CN109295102A - 肿瘤特异性基因表达盒、重组表达载体及构建方法和应用 - Google Patents

肿瘤特异性基因表达盒、重组表达载体及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤特异性基因表达盒、重组表达载体及构建方法和应用。包括依次连接的启动子、目的基因、接头、第一自杀基因、第二自杀基因和终止子；其中，所述目的基因为黑色素瘤分化相关基因7，所述接头为P2A肽基因序列，所述第一自杀基因为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因，所述第二自杀基因为胞嘧啶脱氨酶基因。本发明不仅联合了具有极强抗肿瘤能力的mda‑7及双自杀融合基因TK‑CD，增强了抗肿瘤活性，能有效识别肿瘤位点，而且通过P2A肽基因序列将其连接，使得到的肿瘤特异性基因表达盒或含有该肿瘤特异性基因表达盒的重组表达载体具有很高的转录活性，能够高效地表达，为肿瘤的治疗提供了新的途径。

Description

肿瘤特异性基因表达盒、重组表达载体及构建方法和应用
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗领域，特别是涉及一种肿瘤特异性基因表达盒、重组表达载体及构建方法和应用。
背景技术
近些年来的大量研究证实，肿瘤发生与发展的生物学基础是基因突变。因此，肿瘤的基因治疗已成为目前肿瘤学研究的热点。而在基因治疗中，肿瘤相关基因如何联合应用以克服各自的缺陷、增强抗肿瘤的效果，并在肿瘤细胞或肿瘤组织中的特异性高效表达，对基因治疗的效率和安全性有着重要的意义，也是目前基因治疗所遇到的挑战之一。
黑色素瘤分化相关基因7，即白介素24(melanoma differentiation-associatedgene-7/interleukin-24，mda-7/IL-24)是通过消减杂交发现的属于IL-10家族的抑制肿瘤细胞因子，能特异性的杀伤多种肿瘤细胞却不会损伤正常细胞。但是，mda-7与其它的基因联合应用时存在基因表达效率低下的问题，无法高效的表达从而发挥作用。
发明内容
基于此，有必要提供一种具有较高表达活性的肿瘤特异性基因表达盒及其构建方法和应用。
一种肿瘤特异性基因表达盒，包括依次连接的启动子、目的基因、接头、第一自杀基因、第二自杀基因和终止子；其中，所述目的基因为黑色素瘤分化相关基因7，所述接头为P2A肽基因序列，所述第一自杀基因为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因，所述第二自杀基因为胞嘧啶脱氨酶基因。
在其中一个实施例中，还包括位于所述第二自杀基因与所述终止子之间的标记基因。
在其中一个实施例中，所述标记基因为3Flag标签蛋白基因序列和/或荧光蛋白基因序列。
在其中一个实施例中，所述终止子为WPRE序列。
在其中一个实施例中，所述启动子为CMV启动子。
本发明还提供了一种重组表达载体，包含上述肿瘤特异性基因表达盒。
在其中一个实施例中，所述重组表达载体为质粒或病毒载体。
在其中一个实施例中，所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。
本发明还提供了上述肿瘤特异性基因表达盒或上述重组表达载体在制备用于诊断或治疗肿瘤的产品中的应用。
本发明还提供了一种重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：
提供具有启动子和终止子的表达载体，通过双酶切和连接分别将目的基因、接头、第一自杀基因和第二自杀基因插入所述表达载体，得到结构含有启动子-目的基因-接头-第一自杀基因-第二自杀基因-终止子的重组表达载体；其中，所述目的基因为黑色素瘤分化相关基因7，所述接头为P2A肽基因序列，所述第一自杀基因为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因，所述第二自杀基因为胞嘧啶脱氨酶基因。
黑色素瘤分化相关基因7能直接通过抑制血管内皮的生成而抑制肿瘤细胞的生长，并能通过调节各种信号通路诱导、加强肿瘤细胞的凋亡，伴随强烈的旁观者效应，从而具有广谱的抗肿瘤作用，特异性的杀伤多种肿瘤细胞却不会损伤正常细胞。单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因(herpes simplexvirus thymidine kinase,HSV-TK)和胞嘧啶脱氨酶基因(Escherichia coli cytosine deaminase,Ec-CD)可将无毒性的前体药物转化为有毒性的药物，且仅在转染的肿瘤细胞内表达，因而只对肿瘤有杀伤作用，对未转染的肿瘤细胞能产生强烈的旁观者效应。本发明不仅联合了具有极强抗肿瘤能力的mda-7及双自杀融合基因TK-CD，增强了抗肿瘤活性，能有效识别肿瘤位点，而且通过P2A肽基因序列将其连接，使得到的肿瘤特异性基因表达盒或含有该肿瘤特异性基因表达盒的重组表达载体具有很高的转录活性，能够高效地表达，从而可以更好地杀灭肿瘤细胞，为肿瘤的治疗提供了新的途径。
附图说明
图1为一实施例的表达载体的结构示意图；
图2为实施例1的重组表达载体的结构示意图；
图3为对比例1的重组表达载体的结构示意图；
图4为对比例2的重组表达载体的结构示意图；
图5中A为实施例1、对比例1和对比例2的Western-blot实验结果图，图5中B为实施例1、对比例1和对比例2的Western-blot内参对照图；
图6中A为实施例1的ACT溶解曲线，图6中B为实施例1的GENE溶解曲线；
图7中A为对比例1的ACT溶解曲线，图7中B为对比例1的GENE溶解曲线；
图8中A为对比例2的ACT溶解曲线，图8中B为对比例2的GENE溶解曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的肿瘤特异性基因表达盒，包括依次连接的启动子、目的基因、接头、第一自杀基因、第二自杀基因和终止子。其中，目的基因为黑色素瘤分化相关基因7，接头为P2A肽基因序列，第一自杀基因为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因，第二自杀基因为胞嘧啶脱氨酶基因。
在一个具体示例中，还包括位于第二自杀基因与终止子之间的标记基因，以便用来检验转化成功与否或检测目的基因在细胞中的定位等。可以理解，在其他具体示例中，该基因表达盒可以不含有标记基因。
在一个具体示例中，标记基因为3Flag标签蛋白基因序列和/或荧光蛋白基因序列，荧光蛋白基因可以为黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)基因、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因或增强绿色荧光蛋白基因等。可以理解，在具体应用中，该基因表达盒可以根据实验的需要插入不同的标记基因。
在一个具体示例中，终止子为WPRE序列。
在一个具体示例中，启动子为CMV启动子，它是启动真核基因表达的最强力的启动子。
本发明一实施例的重组表达载体，包含上述肿瘤特异性基因表达盒。
在一个具体示例中，重组表达载体为质粒或病毒载体。该基因表达盒可以整合进质粒或病毒载体中得到重组表达载体，其中，病毒载体可以为慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体等。
本发明一实施例的重组表达载体的制备方法，其包括如下步骤：
提供具有启动子和终止子的表达载体，通过双酶切和连接分别将目的基因、接头(linker)、第一自杀基因和第二自杀基因插入表达载体，得到结构含有启动子-目的基因-接头-第一自杀基因-第二自杀基因-终止子的重组表达载体。其中，目的基因为黑色素瘤分化相关基因7，接头为P2A肽基因序列，第一自杀基因为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因，第二自杀基因为胞嘧啶脱氨酶基因。
在一个具体示例中，表达载体为慢病毒载体pLenti-CMV-MCS-3FLAG，结构如图1所示。
黑色素瘤分化相关基因7能直接通过抑制血管内皮的生成而抑制肿瘤细胞的生长，并能通过调节各种信号通路诱导、加强肿瘤细胞的凋亡，伴随强烈的旁观者效应，从而具有广谱的抗肿瘤作用，特异性的杀伤多种肿瘤细胞却不会损伤正常细胞。单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因(herpes simplexvirus thymidine kinase,HSV-TK)和胞嘧啶脱氨酶基因(Escherichia coli cytosine deaminase,Ec-CD)可将无毒性的前体药物转化为有毒性的药物，且仅在转染的肿瘤细胞内表达，因而只对肿瘤有杀伤作用，对未转染的肿瘤细胞能产生强烈的旁观者效应。本发明不仅联合了具有极强抗肿瘤能力的mda-7及双自杀融合基因TK-CD，增强了抗肿瘤活性，能有效识别肿瘤位点，而且通过P2A肽基因序列将其连接，使得到的肿瘤特异性基因表达盒或含有该肿瘤特异性基因表达盒的重组表达载体具有很高的转录活性，能够高效地表达，从而可以更好地杀灭肿瘤细胞，为肿瘤的治疗提供了新的途径。
下面主要结合具体实施方式和附图对动脉粥样硬化分子标志物及其应用作进一步详细的说明。
一、重组表达载体的构建
1.1实施例1
根据GenBank报道的mda-7序列(No:U16261.1，621bp)设计合成引物，经PCR扩增基因片段。以大肠杆菌E.coli BL21基因组DNA为模板，根据GenBank报道的胞嘧啶脱氨酶基因的序列(NO:AY552602，1284bp)设计合成引物，经PCR扩增基因片段。以质粒pHSV-TK为模板，根据GenBank报道的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因序列(NO:X03764，1131bp)设计合成引物，经PCR扩增基因片段。选择结构如图1所示的慢病毒载体pLenti-CMV-MCS-3FLAG作为空载体，接头为P2A肽，P2A的序列如SEQ ID NO.1所示。通过双酶切和连接依次将黑色素瘤分化相关基因7、P2A肽基因序列、单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因插入上述表达载体，得到结构如图2所示的重组表达载体。
1.2对比例1
根据GenBank报道的mda-7序列(No:U16261.1，621bp)设计合成引物，经PCR扩增基因片段。通过双酶切和连接将黑色素瘤分化相关基因7插入上述表达载体，得到结构如图3所示的重组表达载体。
1.3对比例2
根据GenBank报道的mda-7序列(No:U16261.1，621bp)设计合成引物，经PCR扩增基因片段。以大肠杆菌E.coli BL21基因组DNA为模板，根据GenBank报道的胞嘧啶脱氨酶基因的序列(NO:AY552602，1284bp)设计合成引物，经PCR扩增基因片段。以质粒pHSV-TK为模板，根据GenBank报道的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因序列(NO:X03764，1131bp)设计合成引物，经PCR扩增基因片段。选择结构如图1所示的慢病毒载体pLenti-CMV-MCS-3FLAG作为空载体。通过双酶切和连接依次将黑色素瘤分化相关基因7、单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因插入上述表达载体，得到结构如图4所示的重组表达载体。
二、细胞的转染及Western-blot鉴定
经测序无误后分别使用上述空载体(作为对照组)、实施例1、对比例1和对比例2的重组表达载体转染HEK293T细胞，然后利用重组表达载体上携带的3Flag标记基因，通过Western-blot实验使用Flag抗体检测细胞样品，结果如图5所示。其中，从左至右泳道1为Marker，泳道2为对比例1，泳道4为空载体，泳道5为未转染的HEK293T细胞，泳道6为空载体，泳道7为对比例2，泳道8为实施例1。mda-7与Flag蛋白融合后预测对应蛋白大小约为30KDa，这与泳道2的结果相符。mda-7、TK-CD与Flag蛋白融合后预测对应蛋白大小约为114KDa，由于P2A肽较小，因此无法通过电泳区分，与泳道7和泳道8的结果相符。因此，根据图5A可知上述重组表达载体均已成功转染并表达。图5B为以GAPDH为内参的Western-blot对照，说明了该实验结果的可靠性。
三、目的基因表达量的分析及鉴定结果
3.1总RNA抽提
分别收集经上述重组表达载体转染后的HEK293T细胞，根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行总RNA抽提，均为RNase-free操作。
离心去细胞上清，每孔加入1000μl Trizol，吹打，室温静置5min，后转移至另一新的1.5mL离心管中。每管加入200μL氯仿，用力震荡15s，室温静置15min。然后4℃，12000rpm，离心15min。从每管中吸取上清至另一新的1.5mL离心管，加入等体积异丙醇，混匀后4℃沉淀10min。4℃，12000rpm离心10min后，去上清。再加入至少1mL 4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。4℃，10000rpm离心5min，弃上清。4℃，10000rpm再次离心5min，吸去残液，室温干燥。加入30～40μl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。
3.2 RNA逆转录获得cDNA
M-MLV逆转录酶和dNTP购自TAKARA公司，Oligo dT购自上海生工。RNase-free的耗材购自Axygen。根据TAKARA公司的M-MLV操作说明书进行，均为RNase－free操作。
将1μl Oligo dT(100μM)和2.0μg总RNA加入到PCR小管中，补充DEPC水至10μL。混匀后离心，70℃水浴10min。然后立即插入到0℃冰水浴中，使Oligo dT和模板退火。按表1的比例，根据反应管数算出所需的试剂量。将M-MLV酶等在冰上混匀，得到RT反应液。在每个反应管中加入10μL的RT反应液，混匀后离心。
表1
RT反应在42℃进行1h后完成，之后在70℃处理10min使RT酶失活。在得到的RT反应产物cDNA中加入80μL DEPC水进行5倍稀释，立即用于PCR或者保存在-80℃以后使用。
3.3 Real-time PCR检测
设计合成目的基因(mda-7)的上下游引物序列，分别如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示，内参上下游引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。按照表2的比例配置体系，设定程序为两步法Real-Time定量。预变性95℃，30s，之后每一步变性95℃，5s，退火延伸60℃，34s，共进行40个循环，每次在延伸阶段读取吸光值。
表2
PCR结束后，在95℃变性1min。然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4S，同时读取吸光值，制作熔解曲线，实施例1、对比例1和对比例2的结果分别如图5～图8所示。经qPCR定量数值及统计分析结果可得，空载体对照组中mda-7有非常弱的本底表达。而对比例1中mda-7的表达量为对照组的2378284476.78％，说明不与其他基因联合应用，仅单独表达mda-7时，表达效率较好。而对比例2中mda-7的表达量仅为对照组的194765.89％，说明一旦与其他基因联合应用，表达效率便会受到极大的影响。而实施例1中mda-7的表达量是对照组的1338729.57％，说明基因mda-7通过P2A肽基因序列与TK-CD连接的方式，可获得较高的转录活性，能够高效地表达，实现了与双自杀基因的联合应用，从而增强了抗肿瘤活性，可以更好地杀灭肿瘤细胞，为肿瘤的治疗提供了新的途径。此外，还对采用其他接头替换P2A肽基因序列的对比例也进行了检测，如(G)n序列、(EAAAK)n序列、IRES序列、E2A序列、F2A序列和T2A序列等，其表达活性均不如实施例1。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 新乡医学院
<120> 肿瘤特异性基因表达盒、重组表达载体及构建方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccaccaact tctccctgct gaagcaggcc ggcgacgtgg aggagaaccc cggccc 56
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgttctcatc gtgtcacaac tg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcatccaggt cagaagaatg tc 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttctacaatg agctgcgtg 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcaaacatg atctgggtc 19

Claims (10)

1.一种肿瘤特异性基因表达盒，其特征在于，包括依次连接的启动子、目的基因、接头、第一自杀基因、第二自杀基因和终止子；其中，所述目的基因为黑色素瘤分化相关基因7，所述接头为P2A肽基因序列，所述第一自杀基因为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因，所述第二自杀基因为胞嘧啶脱氨酶基因。
2.根据权利要求1所述的肿瘤特异性基因表达盒，其特征在于，还包括位于所述第二自杀基因与所述终止子之间的标记基因。
3.根据权利要求2所述的肿瘤特异性基因表达盒，其特征在于，所述标记基因为3Flag标签蛋白基因序列和/或荧光蛋白基因序列。
4.根据权利要求1所述的肿瘤特异性基因表达盒，其特征在于，所述终止子为WPRE序列。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的肿瘤特异性基因表达盒，其特征在于，所述启动子为CMV启动子。
6.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1～5中任一项所述的肿瘤特异性基因表达盒。
7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为质粒或病毒载体。
8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。
9.如权利要求1～5中任一项所述的肿瘤特异性基因表达盒或权利要求6～8中任一项所述的重组表达载体在制备用于诊断或治疗肿瘤的产品中的应用。
10.一种重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供具有启动子和终止子的表达载体，通过双酶切和连接分别将目的基因、接头、第一自杀基因和第二自杀基因插入所述表达载体，得到结构含有启动子-目的基因-接头-第一自杀基因-第二自杀基因-终止子的重组表达载体；其中，所述目的基因为黑色素瘤分化相关基因7，所述接头为P2A肽基因序列，所述第一自杀基因为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因，所述第二自杀基因为胞嘧啶脱氨酶基因。
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