CN116656649A - 一种is200/is60s转座子iscb突变蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸编辑领域，提供了一种IS200/IS60S转座子ISCB突变蛋白及其应用。所述IscB突变蛋白与亲本IscB蛋白相比，显著的提高了编辑活性，具有广泛的应用前景。利用本发明可以为实现更加高效的编辑工具和在体转导体系奠定基础，构建罕见病动物模型，推进罕见病致病机制的研究和治疗方案的探索，进一步推动基因编辑技术在临床治疗方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体而言，本发明涉及一种IS200/IS60S转座子ISCB突变蛋白及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。
作为广泛使用的基因组编辑工具，SpCas9和Cas12a能够在多种细胞种类和生物中起作用。它们可以用于全基因组筛选来研究基础生物功能，或者发现和验证复杂遗传病的潜在药物靶点。在临床试验中，Cas核酸酶经过递送可以治疗由已知遗传因素导致的疾病，例如在杜氏肌营养不良症(DMD)中，使用基因编辑可以修正基因突变或者诱发转录过程跳过有缺陷的外显子。
而AAV是一种在体内表达目标基因的有效和安全的载体，已广泛用于基因治疗，它的容量大概是4.7kb。传统的SpCas9、Cas12a等核酸酶虽然活性高具有良好的编辑功能，但它们的分子尺寸相比之下都过大。举例来说，广泛使用的SpCas9蛋白由1000-1400个氨基酸组成，无法进行AAV包装，必须通过内含肽进行拆分，而如果利用两个AAV进行递送，导致SpCas9活性下降；相关的病毒滴度及后续可能多次注射可能会使机体产生抗体等问题的出现。这就限制了这些系统在基因治疗等领域的应用。
2021年，Science杂志刊登公开了一种由IS200/IS605转座子家族编码的RNA引导的核酸酶(IscB)。从蛋白结构预测分析中，IscB同样存在RuvC和HNH两个结构域。通过体外DNA切割实验，研究者发现IscB具备由ωRNA引导识别并切割特定DNA双链序列的能力，其PAM序列也被作者称为TAM(target-adjacent motif)。
IscB已经具备了很多SpCas9的优点，比如有两个酶活性位点，分别负责一条DNA单链的切割；又比如ωRNA的结构较为复杂，便于进行改造。而IscB相比SpCas9最大的优势在于其非常小的体积，仅由500个左右的氨基酸组成，为递送提供了极大的便利，同时也就腾出了巨大的改造空间。
但是IscB蛋白在真核细胞中整体编辑效率较低，本申请对IS200/IS605转座子家族编码的RNA引导的核酸酶(IscB)进行了优化，实现更高效的编辑，为递送提供更多选择，进一步拓宽了基因编辑技术在临床治疗方面的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种IscB突变蛋白及其应用。本发明经过大量实验和反复摸索，通过一种基于可突变位点的算法对IscB蛋白进行位点预测突变，提高了其编辑活性，扩展了其应用范围。
本发明中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(Ala，A)，缬氨酸(Val，V)，甘氨酸(Gly，G)，亮氨酸(Leu，L)，谷酰胺酸(Gln，Q)，苯丙氨酸(Phe，F)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，天冬氨酸(Asp，D)，天冬酰胺(Asn，N)，谷氨酸(Glu，E)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，半胱氨酸(Cys，C)，脯氨酸(Pro，P)，异亮氨酸(Ile，I)，组氨酸(His，H)，精氨酸(Arg，R)。
术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如A401R表示第401位的A突变为R。多个氨基酸位点同时存在突变时，可以采用A401R-S456R类似的形式进行表述，例如，A401R-S456R代表第401位A突变为R同时第456位S突变为R。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种IscB突变蛋白，所述突变蛋白与如SEQ ID NO:1所示的野生型IscB蛋白相比，在以下任一个或多个氨基酸位点处存在突变：第17位、第21位、第25位、第34位、第40位、第51位、第107位、第122位、第135位、第140位、第150位、第152位、第153位、第154位、第160位、第161位、第197位、第198位、第300位、第301位、第376位、第377位、第383位、第401位、第402位、第403位、第418位、第422位、第432位、第456位、第459位、第460位、第468位、第485位，且所述突变均突变为精氨酸。
在具体的实施方案中，编码野生型IscB蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
在具体的实施方案中，所述IscB突变蛋白为将野生型IscB蛋白的第376位氨基酸突变为精氨酸，且将第456位氨基酸突变为精氨酸得到的蛋白质。
在更具体的实施方案中，编码前文所述IscB突变蛋白的核酸分子，具有以下任一核苷酸序列：
(1)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或，
(2)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，
(3)与SEQ ID NO.3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列。
在另一个具体的实施方案中，所述IscB突变蛋白为将野生型IscB蛋白的第401位氨基酸突变为精氨酸，且将第456位氨基酸突变为精氨酸得到的蛋白质。
在更具体的实施方案中，编码前文所述IscB突变蛋白的核酸分子，具有以下任一核苷酸序列：
(1)SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；或，
(2)SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，
(3)与SEQ ID NO.4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列。
第二方面，本发明保护一种融合蛋白，所述融合蛋白包括前文任一所述的突变蛋白以及其他的修饰部分。
在具体的实施方案中，所述融合蛋白还包含优化的核定位信号序列，优选1xMycNLS。
在具体的实施方案中，本发明保护一种核酸分子，其编码前文所述的融合蛋白。
第三方面，本发明保护一种组合物，所述组合物包括：
1)第一核酸，其为编码上述蛋白的核酸分子；和
2)第二核酸，其为导向RNA，即本发明中所述的omigaRNA(obligate mobileelement–guided activity RNA)，所述omigaRNA根据靶基因序列设计构建。
在具体的实施方案中，所述组合物包括IscB mRNA和omigaRNA；所述IscB mRNA为SEQ ID NO.1的转录本；SEQ ID NO.5在SEQ ID NO.2的基础上增加了C端一侧的1xMyc NLS序列。
第四方面，本发明还提供了一种由IS200/IS605转座子家族编码的RNA引导的核酸酶(IscB)系统，其特征在于，所述系统包括：
(1)蛋白组分，其选自：前文所述的IscB突变蛋白、前文所述IscB突变蛋白的衍生化蛋白或融合蛋白，及其任意组合；
(2)核酸组分，其为omigaRNA，所述omigaRNA能够结合(i)所述蛋白组分，并引导蛋白组分至目标基因靶序列的gRNA核酸序列；所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成组合物。
第五方面，本发明还保护前文任一所述的突变蛋白，或前文任一所述的融合蛋白，或前文所述的核酸分子，或前文所述的系统，在基因编辑中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
在具体的实施方案中，所述基因编辑为基因敲除或基因敲入。
第六方面，本发明保护前文任一所述的突变蛋白，或前文任一所述的融合蛋白，或前文所述的核酸分子，或前文所述的系统，在制备制剂中的用途，所述制剂用于：
(i)基因或基因组编辑；
(ii)靶核酸检测和/或诊断；
(iii)编辑靶基因座中的靶序列来修饰生物；
(iv)疾病的治疗；
(v)靶向靶基因；
(vi)切割目的基因。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明可以在多个内源性位点进行高效的基因敲除及基因敲入。
(2)本发明的IscB系统结构很小，便于AAV的递送，为解决包装体积限制提供思路，增加在基因治疗领域的应用可能。
(3)IscB具有两个活性切割结构域，基于本发明优化的IscB蛋白的基础上可以做nickase单链编辑。
(4)本发明可以用来构建基因突变致病动物模型，针对罕见病突变位点进行敲除。
附图说明
图1.为亲本蛋白核定位信号的更换。其中，A为核定位信号更换的3种不同方法，B为在细胞内两处内源性位点上编辑效率的验证。
图2.基于算法预测的IscB蛋白单突变位点及其在细胞内编辑效率的验证。其中，A为IscB蛋白的单突变位点的标注，B为IscB蛋白单突变位点在细胞内编辑效率的验证。
图3.IscB蛋白高效单突变位点的组合突变在在细胞内编辑效率的验证。
图4.最优IscB蛋白的两种突变体在293T细胞中的不同内源性位点上的编辑效率验证。
图5.IscB蛋白复合物在小鼠Angptl3内源性基因上的模式图。
图6.最优IscB蛋白的两种突变体在小鼠Angptl3内源性基因上的编辑效率验证。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.IscB突变蛋白的获得
针对已知的IscB蛋白，申请人通过基于一种可突变位点的算法对IscB蛋白进行位点预测，并将氨基酸位点进行突变，得到了编辑活性提高的IscB突变蛋白。具体的，将IscB蛋白编码序列经过密码子优化(人类)并合成，野生型IscB蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
构建表达IscB突变体的载体时，均使用Clone Express II One Step CloningKit，以IscB真核表达载体(pST1374m-IscB-SV40 NLS)为模板，设计不同的引物，通过标准PCR方式合成。具体的设计方法是以突变的位点为中心将IscB蛋白的DNA序列设计分成两部分，设计两对引物分别扩增这两部分DNA序列，同时引物上引入需要突变的序列。突变体的组合则通过以IscB蛋白单个突变体为模板进行PCR引入新突变。
基于上述氨基酸突变位点，分别获得了IscB的野生型蛋白(Wild Type，WT)，以及上述氨基酸单个位点发生突变的蛋白(以突变类型命名)：T17R、G21R、I25R、V34R、F40R、E51R、L107R、T122R、G135R、I140R、A150R、F152R、N153R、N154R、G160R、W161R、S197R、F198R、N300R、Q301R、Q376R、A377R、L383R、A401R、M402R、D403R、A418R、S422R、Q432R、S456R、E459R、G460R、Y468R或L485R，其相对于SEQ ID No.1所示的序列，自N端第17位、第21位、第25位、第34位、第40位、第51位、第107位、第122位、第135位、第140位、第150位、第152位、第153位、第154位、第160位、第161位、第197位、第198位、第300位、第301位、第376位、第377位、第383位、第401位、第402位、第403位、第418位、第422位、第432位、第456位、第459位、第460位、第468位、第485位氨基酸分别突变为R。
实施例2.IscB野生型蛋白的核定位信号的优化
采用实施例1获得的IscB的野生型蛋白(WT)在HEK293FT细胞中验证其更换不同核定位信号的编辑活性，进一步优化IscB系统，其主要策略是将原始的SV40 NLS分别更换为1xMyc NLS或2xMyc NLS，如图1中A图所示。针对AAVS(人类)内源性基因和TTLL11(人类)内源性基因上设计靶点，其中AAVS-Site4：GACTCTAGCAGCGGACTTAGAA，斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区；TTLL11-Site1：ATTCTAGGCATATGTCATAGAA。
验证核定位信号更换的编辑活性时，将VPR复合物，即IscB系统不同核定位信号的载体和omigaRNA，转染至2×105HEK293FT细胞中，以1:1的比例(1μg：1μg)的质粒浓度进行脂质体转染。转染完毕后以WT IscB作为阳性对照，未转染的细胞作为阴性对照(negativecontrol，NC)。转染24小时后，向培养基中加入Puromycin和Blasticidin进行药筛。转染72小时后，收集细胞并通过高通量测序建库进行测序。
结果分析如图1中B图所示，结论显示使用1xMyc NLS的核定位信号最优。
实施例3.IscB单突变蛋白的编辑活性的验证
采用实施例2获得的核定位信号优化后的IscB蛋白，在此基础上应用实施例1获得的不同的IscB突变蛋白在HEK293FT细胞中验证其基因编辑的活性。
针对VEGFA(人类)内源性基因上设计靶点，VEGFA-Site1：AAAAGAGTGAACGAGACTAGAA，斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。载体pGL3-U6-omigaRNA带有Puromycin抗性基因，拿到设计合成的引物后，将每一对寡核苷酸进行退火，并与经BsaI限制性内切酶线性化的pGL3-U6-sgRNA载体片段连接，获得omigaRNA表达载体。
验证IscB蛋白变异体的活性时，将IscB突变蛋白和omigaRNA的复合物，转染至2×105HEK293FT细胞中，以1:1的比例(1μg：1μg)的质粒浓度进行脂质体转染。转染完毕后以野生型WT IscB作为阳性对照，未转染的细胞作为阴性对照(NC)。转染24小时后，向培养基中加入Puromycin和Blasticidin进行药筛。
药筛48小时后将细胞消化离心，并收取细胞用于提取基因组。
收取的细胞样品DNA提取方式如下：采用30μL的Quick Extract TM DNAExtraction Solution(Lucigen)重选细胞，之后65℃加热45min，接着涡旋离心并使用98℃加热2min。
采用2×Green Taq Mix(Vazyme)扩增DNA上含有编辑位点的目的片段，之后用于Sanger测序；或采用Phanta Super-Fidelity DNA polymerase(Vazyme)及高通量测序建库引物进行高通量测序分析编辑效率。高通量测序的编辑效果如图2所示。
实施例4.IscB迭代突变蛋白的编辑活性的验证
采用实施例3中获得的大于野生型IscB 1.2倍以上编辑效率的4个高效编辑活性的IscB突变蛋白，上述4个氨基酸单个位点发生突变的蛋白(以突变类型命名)：L107R、Q376R、A401R、S456R，其相对于SEQ ID No.1所示的序列其突变位点包括自N端起第107位、第376位、第401位、第456位。
基于上述氨基酸突变位点，分别进行迭代突变，下述氨基酸位点发生突变的蛋白：
SEQ ID No.1自N端起第107位和第376位氨基酸突变为R；SEQ ID No.1自N端起第107位和第401位氨基酸突变为R；SEQ ID No.1自N端起第107位和第456位氨基酸突变为R；SEQ ID No.1自N端起第376位和第401位氨基酸突变为R；SEQ ID No.1自N端起第376位和第456位氨基酸突变为R；SEQ ID No.1自N端起第401位和第456位氨基酸突变为R；SEQ IDNo.1自N端起第107位、第376位和第401位氨基酸均突变为R；SEQ IDNo.1自N端起第107位、第376位和第456位氨基酸均突变为R；SEQ ID No.1自N端起第107位、第401位和第456位氨基酸均突变为R；SEQ ID No.1自N端起第376位、第401位和第456位氨基酸均突变为R；SEQID No.1自N端起第107位、第376位、第401位和第456位氨基酸均突变为R。
针对VEGFA(人类)内源性基因上设计靶点，VEGFA-Site1：AAAAGAGTGAACGAGACTAGAA，斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。载体pGL3-U6-omigaRNA带有Puromycin抗性基因，拿到设计合成的引物后，将每一对寡核苷酸进行退火，并与经BsaI限制性内切酶线性化的pGL3-U6-sgRNA载体片段连接，获得omigaRNA表达载体。
验证IscB迭代突变体的活性时，将VPR复合物，即IscB突变蛋白和omigaRNA，转染至2×105HEK293FT细胞中，以1:1的比例(1μg：1μg)的质粒浓度进行脂质体转染。转染完毕后以野生型WT IscB作为阳性对照，未转染的细胞作为阴性对照(NC)。转染24小时后，向培养基中加入Puromycin和Blasticidin进行药筛。
药筛48小时后将细胞消化离心，并收取细胞用于提取基因组。
收取的细胞样品DNA提取方式如下：采用30μL的Quick Extract TM DNAExtraction Solution(Lucigen)重选细胞，之后65℃加热45min，接着涡旋离心并使用98℃加热2min。
采用2×Green Taq Mix(Vazyme)扩增DNA上含有编辑位点的目的片段，之后用于Sanger测序；或采用Phanta Super-Fidelity DNA polymerase(Vazyme)及高通量测序建库引物进行高通量测序分析编辑效率。高通量测序的编辑效果如图3所示。
图3结果显示最优的两种组合突变蛋白，其中一种组合方式为SEQ ID NO.3所示的核苷酸，其中氨基酸位点发生突变的蛋白(以突变类型命名)：Q376R和S456R，其相对于SEQID No.1所示的序列其突变位点包括自N端起第376位和第456位。
另一种组合方式为SEQ ID NO.4所示的核苷酸，其中氨基酸位点发生突变的蛋白(以突变类型命名)：Q401R和S456R，其相对于SEQ ID No.1所示的序列其突变位点包括自N端起第401位和第456位。
实施例5.IscB最优突变蛋白的不同内源性位点(人类)编辑活性的验证
利用实施例4得到的两种最优IscB突变蛋白，一种突变蛋白SEQ ID No.1自N端起第376位和第456位氨基酸均突变为R；另一种突变蛋白SEQ ID No.1自N端起第401位和第456位氨基酸均突变为R，验证其在不同内源性位点上的编辑效率。
选取了包括TTLL11-Site1、CDKN2A-Site1、CDKN2A-Site2、CDKN2A-Site3、RUNX1-Site1、RUNX1-Site2、ABLIM3-Site1、ABLIM3-Site2、NGR2-Site1、AAVS-Site1、EPHA8-Site1、TUBB6-Site1、TUBB6-Site2共13个内源性位点，在上述13个内源性位点(人类)上分别进行测试。采用野生型的WT IscB作为阳性对照，未转染细胞作为阴性对照(NC)。
采取具体的转染细胞、提取细胞基因组DNA、Sanger测序以及高通量建库测序流程如上述策略中所述一致。结果如图4所示，最优突变体的两种组合在不同内源性位点上与野生型的IscB编辑效率相比，均显著提升。
实施例6.IscB最优突变蛋白在小鼠内源性基因Angptl3上多个位点编辑活性的验证
利用实施例4得到的两种最优IscB突变蛋白，一种突变蛋白SEQ ID No.1自N端起第376位和第456位氨基酸均突变为R；另一种突变蛋白SEQ ID No.1自N端起第401位和第456位氨基酸均突变为R，验证其在小鼠N2A细胞中内源性基因Angptl3不同内源性位点上的编辑效率。
针对Angptl3(小鼠)内源性基因上设计靶点，Angptl3-Site1：GTGTACACTATTAAACCAAGAA，斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区；Angptl3-Site2：GAAGAGGAAAAGGAGCTAAGAA，斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区；Angptl3-Site3：GAGGAAAAGGAGCTAAGAAGAA，斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。载体pGL3-U6-omigaRNA带有PuroR抗性基因，拿到设计合成的引物后，将每一对寡核苷酸进行退火，并与经BsaI限制性内切酶线性化的pGL3-U6-sgRNA载体片段连接，获得omigaRNA表达载体。
验证IscB蛋白两种最优突变组合的活性时，将VPR复合物，即IscB突变蛋白和omigaRNA，如图5模式图所示，转染至2×105HEK293FT细胞中，以1:1的比例(1μg：1μg)的质粒浓度进行脂质体转染。转染完毕后以野生型WT IscB作为阳性对照，未转染的细胞作为阴性对照(NC)。转染24小时后，向培养基中加入Puromycin和Blasticidin进行药筛。
药筛48小时后将细胞消化离心，并收取细胞用于提取基因组。
收取的细胞样品DNA提取方式如下：采用30μL的Quick Extract TM DNAExtraction Solution(Lucigen)重选细胞，之后65℃加热45min，接着涡旋离心并使用98℃加热2min。
采用2×Green Taq Mix(Vazyme)扩增DNA上含有编辑位点的目的片段，之后用于Sanger测序；或采用Phanta Super-Fidelity DNA polymerase(Vazyme)及高通量测序建库引物进行高通量测序分析编辑效率。高通量测序的编辑效果如图6所示，最优突变体的两种组合在Angptl3-Site1、Angptl3-Site2和Angptl3-Site3这三种不同内源性位点上与野生型的IscB编辑效率相比，均显著提升。
上述说明示出并描述了发明的实施例，总之，本发明提供了一种优化的IscB蛋白，所述IscB突变蛋白与亲本野生型IscB蛋白相比，显著的提高了编辑活性，具有广泛的应用前景。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
1.突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白与如SEQ ID NO:1所示的野生型IscB蛋白相比，在以下任一个或多个氨基酸位点处存在突变：第17位、第21位、第25位、第34位、第40位、第51位、第107位、第122位、第135位、第140位、第150位、第152位、第153位、第154位、第160位、第161位、第197位、第198位、第300位、第301位、第376位、第377位、第383位、第401位、第402位、第403位、第418位、第422位、第432位、第456位、第459位、第460位、第468位、第485位，且所述突变均突变为精氨酸。
2.根据权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，编码野生型IscB蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白为将野生型IscB蛋白的第401位氨基酸突变为精氨酸，且将第456位氨基酸突变为精氨酸得到的蛋白质；
优选的，编码所述突变蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白为将野生型IscB蛋白的第376位氨基酸突变为精氨酸，且将第456位氨基酸突变为精氨酸得到的蛋白质；
优选的，编码所述突变蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括权利要求1-4任一所述的突变蛋白以及其他的修饰部分。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含核定位信号序列1xMyc NLS。
7.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求5或6所述的融合蛋白。
8.一种由IS200/IS605转座子家族编码的RNA引导的核酸酶(IscB)系统，其特征在于，所述系统包含：
(i)蛋白组分，其选自：权利要求1-4任一所述的突变蛋白，或权利要求5或6所述的融合蛋白；
(ii)核酸组分，其为omigaRNA，所述omigaRNA能够结合(i)所述蛋白组分，并引导蛋白组分至目标基因靶序列的gRNA核酸序列；所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成组合物。
9.权利要求1-4任一所述的突变蛋白，或5-6任一所述的融合蛋白，或权利要求7所述的核酸分子，或权利要求8所述的系统，在基因编辑中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用；
优选的，所述基因编辑为基因敲除或基因敲入。
10.权利要求1-4任一所述的突变蛋白，或5-6任一所述的融合蛋白，或权利要求7所述的核酸分子，或权利要求8所述的系统，在制备制剂中的用途，所述制剂用于：
(i)基因或基因组编辑；
(ii)靶核酸检测和/或诊断；
(iii)编辑靶基因座中的靶序列来修饰生物；
(iv)疾病的治疗；
(v)靶向靶基因；
(vi)切割目的基因。
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