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一种乳腺癌细胞检测生物试剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乳腺癌细胞检测生物试剂，为一种乳腺癌靶向细菌经多聚甲醛固定形成，所述的乳腺癌靶向细菌表面展示有序列为SEQ ID NO.1的多肽，所述乳腺癌靶向细菌为一细菌本体中转入一表达载体，所述表达载体中含有编码所述多肽的基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因和冰核蛋白N‑末端基因。本发明提供的乳腺癌细胞检测生物试剂可以用于乳腺癌细胞的检测。

Description

一种乳腺癌细胞检测生物试剂及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乳腺癌细胞检测生物试剂及应用。
背景技术
乳腺癌是全球高发肿瘤类型之一，尽管目前一些治疗手段可以帮助大多数肿瘤患者缓解痛苦，但是乳腺癌依旧极大威胁这女性生命安全，导致生活质量下降。每一年，全世界范围内有超过一百三十万的乳腺癌新发病例，有四十五万人死于此病症。在早期诊断的乳腺癌患者中，手术治疗的预后较中晚期有明显改善，因此提高乳腺癌早期诊断的精确性尤为重要。
目前乳腺癌的早期诊断主要依赖于临床医学影像(B超、CT、核磁共振成像)和其他生化指标的检测，在癌症的辅助诊断方面，肿瘤标志物的研究十分活跃。肿瘤标志物主要为糖蛋白抗原、角蛋白类抗原等，在肺癌早期诊断方面有很多分子标记的应用，如量子点、近红外发光材料、上转换发光材料、磁性纳米颗粒等用于肿瘤的诊断检测。上述的具有成像功能的材料要实现诊断的目的，都需要在成像材料上连接具有诊断价值的靶向分子，从而将特异性结合与发光成像联合起来实现诊断的目的。但上述成像材料体系的构建过程繁琐，成本昂贵，不适于规模化生产。
近年来出现的分子靶向技术为癌症的诊断提供了新的方向，常用的靶向分子有抗体、小分子核酸适配体以及多肽，其中多肽小分子可以通过表面展示技术实现。表面展示技术是利用基因工程技术实现外缘多肽以融合蛋白的形式在微生物表面进行展示的新型基因工程技术，被展示的多肽可以保持相对独立的空间结构和生物活性。细菌表面展示技术结合流式细胞分选技术以快速、高通量的特点为展示技术领域中的应用热点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可以检测乳腺癌细胞的生物试剂。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种乳腺癌细胞检测生物试剂，其特征在于，由一种乳腺癌靶向细菌经固定液固定形成，所述乳腺癌靶向细菌表面展示有序列为SEQ ID NO.1的多肽。
SEQ ID NO.1
Tyr Leu Arg Leu Va l Phe Asn Lys
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述乳腺癌靶向细菌为一宿主细菌中转入一表达载体，所述表达载体包括编码所述多肽的基因和绿色荧光蛋白基因，编码所述多肽的基因序列如下SEQ ID NO.2所示
tacctgcgcctggtgttcaataag
进一步，所述多肽的C端连接于膜蛋白冰核蛋白的N端，所述冰核蛋白的N端表达于宿主细菌的细胞外，所述冰核蛋白可以为截断的冰核蛋白，以来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas borea l i s)的冰核蛋白N-末端1-165位氨基酸作为锚定蛋白，截断的冰核蛋白的核苷酸序列如下SEQ I D NO.3所示：
atgaacgatg acaaagtttt ggtcttgcgc acctgtgcca ataacatggccgatcactgcggccagatat ggcctgtttc cggtgttgtc gaatgtaaat attgggaacccacccgaaagctcgagaatg ggctggccgg gctgctatgg ggcaaagggg cgagcacgcatttgaatatgcaggctgacg cccggtgggt tatttgtgaa gttgcggtga gcgatatcatctttctggatgcgcagggcg gggtcaagtt tccgcgtgct gaagttgttc acgtcggcacaagaaacagcgcggcgggct atatttcggc gaatattgcc agttatgcgt cttccacagttgcgttgaatgaaacatttg tttttcctga agttcgcaca gaaacgaagg tggatttccccgcttcgcccgcgaccgctg atagcacttt tgatattgat cgacacgcaa ctattcaaggcccacaaacgctggagacag cggtg
进一步，所述表达载体为pET-28a(+)质粒。
本发明的有益效果是将能够靶向乳腺癌的多肽通过冰核蛋白展示在细菌表面，同时加入绿色荧光蛋白做为标记，用于体外乳腺癌细胞的检测。
进一步，所述固定液为多聚甲醛溶液，所述多聚甲醛溶液浓度为4％。
采用上述进一步方案的有益效果是本发明的乳腺癌细胞检测生物试剂经多聚甲醛固定后能长时间保存，并且提高应用的安全性。
附图说明
图1为本发明制备的乳腺癌诊断生物试剂与细胞的特异性结合实验结果图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1大肠杆菌表面展示载体构建
本实施例中，乳腺癌细胞靶向细菌为大肠杆菌BL21菌株转入同时含有绿色荧光蛋白(GFP)基因和靶向乳腺癌细胞的多肽基因的质粒，特异性多肽的C端连接于冰核蛋白的N端，将多肽展示于大肠杆菌表面，绿色荧光蛋白作为标记蛋白用于后续检测。
具体方法如下：
1、截断的冰核蛋白的人工合成
所述靶向乳腺癌细胞的多肽为本实验室前期研究发现的多肽，序列为SEQ ID NO1，含有8个氨基酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO 2.
SEQ ID NO 1
Tyr Leu Arg Leu Va l Phe Asn Lys
SEQ ID 2
tacctgcgcctggtgttcaataag
根据铜绿假单胞菌(Pseudomonas borea l i s)的冰核蛋白N-末端1-165位氨基酸进行该基因的全合成，并将其克隆至质粒pUC57中，新质粒命名为pUC57-I NP-N。
2、大肠杆菌表面展示载体构建
以INP-F和I NP-R为引物，从质粒pUC57-INP-N上扩增冰核蛋白的N末端序列，扩增产物用BamHI和NcoI酶切后和预先用上述限制性内切酶消化的pET-28a(+)质粒连接，获得质粒pET-INP-N。以引物LS-F和LS-R扩增靶向乳腺癌细胞的多肽核苷酸序列，扩增产物用BamH I和H i ndⅢ酶切后，和预先酶切的pET-INP-N质粒连接，获得pET-I NP-N-LS质粒，将绿色荧光蛋白GFP基因插入质粒中冰核蛋白基因的上游，获得pET-I NP-N-LS-GFP质粒。将质粒pET-I NP-N-LS-GFP转化到大肠杆菌BL21感受态中。
对照组中，将冰核蛋白N端序列以及绿色荧光蛋白(GFP)转入质粒pET-28a(+)中，对照组细菌不表达靶向乳腺癌细胞的多肽。
引物I NP-F、INP-R、LS-F和LS-R的序列分别为SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7。
Figure BDA0001565529500000041
Figure BDA0001565529500000051
3、重组质粒的诱导表达
挑取重组单菌落并接种至5ml含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃250rpm条件下培养过夜，取100μL菌液于新鲜LB培养基中，37℃下扩大培养2小时，用0.6mM的I PTG在37℃诱导2小时。
4、乳腺癌细胞靶向细菌固定
取诱导后的细菌，5000rpm离心5mi n，弃上清，将沉淀用4％的多聚甲醛重悬，室温下固定45mi n。将固定后的细菌再次离心，弃上清，沉淀用PBS溶液清洗3遍，再用PBS重悬，避光4℃保存。
实施例2乳腺癌细胞检测生物试剂结合实验
分别消化skbr3细胞、MCF10A细胞、As578Bst细胞，并进行计数，用PBS溶液重悬；
乳腺癌细胞检测生物试剂中被固定的靶向细菌和各种细胞的比例均为500:1，按照上述比例将所述的细菌和不同的细胞进行混合，4℃下孵育45mi n；同时将不表达靶向多肽的的对照组中靶向细菌也按照相同比例以及时间与各种细胞进行混合孵育。将上述两组孵育后于5000rpm下离心5mi n，弃上清，将沉淀用PBS溶液清洗3遍，将沉淀用PBS溶液重悬，用流式细胞仪进行分析。将上述实验重复5次，根据统计数据作图，结果如图1所示。
流式细胞仪检测结果表明，本发明制备的乳腺癌细胞检测生物试剂能够与乳腺癌skbr3细胞特异性结合,与乳腺正常细胞MCF10A细胞和As578Bst细胞无结合，而不表达靶向多肽的对照组与乳腺癌skbr3细胞以及乳腺癌正常细胞MCF10A细胞和As578Bst细胞都无结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 刘双萍
<120> 一种乳腺癌细胞检测生物试剂及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Tyr Leu Arg Leu Val Phe Asn Lys
1 5
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacctgcgcc tggtgttcaa taag 24
<210> 3
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaacgatg acaaagtttt ggtcttgcgc acctgtgcca ataacatggc cgatcactgc 60
ggccagatat ggcctgtttc cggtgttgtc gaatgtaaat attgggaacc cacccgaaag 120
ctcgagaatg ggctggccgg gctgctatgg ggcaaagggg cgagcacgca tttgaatatg 180
caggctgacg cccggtgggt tatttgtgaa gttgcggtga gcgatatcat ctttctggat 240
gcgcagggcg gggtcaagtt tccgcgtgct gaagttgttc acgtcggcac aagaaacagc 300
gcggcgggct atatttcggc gaatattgcc agttatgcgt cttccacagt tgcgttgaat 360
gaaacatttg tttttcctga agttcgcaca gaaacgaagg tggatttccc cgcttcgccc 420
gcgaccgctg atagcacttt tgatattgat cgacacgcaa ctattcaagg cccacaaacg 480
ctggagacag cggtg 495
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catgccatgg atgaacgatg acaaagtttt gg 32
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgggatccca ccgctgtctc cagc 24
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgggatccta cctgcgc 17
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccaagcttc ttattgaa 18

Claims (4)

1.一种乳腺癌细胞检测生物试剂，其特征在于，由一种乳腺癌靶向细菌经固定液固定形成，所述乳腺癌靶向细菌表面展示有序列为SEQ ID NO.1的多肽，所述乳腺癌靶向细菌为一宿主细菌中转入一表达载体，所述表达载体中包括编码所述多肽的基因和绿色荧光蛋白基因，编码所述多肽的基因序列为SEQ ID NO.2，所述宿主细菌为大肠杆菌BL21，所述表达载体为pET-28a(+)质粒。
2.根据权利要求1所述的一种乳腺癌细胞检测生物试剂，其特征在于，所述多肽的C端连接于膜蛋白冰核蛋白的N端，所述冰核蛋白的N端表达于宿主细菌的细胞外。
3.根据权利要求1所述的一种乳腺癌细胞检测生物试剂，其特征在于，所述固定液为多聚甲醛溶液。
4.根据权利要求3所述的一种乳腺癌细胞检测生物试剂，其特征在于，所述多聚甲醛溶液浓度为4wt％。
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