CN112979823B

CN112979823B - 一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品及融合蛋白

Info

Publication number: CN112979823B
Application number: CN201911312544.0A
Authority: CN
Inventors: 李大力; 朱碧云; 张晓辉; 刘明耀
Original assignee: East China Normal University; Bioray Laboratories Inc
Current assignee: East China Normal University; Bioray Laboratories Inc
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2039-12-18
Also published as: CN112979823A

Abstract

本申请公开了一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品及融合蛋白。所述融合蛋白包括Rad51的DNA结合结构域、胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体和核酸酶；所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体是将所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A第57位的天冬酰胺突变为甘氨酸。所述产品包括所述融合蛋白的编码基因和sgRNA的递送载体，所述sgRNA引导所述融合蛋白对目的细胞中HBG1和HBG2启动子区进行单碱基基因编辑。本申请可极大地提高单碱基基因编辑效率，更加精确高效地靶向HBG1和HBG2启动子区‑117位产生G到A的突变，从而激活γ‑珠蛋白的表达，为临床治疗β‑血红蛋白病提供了一种更加精准高效的治疗策略。

Description

一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品及融合蛋白

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品及融合蛋白。

背景技术

自2013年以来，以CRISPR/Cas9为代表的新一代基因编辑技术进入生物学领域的各个实验，改变了传统的基因操作手段。2016年4月，David Liu实验室首次报导单碱基基因编辑技术，之后，基于胞嘧啶脱氨酶原理的其它类型的单碱基基因编辑技术(如来源于七鳃鳗和人的胞嘧啶脱氨酶以不同方式与dCas9或Cas9n融合)也相继被报道。它以CRISPR/Cas9中来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)spCas9以NGG作为PAM(间隔序列前体临近基序)并识别和特异结合DNA在NGG上游实现C到T或G到A的单碱基突变。

单碱基基因编辑技术，已被报导可用于高效地进行基因组的基因突变或修复、疾病动物模型制作、基因治疗。目前，已发现的单碱基基因编辑工具中，以BE3(碱基编辑器3)应用最为广泛。BE3以最高达37％的碱基替换效率，远远高于利用同源重组实现的效率，同时保持较低的脱靶效应，展现出其在用于基因组的单碱基突变修饰或单碱基突变治疗的巨大潜力。随着研究的深入，发现引入额外两个或者更多拷贝的UGI(尿嘧啶糖苷酶抑制剂)到BE3可进一步增强其编辑效率及产物纯度。引入双分型NLS(核定位信号)和密码子化即BE4max，其编辑效率被一步提高。这些方法均一定程度提高其效率，但都比较有限。

β-血红蛋白病如β地中海贫血和镰状细胞病(SCD)，是由编码β血红蛋白基因HBB突变引起的。在极少数情况下，遗传性胎儿血红蛋白病(HPFH)是一种良性遗传性疾病，成年病人体内高表达γ-珠蛋白可以缓解因β血红蛋白突变而产生的疾病表型。已报导用CRISPR/Cas9删除HBG1/2的启动子区13bp可以激活γ-球蛋白表达，进而缓解或治疗地中海贫血疾病，是一种有效地治疗策略。据报道，在其中一位HPFH患者中，HBG1/2启动子区-117位点的杂合点突变(G>A)产生10-20％的胎儿血红蛋白(HbF)表达，其机制是-117G>A的突变破坏了转录抑制因子BCL11A的结合位点。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品及融合蛋白。

一方面，本发明提供了一种提高基因编辑效率的融合蛋白，所述融合蛋白包括Rad51的DNA结合结构域、胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体和核酸酶；

所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体是将所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A第57位(自起始密码子)的天冬酰胺(N或Asn)突变为甘氨酸(G或Gly)。

在具体实施时，所述融合蛋白的连接顺序为：所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体位于所述核酸酶的N端或C端，所述Rad51的DNA结合结构域位于所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体和所述核酸酶的N端、C端和/或所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体和所述核酸酶之间；

优选的，所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体位于所述核酸酶的N端；

更优选的，所述Rad51的DNA结合结构域位于所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体和所述核酸酶之间。

一种优选的实施方式是，所述Rad51的DNA结合结构域的氨基酸序列包括SEQ IDNo.1所示序列，更优选的，所述Rad51的DNA结合结构域的编码序列包括SEQ ID No.2所示序列；

一种优选的实施方式是，所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A来源于人，优选的，所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A的氨基酸序列包括SEQ ID No.23所示序列，更优选的，所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A的编码序列包括SEQ ID No.24所示序列；所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示序列，更优选的，所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A的编码序列包括SEQ ID No.4所示序列；

具体实施时，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或任意几种；优选的，所述核酸酶为Cas9；更优选的，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌或嗜热链球菌的Cas9，更优选的，所述Cas9选自Cas9突变体VQR-spCas9、VRER-spCas9、spCas9n，更优选，spCas9n，更优选的，所述spCas9n的氨基酸序列包括SEQ ID No.5所示序列，更优选的，所述spCas9n的编码序列包括SEQ ID No.6所示序列；

具体实施时，所述融合蛋白还包括NLS，优选的，所述NLS位于所述融合蛋白的至少一端；更优选的，所述NLS的氨基酸序列包括SEQ ID No.7所示序列，更优选的，所述NLS的编码序列包括SEQ ID No.8所示序列；

具体实施时，所述融合蛋白还包括UGI，优选的，所述UGI位于所述融合蛋白的至少一端；更优选的，所述UGI的氨基酸序列包括SEQ ID No.9所示序列，更优选的，所述UGI的编码序列包括SEQ ID No.10所示序列，更优选的，所述UGI为两个以上拷贝。

另一方面，本发明还提供了如下A)-C)生物材料中的任一种：

A)一种基因，编码以上任一所述融合蛋白；所述基因为DNA或RNA(如mRNA)；

B)一种重组载体，含有A)所述基因；所述重组载体包括病毒载体、和/或非病毒载体；所述病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、和/或溶瘤病毒载体，所述非病毒载体包括阳离子高分子聚合物、质粒载体和/或脂质体；

C)一种重组细胞或重组菌，含有以上任一所述的融合蛋白，或含有A)所述基因，优选的，所述细胞为T细胞、造血干细胞、骨髓细胞或血红细胞，更优选，红细胞前体细胞或造血干细胞。

另一方面，本发明还提供了一种对细胞内目的基因进行基因编辑的sgRNA，所述sgRNA的靶序列包括SEQ ID No.17-20和22中至少一种，

优选的，所述sgRNA的靶序列包括SEQ ID No.22所示序列，

优选的，所述细胞为T细胞、造血干细胞、骨髓细胞或血红细胞，更优选，红细胞前体细胞或造血干细胞，

优选的，所述目的基因为HBG1和HBG2启动子区(具体为-117位点的G编辑为A，-117位点的G即所述启动子区CCAGCCTTGCCTTGACCAATAGCC中左起第14位G)。

另一方面，本发明还提供了一种单碱基基因编辑系统，包括以上任一所述的融合蛋白、和/或以上任一所述的生物材料和sgRNA，所述sgRNA引导所述融合蛋白对目的细胞中的目的基因进行单碱基基因编辑；

优选的，所述sgRNA的靶序列包括SEQ ID No.1-22中的至少一种，更优选的，所述sgRNA的靶序列包括SEQ ID No.22所示序列，

本发明保护以上任一所述融合蛋白、所述的生物材料、所述的sgRNA或所述的单碱基基因编辑系统在制备基因编辑产品、疾病治疗和/或预防产品、动物模型或植物新品种中的应用，

优选的，所述疾病为β血红蛋白病，所述β血红蛋白病包括β地中海贫血和/或镰刀型细胞贫血症。

本发明保护一种提高单碱基基因编辑效率的方法，所述方法包括利用以上任一所述的融合蛋白和sgRNA引入细胞、对目的基因进行基因编辑的步骤，所述sgRNA引导所述融合蛋白对所述目的基因进行单碱基基因编辑；

另一方面，本发明提供了一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品，包含：以上A)中所述基因和sgRNA的递送载体，

所述sgRNA引导所述融合蛋白对目的细胞中HBG1和HBG2启动子区(具体为-117位点的G编辑为A，-117位点的G即所述启动子区CCAGCCTTGCCTTGACCAATAGCC中左起第14位G)进行单碱基基因编辑；

优选的，所述sgRNA的靶序列包括SEQ ID No.22所示序列；

优选的，所述β血红蛋白病包括β地中海贫血和/或镰刀型细胞贫血症；

在上述产品中，所述递送载体包括病毒载体、和/或非病毒载体；所述病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、和/或溶瘤病毒载体，所述非病毒载体包括阳离子高分子聚合物、质粒载体和/或脂质体；

优选的，所述递送载体包括慢病毒载体。

本发明有益效果如下：

根据单碱基基因编辑技术的基本工作原理，通过将Rad51单链结合功能域与现在广泛使用的能特异实现TC motif中的C到T转换的单碱基基因编辑工具eA3A-BE4max进行融合，得到超高活性hyeA3A-BE4max。相对于eA3A-BE4max，hyeA3A-BE4max高活性窗口从原来C3-C11，拓展到C3-C15位，能特异靶向TC motif中的单个碱基C实现C到T转换。其中，在远离PAM区的C3-C11，hyeA3A-BE4max对单个碱基C到T的编辑效率是eA3A-BE4max的1.6-2.8倍，在靠近PAM区的C12-C15，hyeA3A-BE4max对单个碱基C到T的编辑效率是eA3A-BE4max的4.5-31.9倍，同时保持较低的indels。这是单碱基基因编辑技术领域极大的一个技术改进。

我们进一步将其运用到基因治疗中，以β-血红蛋白病为例，相对于eA3A-BE4max，A3A-BE4max，hyeA3A-BE4max靶向HBG1和HBG2(以下简称HBG1/2)启动子区较靠近PAM区-117位点，能更加精确高效地靶向-117产生G到A的突变，从而激活γ-珠蛋白的表达，为临床治疗β-血红蛋白病提供了一种更加精准高效的治疗策略。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为融合蛋白A3A-BE4max、hyA3A-BE4max、eA3A-BE4max和hyeA3A-BE4max的结构示意图。其中，NLS为核定位信号(其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，编码序列如SEQ IDNo.8所示)，hA3A为来源于人的胞苷脱氨酶APOBEC3A(其氨基酸序列如SEQ ID No.23所示，编码序列如SEQ ID No.24所示)，A3A N57G为hA3A的突变体(其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，编码序列如SEQ ID No.4所示)，spCas9n为源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9n(其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，编码序列如SEQ ID No.6所示)，UGI为尿嘧啶糖苷酶抑制剂(其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，编码序列如SEQ ID No.10所示)。

图2为hyeA3A-BE4max与eA3A-BE4max在293T上11个内源性靶点实现的C到T碱基编辑效率(即纵坐标，单位为％)的对比。

图3为hyeA3A-BE4max与eA3A-BE4max在293T上11个内源性靶点实现的C到T碱基编辑效率(即纵坐标，单位为％)的平均值对比。

图4为hyeA3A-BE4max与eA3A-BE4max在293T上11个内源性靶点产生的indels的碱基编辑效率(即纵坐标，单位为％)对比。

图5为hyeA3A-BE4max靶向HBG1/2启动子区-117G示意图。其中，-117G>A突变位于三角箭头处，转录因子BCL11A结合位点的核心序列用方框表示，PAM序列为浅灰色，G>A转化破坏了转录抑制因子BCL11A的结合位点并激活了HUDEP-2(Δ^Gγ)中HBG1/2的表达。

图6为hyeA3A-BE4max、eA3A-BE4max、A3A-BE4max、hyA3A-BE4max在HEK293T细胞中靶向HBG-117G靶点实现的C到T碱基编辑效率(即纵坐标，单位为％)对比。

图7为慢病毒载体Lenti-117G-hyA3A-BE4max-P2A-GFP和Lenti-117G-hyeA3A-BE4max-P2A-GFP构建示意图。其中，sgRNA的靶点序列为HBG-117G。

图8为hyeA3A-BE4max和hyA3A-BE4max在HUDEP-2(Δ^Gγ)细胞中靶向HBG-117G靶点实现的C到T碱基编辑效率(即纵坐标，单位为％)对比。

图9为感染慢病毒Lenti-117G-hyeA3A-BE4max-P2A-GFP和Lenti-117G-hyA3A-BE4max-P2A-GFP的HUDEP-2(Δ^Gγ)细胞分化后珠蛋白mRNA表达对比。其中，****表示差异显著性水平P＜0.0001。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。如按照Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)所记载，或按照厂商的建议条件。

一、融合蛋白hyeA3A-BE4max工作特性

1.1、质粒设计及构建

1.1.1、工作系统质粒构建

设计单链DNA结合蛋白功能域Rad51-DBD按照表1中编码序列进行合成，之后进行无缝克隆组装至表达蛋白A3A-BE4max(图1)的质粒pCMV-A3A-BE4max中hA3A和spCas9n之间，构建表达融合蛋白hyA3A-BE4max(图1)的重组质粒pA。

将单链DNA结合蛋白功能域Rad51-DBD按照表1中编码序列进行合成，之后进行无缝克隆组装至表达蛋白eA3A-BE4max(图1)的质粒pCMV-eA3A-BE4max中eA3A与spCas9n之间，构建表达融合蛋白hyeA3A-BE4max(图1)的重组质粒pAe。

1.1.2、靶点质粒的构建

同时设计12个来自于人的内源性靶点(如表2)，分别连接至sgRNA表达质粒U6-sgRNA-EF1α-GFP的BbsI位点处，用于表达相应靶点的sgRNA，得到重组质粒pB1、pB2、……pB12。

1.1.3、将1.1.1与1.1.2中构建的质粒经sanger测序，确保完全正确。

表1、单链DNA结合蛋白功能域Rad51-DBD的序列

表2、所用靶点及序列

靶点名称	序列(5`-3`)	SEQ ID No.
			EMX1-sg2p	GACATCGATGTCCTCCCCATTGG	11
CTLA-sg1	CTCCCTCAAGCAGGCCCCGCTGG	12
			EMX1 site1	GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGG	13
EGFR-sg5	GTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGG	14
			Nme1-sg1	AGGGATCGTCTTTCAAGGCGAGG	15
CDK10-sg1	TTCTCGGAGGCTCAGGTGCGTGG	16
			EMX1-sg1	GCTCCCATCACATCAACCGGTGG	17
HPRT1-sg6	GCCCTCTGTGTGCTCAAGGGGGG	18
			EGFR-sg26	CATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGG	19
CCR5-sg1	TAATAATTGATGTCATAGATTGG	20
			EGFR-sg21	CAAAGCAGAAACTCACATCGAGG	21
HBG-117G	GGCTATTGGTCAAGGCAAGGCTGG	22

1.2、细胞转染-验证hyeA3A-BE4max工作系统

将5×10⁵个HEK293T细胞铺24孔板，待细胞长至70％-80％时，按pA(或质粒pCMV-eA3A-BE4max):pB1(或pB2、pB3、……pB11)＝750ng:250ng进行质粒组合的转染，每种质粒组合转染设3孔重复，每孔2×10⁵个细胞。同时设不转染任何质粒的空白对照。

1.3、基因组提取及扩增子文库的准备

转染72h后，用天根细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取细胞基因组DNA。之后用Hitom试剂盒的操作流程，设计相对应的鉴定引物(表3)，即在正向鉴定引物5`端加上搭桥序列5`-ggagtgagtacggtgtgc-3`，反向鉴定引物5`端加上搭桥序列5`-gagttggatgctggatgg-3`，即得到一轮PCR产物，之后利用一轮PCR产物作为模板，进行二轮PCR，后混在一起进行切胶回收纯化后进行送公司进行测序。

表3、所用靶点的鉴定引物

1.4深度测序结果分析与统计

利用BE-analyzer网站分析深度测序结果，即统计C到T、Indels的比率。并用graphpad prism 8.0进行统计作图。

结果表明：相对于蛋白eA3A-BE4max，融合蛋白hyeA3A-BE4max对各靶点不同位置(C3-C15)单个碱基C到T的编辑效率大部分明显提高，且高活性窗口从原来C3-C11拓展到C3-C15位，能特异靶向TC motif中的单个碱基C实现C到T转换(图2)；其中，在远离PAM区的C3-C11，hyeA3A-BE4max对单个碱基C到T的编辑效率是eA3A-BE4max的1.6-2.8倍，在靠近PAM区的C12-C15，hyeA3A-BE4max对单个碱基C到T的编辑效率是eA3A-BE4max的4.5-31.9倍，即在靠近PAM区的C12-C15，hyeA3A-BE4max对单个碱基C到T的编辑效率提高更为明显(图3)。同时hyeA3A-BE4max保持较低的indels(图4)。

二、应用融合蛋白hyeA3A-BE4max进行基因治疗

2.1、hyeA3A-BE4max靶向HBG-117G位点在HEK293T细胞上编辑效率的测试

按照1.2的细胞转染方法，将按pA(或质粒pCMV-A3A-BE4max、或pAe、或pCMV-eA3A-BE4max):pB12＝750ng:250ng进行质粒组合的转染HEK293T细胞；按照1.3和1.4的方法进行深度测序及统计分析。

结果：A3A-BE4max除能靶向HBG1/2启动子区的-117G>A(C11)突变外，还会产生-109G>A(C3)，-122G>A(C16)“旁观者”突变；对于eA3A-BE4max和hyeA3A-BE4max而言，eA3A-BE4max精确地编辑了-117上的G到A转换(即互补链C到T转换)而不引起“旁观者”突变，但效率非常低，与eA3A-BE4max相比，hyeA3A-BE4max提高了6.6倍的G到A转换效率，并且在-109和-122处均未产生可检测到的“旁观者”突变。结果表明，hyeA3A-BE4max展现出精准高效靶向HBG1/2启动子区-117G的特性(作用机理总结如图5所示)。

2.2、慢病毒载体的构建与病毒包装

2.2.1、慢病毒载体的构建

以pLenti-BE3-P2A-Puro(Addgene，#110838)为骨架载体，将hyA3A-BE4max的编码序列通过无缝克隆替换骨架载体上的BE3得到慢病毒载体Lenti-hyA3A-BE4max-P2A-GFP。

以pLenti-BE3-P2A-Puro(Addgene，#110838)为骨架载体，将hyeA3A-BE4max的编码序列通过无缝克隆替换骨架载体上的BE3得到慢病毒载体Lenti-hyeA3A-BE4max-P2A-GFP。

将HBG-117G靶点序列(表2)分别连接至上述两个慢病毒载体的hyA3A-BE4max或hyeA3A-BE4max的上游(图7上图)，得到重组质粒Lenti-117G-hyA3A-BE4max-P2A-GFP和重组质粒Lenti-117G hyeA3A-BE4max-P2A-GFP(图7下图)。

2.2.2、慢病毒包装

2.2.2.1、转染

第1天，将生长状态良好的HEK293T细胞消化后铺10cm皿，每个病毒约30皿。第2天，待汇合度80％-90％时，按如下量进行质粒转染:Lenti-117G-hyA3A-BE4max-P2A-GFP(或Lenti-117G-hyeA3A-BE4max-P2A-GFP):PSPAX2:PMD2.G＝10ug:10ug:10ug。

2.2.2.2、病毒的收集和纯化

病毒上清收集于转染后48h(转染即可为0小时计起)、72h的HEK293T细胞上清。于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片，后以0.45μm滤器过滤上清液于40mL超滤离心管中，把慢病毒粗提液加入到过滤杯中，4℃、25000g离心2.5小时。离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。样品收集杯中的液体即为病毒浓缩液(含有慢病毒Lenti-117G-hyA3A-BE4max-P2A-GFP或慢病毒Lenti-117G-hyeA3A-BE4max-P2A-GFP)。将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80℃长期保存。

2.3、基因治疗

2.3.1、HUDEP-2(Δ^Gγ)细胞感染病毒

在96孔板铺5×10⁴的HUDEP-2(Δ^Gγ)细胞3个孔，总体积为100ul培养基，分别等滴度感染慢病毒Lenti-117G-hyA3A-BE4max-P2A-GFP和Lenti-117G-hyeA3A-BE4max-P2A-GFP，感染体系如下：

2.3.2、编辑效率检测

将感染慢病毒Lenti-117G-hyA3A-BE4max-P2A-GFP或Lenti-117G-hyeA3A-BE4max-P2A-GFP的HUDEP-2(ΔGγ)细胞经流式分选GFP阳性细胞，培养到细胞数量大于5×10⁴后，收取细胞，提取基因组DNA，按照步骤1.3和1.4的方法进行深度测序和分析。

结果：与hyA3A-BE4max相比，hyeA3A-BE4max有效靶向HUDEP-2(Δ^Gγ)细胞中精确的–117G>A突变，并表现出更高的活性(图8)。

2.3.3分化及γ珠蛋白表达检测

将感染慢病毒Lenti-117G-hyA3A-BE4max-P2A-GFP或Lenti-117G-hyeA3A-BE4max-P2A-GFP的HUDEP-2(ΔGγ)细胞经流式分选GFP阳性细胞，培养到细胞数量大于5×10⁴，约5-7天后收集HUDEP-2(Δ^Gγ)细胞进行分化表达。分化过程如下：

计数后，1×10⁵个HUDEP-2(Δ^Gγ)细胞分化在类红细胞分化培养基(IMDM)中进行，同时补充2％人血AB型血浆(血清)(Gemini，100-512)，1％L-谷氨酰胺，2IU/mL肝素，促红细胞生成素(EPO，3IU/ml，PeproTech)，330μg/mL Holo-人类转铁蛋白(Sigma-Aldrich)，人干细胞因子(SCF，50ng/ml，PeproTech)，2％的Pen/Strep(Gibco)，10μg/ml重组人胰岛素，分化8天。

γ珠蛋白表达检测：分化8天后，收细胞用酚氯仿抽提法抽提总的mRNA。使用HiScript II Q RT SuperMix(Vazyme)对分离的mRNA进行逆转录；在QuantiStudio 3实时PCR系统(ABI)上进行qPCR，并通过SYBRGreen qPCR对HBG和HBB mRNA进行定量。引物(5’-3’)如下：

HBG-qPCR-F：ggttatcaataagctcctagtcc；

HBG-qPCR-R：acaaccaggagccttccca；

HBB-qPCR-F：tgaggagaagtctgccgttac；

HBB-qPCR-F：accaccagcagcctgccca。

结果：与HUDEP-2(Δ^Gγ)的WT细胞相比，hyA3A-BE4max和hyeA3A-BE4max可以显著提高HUDEP-2(Δ^Gγ)细胞中γ-珠蛋白mRNA的水平；hyeA3A-BE4max对HUDEP-2(Δ^Gγ)细胞中γ-珠蛋白mRNA水平提高程度是hyA3A-BE4max的3倍(图9)。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

序列表

<110> 华东师范大学上海邦耀生物科技有限公司

<120> 一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品及融合蛋白

<130> JH-CNP191777

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Ala Met Gln Met Gln Leu Glu Ala Asn Ala Asp Thr Ser Val Glu

1 5 10 15

Glu Glu Ser Phe Gly Pro Gln Pro Ile Ser Arg Leu Glu Gln Cys Gly

20 25 30

Ile Asn Ala Asn Asp Val Lys Lys Leu Glu Glu Ala Gly Phe His Thr

35 40 45

Val Glu Ala Val Ala Tyr Ala Pro Lys Lys Glu Leu Ile Asn Ile Lys

50 55 60

Gly Ile Ser Glu Ala Lys Ala Asp Lys Ile Leu Ala Glu Ala Ala Lys

65 70 75 80

Leu Val Pro Met Gly Phe Thr Thr Ala Thr Glu Phe His Gln Arg Arg

85 90 95

Ser Glu Ile Ile Gln Ile Thr Thr Gly Ser Lys Glu Leu Asp Lys Leu

100 105 110

Leu Gln

<210> 2

<211> 342

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

atggcaatgc agatgcagct tgaagcaaat gcagatactt cagtggaaga agaaagcttt 60

ggcccacaac ccatttcacg gttagagcag tgtggcataa atgccaacga tgtgaagaaa 120

ttggaagaag ctggattcca tactgtggag gctgttgcct atgcgccaaa gaaggagcta 180

ataaatatta agggaattag tgaagccaaa gctgataaaa ttctggctga ggcagctaaa 240

ttagttccaa tgggtttcac cactgcaact gaattccacc aaaggcggtc agagatcata 300

cagattacta ctggctccaa agagcttgac aaactacttc aa 342

<210> 3

<211> 198

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 3

Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His Ile

1 5 10 15

Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr Leu

20 25 30

Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met Asp

35 40 45

Gln His Arg Gly Phe Leu His Gly Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys Gly

50 55 60

Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro Ser

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile Ser

85 90 95

Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala Phe

100 105 110

Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg Ile

115 120 125

Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg Asp

130 135 140

Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His Cys

145 150 155 160

Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp Asp

165 170 175

Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala Ile

180 185 190

Leu Gln Asn Gln Gly Asn

195

<210> 4

<211> 594

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 4

gaggcatctc cagcaagcgg accaaggcac ctgatggacc cccacatctt cacctctaac 60

tttaacaatg gcatcggcag gcacaagaca tacctgtgct atgaggtgga gcgcctggac 120

aacggcacca gcgtgaagat ggatcagcac agaggcttcc tgcacggcca ggccaagaat 180

ctgctgtgcg gcttctacgg ccggcacgca gagctgagat ttctggacct ggtgcctagc 240

ctgcagctgg atccagccca gatctatagg gtgacctggt tcatcagctg gtccccatgc 300

ttttcctggg gatgtgcagg agaggtgcgc gccttcctgc aggagaatac acacgtgcgg 360

ctgagaatct ttgccgcccg gatctacgac tatgatcctc tgtacaagga ggccctgcag 420

atgctgagag acgcaggagc ccaggtgtcc atcatgacct atgatgagtt caagcactgc 480

tgggacacat ttgtggatca ccagggctgt ccctttcagc cttgggacgg actggatgag 540

cactcccagg ccctgtctgg caggctgagg gccatcctgc agaaccaggg caat 594

<210> 5

<211> 1367

<212> PRT

<213> 酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）

<400> 5

Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly

1 5 10 15

Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys

20 25 30

Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly

35 40 45

Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys

50 55 60

Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe

85 90 95

Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His

100 105 110

Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His

115 120 125

Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser

130 135 140

Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met

145 150 155 160

Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp

165 170 175

Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn

180 185 190

Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys

195 200 205

Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu

210 215 220

Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu

225 230 235 240

Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp

245 250 255

Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp

260 265 270

Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu

275 280 285

Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile

290 295 300

Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met

305 310 315 320

Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp

340 345 350

Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln

355 360 365

Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly

370 375 380

Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys

385 390 395 400

Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly

405 410 415

Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu

420 425 430

Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro

435 440 445

Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met

450 455 460

Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val

465 470 475 480

Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn

485 490 495

Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu

500 505 510

Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr

515 520 525

Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys

530 535 540

Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val

545 550 555 560

Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser

565 570 575

Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr

580 585 590

Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn

595 600 605

Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu

610 615 620

Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His

625 630 635 640

Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr

645 650 655

Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys

660 665 670

Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala

675 680 685

Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys

690 695 700

Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His

705 710 715 720

Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile

725 730 735

Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg

740 745 750

His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr

755 760 765

Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu

770 775 780

Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val

785 790 795 800

Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln

805 810 815

Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu

820 825 830

Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp

835 840 845

Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly

850 855 860

Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn

865 870 875 880

Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe

885 890 895

Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys

900 905 910

Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys

915 920 925

His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu

930 935 940

Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys

945 950 955 960

Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu

965 970 975

Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

980 985 990

Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val

995 1000 1005

Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr

1025 1030 1035

Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn

1040 1045 1050

Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr

1055 1060 1065

Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg

1070 1075 1080

Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu

1085 1090 1095

Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg

1100 1105 1110

Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys

1115 1120 1125

Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu

1130 1135 1140

Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser

1145 1150 1155

Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe

1160 1165 1170

Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu

1175 1180 1185

Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe

1190 1195 1200

Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu

1205 1210 1215

Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn

1220 1225 1230

Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro

1235 1240 1245

Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg

1265 1270 1275

Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr

1280 1285 1290

Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile

1295 1300 1305

Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe

1310 1315 1320

Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr

1325 1330 1335

Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly

1340 1345 1350

Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

<210> 6

<211> 4101

<212> DNA

<213> 酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）

<400> 6

gacaagaagt acagcatcgg cctggccatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60

accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120

agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180

acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240

ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300

gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360

atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420

ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480

atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540

gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600

aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660

ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 720

attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780

gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840

atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900

ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960

atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020

cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080

tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140

aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200

cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260

attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320

aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380

ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440

gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500

ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560

aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620

ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680

aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740

ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800

aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860

accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920

ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980

ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040

ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100

ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160

gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220

aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280

gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340

aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400

gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460

atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2520

gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580

aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640

tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700

aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760

gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820

aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880

ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940

caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000

cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060

atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120

atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3180

ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240

accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300

acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360

agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420

tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480

gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540

ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600

tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660

aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720

tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780

cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840

ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900

atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960

gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020

gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080

ctgtctcagc tgggaggtga c 4101

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys Arg

1 5 10 15

Lys Val

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaacggacag ccgacggaag cgagttcgag tcaccaaaga agaagcggaa agtc 54

<210> 9

<211> 176

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）噬菌体

<400> 9

Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val

1 5 10 15

Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile

20 25 30

Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu

35 40 45

Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr

50 55 60

Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile

65 70 75 80

Lys Met Leu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Leu

85 90 95

Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val Ile Gln Glu

100 105 110

Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile Gly Asn Lys

115 120 125

Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu Ser Thr Asp

130 135 140

Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr Lys Pro Trp

145 150 155 160

Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile Lys Met Leu

165 170 175

<210> 10

<211> 528

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）噬菌体

<400> 10

actaatctga gcgacatcat tgagaaggag actgggaaac agctggtcat tcaggagtcc 60

atcctgatgc tgcctgagga ggtggaggaa gtgatcggca acaagccaga gtctgacatc 120

ctggtgcaca ccgcctacga cgagtccaca gatgagaatg tgatgctgct gacctctgac 180

gcccccgagt ataagccttg ggccctggtc atccaggatt ctaacggcga gaataagatc 240

aagatgctga gcggaggatc cggaggatct ggaggcagca ccaacctgtc tgacatcatc 300

gagaaggaga caggcaagca gctggtcatc caggagagca tcctgatgct gcccgaagaa 360

gtcgaagaag tgatcggaaa caagcctgag agcgatatcc tggtccatac cgcctacgac 420

gagagtaccg acgaaaatgt gatgctgctg acatccgacg ccccagagta taagccctgg 480

gctctggtca tccaggattc caacggagag aacaaaatca aaatgctg 528

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 11

gacatcgatg tcctccccat tgg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 12

ctccctcaag caggccccgc tgg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 13

gagtccgagc agaagaagaa ggg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 14

gtgctgggct ccggtgcgtt cgg 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 15

agggatcgtc tttcaaggcg agg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 16

ttctcggagg ctcaggtgcg tgg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 17

gctcccatca catcaaccgg tgg 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 18

gccctctgtg tgctcaaggg ggg 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 19

catgcccttc ggctgcctcc tgg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 20

taataattga tgtcatagat tgg 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 21

caaagcagaa actcacatcg agg 23

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 22

ggctattggt caaggcaagg ctgg 24

<210> 23

<211> 198

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 23

Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His Ile

1 5 10 15

Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr Leu

20 25 30

Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met Asp

35 40 45

Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys Gly

50 55 60

Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro Ser

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile Ser

85 90 95

Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala Phe

100 105 110

Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg Ile

115 120 125

Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg Asp

130 135 140

Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His Cys

145 150 155 160

Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp Asp

165 170 175

Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala Ile

180 185 190

Leu Gln Asn Gln Gly Asn

195

<210> 24

<211> 594

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 24

gaggcatctc cagcaagcgg accaaggcac ctgatggacc cccacatctt cacctctaac 60

tttaacaatg gcatcggcag gcacaagaca tacctgtgct atgaggtgga gcgcctggac 120

aacggcacca gcgtgaagat ggatcagcac agaggcttcc tgcacaacca ggccaagaat 180

ctgctgtgcg gcttctacgg ccggcacgca gagctgagat ttctggacct ggtgcctagc 240

ctgcagctgg atccagccca gatctatagg gtgacctggt tcatcagctg gtccccatgc 300

ttttcctggg gatgtgcagg agaggtgcgc gccttcctgc aggagaatac acacgtgcgg 360

ctgagaatct ttgccgcccg gatctacgac tatgatcctc tgtacaagga ggccctgcag 420

atgctgagag acgcaggagc ccaggtgtcc atcatgacct atgatgagtt caagcactgc 480

tgggacacat ttgtggatca ccagggctgt ccctttcagc cttgggacgg actggatgag 540

cactcccagg ccctgtctgg caggctgagg gccatcctgc agaaccaggg caat 594

Claims

1.一种提高基因编辑效率的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括Rad51的DNA结合结构域、胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体和核酸酶；

所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体是将所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A第57位的天冬酰胺突变为甘氨酸；

其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体位于所述核酸酶的N端；

所述Rad51的DNA结合结构域位于所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体和所述核酸酶之间；

所述Rad51的DNA结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述核酸酶为spCas9n；

所述spCas9n的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述融合蛋白还包括NLS；

所述NLS位于所述融合蛋白的至少一端；

所述NLS的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述融合蛋白还包括UGI；

所述UGI位于所述融合蛋白的至少一端；

所述UGI的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；

所述UGI为两个以上拷贝。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Rad51的DNA结合结构域的编码序列如SEQ ID No.2 所示。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A来源于人。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A的氨基酸序列如SEQ ID No.23所示。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A的编码序列如SEQ ID No.24所示。

6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A的编码序列如SEQ ID No.4所示。

7.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述spCas9n的编码序列如SEQ IDNo.6所示。

8.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述NLS的编码序列如SEQ ID No.8所示。

9.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述UGI的编码序列如SEQ ID No.10所示。

10.如下A）-C）生物材料中的任一种：

A）一种基因，编码权利要求1-9中任一所述融合蛋白；

B）一种重组载体，含有A）所述基因；

C）一种重组细胞或重组菌，含有权利要求1-9中任一所述的融合蛋白，或含有A）所述基因。

11.根据权利要求10所述的生物材料，其特征在于，所述细胞为T细胞、造血干细胞、骨髓细胞或血红细胞。

12.根据权利要求11所述的生物材料，其特征在于，所述细胞为红细胞前体细胞或造血干细胞。

13.一种对细胞内目的基因进行基因编辑的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.17-20和22中至少一种。

14.根据权利要求13所述的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列如SEQ ID No.22所示。

15.根据权利要求13所述的sgRNA，其特征在于，所述细胞为T细胞、造血干细胞、骨髓细胞或血红细胞。

16.根据权利要求15所述的sgRNA，其特征在于，所述细胞为红细胞前体细胞或造血干细胞。

17.根据权利要求13所述的sgRNA，其特征在于，所述目的基因为HBG1和HBG2启动子区。

18.一种单碱基基因编辑系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1-9中任一所述的融合蛋白、和/或权利要求10-12中任一所述的生物材料和sgRNA，所述sgRNA引导所述融合蛋白对目的细胞中的目的基因进行单碱基基因编辑。

19.根据权利要求18所述的系统，其特征在于，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.1-22中的至少一种。

20.根据权利要求19所述的系统，其特征在于，所述sgRNA的靶序列如SEQ ID No.22所示。

21.根据权利要求18所述的系统，其特征在于，所述细胞为T细胞、造血干细胞、骨髓细胞或血红细胞。

22.根据权利要求21所述的系统，其特征在于，所述细胞为红细胞前体细胞或造血干细胞。

23.根据权利要求18所述的系统，其特征在于，所述目的基因为HBG1和HBG2启动子区。

24.权利要求1-9中任一所述融合蛋白、权利要求10-12中任一所述的生物材料、权利要求13-17中任一所述的sgRNA或权利要求18-23中任一所述的单碱基基因编辑系统在制备基因编辑产品、制备疾病治疗和/或预防产品、制备动物模型或植物新品种中的应用。

25.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述疾病为β血红蛋白病，所述β血红蛋白病包括β地中海贫血和/或镰刀型细胞贫血症。

26.一种提高单碱基基因编辑效率的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1-9中任一所述的融合蛋白和sgRNA引入细胞、对目的基因进行基因编辑的步骤，所述sgRNA引导所述融合蛋白对所述目的基因进行单碱基基因编辑。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.1-22中的至少一种。

28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的靶序列如SEQ ID No.22所示。

29.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述细胞为T细胞、造血干细胞、骨髓细胞或血红细胞。

30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述细胞为红细胞前体细胞或造血干细胞。

31.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述目的基因为HBG1和HBG2启动子区。

32.一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品，其特征在于，所述产品中包含：权利要求10-12中任一A）中所述基因和sgRNA的递送载体。

33.根据权利要求32所述的产品，其特征在于，所述sgRNA引导所述融合蛋白对目的细胞中目的基因进行单碱基基因编辑。

34.根据权利要求33所述的产品，其特征在于，所述目的基因为HBG1和HBG2启动子区。

35.根据权利要求32所述的产品，其特征在于，所述sgRNA的靶序列如SEQ ID No.22所示。

36.根据权利要求32所述的产品，其特征在于，所述β血红蛋白病包括β地中海贫血和/或镰刀型细胞贫血症。

37.根据权利要求33所述的产品，其特征在于，所述细胞为T细胞、造血干细胞、骨髓细胞或血红细胞。

38.根据权利要求37所述的产品，其特征在于，所述细胞为红细胞前体细胞或造血干细胞。

39.根据权利要求32所述的产品，其特征在于，所述递送载体包括病毒载体、和/或非病毒载体。

40.根据权利要求39所述的产品，其特征在于，所述病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、和/或溶瘤病毒载体。

41.根据权利要求39所述的产品，其特征在于，所述非病毒载体包括阳离子高分子聚合物、和/或脂质体。

42.根据权利要求40所述的产品，其特征在于，所述递送载体为慢病毒载体。