CN107904252A - 质粒载体及其构建方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及质粒载体及其构建方法、应用。本发明提供了双表达载体是以此质粒载体为基础，使用具有自我剪切功能的p2A序列代替到IRES(内部核糖体进入位点序列)。转染后，质粒从CMV启动子区域开始形成的mRNA可以自我剪切成2个独立的mRNA序列，分别表达两种基因，并且保证了两种蛋白的表达量相当，方便后续的研究。

Description

质粒载体及其构建方法、应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及质粒载体及其构建方法、应用。
背景技术
颗粒溶素(granulysin，GNLY)是存在于人类细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlympocytes,CFLs)和自然杀伤细胞(NKCells)胞浆颗粒中的细胞毒性蛋白。目前认为颗粒溶素有9kDa和15kDa两种形式。两种不同的形式同样都有生物学功能。但是市面是多数的载体构建都是表达其中的一种形式，或者是9kDa的，或者是15kDa的颗粒溶素蛋白。我们构建的双表达质粒载体，可以同时表达两种形式。将其转染到细胞中以后，两种蛋白都可以表达，并且表达量相当。氨基酸序列分析表明其与NK溶素和阿米巴溶素(抗微生物蛋白)同源，为脂结合蛋白一皂素样蛋白(saposin-likeprotein,SAPLIP)家族的成员之一。GNLYmRNA主要在CTL和NK细胞活化后，3—5天增加，5—7天剧增，在机体免疫应答过程中。
颗粒溶素是一种溶细胞和促炎症分子，表达于活化的人类细胞毒T细胞(CTLs)和自然杀伤(NK)细胞。目前认为颗粒溶素有9kDa和15kDa两种形式，具有溶细胞性、溶肿瘤性、杀菌活性、趋化作用、促炎症等功能。但是颗粒溶素对正常人细胞的毒性很低，所以在对抗耐药性细菌方面具有广阔的应用前景。
目前认为颗粒溶素有9kDa和15kDa两种形式。9kDa颗粒溶素是15kDa颗粒溶素的前体。9kDa颗粒溶素通过钙依赖通道途径释放到效应细胞与靶细胞之间。该颗粒溶素与其他皂素样蛋白家族同源，通过与靶细胞表面结合引起离子流，从而对多种微生物和肿瘤起溶细胞作用。15kDa颗粒溶素是自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞(CTLs)通过非颗粒溶细胞途径释放到细胞外.其浓度在T细胞活化后升高。关于15kDa颗粒溶素溶细胞性说法不一，研究认为15kDa颗粒溶素有类似于9kDa颗粒溶素的溶细胞潜能。
现在广泛报道的颗粒溶素的表达载体的构建，主要有以下几个特点：(1)表达其一种形式：9kDa或者15kDa的。(2)使用的载体根据转染的细胞不同，可以是质粒载体也可以是病毒载体。但是，迄今为止，还没有同时将两种形式的颗粒溶素同时放到一个表达载体上的。
现在常用的同时表达两种蛋白的方式，是分别将带有不同蛋白的质粒转染到同一个细胞中，让细胞表达两种蛋白。这种方式的缺点是(1)不能确定细胞是否同时表达两种载体。因为在转染的过程中，不可避免的有一种细胞表达只表达其中的一种蛋白；(2)同一个细胞中两种蛋白的表达量不一样，一个多一个少，对后续的实验的开展造成很大的麻烦。
于是，近年来，质粒的双表达载体慢慢兴起。比如美国invitrogen的pIRES载体就同时具有2个多克隆位点区，可以同时表达2个蛋白。这种质粒也存在一个问题就是：IRES序列后面的下游基因的表达不稳定。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种质粒载体及其构建方法、应用。本发明提供了双表达载体是以此质粒载体为基础，使用具有自我剪切功能的p2A序列代替到IRES(内部核糖体进入位点序列)。这样在转染后，质粒从CMV启动子区域开始形成的mRNA可以自我剪切成2个独立的mRNA序列，分别表达两种基因，并且保证了两种蛋白的表达量相当，方便后续的研究。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了具有自我剪切功能的2A元件在构建质粒载体中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述具有自我剪切功能的2A元件选自P2A、T2A或E2A。
在本发明的一些具体实施方案中，所述质粒载体含有两个多克隆位点的所述具有自我剪切功能的2A元件。
在本发明的一些具体实施方案中，所述质粒载体还包括目的基因，所述目的基因为编码9kDa颗粒溶素的基因和/或15kDa颗粒溶素的基因。
本发明还提供了一种质粒载体，包括含有两个多克隆位点的具有自我剪切功能的2A元件以及目的基因。
在本发明的一些具体实施方案中，所述具有自我剪切功能的2A元件选自P2A、T2A或E2A。
在本发明的一些具体实施方案中，所述目的基因为编码9kDa颗粒溶素的基因和/或15kDa颗粒溶素的基因。
本发明还提供了所述的质粒载体的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：取pIRES-EGFP载体，经BamHI、BstXI双酶切切除IRES，获得线性化载体片段；合成带有BamHI与BstXI酶切位点的P2A片段进行双酶切，获得P2A片段，与所述线性化载体连接，构建获得p2A-EGFP载体；
步骤2：取步骤1获得的p2A-EGFP载体经SalI、SacII双酶切获得线性化载体片段；PCR扩增出带有SalI、SacII酶切位点的P2A片段并进行双酶切，获得P2A片段，与所述线性化载体片段连接，构建获得p2A-2A-EGFP载体；
步骤3：取步骤2获得的p2A-2A-EGFP载体经SacII、BamHI双酶切获得线性化载体片段；合成或扩增带有SacII、BamHI酶切位点的GNLYS片段进行双酶切，获得GNLYS片段，与所述线性化载体片段连接，构建获得p2A-GNLYS-2A-EGFP载体；
步骤4：取步骤3制得的p2A-GNLYS-2A-EGFP载体，经XhoI、SacI、EcoRI、SalI中任选2个双酶切，获得线性化载体片段；合成或扩增带有XhoI、SacI、EcoRI、SalI中任选2个酶切位点的GNLYL片段进行双酶切，获得GNLYL片段，与所述线性化载体片段连接，构建p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体；或
包括如下步骤：
步骤1：在GNLYL-2A-GNLYS-2A的5’端引入EcoRI酶切位点，3’端引入MscI酶切位点，获得如SEQ ID No.6所示序列；
步骤2：将表达载体pIRES2-EGFP和如SEQ ID No.6所示序列的目的基因分别进行EcoRI和MscI双酶切后连接，构建获得p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体。
本发明还提供了所述的质粒载体在表达颗粒溶素中的应用。
本发明还提供了所述的质粒载体在同时表达9kDa颗粒溶素和15kDa颗粒溶素中的应用。
本发明提供了具有自我剪切功能的2A元件在构建质粒载体中的应用以及含有具有自我剪切功能的2A元件的质粒载体。具有如下优点：
(1)带有两个MCS(多克隆位点)p2A的质粒载体是首创的。
(2)带有颗粒溶素目的基因的双表达质粒载体，可以同时表达两种不同形式的颗粒溶素，并且保证两种不同形式的颗粒溶素的表达量相当。而且同时载体带有的GFP蛋白可以用来直观的观察转染的效率。
(3)15kDa颗粒溶素带有flag标签，9kDa颗粒溶素带有His-tag标签，后期可以使用不同的标签来纯化不同的颗粒溶素，方便操作，并且节省成本。
(4)双表达质粒是一个质粒，转染时只需要进行一次转染，相对于两个质粒共同转染来讲，操作简单。
质粒形式的颗粒溶素的双表达载体，适用于做贴壁细胞的转染，研究颗粒溶素的功能，也可以用于颗粒溶素的表达和纯化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示p-IRES2-EGFP载体的图谱；
图2示构建完成的双表达载体p-GNLYL-2A-GNLYS-2AGNLY-EGFP的线性示意图；
图3示构建完成的双表达载体p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP的环形示意图；
图4示p2A-EGFP载体图谱；
图5示p2A-2A-EGFP载体图谱；
图6示p2A-GNLYS-2A-EGFP载体图谱；
图7示p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体图谱；
图8示转染效率的结果；白光显示细胞的形态，GFP显示转染后细胞发出的荧光，这是同一组细胞不同光下的照片，两者对比可以看出细胞的转染后是可以发出绿色荧光；
图9示western blot检测转染后9kDa和15kDa的颗粒溶素的蛋白水平变化的结果；
图10示使用商用的pIRES-EGFP载体，构建成功的颗粒溶素的双表达载体；
图11示对比例中转染效率的结果；白光显示细胞的形态，GFP显示转染后细胞发出的荧光，这是同一组细胞不同光下的照片，两者对比可以看出细胞的转染后是可以发出绿色荧光；
图12示对比例中western blot检测转染后9kDa和15kDa的颗粒溶素的蛋白水平变化的结果。
具体实施方式
本发明公开了一种质粒载体及其构建方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的质粒载体及其构建方法、应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本发明使用到的关键基因序列如下：
P2A sequence
P2A:GCCACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAG AACCCCGGCCC(如SEQID No.1所示)。
15KD GNLY
SP(信号肽)基因序列
at ggctacctgg gccctcctgc tccttgcagc catgctcctg ggcaacccag
gtctggtctt ctct(如SEQ ID No.2所示)。
CDS(蛋白质编码)区序列
cgtctg agccctgagt actacgacct ggcaagagcc cacctgcgtg
atgaggagaa atcctgcccg tgcctggccc aggagggccc ccagggtgac ctgttgacca
aaacacagga gctgggccgt gactacagga cctgtctgac gatagtccaa aaactgaaga
agatggtgga taagcccacc cagagaagtg tttccaatgc tgcgacccgg gtgtgtagga
cggggaggtc acgatggcgc gacgtctgca gaaatttcat gaggaggtat cagtctagag
ttacccaggg cctcgtggcc ggagaaactg cccagcagat ctgtgaggac ctcaggttgt
gtataccttc tacaggtccc ctctga(如SEQ ID No.3所示)。
9KD GNLY
SP(信号肽)基因序列
at ggctacctgg gccctcctgc tccttgcagc catgctcctg ggcaacccag
gtctggtctt ctct(如SEQ ID No.4所示)。
CDS(蛋白质编码)区序列
ggccgt gactacagga cctgtctgac gatagtccaa aaactgaaga
agatggtgga taagcccacc cagagaagtg tttccaatgc tgcgacccgg gtgtgtagga
cggggaggtc acgatggcgc gacgtctgca gaaatttcat gaggaggtat cagtctagag
ttacccaggg cctcgtggcc ggagaaactg cccagcagat ctgtgaggac ctcagg TGA(如SEQ ID No.5所示)。
二、设计和构建流程
1、使用的基础质粒载体是：p-IRES2-EGFP载体。其图谱如图1所示：
2、设计和构建流程(第一种方案)
(1).公司完成GNLYL-2A-GNLYS-2A基因序列的设计，交由安徽通用生物技术有限公司进行合成(892bp)。分别在5’端引入EcoRI酶切位点，3’端引入MscI酶切位点。
gaattcatggctacctgggccctcctgctccttgcagccatgctcctgggcaacccaggtctggtcttctctcgtctgagccctgagtactacgacctggcaagagcccacctgcgtgatgaggagaaatcctgcccgtgcctggcccaggagggcccccagggtgacctgttgaccaaaacacaggagctgggccgtgactacaggacctgtctgacgatagtccaaaaactgaagaagatggtggataagcccacccagagaagtgtttccaatgctgcgacccgggtgtgtaggacggggaggtcacgatggcgcgacgtctgcagaaatttcatgaggaggtatcagtctagagttacccagggcctcgtggccggagaaactgcccagcagatctgtgaggacctcaggttgtgtataccttctacaggtcccctcGATTACAAGGATGACGACGATAAGGCCACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCatggctacctgggccctcctgctcc ttgcagccatgctcctgggcaacccaggtctggtcttctctggccgtgactacaggacctgtctgacgatagtccaaaaactgaagaagatggtggataagcccacccagagaagtgtttccaatgctgcgacccgggtgtgtaggacggggaggtcacgatggcgcgacgtctgcagaaatttcatgaggaggtatcagtctagagttacccagggcctcgtggccggagaaactgcccagcagatctgtgaggacctcaggCATCATCACCATCACCATGCCACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCctggcca(如SEQ ID No.6所示)。
(2)将表达载体pIRES2-EGFP和目的基因进行EcoRI和MscI双酶切,切胶回收后，配制载体与目的片段连接体系，过夜连接后转化大肠杆菌，通过菌落PCR、测序验证。完成p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP的构建。(如图2和3所示)
实施例2
以p2A-2A-EGFP载体为基础构建颗粒溶素的双表达载体(第二种方案)
目的：根据需求完成p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体的构建：在改造载体p2A-2A-EGFP载体的两个MCS分别插入带有His标签的GNLYL、GNLYS构建成重组载体。
方法：
含有双p2A序列的双表达p2A-2A-EGFP基础载体的构建方案：
目的：根据需求完成原载体pIRES-EGFP的改造：将IRES替换成P2A，并在MCS再引入一个P2A，构建成为p2A-2A-EGFP载体
方法：
(1)提取pIRES-EGFP载体后，进行双酶切切除IRES(BamHI、BstXI)，获得线性化载体片段；合成带有BamHI与BstXI酶切位点的P2A片段进行双酶切；
(2)将酶切后的线性化载体与P2A片段连接，构建成p2A-EGFP；
(3)提取p2A-EGFP载体后，进行双酶切载体(SalI、SacII)，获得线性化载体片段；PCR扩增出带有SalI、SacII酶切位点的P2A片段并进行双酶切；
(4)将酶切后的p2A-EGFP线性化载体与P2A片段连接，完成p2A-2A-EGFP载体的构建。
实验流程：
(1)P2A片段(BamHI、BstXI)的获取
合成带有BamHI与BstXI酶切位点的P2A片段(with BamHI&BstXI)：5’-CCGGATCCGCCACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCCCACAACCATGGAAGACGTC-3’(如SEQ ID No.7所示)。
使用BamHI与BstXI进行双酶切，回收后获得带有粘性末端的P2A片段。
(2)线性化载体的获取
提取pIRES-EGFP载体，配制双酶切(BamHI、BstXI)体系切除IRES，切胶回收线性化载体片段。
(3)连接转化与验证
加入线性化载体与酶切后的P2A片段，配制连接体系，过夜连接后转化大肠杆菌，通过菌落PCR、测序验证。完成p2A-EGFP的构建，如图4所示。
(4)P2A片段(SalI、SacII)的获取
P2A片段(SalI、SacII)的获取方法可从以下选择：
1.合成带有SalI、SacII酶切位点的P2A片段；
2.使用带有SalI、SacII的引物扩增上述合成的P2A片段。
获取后使用SalI、SacII进行双酶切，回收后获得带有粘性末端的P2A片段。
(5)线性化载体的获取
提取p2A-EGFP载体，配制双酶切(SalI、SacII)体系，切胶回收线性化载体片段。
(6)连接转化与验证
加入线性化的p2A-EGFP载体与酶切后的P2A片段，配制连接体系，过夜连接后转化大肠杆菌，通过菌落PCR、测序验证。完成p2A-2A-EGFP的构建，如图5所示。
p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体的构建：
(1)提取p2A-2A-EGFP载体后，进行双酶切(SacII、BamHI)，获得线性化载体片段；合成或扩增带有SacII、BamHI酶切位点的GNLYS片段进行双酶切；
(2)将酶切后的线性化载体与GNLYS片段连接，构建成p2A-GNLYS-2A-EGFP载体；
(3)提取p2A-GNLYS-2A-EGFP载体后，进行双酶切载体(可在XhoI、SacI、EcoRI、SalI中任选2个，本流程选用XhoI、SalI)，获得线性化载体片段；合成或扩增带有XhoI、SalI酶切位点的GNLYL片段进行双酶切；
(4)将酶切后的p2A-GNLYS-2A-EGFP线性化载体与GNLYL片段连接，完成p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体的构建，如图6所示。
实验具体流程：
GNLYS片段(SacII、BamHI)的获取
合成或扩增GNLYS片段(with SacII、BamHI)，序列应如下：
5’-CCGCGGATGGCTACCTGGGCCCTCCTGCTCCTTGCAGCCATGCTCCTGGGCAACCCAGGTCTGGTCTTCTCTGGCCGTGACTACAGGACCTGTCTGACGATAGTCCAAAAACTGAAGAAGATGGTGGATAAGCCCACCCAGAGAAGTGTTTCCAATGCTGCGACCCGGGTGTGTAGGACGGGGAGGTCACGATGGCGCGACGTCTGCAGAAATTTCATGAGGAGGTATCAGTCTAGAGTTACCCAGGGCCTCGTGGCCGGAGAAACTGCCCAGCAGATCTGTGAGGACCTCAGGCATCATCACCATCACCATGGATCC-3’(如SEQ ID No.8所示)。
使用SacII、BamHI进行双酶切，回收后获得带有粘性末端的GNLYS片段。
线性化载体的获取：
提取p2A-2A-EGFP载体，配制双酶切(SacII、BamHI)体系，切胶回收线性化载体片段。
连接转化与验证：
加入线性化载体与酶切后的GNLYS片段，配制连接体系，过夜连接后转化大肠杆菌，通过菌落PCR、测序验证。完成p2A-GNLYS-2A-EGFP的构建。GNLYL片段(XhoI、SalI)的获取：
合成或扩增GNLYL片段(with XhoI、SalI)，序列应如下：
5’-CTCGAGATGGCTACCTGGGCCCTCCTGCTCCTTGCAGCCATGCTCCTGGGCAACCCAGGTCTGGTCTTCTCTCGTCTGAGCCCTGAGTACTACGACCTGGCAAGAGCCCACCTGCGTGATGAGGAGAAATCCTGCCCGTGCCTGGCCCAGGAGGGCCCCCAGGGTGACCTGTTGACCAAAACACAGGAGCTGGGCCGTGACTACAGGACCTGTCTGACGATAGTCCAAAAACTGAAGAAGATGGTGGATAAGCCCACCCAGAGAAGTGTTTCCAATGCTGCGACCCGGGTGTGTAGGACGGGGAGGTCACGATGGCGCGACGTCTGCAGAAATTTCATGAGGAGGTATCAGTCTAGAGTTACCCAGGGCCTCGTGGCCGGAGAAACTGCCCAGCAGATCTGTGAGGACCTCAGGTTGTGTATACCTTCTACAGGTCCCCTCGATTACAAGGATGACGACGATAAGGTCGAC-3’(如SEQ ID No.9所示)。
使用XhoI、SalI进行双酶切，回收后获得带有粘性末端的GNLYL片段。线性化载体的获取：
提取p2A-GNLYS-2A-EGFP载体，配制双酶切(XhoI、SalI)体系，切胶回收线性化载体片段。
连接转化与验证：
加入线性化的p2A-GNLYS-2A-EGFP载体与酶切后的GNLYL片段，配制连接体系，过夜连接后转化大肠杆菌，通过菌落PCR、测序验证。完成p2A-2A-EGFP的构建，如图7所示。
实施例3
使用实施例1～2构建成功的颗粒溶素的双表达载体，经lipofectamine2000转染到293T-人胚肾细胞中进行表达，使用的对照质粒是我们构建的含有双p2A序列的不含有颗粒溶素的空载体。细胞转染的流程按照lipofectamine2000的说明书进行，简述如下：(1)分别将4ug质粒和10ullipofectamine 2000稀释到250ulDMEM培养基中，(2)将两者混合均匀，室温下孵育20分钟,(3)将混合后的溶液加入到含有293T细胞的6孔板中。48h后拍照，并收集细胞，进行qPCR和western blot检测。
实验结果如下：
(1)转染效率的结果如图8所示。实验分组：空载体组，双表达载体组。由于空载体和双表达载体都具有GFP(绿色荧光蛋白)基因，所以转染后都有绿色荧光。
(2)western blot检测转染后9kDa和15kDa的颗粒溶素的蛋白水平变化。实验分组：双表达载体组。实验中分别使用anti-flag抗体(abcam公司，货号ab49763)检测15kDa的颗粒溶素、anti-His tag抗体检测9kDa的颗粒溶素(abcam公司，货号ab18184)、anti-GNLY抗体(abcam公司，货号ab213561)检测检测15kDa和9kDa的颗粒溶素。
对双表达载体组的细胞进行了颗粒溶素的蛋白检测，使用了3种不同的抗体。由图9显示，两种形式的颗粒溶素的表达效果相当，并且带有不同的标签。并且我们对westernblot的结果进行了灰度分析，灰度分析的数值可以代表蛋白的表达量，数值如表1所示：
表1灰度分析：
Anti-GNLY Anti-FLAG Anti-Histag
15kDa 33407.827 34428.475 -
9kDa 29619.099 - 31773.91
对比例
实验流程：
使用商用的pIRES-EGFP载体，构建成功的颗粒溶素的双表达载体，构建图如图10所示，经lipofectamine2000转染到293T-人胚肾细胞中进行表达，使用的对照质粒是我们构建的含有双IRES序列的不含有颗粒溶素的空载体。细胞转染的流程按照lipofectamine2000的说明书进行，简述如下：(1)分别将4ug质粒和10ulipofectamine2000稀释到250ulDMEM培养基中，(2)将两者混合均匀，室温下孵育20分钟,(3)将混合后的溶液加入到含有293T细胞的6孔板中。48h后拍照，并收集细胞，进行qPCR和western blot检测。
实验结果如下：
(1)转染效率的结果如图11所示。实验分组：空载体组，双表达载体组。由于空载体和双表达载体都具有GFP(绿色荧光蛋白)基因，所以转染后都有绿色荧光。
(2)western blot检测转染后9kDa和15kDa的颗粒溶素的蛋白水平变化。实验分组：双表达载体组。实验中分别使用anti-flag抗体(abcam公司，货号ab49763)检测15kDa的颗粒溶素、anti-His tag抗体检测9kDa的颗粒溶素(abcam公司，货号ab18184)、anti-GNLY抗体(abcam公司，货号ab213561)检测检测15kDa和9kDa的颗粒溶素。
对双表达载体组的细胞进行了颗粒溶素的蛋白检测，使用了3种不同的抗体。由图12显示，两种形式的颗粒溶素的表达效果明显不同，并且带有不同的标签。并且对westernblot的结果进行了灰度分析，灰度分析的数值可以代表蛋白的表达量，数值如表2所示：
表2灰度分析：
protein A(15KD GNLY) 31361.011 —— 33129.111
protein B(9KD GNLY) 49398.605 62249.798 ——
通过对p2A质粒和pIRES质粒转染后的western blot结果的对比，可以发现，使用p2A质粒进行转染后，两种蛋白的表达情况相当，无论是使用GNLY抗体检测或者使用标签抗体检测，结果都是一样的。但是，使用pIRES质粒进行转染后，两种蛋白的表达量明显不同，后一种比前一种明显要多，具有显著差异(P＜0.05)。无论是使用GNLY抗体检测或者使用标签抗体检测，结果都是如此。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南丰晖生物科技有限公司
<120> 质粒载体及其构建方法、应用
<130> MP1719312
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> P2A sequence
<400> 1
gccaccaact tctccctgct gaagcaggcc ggcgacgtgg aggagaaccc cggccc 56
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 15KD GNLY SP sequence
<400> 2
atggctacct gggccctcct gctccttgca gccatgctcc tgggcaaccc aggtctggtc 60
ttctct 66
<210> 3
<211> 372
<212> DNA
<213> 15KD GNLY CDS sequence
<400> 3
cgtctgagcc ctgagtacta cgacctggca agagcccacc tgcgtgatga ggagaaatcc 60
tgcccgtgcc tggcccagga gggcccccag ggtgacctgt tgaccaaaac acaggagctg 120
ggccgtgact acaggacctg tctgacgata gtccaaaaac tgaagaagat ggtggataag 180
cccacccaga gaagtgtttc caatgctgcg acccgggtgt gtaggacggg gaggtcacga 240
tggcgcgacg tctgcagaaa tttcatgagg aggtatcagt ctagagttac ccagggcctc 300
gtggccggag aaactgccca gcagatctgt gaggacctca ggttgtgtat accttctaca 360
ggtcccctct ga 372
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 9KD GNLY SP sequence
<400> 4
atggctacct gggccctcct gctccttgca gccatgctcc tgggcaaccc aggtctggtc 60
ttctct 66
<210> 5
<211> 225
<212> DNA
<213> 9KD GNLY CDS sequence
<400> 5
ggccgtgact acaggacctg tctgacgata gtccaaaaac tgaagaagat ggtggataag 60
cccacccaga gaagtgtttc caatgctgcg acccgggtgt gtaggacggg gaggtcacga 120
tggcgcgacg tctgcagaaa tttcatgagg aggtatcagt ctagagttac ccagggcctc 180
gtggccggag aaactgccca gcagatctgt gaggacctca ggtga 225
<210> 6
<211> 892
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaattcatgg ctacctgggc cctcctgctc cttgcagcca tgctcctggg caacccaggt 60
ctggtcttct ctcgtctgag ccctgagtac tacgacctgg caagagccca cctgcgtgat 120
gaggagaaat cctgcccgtg cctggcccag gagggccccc agggtgacct gttgaccaaa 180
acacaggagc tgggccgtga ctacaggacc tgtctgacga tagtccaaaa actgaagaag 240
atggtggata agcccaccca gagaagtgtt tccaatgctg cgacccgggt gtgtaggacg 300
gggaggtcac gatggcgcga cgtctgcaga aatttcatga ggaggtatca gtctagagtt 360
acccagggcc tcgtggccgg agaaactgcc cagcagatct gtgaggacct caggttgtgt 420
ataccttcta caggtcccct cgattacaag gatgacgacg ataaggccac caacttctcc 480
ctgctgaagc aggccggcga cgtggaggag aaccccggcc ccatggctac ctgggccctc 540
ctgctccttg cagccatgct cctgggcaac ccaggtctgg tcttctctgg ccgtgactac 600
aggacctgtc tgacgatagt ccaaaaactg aagaagatgg tggataagcc cacccagaga 660
agtgtttcca atgctgcgac ccgggtgtgt aggacgggga ggtcacgatg gcgcgacgtc 720
tgcagaaatt tcatgaggag gtatcagtct agagttaccc agggcctcgt ggccggagaa 780
actgcccagc agatctgtga ggacctcagg catcatcacc atcaccatgc caccaacttc 840
tccctgctga agcaggccgg cgacgtggag gagaaccccg gccccctggc ca 892
<210> 7
<211> 85
<212> DNA
<213> 带有BamHI与BstXI酶切位点的P2A片段(P2A segment with BamHI and BstXI)
<400> 7
ccggatccgc caccaacttc tccctgctga agcaggccgg cgacgtggag gagaaccccg 60
gccccccaca accatggaag acgtc 85
<210> 8
<211> 318
<212> DNA
<213> 带有SacII和BamHI酶切位点的GNLYS片段(GNLYS segments with SacII andBamHI)
<400> 8
ccgcggatgg ctacctgggc cctcctgctc cttgcagcca tgctcctggg caacccaggt 60
ctggtcttct ctggccgtga ctacaggacc tgtctgacga tagtccaaaa actgaagaag 120
atggtggata agcccaccca gagaagtgtt tccaatgctg cgacccgggt gtgtaggacg 180
gggaggtcac gatggcgcga cgtctgcaga aatttcatga ggaggtatca gtctagagtt 240
acccagggcc tcgtggccgg agaaactgcc cagcagatct gtgaggacct caggcatcat 300
caccatcacc atggatcc 318
<210> 9
<211> 471
<212> DNA
<213> 带有XhoI和SalI酶切位点的GNLYL片段(GNLYL fragments with XhoI andSalI )
<400> 9
ctcgagatgg ctacctgggc cctcctgctc cttgcagcca tgctcctggg caacccaggt 60
ctggtcttct ctcgtctgag ccctgagtac tacgacctgg caagagccca cctgcgtgat 120
gaggagaaat cctgcccgtg cctggcccag gagggccccc agggtgacct gttgaccaaa 180
acacaggagc tgggccgtga ctacaggacc tgtctgacga tagtccaaaa actgaagaag 240
atggtggata agcccaccca gagaagtgtt tccaatgctg cgacccgggt gtgtaggacg 300
gggaggtcac gatggcgcga cgtctgcaga aatttcatga ggaggtatca gtctagagtt 360
acccagggcc tcgtggccgg agaaactgcc cagcagatct gtgaggacct caggttgtgt 420
ataccttcta caggtcccct cgattacaag gatgacgacg ataaggtcga c 471

Claims (10)

1.具有自我剪切功能的2A元件在构建质粒载体中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述具有自我剪切功能的2A元件选自P2A、T2A或E2A。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述质粒载体含有两个多克隆位点的所述具有自我剪切功能的2A元件。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述质粒载体还包括目的基因，所述目的基因为编码9kDa颗粒溶素的基因和/或15kDa颗粒溶素的基因。
5.一种质粒载体，其特征在于，包括含有两个多克隆位点的具有自我剪切功能的2A元件以及目的基因。
6.根据权利要求5所述的质粒载体，其特征在于，所述具有自我剪切功能的2A元件选自P2A、T2A或E2A。
7.根据权利要求5或6所述的质粒载体，其特征在于，所述目的基因为编码9kDa颗粒溶素的基因和/或15kDa颗粒溶素的基因。
8.根据权利要求5至7任一项所述的质粒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取pIRES-EGFP载体，经BamHI、BstXI双酶切切除IRES，获得线性化载体片段；合成带有BamHI与BstXI酶切位点的P2A片段进行双酶切，获得P2A片段，与所述线性化载体连接，构建获得p2A-EGFP载体；
步骤2：取步骤1获得的p2A-EGFP载体经SalI、SacII双酶切获得线性化载体片段；PCR扩增出带有SalI、SacII酶切位点的P2A片段并进行双酶切，获得P2A片段，与所述线性化载体片段连接，构建获得p2A-2A-EGFP载体；
步骤3：取步骤2获得的p2A-2A-EGFP载体经SacII、BamHI双酶切获得线性化载体片段；合成或扩增带有SacII、BamHI酶切位点的GNLYS片段进行双酶切，获得GNLYS片段，与所述线性化载体片段连接，构建获得p2A-GNLYS-2A-EGFP载体；
步骤4：取步骤3制得的p2A-GNLYS-2A-EGFP载体，经XhoI、SacI、EcoRI、SalI中任选2个双酶切，获得线性化载体片段；合成或扩增带有XhoI、SacI、EcoRI、SalI中任选2个酶切位点的GNLYL片段进行双酶切，获得GNLYL片段，与所述线性化载体片段连接，构建p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体；或
包括如下步骤：
步骤1：在GNLYL-2A-GNLYS-2A的5’端引入EcoRI酶切位点，3’端引入MscI酶切位点，获得如SEQ ID No.6所示序列；
步骤2：将表达载体pIRES2-EGFP和如SEQ ID No.6所示序列的目的基因分别进行EcoRI和MscI双酶切后连接，构建获得p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体。
9.根据权利要求5至7任一项所述的质粒载体在表达颗粒溶素中的应用。
10.根据权利要求5至7任一项所述的质粒载体在同时表达9kDa颗粒溶素和15kDa颗粒溶素中的应用。
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