CN117757844A - 荧光报告细胞系及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种荧光报告细胞系及其构建方法。荧光报告细胞系的构建方法包括以下步骤：构建重组病毒表达质粒，所述重组病毒表达质粒包括从5’端至3’端依次为Albumin上游同源臂序列、剪切序列、staygold基因序列、筛选基因序列和Albumin下游同源臂序列的核酸片段；对所述重组病毒表达质粒进行病毒质粒包装，利用所述重组病毒表达质粒与病毒包装质粒感染宿主细胞，构建表达staygold细胞系；经过抗性筛选后得到荧光报告细胞系。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种荧光报告细胞系及其构建方法。
背景技术
肝脏是人体最重要的代谢器官，也是各种代谢性遗传疾病的主要病变器官，遗传性代谢疾病对人体健康危害巨大，发病率高，而且大多数疾病目前临床上都没有有效的解决方案。随着技术的进步和发展，细胞治疗和基因治疗越来越多的进入人们的视野。很多遗传性代谢疾病在实验室和初期临床中取得了不错的进展，比如肝豆状核硬化，高酪氨酸血症-1，苯丙酮尿症等。当前CRISPR/Cas9基因编辑系统在基因治疗领域展现出无与伦比的潜力，但原始的CRISPR/Cas9基因编辑系统存在脱靶，对DNA和细胞损伤大等安全性问题。因此，一系列基于CRISPR/Cas9系统的更加安全可靠，简单易行的基因编辑工具被开发出来。尤其是David Liu等人开发的DNA碱基编辑器，例如胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)、腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)和Prime editing (PE)系统。但这些基因编辑系统目前仍有着各自的缺陷，如ABEs，CBEs旁编辑效果严重，Prime editing (PE)系统编辑效率较低等，仍需要进一步的优化。因此，需要合适的报告系统来进行这些优化工作。
当前的细胞报告系统通常以EGFP蛋白为示踪分子，但EGFP存在稳定性不够高，而如果整合到细胞中，也存在表达效率低从而导致荧光强度弱的问题。对于基因治疗的研究，存在很多疗效时长的研究，而对于长时间的跟踪观察，EGFP的稳定性不够高也常常会对研究结果造成影响。
因此，亟需一种稳定性强的荧光报告系统。
发明内容
基于此，本申请一个或者多个实施例提供了一种荧光报告细胞系及其构建方法。技术方案包括：
本申请的一方面提供了一种荧光报告细胞系的构建方法，包括以下步骤：
构建重组病毒表达质粒，所述重组病毒表达质粒包括从5’端至3’端依次为Albumin上游同源臂序列、剪切序列、staygold基因序列、筛选基因序列和Albumin下游同源臂序列的核酸片段；
对所述重组病毒表达质粒进行病毒质粒包装，利用所述重组病毒表达质粒与病毒包装质粒染宿主细胞，构建表达staygold细胞系；
经过抗性筛选后得到荧光报告细胞系。
在其中一个实施例中，构建重组病毒表达质粒的步骤包括：
构建staygold荧光蛋白表达载体，获取staygold基因；
将staygold基因与载体pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro连接，构建重组病毒表达质粒。
在其中一个实施例中，扩增staygold基因的正向引物如SEQIDNO:1所示，扩增staygold基因的反向引物如SEQIDNO:2所示。
在其中一个实施例中，所述重组病毒表达质粒中Albumin上游同源臂序列为如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，Albumin下游同源臂序列为如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。
在其中一个实施例中，staygold基因与载体pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro连接的步骤包括：
添加BamH1酶，酶切载体pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro，得到pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro骨架片段；
将staygold基因片段和所述pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro骨架片段同源重组成重组病毒表达质粒。
在其中一个实施例中，所述病毒包括SARS-COV-2、肝炎病毒、腺病毒、慢病毒载体或腺相关病毒中的至少一种。
在其中一个实施例中，病毒包装质粒包括pCMV-dR8.91和pCMV-VSV-G中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述宿主细胞包括AML12细胞。
在其中一个实施例中，抗性筛选的步骤包括利用嘌呤霉素进行筛选，获得荧光报告细胞系。
本申请在构建表达载体时，以重组病毒为载体，将其感染宿主细胞，筛选获得能稳定表达staygold蛋白的细胞系，staygold绿色荧光蛋白作为示踪分子，方便目的蛋白表达的检测，且在staygold绿色荧光蛋白前引入白蛋白（Albumin）定位序列，将staygold蛋白插入到Albumin，使其可以特异性地在肝实质细胞中表达，构建一种可以在肝细胞中特异表达的，荧光稳定的接近体内肝实质细胞生理特性的荧光报告细胞系。本申请的荧光报告细胞系能够稳定表达staygold绿色荧光，解决了瞬时转染实验中示踪分子稳定性不够高的缺点，此外，本申请选择同源重组的方法，把目标示踪分子插入到肝细胞特异表达的白蛋白（Albumin），使得示踪分子可以特异性的在肝实质细胞中表达，为后续肝细胞基因编辑提供样板。
本申请另一方面提供了一种荧光报告细胞系，采用上述的荧光报告细胞系的构建方法构建得到。
附图说明
图1为本申请实施例1中pSin-staygold -Ires-Puro质粒构建结果图，其中，图1中A为pSin-staygold -Ires-Puro质粒结构图，图1中B为pSin-staygold -Ires-Puro质粒构建结果图，图1中C为pSin-staygold -Ires-Puro质粒PCR鉴定结果，图1中D为pSin-staygold -Ires-Puro质粒测序鉴定结果；
图2为本申请实施例1中Staygold蛋白荧光稳定性检测结果图，其中，图2中A为EGFP,sfGFP,staygold蛋白荧光强度对比图，图2中B为EGFP，sfGFP，staygold蛋白冷淬灭抗性对比图，图2中C为EGFP，sfGFP，staygold蛋白紫外照射淬灭抗性对比图；
图3为本申请实施例1中构建pX601-Alb-staygold -Ires-Puro质粒结果图，其中，图3中A为pX601-Alb-staygold-Ires-Puro质粒结构图，图3中B为pX601-Alb-staygold-Ires-Puro质粒构建结果图，图3中C为pX601-Alb-staygold-Ires-Puro质粒PCR鉴定结果，图3中D为pX601-Alb-staygold-Ires-Puro质粒测序鉴定结果；
图4为本申请实施例1中AML12细胞鉴定和AAV-DJ感染测试结果图，其中，图4中A为AML12细胞白蛋白的蛋白表达水平检测结果图，图4中B为AML12 AAV-DJ病毒感染效率，横坐标为绿色荧光细胞数量，纵坐标为荧光强度；
图5为本申请实施例1中AAV-DJ-Alb-staygold -Ires-Puro病毒感染AML细胞结果图，其中，图5中A为筛选到的AML12-Alb-staygold细胞，图5中B为AML12-Alb-staygold细胞PCR鉴定示意图，图5中C为AML12-Alb-staygold细胞PCR鉴定结果图。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
在本发明中术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或 P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用于外源DNA转移的常规的基于病毒的系统包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关和单纯疱疹病毒载体；上述病毒通常是复制缺陷的。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点（IRES）和其他表达控制元件（例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等）。
本申请一实施方式提供了一种荧光报告细胞系的构建方法，包括步骤S100~步骤S300。
步骤S100：构建重组病毒表达质粒，所述重组病毒表达质粒包括从5’端至3’端依次为Albumin上游同源臂序列、剪切序列、staygold基因序列、筛选基因序列和Albumin下游同源臂序列的核酸片段。
在其中一些实施例中，上述剪切序列包括T2A序列。
在其中一些实施例中个，上述筛选基因序列包括Puro序列。
具体地，构建重组病毒表达质粒的步骤包括步骤S110~步骤S120。
步骤S110：构建staygold荧光蛋白表达载体，获取staygold基因。
在其中一些实施例中，扩增staygold基因的正向引物如SEQ ID NO:1所示，扩增staygold基因的反向引物如SEQ ID NO:2所示。
具体地，如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为：5'-CCCTGGACCTGGATCCATGCTGCTGCCCGT-3'；如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为：5'-AGATGCATGCGGATCTTACAGTTCATCCTTCACGGCAG-3'。
在其中一些实施例中，重组病毒表达质粒中Albumin上游同源臂序列为如SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列，Albumin下游同源臂序列为如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
具体地，如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为SEQ ID NO:3：5'-CTCCTACACAGCCAAGATTCCTAAGTTGGCAGTGGCATGCTTAATCCTCAAAGCCAAAGTTACTTGGCTCCAAGATTTATAGCCTTAAACTGTGGCCTCACATTCCTTCCTATCTTACTTTCCTGCACTGGGGTAAATGTCTCCTTGCTCTTCTTGCTTTCTGTCCTACTGCAGGGCTCTTGCTGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCTACAGCGGAGCAACTGAAGACTGTCATGGATGACTTTGCACAGTTCCTGGATACATGTTGCAAGGCTGCTGACAAGGACACCTGCTTCTCGACTGAGGTCAGAAACGTTTTTGCATTTTGACGATGTTCAGTTTCCATTTTCTGTGCACGTGGTCAGGTGTAGCTCTCTGGAACTCACACACTGAATAACTCCACCAATCTAGATGTTGTTCTCTACGTAACTGTAATAGAAACTGACTTACGTAGCTTTTAATTTTTATTTTCTGCCACACTGCTGCCTATTAAATACCTATTATCACTATTTGGTTTCAAATTTGTGACACAGAAGAGCATAGTTAGAAATACTTGCAAAGCCTAGAATCATGAACTCATTTAAACCTTGCCCTGAAATGTTTCTTTTTGAATTGAGTTATTTTACACATGAATGGACAGTTACCATTATATATCTGAATCATTTCACATTCCCTCCCATGGCCTAACAACAGTTTATCTTCTTATTTTGGGCACAACAGATGTCAGAGAGCCTGCTTTAGGAATTCTAAGTAGAACTGTAATTAAGCAATGCAAGGCACGTACGTTTACTATGTCATTGCCTATGGCTATGAAGTGCAAATCCTAACAGTCCTGCTAATACTTTTCTAACATCCATCATTTCTTTGTTTTCAGGGTCCAAACCTTGTCACTAGATGCAAAGACGCCTTAGCC-3'；如SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列为：5'-ACACATCACAACCACAACCTTCTCAGGTAACTATACTTGGGACTTAAAAAACATAATCATAATCATTTTTCCTAAAACGATCAAGACTGATAACCATTTGACAAGAGCCATACAGACAAGCACCAGCTGGCACTCTTAGGTCTTCACGTATGGTCATCAGTTTGGGTTCCATTTGTAGATAAGAAACTGAACATATAAAGGTCTAGGTTAATGCAATTTACACAAAAGGAGACCAAACCAGGGAGAGAAGGAACCAAAATTAAAAATTCAAACCAGAGCAAAGGAGTTAGCCCTGGTTTTGCTCTGACTTACATGAACCACTATGTGGAGTCCTCCATGTTAGCCTAGTCAAGCTTATCCTCTGGATGAAGTTGAAACCATATGAAGGAATATTTGGGGGGTGGGTCAAAACAGTTGTGTATCAATGATTCCATGTGGTTTGACCCAATCATTCTGTGAATCCATTTCAACAGAAGATACAACGGGTTCTGTTTCATAATAAGTGATCCACTTCCAAATTTCTGATGTGCCCCATGCTAAGCTTTAACAGAATTTATCTTCTTATGACAAAGCAGCCTCCTTTGAAAATATAGCCAACTGCACACAGCTATGTTGATCAATTTTGTTTATAATCTTGCAGAAGAGAATTTTTTAAAATAGGGCAATAATGGAAGGCTGCGGCCGC-3'。
可理解，在staygold绿色荧光蛋白前引入白蛋白（Albumin）定位序列，将staygold蛋白插入到Albumin 13号外显子到14号外显子之间，使其可以特异性地在肝实质细胞中表达，构建一种可以在肝细胞中特异表达的，荧光稳定的接近体内肝实质细胞生理特性的荧光报告细胞系。
步骤S120：将staygold基因与载体pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro连接，构建重组病毒表达质粒。
具体地，staygold基因与载体pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro连接的步骤包括步骤S121~步骤S122。
步骤S121：添加BamH1酶，酶切载体pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro，得到pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro骨架片段。
步骤S122：将staygold基因片段和pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro骨架片段同源重组成重组病毒表达质粒。
步骤S200：对重组病毒表达质粒进行病毒质粒包装，利用重组病毒表达质粒与病毒包装质粒构建表达staygold细胞系。
在其中一些实施例中，上述病毒包括SARS-COV-2、肝炎病毒、腺病毒、慢病毒载体或腺相关病毒中的至少一种。
在一具体示例中，上述病毒包装质粒包括pCMV-dR8.91和pCMV-VSV-G中的至少一种。
在其中一些实施例中，对重组病毒表达质粒进行病毒质粒包装，利用重组病毒表达质粒与病毒包装质粒染宿主细胞，构建表达staygold细胞系的步骤包括步骤S210~步骤S220。
步骤S210：将重组病毒表达质粒与病毒包装质粒构建AAV-DJ-Alb-staygold-Ires-Puro病毒。
步骤S220：将AAV-DJ-Alb-staygold-Ires-Puro病毒感染宿主细胞后，得到表达staygold细胞系。
在其中一些实施例中，上述宿主细胞包括AML12细胞。
步骤S300：经过抗性筛选后得到荧光报告细胞系。
在其中一些实施例中，上述抗性筛选的步骤包括利用嘌呤霉素进行筛选，获得荧光报告细胞系。
本申请在构建表达载体时，以重组病毒为载体，将其感染宿主细胞，筛选获得能稳定表达staygold蛋白的细胞系，staygold绿色荧光蛋白作为示踪分子，方便目的蛋白表达的检测，且在staygold绿色荧光蛋白前引入白蛋白（Albumin）定位序列，将staygold蛋白插入到Albumin，使其可以特异性地在肝实质细胞中表达，构建一种可以在肝细胞中特异表达的，荧光稳定的接近体内肝实质细胞生理特性的荧光报告细胞系。此外，本申请选择同源重组的方法，把目标示踪分子插入到肝细胞特异表达的白蛋白（Albumin），使得示踪分子可以特异性的在肝实质细胞中表达，为后续肝细胞基因编辑提供样板。
本申请一实施方式还提供一种荧光报告细胞系，采用上述的荧光报告细胞系的构建方法构建得到。
上述荧光报告细胞系能够稳定表达staygold绿色荧光，解决了瞬时转染实验中示踪分子稳定性不够高的缺点。
下面将结合具体实施例和对比例对本申请作进一步说明，但不应将其理解为对本申请保护范围的限制。以下具体实施例中所涉及的原料，若无特殊说明，均可来源于市售，所使用的仪器，若无特殊说明，均可来源于市售，所涉及到的工艺，如无特殊说明，均为本领域技术人员常规选择。
实施例1
1、pSin-staygold -Ires-Puro质粒构建
（1）合成er-(n2)oxStayGold基因片段，并克隆到pUC57载体上。
① 合成er-(n2)oxStayGold基因片段委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。er-(n2)oxStayGold基因序列为SEQ ID NO:5，具体地，如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为：5'- GAATTCGCCACCATGCTGCTGCCCGTCCCCCTGCTGCTGGGCCTGCTGGGCGCCGCCGCGGATCCGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTTACAGGCGTGACCCCCTTCAAGTTCCAGCTGAAGGGCACCATCAACGGCAAGAGCTTCACCGTGGAAGGCGAGGGCGAGGGCAATAGCCACGAGGGCAGCCACAAAGGCAAGTACGTGTGCACCAGCGGCAAACTGCCAATGTCTTGGGCCGCCCTGGGAACTAGCTTCGGCTATGGCATGAAGTACTACACCAAGTACCCCAGCGGCCTGAAGAACTGGTTCCACGAGGTGATGCCCGAGGGCTTCACCTACGACAGACACATCCAGTACAAGGGCGACGGCAGCATCCACGCCAAGCACCAGCACTTCATGAAGAACGGCACCTACCACAACATCGTGGAGTTCACCGGCCAGGACTTCAAGGAGAACAGCCCCGTGCTGACCGGCGACATGAACGTGAGCCTGCCCAACGAGGTGCAGCACATCCCCAGAGATGACGGCGTGGAGTGCCCAGTGACCCTGCTGTACCCTCTGCTGAGCGACAAGAGCAAGTGCGTGGAGGCCTACCAGAACACCATCATCAAGCCCCTGCACAATCAGCCAGCCCCCGATGTGCCATACCACTGGATCAGAAAGCAGTACACCCAGAGCAAGGACGACACCGAGGAGAGAGACCACATCATCCAGAGCGAGACCCTGGAGGCCCACCTGCCATGGCACGAGCCTTCTGCTTCTGCCGTGAAGGATGAACTGTAAAGATCT-3'。
② PCR扩增的反应程序如表1所示：
表1
琼脂糖凝胶电泳回收802bp er-(n2)oxStayGold PCR片段。
克隆到pUC57载体的条件为：
③ pUC57载体空质粒EcoR1，Bgl2酶切，酶切体系如下表2所示：
表2
37℃酶切过夜，利用琼脂糖凝胶电泳回收2703bp pUC57载体空质粒EcoR1，Bgl2酶切片段。
④ er-(n2)oxStayGold PCR片段EcoR1，Bgl2酶切，酶切体系如下表3所示：
表3
37℃酶切过夜，利用琼脂糖凝胶电泳回收793bp er-(n2)oxStayGold EcoR1,Bgl2酶切片段。
⑤ pUC57载体空质粒EcoR1,Bgl2酶切片段与er-(n2)oxStayGold EcoR1，Bgl2酶切片段连接如下表4所示：
表4
25℃连接2小时。
⑥ 将上述连接产物转化到DH10b感受态细菌中，氨苄抗性平板培养，挑取单克隆菌落。
（2）提取pUC57-staygold质粒，EcoR1，Bgl2酶切，回收793bp的staygold片段1；
其中，酶切体系如下表5所示：
表5
37℃酶切过夜，利用琼脂糖凝胶电泳回收793bp的staygold片段。
提取pSin-EGFP-Ires-Puro质粒，使用EcoR1，BamH1酶切，回收7506bp载体骨架。
其中，酶切体系如下表6所示：
表6
37℃酶切过夜，利用琼脂糖凝胶电泳回收7506bp载体骨架。
（3）将staygold片段和pSin-EGFP -Ires-Puro载体骨架连接，转化涂板，挑克隆鉴定，取阳性克隆提质粒测序。
其中，连接转化体系如下表7所示：
表7
25℃连接2小时，将连接产物转化到DH10b感受态细菌中，氨苄抗性平板培养，挑取单克隆菌落进行鉴定。
其中，PCR鉴定体系如下表8所示：
表8
结果如图1所示，图1中A为pSin-staygold -Ires-Puro质粒结构图，图1中B为pSin-staygold -Ires-Puro质粒构建结果图，其中方框内从左至右依次为7506bp载体骨架片段和793bp staygold片段，图1中C为pSin-staygold -Ires-Puro质粒PCR鉴定结果，图1中D为pSin-staygold -Ires-Puro质粒测序鉴定结果，测序鉴定质粒构建正确。
2、Staygold蛋白荧光稳定性检测
（1）将pSin-EGFP-Ires-Puro，pSin-sfGFP-Ires-Puro，pSin-staygold-Ires-Puro质粒分别转染到Hela细胞中，48小时后制作各两份细胞爬片并用荧光显微镜观察。
转染的具体步骤为：Hela细胞铺到24孔板中，每孔50000个，24小时后转染，转染体系如下表9所示：
表9
上述转染体系配好后静置15min，加入Hela细胞中。
（2）荧光显微镜观察荧光蛋白表达情况，一份细胞爬片放-20℃冷冻保存10天后观察荧光情况。
（3）一份细胞爬片分别用荧光显微镜的FITC激发光照射1min，10min，30min后观察荧光情况。
结果如图2所示，图2中A为EGFP,sfGFP,staygold蛋白荧光强度对比图，图2中B为EGFP，sfGFP，staygold蛋白冷淬灭抗性对比图，图2中C为EGFP，sfGFP，staygold蛋白紫外照射淬灭抗性对比图，由图2可知，staygold蛋白相比较于EGFP和sfGFP蛋白荧光强度更强更均匀，对冷淬灭和紫外照射淬灭抵抗性更强，稳定性更好。
3、构建pX601-Alb-staygold -Ires-Puro质粒
（1）PCR扩增staygold片段2，跑胶回收808bp片段。
扩增staygold片段2的体系如下表10所示：
表10
（2）BamH1酶切pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro质粒，跑胶回收5776 bp骨架片段。
其中，酶切体系如下表11所示：
表11
37℃酶切过夜。
（3）将staygold片段2和pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro骨架片段同源重组成新质粒，转化入DH10b感受态细菌涂氨苄抗性LB平板，挑克隆进行PCR鉴定，取阳性克隆提质粒测序。
重组体系如下表12所示：
表12
50℃重组20min。
结果如图3所示，图3中A为pX601-Alb-staygold-Ires-Puro质粒结构图，图3中B为pX601-Alb-staygold-Ires-Puro质粒构建结果图，图3中C为pX601-Alb-staygold-Ires-Puro质粒PCR鉴定结果，图3中D为pX601-Alb-staygold-Ires-Puro质粒测序鉴定结果，测序鉴定质粒构建正确。
4、将pX601-Alb-staygold -Ires-Puro质粒包装成AAV-DJ病毒。
质粒包装AAV-DJ病毒委托和元生物（上海）有限公司完成。
5、AML12细胞鉴定和AAV-DJ感染测试。
（1）提取AML12细胞蛋白，Western blot检测其白蛋白的表达情况。
Western blot检测的步骤为：
①.提取小鼠肝脏和AML12细胞总蛋白。
②.12%分离胶，5%浓缩胶电泳80V 20min+150V 90min。
③.转膜：0.3A 90min。
④.封闭：5%脱脂牛奶60 min。
⑤.一抗：Actin（1：2000），Albumin （1：500）4°过夜。TBST洗3次，15min/次。
⑥. 二抗： M（1：5000）， R（1：5000）摇床2h， TBST洗3次，15min/次。
⑦.曝光
（2）将AAV-DJ-EGFP病毒分别以MOI2000，10000感染AML12细胞，检测其感染效率。
将AAV-DJ-EGFP病毒用AML12细胞培养基按MOI2000，MOI10000的比例稀释，再将稀释好的病毒培养基替代原AML12细胞培养基，继续培养细胞48小时。
结果如图4所示，图4中A为AML12细胞白蛋白的蛋白表达水平检测结果图，图4中B为AML12 AAV-DJ病毒感染效率，横坐标为绿色荧光细胞数量，纵坐标为荧光强度，由图4可知，在AML12细胞中有较多的白蛋白表达，可以针对Albumin位点设计插入基因。AAV-DJ-EGFP病毒感染AML12细胞，在MOI 2000和10000时有50%-70%的感染效率，实验时可继续提高MOI。
6、AAV-DJ-Alb-staygold -Ires-Puro病毒感染AML细胞，筛选细胞株。
（1）AAV-DJ-Alb-staygold -Ires-Puro病毒分别以MOI2000，10000，20000，50000感染AML12细胞。
将AAV-DJ-Alb-staygold -Ires-Puro病毒用AML12细胞培养基按MOI2000，10000，20000，50000的比例稀释，再将稀释好的病毒培养基替代原AML12细胞培养基，继续培养细胞48小时。
（2）感染48小时后加入1 μg/mL的嘌呤霉素筛选，直到筛选到单克隆细胞。
将1 mg/mL的嘌呤霉素母液用AML12细胞培养基按1：1000的比例稀释成含1 μg/mL的嘌呤霉素AML12细胞培养基，加入感染细胞中持续培养，直到有能挑取的细胞单克隆长出。
（3）设计Alb上游和下游的PCR引物鉴定筛选到的细胞克隆。
嘌呤霉素筛选得到几个细胞单克隆，荧光显微镜下呈现绿色，针对Alb同源臂上游和下游设计鉴定引物，提取获得的细胞克隆基因组DNA，PCR鉴定可得阳性条带，细胞克隆正确。
其中，获得的细胞克隆基因组DNA的提取方法具体为：培养的AML12细胞和AML12-Alb-staygold细胞克隆胰酶消化后离心获取细胞沉淀，加入100μL DNA directlysisbuffer (10 mM Tris pH 7.0, 0.05% SDS,25μg/ml 蛋白酶K),裂解程序为37℃ 60min，85℃ 10min。产物加入10μL 3M醋酸钠（ph5.2）混匀，再加入300μL预冷的无水乙醇，混匀-20℃静置10 min，4℃ 12000rpm离心10 min，去上清，加入50μL H2O溶解。
PCR鉴定的体系如下表13所示：
表13
结果如图5所示，图5中A为筛选到的AML12-Alb-staygold细胞，图5中B为AML12-Alb-staygold细胞PCR鉴定示意图，图5中C为AML12-Alb-staygold细胞PCR鉴定结果图，嘌呤霉素筛选得到几个细胞单克隆，荧光显微镜下呈现绿色，针对Alb同源臂上游和下游设计鉴定引物，提取获得的细胞克隆基因组DNA，PCR鉴定可得阳性条带，细胞克隆正确。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种荧光报告细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建重组病毒表达质粒，所述重组病毒表达质粒包括从5’端至3’端依次为Albumin上游同源臂序列、剪切序列、staygold基因序列、筛选基因序列和Albumin下游同源臂序列的核酸片段；
对所述重组病毒表达质粒进行病毒质粒包装，利用所述重组病毒表达质粒与病毒包装质粒感染宿主细胞，构建表达staygold细胞系；
经过抗性筛选后得到荧光报告细胞系。
2.根据权利要求1所述的荧光报告细胞系的构建方法，其特征在于，构建重组病毒表达质粒的步骤包括：
构建staygold荧光蛋白表达载体，获取staygold基因；
将staygold基因与载体pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro连接，构建重组病毒表达质粒。
3.根据权利要求2所述的荧光报告细胞系的构建方法，其特征在于，扩增staygold基因的正向引物如SEQ ID NO:1所示，扩增staygold基因的反向引物如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求2所述的荧光报告细胞系的构建方法，其特征在于，所述重组病毒表达质粒中Albumin上游同源臂序列为如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，Albumin下游同源臂序列为如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求2所述的荧光报告细胞系的构建方法，其特征在于，staygold基因与载体pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro连接的步骤包括：
添加BamH1酶，酶切载体pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro，得到pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro骨架片段；
将staygold基因片段和所述pX601-Alb-sfGFP-Ires-Puro骨架片段同源重组成重组病毒表达质粒。
6.根据权利要求1~5任一项所述的荧光报告细胞系的构建方法，其特征在于，所述病毒包括SARS-COV-2、肝炎病毒、腺病毒、慢病毒载体或腺相关病毒中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的荧光报告细胞系的构建方法，其特征在于，病毒包装质粒包括pCMV-dR8.91和pCMV-VSV-G中的至少一种。
8.根据权利要求1~5任一项所述的荧光报告细胞系的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞包括AML12细胞。
9.根据权利要求1~5任一项所述的荧光报告细胞系的构建方法，其特征在于，抗性筛选的步骤包括利用嘌呤霉素进行筛选，获得荧光报告细胞系。
10.一种荧光报告细胞系，其特征在于，采用权利要求1~9任一项所述的荧光报告细胞系的构建方法构建得到。
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