；相反，对照构建体未显示向肿瘤的定位(图9A-D)。如图9所示，突变的肽序列P-＞A(YRCTLNSAFFWEDMTHECHA；SEQ ID NO：25)、零乱1(YRFCTSPFHEWHLENTDMCA；SEQ ID NO：26)和零乱2(YRECTDSPHEFHLWNTMCAF；SEQ ID NO：27)未显示出肿瘤靶向。使用在SEQ ID NO：1中毗邻脯氨酸残基处包含FFW-＞AAA突变的肽(YRCTLNSPAAAEDMTHECHA；SEQ ID NO：28)或2个其它的零乱序列(#3：YRCETDSPHEFHLWNTMCAF；SEQ ID NO：29和#4：YRCETDSPHEFHLWNTFCAM；SEQ ID NO：30)进行的另外的研究也没有显示出突变体的肿瘤靶向活性。此外，研究显示：当使用重组CRKL预先温育结合CRKL的噬菌体、然后再向携带肿瘤的小鼠施用时，肿瘤归巢被抑制(图10)。还发现：与结合αv整联蛋白的噬菌体相比(肽序列为CDCRGDCFC(SEQ ID NO：31)，其被称作RGD-4C；其通常被用作此类实验的阳性对照)(Hajitou等人，2006；Arap等人，1998；Pasqualini等人，2001；Giordano等人，2001；Javadpour等人，1996；Ellerby等人，1999；Pasqualini等人，1997)，结合CRKL的噬菌体高出至少10倍。

最后，设计并进行了包括4个队列的携带大小匹配的肿瘤的小鼠的初步临床前试验(图11)。动物接受以下试剂：(i)合成的PSI结构域类似肽；(ii)与促细胞凋亡的拟肽连接的合成的PSI结构域类似肽(Arap等人，2004；Ellerby等人，1999；Kolonin等人，2004；Zurita等人，2004)，以便在受体介导的内化之后诱导靶向的细胞凋亡；(iii)单独的合成的促细胞凋亡的拟肽；或(iv)单独的介质。所有的肽或拟肽均以等摩尔浓度施用。这些体内结果显示，在所评估的实验条件下，PSI结构域类似肽对于肿瘤生长没有可检测的效应，而靶向的促细胞凋亡拟肽显著抑制肿瘤生长。

体内肿瘤靶向和抑制

按照描述(Hajitou等人，2006；Arap等人，1998；Arap等人，2004；Kolonin等人，2004；Marchio等人，2004)使用噬菌体进行了体内靶向实验。实验中使用的动物是：携带人DU145异种移植物的雄性裸鼠，或携带人卡波西肉瘤KS1767衍生的异种移植物(皮下)的雌性裸鼠，和携带EF43-FGF4衍生的乳腺肿瘤(乳腺脂肪垫原位移植)的免疫活性的Balb/c雌鼠。简而言之，将携带肿瘤(～8mm)的小鼠麻醉并通过尾部静脉以静脉内方式向每只小鼠注射5x10¹⁰T.U.野生型YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)-噬菌体，或阴性对照：fd-tet噬菌体(无插入子)和零乱的YRFCTSPFHEWHLENTDMCA(SEQ ID NO：26)-噬菌体、YRECTDSPHEFHLWNTMCAF(SEQ ID NO：27)-噬菌体、YRCETDSPHEFHLWNTMCAF(SEQ ID NO：29)-噬菌体、YRCETDSPHEFHLWNTFCAM(SEQ ID NO：30)-噬菌体、或突变体YRCTLNSAFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：25)-噬菌体和YRCTLNSPAAAEDMTHECHA(SEQ ID NO：28)-噬菌体。具有大小匹配的肿瘤的2只小鼠的队列接受每一组噬菌体克隆。24小时后，从每只小鼠切除肿瘤，并通过细菌感染回收噬菌体，按照组织的重量进行校正。对于每个肿瘤模型，实验重复两次。对于肿瘤靶向的抑制，首先将CRKL归巢噬菌体与重组gst-CRKL或对照gst蛋白在37℃温育30分钟，然后静脉内施用至携带前列腺肿瘤的小鼠。fd噬菌体用作阴性对照；RGD-4C(Hajitou等人，2006；Arap等人，1998)用作阳性对照。在石蜡包埋的肿瘤组织切片上，通过TUNEL染色(Promega)，检测到仅有极小的背景细胞凋亡(小于总细胞的1％)。

在携带肿瘤的小鼠中的治疗

将携带DU145肿瘤的小鼠进行大小匹配并分成各个队列(每组n＝4)。合成与促细胞凋亡基序_D(KLAKLAK)₂融合的肿瘤归巢肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)。未缀合的肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ ID NO：1)或_D(KLAKLAK)₂用作对照。全身施用合成的肽，按照描述(Arap等人，1998；Arap等人，2004)测定肿瘤体积。

使用靶向CRKL的肽进行MRI成像

将靶向肿瘤的噬菌体(靶向CRKL)以及无插入子的噬菌体(作为对照)形成金/噬菌体咪唑水凝胶。以30％最终体积(按体积计算)向这些水凝胶中掺入氧化铁。这种水凝胶制备物用于随后的MRI研究，其中向3只携带前列腺肿瘤的小鼠(DU145)肿瘤内注射等量的仅AuFe、含有AuFe的非靶向的水凝胶(含有无插入子的噬菌体)和含有AuFe的靶向CRKL的水凝胶。可以通过MRI清晰地看到并定量由铁芯介导形成的负反差。

根据本公开，无需过度实验即可制备并实现本文公开的和要求保护的所有组合物和方法。虽然以优选实施方式的形式描述了本发明的组合物和方法，但是对本领域技术人员显而易见的是，可以不脱离本发明的概念、精神和范围而对本文描述的组合物和方法以及该方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地，显而易见的是，一些化学和生理学上均相关的试剂可以替换本文描述的试剂，而仍获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似替换和修饰都被认为落在如随附的权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念之内。

参考文献

以下参考文献通过引用特别并入本文，达到它们为本文所示内容提供示例性的程序或其它详细补充的程度。

美国专利3,817,837

美国专利3,850,752

美国专利3,939,350

美国专利3,996,345

美国专利4,275,149

美国专利4,277,437

美国专利4,366,241

美国专利4,472,509

美国专利5,021,236

美国专利5,889,155

美国专利公开20040023415

Arap等人，Cancer Cell，6：275-284，2004.

Arap等人，Cancer Res.，55(6)：1351-1354，1995.

Arap等人，Nat.Med.，8：121-127，2002.

Arap等人，Science，279：377-380，1998.

Arnaout等人，Annu.Rev.CellDev.Biol.，21：381-410，2005.

Baichwal and Sugden，In：Gene Transfer，Kucherlapati(Ed.)，Plenum Press，NY，117-148，1986.

Bakhshi等人，Cell，41(3)：899-906，1985.

Barany and Merrifield，In：The Peptides，Gross and Meienhofer(Eds.)，Academic Press，NY，1-284，1979.

Bedi等人，Blood，83：2038-2044，1994.

Blume-Jensen and Hunter，Nature，411：355-365，2001.

Caldas等人，Cancer Res.，54：3568-3573，1994.

Cardo-Vila等人，Mol.Cell，11：1151-1162，2003.

Cheng等人，Cancer Res.，54(21)：5547-5551，1994.

Cho and Stahelin，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，34：119-151，2005.

Cleary and Sklar，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(21)：7439-7443，1985.

Cleary等人，J.Exp.Med.，164(1)：315-320，1986.

Coffin，In：Virology，Fields 等人(Eds.)，Raven Press，NY，1437-1500，1990.

Conner and Schmid，Nature，422：37-44，2003.

Culver等人，Science，256(5063)：1550-1552，1992.

Ellerby等人，Nat.Med.，5：1032-1038，1999.

Flieger等人，FEBS Lett.，551：78-86，2003.

Giordano等人，Nat.Med.，7：1249-1253，2001.

Goldstein等人，Clin.Cancer Res.，1：1311-1318，1995.

Gomez-Foix等人，J.Biol.Chem.，267：25129-25134，1992.

Goodman &Gilman’s“The Pharmacological Basis ofTherapeutics

Graham and Prevec，In：Methods in Molecular Biology：GeneTransfer and Expression Protocol，Murray(Ed.)，Humana Press，Clifton，NJ，7：109-128，1991.

Grunhaus and Horwitz，Seminar in Virology，3：237-252，1992.

Hajitou等人，Cell，125：385-398，2006.

Hamon等人，Blood，90：2911-2915，1997.

Hermonat and Muzycska，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6466-6470，1984.

Herz and Gerard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2812-2816，1993.

Hollstein等人，Science，253(5015)：49-53，1991.

Hovanessian等人，Exp.Cell Res.，261：312-328，2000.

Hunter，Cell，100：113-127，2000.

Hussussian等人，Nat.Genet.，8(1)：15-21，1994.

Javadpour等人，J.Med.Chem.，39：3107-3113，1996.

Juliano等人，Biochem.Soc.Trans.，32：443-446，2004.

Kamb等人，Nat.Genet.，8(1)：23-26，1994.

Kamb等人，Science，2674：436-440，1994.

Kang等人，EMBO J.，19：2889-2899，2000.

Kato等人，J.Biol.Chem.，275：37481-37487，2000.

Kerr等人，Br.J.Cancer，26(4)：239-257，1972.

Kishan等人，Nat.Struct.Biol.，4：739-743，1997.

Kolonin等人，Nat.Med.，10：625-632，2004.

Kristensen等人，EMBO J.25：785-797，2006.

Le Gal La Salle等人，Science，259：988-990，1993.

Levrero等人，Gene，101：195-202，1991.

Li等人，Mol.Cell Biol.，23：2883-2892，2003.

Mandava等人，Proteomics，4：1439-1460，2004.

Mann等人，Cell，33：153-159，1983.

Manning等人，Science，298：1912-1934，2002.

Marchio等人，Cancer Cell，5：151-162，2004.

Martin等人，Science，296：1652-1653，2002.

Marty等人，Glia，49：511-519，2005.

Mayer，J.Cell Sci，114：1253-1263，2001.

McGahon等人，Blood，83：1179-1187，1994.

Merrifield，Science，232(4748)：341-347，1986.

Mintz等人，Nat.Biotechnol.，21：57-63，2003.

Mochly-Rosen，Science，268：247-251，1995.

Monferran等人，EMBO J.，23：3758-3768，2004.

Mori等人，Cancer Res.，54(13)：3396-3397，1994.

Mould等人，J.Biol.Chem.，280：4238-4246，2005.

Nickel，Eur.J.Biochem.，270：2109-2119，2003.

Nicolas and Rubinstein，In：Vectors：A survey of molecularcloning vectors and their uses，Rodriguez and Denhardt，eds.，Stoneham：Butterworth，pp.494-513，1988.

Nicolau等人，Methods Enzymol.，149：157-176，1987.

Nobori等人，Nature，368(6473)：753-756，1994.

Okamoto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(23)：11045-11049，1994.

Orlow等人，Cancer Res，54(11)：2848-2851，1994.

Orlow等人，Int.J.Oncol.，15(1)：17-24，1994.

Paskind等人，Virology，67：242-248，1975.

Pasqualini and ruoslahti，Nature，380：364-636，1996.

Pasqualini等人，In：Phage Display：A Laboratory Manual，Barbas III等人(Eds.)，22.1-22.24，Cold Spring Harbor Lab.Pres.，NY，2001.

Pasqualini等人，Nat.Biotechnol.，15：542-546，1997.

Pawson and Scott，Science，278：2075-2080，1997.

Pendergast等人，Cell，75：175-185，1993.

Physicians Desk Reference

Prudovsky等人，J.Cell Sci.，116：4871-4881，2003.

Puil等人，EMBO J.，13(4)：764-773，1994.

Ragot等人，Nature，361：647-650，1993.

Remington’s Pharmaceutical Sciences”15^th ed.，pp 1035-1038and 1570-1580

Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack PrintingCompany，pp.1289-1329，1990.

Ridgeway，In：Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors andTheir Uses，Rodriguez等人(Eds.)，Stoneham：Butterworth，467-492，1988.

Rosenfeld等人，Science，252：431-434，1991.

Rosenfeld，等人，Cell，68：143-155，1992.

Serrano等人，Nature，366：704-707，1993.

Serrano等人，Science，267(5195)：249-252，1995.

Shi等人，J.Biol.Chem.，280：30586-30593，2005.

Shin等人，J.Biol.Chem.，278：7607-7616，2003.

Sicheri等人，Nature，385：602-609，1997.

Sinclair and O’Brien，J.Biol.Chem.，277：2876-2885，2002.

Skorski等人，Blood，86：726-736，1995.

Skorski等人，J.Exp.Med.，179：1855-1865，1994.

Skorski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：4504-4508，1994.

Smith and Scott，Methods Enzymol.，217：228-257，1993.

Stewart and Young，In：Solid Phase Peptide Synthesis，2d.ed.，Pierce Chemical Co.，1984.

Szczulik等人，Science，253：562-265，1991.

Takagi等人，Cell，110：599-611，2002.

Tam等人，J.Am.Chem.Soc.，105：6442，1983.

Tari等人，Blood，84：601-607，1994.

Temin，In：Gene Transfer，Kucherlapati(Ed.)，NY，Plenum Press，149-188，1986.

ten Hoeve等人，Blood，84：1731-1736，1994.

ten Hoeve等人，CancerRes.，54：2563-2567，1994.

ten Hoeve等人，Oncogene，8：2469-2474，1993.

Tsujimoto and Croce，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(14)：5214-5218，1986.

Tsujimoto等人，Nature，315：340-343，1985.

Tsujimoto等人，Science，228(4706)：1440-1443，1985.

Uemura等人，Oncogene，18：3343-3353，1999.

Walter等人，Cell，38：5-8，1984.

Weinberg，Science，254(5035)：1138-1146，1991.

Wong等人，Gene，10：87-94，1980.

Xu等人，Nature，385：595-602，1997.

Zurita等人，Cancer Res.，64：435-439，2004.

Claims

1.包含CRKL结合基序的分离的靶向肿瘤的肽，所述基序定义为：

a)长度为6-20个氨基酸；

b)与β₁整联蛋白(SEQ ID NO：47)的相应最佳拟合序列比对的相似性程度为至少25％；并且

其中所述靶向肽的长度是100个氨基酸或更少的氨基酸，并且在生理条件下结合至表达CRKL的细胞。

2.权利要求1的肽，其中所述CRKL结合基序与β₁整联蛋白(SEQID NO：47)的最佳拟合序列比对的相似性程度是至少40％。

3.权利要求1的肽，其中所述CRKL结合基序与β₁整联蛋白(SEQID NO：47)的最佳拟合序列比对的相似性程度是至少50％。

4.权利要求1的肽，其中所述CRKL结合基序与β₁整联蛋白(SEQID NO：47)的最佳拟合序列比对的相似性程度是至少60％。

5.权利要求1的肽，其中所述肽具有不同于与β₁整联蛋白(SEQID NO：47)的最佳拟合序列比对的序列。

6.权利要求1的肽，其中所述CRKL结合基序具有与β₁整联蛋白(SEQ ID NO：47)PSI结构域区域的最佳拟合序列比对。

7.权利要求1的肽，其中所述CRKL结合基序具有与β₁整联蛋白(SEQ ID NO：47)PSI结构域区域的最佳拟合序列比对，所述PSI结构域区域选自氨基酸10至29；15至34；18至37；36至55；39至58；45至64；94至113；196至215；198至213；203至222；244至263；330至349；377至396；379至398；380至399；398至417；400至419；413至432；447至466；460至479；460至479；464至483；469至488；474至493；475至494；512至533；519至538；551至570；574至593；577至596；579至598；590至609；596至615；613至632；615至634；616至635；644至663；648至667；663至682；674至693；682至701；721至740；727至746；和779至798。

8.权利要求1的肽，其中所述CRKL结合基序具有选自SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：46的序列。

9.权利要求1的分离的肽，其进一步定义为环肽。

10.权利要求1的分离的肽，其中所述肽连接至分子。

11.权利要求10的分离的肽，其中所述分子是蛋白，并且所述肽缀合或融合至所述蛋白以形成蛋白缀合物，其中所述蛋白缀合物不是天然存在的蛋白。

12.权利要求11的分离的肽，其中所述肽位于所述蛋白的末端。

13.权利要求10的分离的肽，其中所述分子是促细胞调亡剂、抗血管生成剂、细胞因子、细胞毒性试剂、药物、化疗剂、激素、生长因子、抗生素、抗体或其片段或单链、存活因子、抗细胞调亡剂、激素拮抗剂、抗原、肽、蛋白、诊断剂、放射性同位素或成像剂。

14.权利要求13的分离的肽，其中所述分子是选自下列的促细胞调亡剂：短杆菌肽、爪蟾抗菌肽、mellitin、防御素、天蚕素、(KLAKLAK)₂(SEQ ID NO：48)、(KLAKKLA)₂(SEQ ID NO：49)、(KAAKKAA)₂(SEQ ID NO：50)、(KLGKKLG)₃(SEQ ID NO：51)、Bcl-2、Bad、Bak、Bax和Bik。

15.权利要求14的分离的肽，其中所述促细胞调亡剂是(KLAKLAK)₂(SEQ ID NO：48)。

16.权利要求15的分离的肽，其中所述SEQ ID NO：48由D氨基酸组成。

17.权利要求13的分离的肽，其中所述分子是选自下列的抗血管生成剂：血小板反应素、血管抑素、色素上皮衍生的因子、血管紧缩素、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活剂抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、血小板反应素、2-甲氧基雌甾二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧胺三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素2、除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、三羧氨基喹啉、萨立多胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、多烯紫杉醇、聚胺、蛋白酶体抑制剂、激酶抑制剂、信号传导肽、accutin、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4、二甲胺四环素、内皮抑素XVIII、内皮抑素XV、基质金属蛋白酶-2的C-末端血红素结合蛋白结构域、人类纤溶酶原的kringle 5结构域、内皮抑素和血管抑素的融合蛋白、内皮抑素和人类纤溶酶原的kringle 5结构域的融合蛋白、干扰素-γ诱生的单核因子(Mig)、Mig与IP10的融合蛋白、可溶性FLT-1(fins样酪氨酸激酶1受体)、或激酶插入子结构域受体(KDR)。

18.权利要求13的分离的肽，其中所述分子是选自下列的细胞因子：白细胞介素1(IL-1)、IL-2、IL-5、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18、干扰素-γ(IF-γ)、IF-α、IF-β、肿瘤坏死因子、或GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。

19.权利要求10的分离的肽，其中所述肽连接至大分子复合物。

20.权利要求19的分离的肽，其中所述复合物是病毒、噬菌体、细菌、脂质体、微颗粒、磁性珠子、酵母细胞或哺乳动物细胞。

21.权利要求13的分离的肽，其中所述肽连接至病毒。

22.权利要求14的分离的肽，其中所述病毒是慢病毒、乳多空病毒、腺病毒、逆转录病毒、AAV、痘苗病毒或疱疹病毒。

23.权利要求19的分离的肽，其中所述肽连接至固体载体。

24.权利要求23的分离的肽，其中所述固体载体是微量滴定皿或微芯片。

25.制备构建体的方法，其包括：获得根据权利要求1的肽；和将所述肽连接至分子以制备构建体。

26.将肽、分子或蛋白的递送靶向表达CRKL的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)获得根据权利要求1至24任一项的肽或通过权利要求23的方法制备的肽；和

(b)将所述肽施用至细胞群体，其中所述群体包括表达CRKL的细胞，从而将分子或蛋白递送至所述细胞。

27.权利要求26的方法，其中所述的表达CRKL的细胞是在受试者中，肽或蛋白融合构建体配制在药学上可接受的组合物中，所述组合物施用至受试者。

28.权利要求27的方法，其中所述受试者是人类受试者。

29.权利要求26的方法，其中所述方法进一步定义为检测方法，并且所述方法还包括检测已经被递送至细胞的肽、分子或蛋白。

30.权利要求26的方法，其中所述受试者具有疾病或病症，并且所述方法进一步定义为治疗方法。

31.权利要求29或30的方法，其中所述受试者具有癌症。

32.权利要求31的方法，其中所述癌症选自前列腺癌、乳腺癌、肉瘤、牙龈癌、舌癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、肾癌、眼癌、脑癌、白血病、间皮瘤、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、胰腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌和膀胱癌。

33.权利要求32的方法，其中所述癌症是前列腺癌。

34.权利要求32的方法，其中所述癌症是乳腺癌。

35.权利要求32的方法，其中所述癌症是肉瘤。

36.权利要求1的方法，其中所述基序进一步定义为长度是6至10个氨基酸。

37.权利要求1的方法，其中所述基序进一步定义为长度是14至20个氨基酸。