CN108220252B

CN108220252B - 一种传染性脾肾坏死病毒orf022基因缺失株及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108220252B
Application number: CN201810209599.8A
Authority: CN
Inventors: 何建国; 郭长军; 曾若云; 林易凡; 翁少萍; 何键
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-03-14
Filing date: 2018-03-14
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2038-03-14
Also published as: CN108220252A

Abstract

本发明提供了一种传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株及其制备方法和应用，为传染性脾肾坏死病毒株缺失ORF022基因后制成的减毒病毒株。本发明还提供了一种带筛选标记的传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株及其制备方法和应用，为传染性脾肾坏死病毒缺失了ORF022基因，且在基因缺失的部位通过同源重组插入筛选标记基因后制成的减毒病毒株。本发明提供的传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株是一种敲除了ORF022基因的重组基因工程疫苗，毒力较弱，大大降低被免疫的鱼类发病致死率，采用浸泡免疫即可达到显著的免疫效果，无须注射，应用价值极大。

Description

一种传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及水产养殖疾病防控领域，具体涉及一种传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株及其制备方法和应用。

背景技术

传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）是肿大病毒属的代表种。ISKNV感染主要宿主鳜鱼后引起传染性疾病，并导致鳜鱼大批死亡，是我国鳜鱼养殖业发展的一大障碍，因此成为我国水产学者的重要研究对象。ISKNV全基因的组核酸序列已经测定，其全长为111362 bp，G+C含量在54.78%，包含124个潜在的开放阅读框（ORF），编码长度从40到1208个氨基酸。通过序列分析，目前推测出ORF006L为主衣壳蛋白；ORF19R、ORF46L、ORF27L和ORF63L与DNA复制、修饰和加工有关；ORF24、ORF28L、ORF34R、ORF64L及ORF87R与转录和核苷酸代谢有关；ORF111L和ORF048R与宿主相互作用有关；ORF12、ORF65、ORF66、ORF99和ORF111L编码环指蛋白。

通过对ISKNV全基因组进行生物信息学分析，发现ORF022编码的蛋白的C端含有一个macro结构域。Macro结构域是一个古老的，进化上高度保守的结构域，广泛存在于所有类别的生物中，这预示着它在生物体内具有基础性的作用。“Macro 折叠”大小约为25 kDA，包括一个混合的α-β折叠，与包含P-loop的核苷酸三磷酸盐水解酶具有相似性。它们的功能是作为NAD⁺代谢物的结合模块，包括ADP核糖（ADPR）和多聚ADP-核糖（PAR）。蛋白，包括组蛋白的多聚ADP核糖基化是一种原始的翻译后修饰，由PAR聚合酶（PARP）介导，PARP催化ADPR单元共价结合到目标蛋白上，形成PAR链。PARP本身也可多聚ADP核糖基化（如PARP-1）。除了保守的macro结构域，macro结构域蛋白还含有各种不同的其他结构域，使他们可以与特定的目标蛋白相互作用，或者将他们定位到特定的核酸区域上。因此，macro结构域蛋白可视为分子桥梁，连接目标蛋白（通过与蛋白中不同结构域的相互作用），和NAD+的代谢因子，包括PAR（通过与保守的macro结构域结合）。目前的研究表明，多聚ADP核糖基化的macro结构域蛋白可能是染色质相关的各种生物活动的协调者，包括生长发育、DNA修复和染色质重塑等。

目前用于预防控制传染性脾肾坏死病毒的ISKNV疫苗主要为细胞灭活疫苗。细胞灭活疫苗具有安全性好、免疫原性强、保护率高、研发周期短等优点，成为最常用的疫苗种类，但灭活疫苗只能引起体液免疫，免疫应答类型较单一，免疫维持时间较短，需要多次接种且接种量大等缺点。现在许多文献已经报道了基因缺失减毒活疫苗可以有效、安全地起到保护的效果，减毒活疫苗可诱发体液免疫和细胞免疫，免疫应答类型较全面，免疫维持时间较长，接种次数少且接种量小等优点成为目前ISKNV疫苗的研究新热点。而目前以ISKNVORF022基因缺失株作为基因缺失减毒活疫苗的研究未有报道。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供一种免疫效果好、使用便捷、应用性强、无须注射的传染性脾肾坏死病毒疫苗及其制备方法和应用。在野生性传染性脾肾坏死病毒的基因组中敲除了ORF022基因，构建了ORF022基因缺失病毒（ISKNV△ORF022）。相比传统疫苗的免疫方式，浸泡免疫是基因缺失疫苗的最大优势，这是鱼类病毒性疫苗免疫方式的重大创新，具有广阔的应用空间。

本发明第一方面提供了一种传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株，为传染性脾肾坏死病毒株缺失ORF022基因后制成的减毒病毒株。

优选地，所述ORF022基因序列为与SEQ ID NO：1所示序列具有至少 90％、至少95％、至少 98％、至少 99％或100%同源性的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供了一种带筛选标记的传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株，为传染性脾肾坏死病毒缺失了ORF022基因，且在基因缺失的部位通过同源重组分别插入第一筛选基因和第二筛选基因后制成的减毒病毒株。

优选地，所述ORF022基因序列为与SEQ ID NO.1所示序列具有至少 90％、至少95％、至少 98％、至少 99％或100%同源性的核苷酸序列。

优选地，所述第一筛选基因和第二筛选基因不同，且分别独立地选自插入红色荧光蛋白基因以及抗性筛选基因。

进一步优选地，所述红色荧光蛋白基因为DsRed2蛋白基因。

进一步优选地，所述抗性筛选基因为嘌呤霉素抗性筛选基因。

第三方面，本发明提供了一种传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株的构建方法，包括：分离并鉴定传染性脾肾坏死病毒株；再通过同源重组的方法将传染性脾肾坏死病毒株的ORF022基因进行缺失，获得传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株；

第四方面，本发明提供了一种带筛选标记的传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株的构建方法，包括：分离并鉴定传染性脾肾坏死病毒株；再通过同源重组的方法将传染性脾肾坏死病毒株的ORF022基因进行缺失，并在基因缺失的部位分别插入第一筛选基因和第二筛选基因，获得传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株。

进一步优选地，所述红色荧光蛋白基因为DsRed2蛋白基因。

优选地，所述构建方法具体包括：

a）改造筛选基因

将第一筛选基因克隆到pUC19载体的多克隆位点，获得第一pUC19重组载体；再将第二筛选基因克隆到第一pUC19重组载体的多克隆位点，获得第二pUC19重组载体；

b）转移载体的构建

重组ORF022基因缺失病毒转移载体的构建：以ISKNV株基因组DNA 为模板，通过PCR获得ORF022的上臂基因和ORF022的下臂基因；将所得ORF022的上臂基因和ORF022的下臂基因，克隆到步骤a）所制备的第二pUC19重组载体中，得到第三pUC19重组载体中，所得第三pUC19重组载体中，第一筛选基因、第二筛选基因位于ORF022的上臂基因和ORF022的下臂基因之间；

c）同源重组

使用构建好的ORF022重组转移载体转染鳜鱼细胞，在转染后加入ISKNV病毒液攻毒，收集发病的细胞，得到含ISKNV△ORF022与野生型ISKNV混合的病毒液；采用有限稀释法纯化病毒液，获得ISKNV△ORF022重组病毒。

进一步优选地，所述步骤c）采用有限稀释法纯化5-10代获得ISKNV△ORF022重组病毒。

更进一步优选地，所述步骤c）采用有限稀释法纯化5-10代获得ISKNV△ORF022基因缺失株具体包括：

将所得的含ISKNV△ORF022与野生型ISKNV混合病毒液反复冻融3-5次，滤膜过滤除菌，稀释后感染健康的鳜鱼细胞，发病后挑选同时表达第一筛选基因和第二筛选基因的细胞，稀释后感染健康的鳜鱼细胞，继续培养、观察；

等培养的细胞发病后，挑选同时表达第一筛选基因和第二筛选基因的细胞，稀释后感染健康的鳜鱼细胞，继续培养、观察；如此反复，利用有限稀释的方法纯化5-10代，获得纯化的ISKNV△ORF022基因缺失株。

第五方面，本发明提供了一种传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失重组病毒疫苗，包括第一方面所述的传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株或第二方面所述的带筛选标记的传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株。

优选地，所述传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失重组病毒疫苗还包括药学上接受的诊断剂、载剂、赋形剂或稀释剂。

第六方面，本发明提供了一种第一方面所述的传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株或第二方面所述的带筛选标记的传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株按下述一种或多种方法进行应用：

（1）将所述传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株单独进行应用；

（2）将所述传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株与一种或几种疫苗联合应用；

（3）采用浸泡的方式将所述传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株投放至养殖水体进行应用；

（4）采用投喂的方式将所述传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株投放至养殖水体进行应用。

第七方面，本发明提供了一种第一方面所述的传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株或第二方面所述的带筛选标记的传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株在制备诊断、预防、治疗肿大细胞病毒疾病的试剂或药物中的应用。

优选地，所述的肿大细胞病毒包括鳜传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、条石鲷虹彩病毒、海鲈虹彩病毒、大黄鱼病毒、台湾石斑鱼虹彩病毒、斜带石斑鱼虹彩病毒中的一种或多种。

本发明有益效果：

本发明构建了传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株，毒株经过纯化后即获得有免疫原性的重组基因工程疫苗。

本发明提供的重组基因工程疫苗是一种具有良好免疫原性的减毒疫苗，能够诱发鱼类更好的产生免疫反应，具有免疫的效果。此外，重组基因工程疫苗能够诱发被免疫鱼类长期而有效的产生特异性抗体。其次，相比其他种类的疫苗，重组基因工程疫苗有着免疫率高的优点，在生产应用中能够达到更好的免疫效果。

更重要的是，重组基因工程疫苗因具备一定的病毒学活性，在免疫方式上更便捷，可以采用浸泡免疫的方法，使病毒从鳃或消化道进入鱼体内，发挥免疫原性，诱导鱼类产生免疫反应。可在生产应用中节省大量成本。同时，由于本发明构建的重组基因工程疫苗敲除了ORF022基因，所以毒力变弱，降低导致被免疫的鱼类发病死亡的机率，从而达到较好的免疫效果。

本发明提供的重组基因工程疫苗制备方法简单：在ISKNV野生性病毒株的基础上，以DsRed2红色荧光蛋白基因以及嘌呤霉素抗性筛选基因作为筛选标记，利用基因工程技术构建含有ORF022基因重组臂的重组转移载体，利用转染技术使重组转移载体和野生型病毒在鳜鱼细胞中进行同源重组，敲除野生型中的ORF022基因，获得ISKNV△ORF022的病毒悬液，再通过有限稀释法纯化ISKNV△ORF022病毒株，最后利用细胞培养技术扩大培养缺失病毒株，提纯制成重组基因工程疫苗。

附图说明

图1为ORF022重组转移载体pUC19-RP图谱；

图2为ORF022重组转移载体pUC19-RP的鉴定结果，其中，各个泳道从左至右分别为1：1 kb marker，2：DsRed2基因-puro基因的双酶切鉴定结果，3：ORF022上臂的双酶切鉴定结果，4：ORF022下臂的双酶切鉴定结果，ORF022下臂有KpnⅠ酶切位点，因此酶切出3条条带；

图3为放大倍数为100倍的倒置荧光显微镜下观察ISKNV△ORF022感染的鳜鱼细胞红光发光情况；

图4为 PCR鉴定重组病毒ORF022基因的一扩结果，各个泳道从左至右分别为：泳道1：ISKNV MCP阴性对照，泳道2：ISKNV MCP阳性对照，泳道3：ORF022敲除株MCP扩增结果，泳道4：DS2000 marker，泳道5：ISKNV ORF022阴性对照，泳道6：ISKNV ORF022阳性对照，泳道7：ORF022敲除株检测结果；

图5 为PCR鉴定重组病毒ORF022基因的二扩结果；各个泳道从左至右分别为：泳道1： DS2000 marker，泳道2：ISKNV ORF022阴性对照，泳道3：ISKNV ORF022阳性对照，泳道4：ORF022敲除株检测结果；

图6为ORF022基因缺失重组病毒攻毒存活率实验结果图，显示与野生型病毒相比，基因缺失重组病毒攻毒毒性明显降低；

图7为ORF022基因缺失重组病毒攻毒保护率实验结果图，显示ORF022基因缺失重组病毒攻毒后使鳜鱼对野生型病毒产生较好的免疫能力。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。

本发明实施例提供了一种传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失重组病毒疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1. 构建带DsRed2基因的pUC19-Red载体

利用pDsRed-Monomer-N1 Vector，分别设计：

左右引物：

RFP-F：5’-ATAGTAATCAATTACGGGGT-3’（ SEQ ID NO.2），

RFP-R：5’-TGATGAGTTTGGACAAACCA-3’（ SEQ ID NO.3），

重叠PCR（Overlap）引物：

RFP-OL-F：5’-CAGATCCGCTAGCGCTCGCCACCATGGACAACACCG-3’（SEQ ID NO.4），

RFP-OL-R: 5’-GTTGTCCATGGTGGCGAGCGCTAGCGGATCTGACGG-3’（SEQ ID NO.5），

利用Overlap技术删除原有DsRed2载体中的多克隆位点序列（第591 bp至第671bp的碱基序列，便于连接入新的重组转移载体）。Overlap PCR的第一次扩增分别扩增出DsRed2载体碱基序号9-591 bp和671-1590 bp的两段序列。使用TOYOBO公司的Kod Fx聚合酶系统，其PCR体系具体为：

试剂	用量（共50 μL体系）单位：μL
		Kod Fx DNA热稳定聚合酶	1
2×Kod Buffer	25
		无菌水	10
dNTPs	10
		RFP-F/RFP-OL-R	1.5
RFP-OL-F/RFP-R	1.5
		DsRed2模板	1

变性温度95℃，时间30 s，退火温度50℃，时间30 s，延伸温度62℃，延伸时间30s，进行30个循环。

PCR产物加入10 μL的6×DNA电泳Loading Buffer，混匀后电泳鉴定并进行胶回收。之后以第一次扩增的回收产物作为模板进行第二次扩增，第二次扩增体系为：

试剂	用量（共50 μL体系）单位：μL
		Kod Fx DNA热稳定聚合酶	1
2×Kod Buffer	25
		无菌水	9
dNTPs	10
		RFP-F	1.5
RFP-R	1.5
		第一次扩增产物（共两种）	1/1

使用Touchdown PCR，变性温度95℃，第一轮退火温度从55℃-46℃下降10个循环，变性30 s，退火30 s，延伸温度62℃，延伸时间1分钟。再以50℃作为退火温度进行25个循环，变性、退火、延伸时间不变。

通过Overlap PCR得到的将DsRed2碱基序列第9 bp至第590 bp和第672 bp至第1590 bp连接起来的PCR产物加入10 μL的6×DNA电泳Loading Buffer，混匀后电泳鉴定并进行胶回收。回收产物使用TAKARA的Taq酶进行加尾反应，72℃ 20分钟。

使用TAKARA的pMD19T载体系统，进行连接反应，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂板，培养12-16h后，挑菌测序，克隆出1509 bp大小的DsRed2表达元件。

设计分别带KpnⅠ和BamHⅠ限制性内切酶酶切位点的引物RFP-K-F和RFP-B-R，利用与之前相同的Kod Fx聚合酶系统，以连入改造的DsRed红光蛋白的T载为模板，通过PCR扩增得到带有KpnⅠ和BamHⅠ限制性内切酶酶切位点的改造红光蛋白。之后我们利用KpnⅠ和BamHⅠ限制性核酸内切酶酶分别对上一步得到的PCR产物和pUC19载体进行酶切反应，酶切体系如下：

试剂	用量（共50 μL体系）
		KpnⅠ限制性内切酶酶	2 μL
BamHⅠ限制性内切酶酶	2 μL
		10×酶切buffer	5 μL
PCR产物	2 μg
		无菌水	up to 50 μL

酶切反应37℃ 12h，并用T4 DNA连接酶将该表达元件连接入pUC19载体中，构建成带DsRed2的pUC19-Red载体。

2. 构建 puro基因的pUC19-Red载体

将puro基因插入到pUC19-Red载体中，合成如下overlap引物：

rp-ol-1：	5’-GGGGTACCTAGTTATTAATAGTAATCAA-3’（SEQ ID NO.6）
		rp-ol-2：	5’-GTGGGCTTGTACTCGGTCATAGCGCTAGCGGATCTGACGG-3’（SEQ ID NO.7）
rp-ol-3：	5’-CCGTCAGATCCGCTAGCGCTATGACCGAGTACAAGCCCAC-3’（SEQ ID NO.8）
		rp-ol-4：	5’-CGGTGTTGTCCATGGTGGCGTCAGGCACCGGGCTTGCGGG-3’（SEQ ID NO.9）
rp-ol-5：	5’-CCCGCAAGCCCGGTGCCTGACGCCACCATGGACAACACCG-3’（SEQ ID NO.10）
		rp-ol-6：	5’-CGGGATCCGCAGTGAAAAAAATGCTTTA-3’（SEQ ID NO.11）

分别利用rp-ol-1/rp-ol-2 、rp-ol-3/rp-ol-4 、rp-ol-5/rp-ol-6引物P出片段overlap1、overlap2、overlap3，PCR体系如下：

	单位：μL
		Template	1
Primer forward	1.5
		Primer reverse	1.5
Kod Fx	1
		Kod Buffer	25
ddH2O	20

变性温度95℃，时间30 s，退火温度55℃，时间30 s，延伸温度68℃，延伸时间1min ，进行30个循环。

PCR完成后跑1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用E.D.Z.A公司提供的Gel ExtractionKit进行胶回收，获得胶回收产物overlap1、overlap2、overlap3。

将上述胶回收产物overlap1、overlap2进行连接，overlap PCR体系如下：

	单位：μL
		Overlap1	1
Overlap2	1
		Primer rp-ol-1	1
Primer rp-ol-4	1
		Kod Fx	1
Kod Buffer	25
		ddH2O	20

变性温度95℃，时间30 s，退火温度50℃，时间30 s，延伸温度68℃，延伸时间1min ，进行30个循环。

PCR完成后跑1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用E.D.Z.A公司提供的Gel ExtractionKi回收1500bp左右的条带，得到胶回收产物overlap1/2。同理利用overlap2、overlap3进行连接，获得overlap2/3。再将overlap1/2 ，overlap2/3利用overlap PCR的方法连接得到overlap1/2/3。

使用Kpn1和BamH1限制酶酶切puc19-red载体和overlap1/2/3，将酶切产物进行连接得到改造好的重组转移载体pUC19-RP，载体图谱如图1所示。

3.构建ORF022重组转移载体

将ORF022的上下臂连入载体pUC19-RP中：使用Invitrogen PureLink Viral DNA/RNA Kit提取ISKNV DNA，将其稀释至50 μg/mL作模板。使用带EcoRⅠ、KpnⅠ和BamHⅠ、HindⅢ限制性核酸内切酶酶切位点的引物：

ORF022上臂-F：	5’-GGTACCCTTTTACTTGTATAAAAATT-3’（SEQ ID NO.12）
		ORF022上臂-R：	5’-GAATTCCTACATTGCATACAGACCAC-3’（SEQ ID NO.13）
ORF022下臂-F：	5’-AAGCTTCGACTTTGTGCTGACAAAGA-3’（SEQ ID NO.14）
		ORF022下臂-R：	5’-GGATCCGGTCGATGCGGTTGGTGCGC-3’（SEQ ID NO.15）

从ISKNV的基因组中使用Kod Fx聚合酶系统通过PCR得到ORF022的上臂（ISKNV基因组中第16941 bp至17990 bp）和下臂（ISKNV基因组中第19489 bp至20560 bp），PCR反应体系如下：

试剂	用量（共50 μL体系）单位：μL
		Kod Fx DNA热稳定聚合酶	1
2×Kod Buffer	25
		无菌水	10
dNTPs	10
		ORF022上臂/下臂-F	1.5
ORF022上臂/下臂-R	1.5
		ISKNV模板	1

PCR产物加入10 μL的6×DNA电泳Loading Buffer，混匀后电泳鉴定并进行胶回收。回收产物分别使用EcoRⅠ、KpnⅠ和BamHⅠ、HindⅢ限制性核酸内切酶酶切回收后利用T4连接酶连接入上一步构建好的pUC19-Red载体上，构成ORF022重组转移载体。酶切体系如下：

试剂	用量（共5 0μL体系）
		EcoRⅠ/BamHⅠ限制性内切酶酶	2 μL
KpnⅠ/HindⅢ限制性内切酶酶	2 μL
		10×酶切buffer	5 μL
PCR产物	2 μg
		无菌水	up to 50 μL

对重组转移载体进行双酶切鉴定，结果如图2所示。

4. 细胞内同源重组

使用构建好的ORF022重组转移载体转染鳜鱼细胞，转染使用Promega公司的FuGENE™ HD Transfection Reagent，转染量5 μg，转染2×10⁷个细胞。

转染24 h之后按照每毫升1.3E5个病毒拷贝数加入ISKNV病毒液。攻毒72 h后，收集发病的细胞，得到ISKNV△ORF022与野生型ISKNV混合的病毒液。

5. 纯化重组病毒

将ISKNV△ORF022与野生型ISKNV混合病毒液反复冻融3-5次，使用0.22 μm的滤膜过滤除菌，再按照1:1000的比例感染健康的鳜鱼细胞。

72 h左右开始发病后在倒置荧光显微镜下观察荧光，若发现红色荧光，则以2 ng/μl的浓度加入嘌呤霉素(puromycin)杀除其中野生型ISKNV感染的细胞。24 h后，吸走上清，并用PBS洗3次后，加入新鲜DMEM培养基。约48 h后剩余野生型ISKNV感染的细胞全发病死亡，收集这些细胞，反复冻融3-5次并0.22 μm的滤膜过滤除菌，得到第一代经嘌呤霉素(puromycin)筛选的ISKNV△ORF022与野生型ISKNV混合病毒液。将此病毒液再次感染健康的鳜鱼细胞，并重复以上筛选步骤。多次重复后最终获得纯化的ISKNV△ORF022病毒株。

倒置荧光显微镜下的ISKNV△ORF022感染的细胞发光情况如图3所示。

6. PCR鉴定鉴定重组病毒的纯度

提取病毒DNA，并在 ORF022 基因的两侧/内部分别设计检测引物，进行PCR鉴定。PCR鉴定使用TAKARA公司的rTaq系统，体系如下：

试剂	用量（共20 μL体系）单位：μL
		2×rTaq	10
无菌水	7
		ORF022检测-F	1
ORF022检测-R	1
		重组病毒基因组模板	1

变性温度95℃ 30 s，退火温度55℃ 30 s，延伸温度72℃ 90 s，25个循环。

之后使用一扩的产物作为模板，相同的体系进行二扩，鉴定重组病毒的纯度。鉴定结果如图4、图5所示。

7. 鳜鱼活体攻毒实验

以ISKNV△ORF022基因缺失重组病毒株进行鳜鱼活体攻毒实验，实验选用平均体重175g±30 g的鳜鱼作为样本。实验设置ISKNV△ORF022基因缺失重组病毒实验组、野生型病毒组、DMEM对照组，样本数分别为66/29/30尾。实验组以物理滴度9.0E3/mL的浓度浸泡攻毒3 h，随后换水；野生型病毒组以8.0E5/mL的浓度同样方法攻毒，对照组在水体中加入20mL DMEM培养基。养殖20天，每天统计存活率，结果如图6所示，ISKNV△ORF022基因缺失重组病毒实验组在养殖20天后的存活率98.48%，野生型病毒组在20天后的存活率仅为3.45% ，表明ISKNV△ORF022基因缺失重组病毒相比野生型病毒毒性降低，详细数据可见下表：

取上述重组病毒实验组存活的鳜鱼62尾再以8.0E6/mL的浓度攻毒野生型毒株，并设置29尾的对照组，养殖20天，每天统计保护率。结果如图7所示， ISKNV△ORF022基因缺失重组病毒实验组保护率为79.03%，而对照组29尾鳜鱼未经减毒疫苗免疫，在野生型毒株攻毒后的14天内全部死亡，表明采用ISKNV△ORF022基因缺失重组病毒株对鳜鱼进行免疫，能取得有效的免疫预防效果，详细数据可见下表：

综上所述，ISKNV△ORF022基因缺失重组病毒株可以作为预防传染性脾肾坏死病毒减毒疫苗理想选择。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种传染性脾肾坏死病毒ORF022基因缺失株及其制备方法和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctattgcact gggttgaagt atgtaggcaa ctggctattg tacacctgaa agtcagcatt 60

actgaacgta cagaaaacga tgtgatcaaa agcaccgggg tgctgtatga catatgcacg 120

tacgctcgac atggccacat gaacggcatc ctcaatcggg tagttgtacg cgcccgtgga 180

tatggacggg aacgcaatgg tgcgcgcccc atttgcttgg gccacatgca atgactggat 240

atagcaactg gtcaacacgc gcttgtccgc tgcggtggga cgagcacccc tattcagtat 300

agggccaaca gtgtggatga cataagtcgc tggcagccga tagccgcctg tgatttttgc 360

ctccccaaac ctaataccac caagggtctc gcactccctc ttgagctcgg ggcctgccat 420

cctatgaata ctcccatcga caccaccacc accgagccct ccggggttgg ctgcgttaac 480

tatggcatct acccttaaag aggttatatc atccaacaca acactcacat tagtctgcct 540

attgtgctct atgctgtcat caaaatgaac atgtcgagcc ggcgctggtg gcgctggcgg 600

cgctggtagt atctgaggta catcgtagtg tgttagtgtg tcataggtga taggcattat 660

acccccaatg ggtgaattaa accgctgcaa tgcgtttgca agctgtccgg tggcagacat 720

caatgtgtta ggagcgagtg ggtagccatt tgtacccggg gtgtaagaaa cctccatttg 780

tacaccatcc atcgcctcta tgtcagccca cgtgtatgtg ttgtggttgt gccgagattt 840

gagcacaata ccattacgtg tggcatatac atgcaacatg acaccggggg ataccggtcc 900

caatggcaac ggcacattta cataatagcg gaacgatgat gccatgccgg tgtctacgtc 960

tgtgttggag tgcttgtcaa tgcaagtgac aatctcatat cgaccctggt aaaacatgag 1020

cacgtgcata gcaccattgg cctgaccacc agcctttatg tgtaccagct gccggaggcg 1080

atcaagctgc agtgcagaca catacacaat gattgtcatt ggctgagggc gacccccgga 1140

tgagatgagt tctctcgcag catagttaac cactggcatt tgcgctgcat taaagtagtg 1200

agggcagaag ccaatgtgtg tgcccatgtc ctggtaattg acaaatccat cttgtgacat 1260

gtctgggtgg atcagtgtaa taggcacgcg cagccgcgac ccaaaaatct gggctgcgac 1320

tataagacac ctgcgcaatg tctcataatc cccgttgtca ggcaccgccg tgaccgtgac 1380

gcacccttgg gtggtattat ttaacgccac ggcttgcccc gggtcgcggt tgtacatcac 1440

gcgtatgttg tcacgcgaca ctagcaccaa cacgtctcct atctcaagca cagtgaacat 1500

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atagtaatca attacggggt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgatgagttt ggacaaacca 20

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagatccgct agcgctcgcc accatggaca acaccg 36

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gttgtccatg gtggcgagcg ctagcggatc tgacgg 36

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggtaccta gttattaata gtaatcaa 28

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgggcttgt actcggtcat agcgctagcg gatctgacgg 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgtcagatc cgctagcgct atgaccgagt acaagcccac 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggtgttgtc catggtggcg tcaggcaccg ggcttgcggg 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cccgcaagcc cggtgcctga cgccaccatg gacaacaccg 40

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgggatccgc agtgaaaaaa atgcttta 28

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtacccttt tacttgtata aaaatt 26

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaattcctac attgcataca gaccac 26

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aagcttcgac tttgtgctga caaaga 26

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggatccggtc gatgcggttg gtgcgc 26

Claims

1.一种预防鳜传染性脾肾坏死病毒的ORF022基因缺失重组病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗活性成分为传染性脾肾坏死病毒缺失ORF022基因后制成的减毒病毒株，所述ORF022基因序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种带筛选标记的预防鳜传染性脾肾坏死病毒的ORF022基因缺失重组病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗活性成分为传染性脾肾坏死病毒缺失ORF022基因且在基因缺失的部位通过同源重组分别插入第一筛选基因和第二筛选基因后制成的减毒病毒株，所述ORF022基因序列如SEQ ID NO：1所示。

3.如权利要求1或2所述的ORF022基因缺失重组病毒疫苗，其特征在于，所述ORF022基因缺失重组病毒疫苗还包括及药学上接受的诊断剂、载剂、赋形剂或稀释剂。

4.如权利要求1或2所述的ORF022基因缺失重组病毒疫苗在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒的试剂或药物中的应用。