CN117384884B - IscB多肽及其用途 - Google Patents
IscB多肽及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117384884B CN117384884B CN202311617088.7A CN202311617088A CN117384884B CN 117384884 B CN117384884 B CN 117384884B CN 202311617088 A CN202311617088 A CN 202311617088A CN 117384884 B CN117384884 B CN 117384884B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- iscb
- sequence
- target
- present disclosure
- polynucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 35
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 35
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 16
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 10
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 6
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 101150071322 ruvC gene Proteins 0.000 description 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 1
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 1
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 1
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 1
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 1
- 241000649045 Adeno-associated virus 10 Species 0.000 description 1
- 241000649046 Adeno-associated virus 11 Species 0.000 description 1
- 241000649047 Adeno-associated virus 12 Species 0.000 description 1
- 241000300529 Adeno-associated virus 13 Species 0.000 description 1
- 241000425548 Adeno-associated virus 3A Species 0.000 description 1
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100024482 Cell division cycle-associated protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101100383112 Homo sapiens CDCA4 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- KQDIGHIVUUADBZ-PEDHHIEDSA-N pentigetide Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KQDIGHIVUUADBZ-PEDHHIEDSA-N 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本公开提供了一种IscB多肽，包含其的系统，及其用途，特别是在DNA切割方面的用途。
Description
技术领域
本公开属于基因编辑技术领域，涉及一种IscB多肽及其用途。
背景技术
作为IS200/IS605转座子家族编码的一类内切核酸酶，IscB蛋白表现出指导核酸引导的内切核酸酶活性，具有作为基因编辑工具的潜力。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种IscB多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
在另一个方面，本公开提供了一种非天然存在的或工程化的IscB系统或组合物，其包含：
（1）本公开的IscB多肽，或者编码所述IscB多肽的多核苷酸；和
（2）指导核酸，或者编码所述指导核酸的多核苷酸，所述指导核酸包含：
（a）能够与所述IscB多肽形成复合物的支架序列；和
（b）能够与靶DNA中的靶序列杂交，由此将所述复合物引导至所述靶DNA的指导序列。
在又一个方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包含编码本公开的IscB多肽的多核苷酸。
在又一个方面，本公开提供了一种载体，其包含本公开的多核苷酸。
在又一个方面，本公开提供了本公开的IscB多肽、本公开的非天然存在的或工程化的IscB系统或组合物、本公开的多核苷酸、或者本公开的载体在用于制备用于修改靶DNA中的靶序列的试剂中的用途。
本公开包含以XML格式电子提交的序列表XML文件，其全文通过引用并入本文。所述XML文件系根据WIPO标准ST.26通过“WIPO Sequence”软件创建于2023年11月2日，命名为HEP007CN1.xml，大小为9,588字节。
根据WIPO标准ST.26，符号“t”用于表示DNA中的T和RNA中的U。因此在根据ST.26制备的本序列表中，当序列是RNA时，序列中的T应视为U。
附图说明
图1显示了代表性IscB多肽IscB.m3的内切核酸酶活性，由落在右侧虚线之外的点来指示。
具体实施方式
1.概述
作为IS200/IS605转座子家族编码的一类原核内切核酸酶，IscB蛋白表现出可以被指导核酸（guide nucleic acid）引导至靶DNA的可编程DNA内切核酸酶（programmableDNA endonuclease）活性，与Cas9蛋白具有一定的功能相似性，但不属于Cas蛋白（CRISPR相关蛋白）类别，也不属于Cas9蛋白类别。IscB蛋白包含PLMP、RuvC I、BH、接头、RuvC II、HNH、RuvC III、P1D和TID结构域，其中HNH和RuvC结构域分别负责切割dsDNA的靶向和非靶向DNA链。引导IscB蛋白的指导核酸可以是RNA，被称为指导RNA（guide RNA，gRNA）或omega RNA（ωRNA）。指导核酸包含能够与IscB蛋白相互作用以形成复合物（蛋白质-RNA复合物）的支架（scaffold）序列和能够与靶DNA中的靶序列杂交，由此将所述复合物引导至所述靶DNA的指导序列（guide sequence；又称间隔序列（spacer sequence））。
2.IscB多肽
在一个方面，本公开提供了一种IscB多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。所述IscB多肽表现出DNA切割活性，适用于DNA切割应用，例如在真核细胞中，例如切割真核细胞基因组。本公开还提供了一种IscB多肽，其包含如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有至少约60%（例如，至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%）的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述IscB多肽是分离的。
3.指导RNA
在另一个方面，本公开提供了一种指导核酸，或者编码所述指导核酸的多核苷酸，所述指导核酸包含：
（a）能够与本公开的IscB多肽形成复合物的支架序列；和
（b）能够与靶DNA中的靶序列杂交，由此将所述复合物引导至所述靶DNA的指导序列。
在一些实施方式中，所述支架序列如SEQ ID NO: 3所示。在一些实施方式中，所述支架序列包含SEQ ID NO: 3所示的多核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO: 3所示的多核苷酸序列具有至少约60%（例如，至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%）的序列同一性的多核苷酸序列。
4.IscB系统或组合物
在又一个方面，本公开提供了一种IscB系统或组合物，其包含：
（1）本公开的IscB多肽，或者编码所述IscB多肽的多核苷酸；和
（2）指导核酸，或者编码所述指导核酸的多核苷酸，所述指导核酸包含：
（a）能够与本公开的IscB多肽形成复合物的支架序列；和
（b）能够与靶DNA中的靶序列杂交，由此将所述复合物引导至所述靶DNA的指导序列。
在一些实施方式中，所述IscB系统或组合物是非天然存在的或工程化的。
在一些实施方式中，所述靶DNA是靶dsDNA。在一些实施方式中，所述靶DNA是原核DNA。在一些实施方式中，所述靶DNA是真核DNA。
在一些实施方式中，所述指导核酸是本公开的指导核酸。
在一些实施方式中，所述指导序列的长度为约14个核苷酸或至少约14个核苷酸，例如，长度为约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个核苷酸，或至少约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个核苷酸，或者长度为任何两个前述数值之间的数值范围，例如，长度为约16至约50个核苷酸。
在一些实施方式中，所述指导序列与所述靶DNA的所述靶序列约90-100%互补。在一些实施方式中，所述指导序列与所述靶DNA的所述靶序列100%互补。
在一些实施方式中，所述指导序列与所述靶序列之间存在不超过1、2、3、4或5个错配。
在一些实施方式中，所述IscB系统包含多个（例如，2、3、4、5或更多个）能够分别与多个靶序列杂交的指导序列。
在一些实施方式中，所述支架序列在所述指导序列的5’端或3’端。
在一些实施方式中，所述多个靶序列在同一多核苷酸上，或者在分开的多核苷酸上。
在一些实施方式中，所述IscB系统进一步包含用于整合到靶DNA中的供体DNA模板。在一些实施方式中，在本公开的IscB多肽对靶DNA进行切割后，所述供体DNA模板被插入到靶DNA中。在一些实施方式中，所述插入是通过同源重组进行。
在一些实施方式中，所述引导所述复合物至所述靶DNA导致对所述靶序列的修改。
在一些实施方式中，对所述靶序列的修改是对所述靶序列的双链切割或单链切割。在一些实施方式中，对所述靶序列的双链切割或单链切割导致产生缺失和/或插入突变（Indel）。在一些实施方式中，所述缺失和/或插入突变（Indel）改变所述靶序列的转录和/或表达。
在一些实施方式中，所述引导所述复合物至所述靶DNA导致对所述靶序列的转录的修改。
在一些实施方式中，对所述靶序列的转录的修改是转录上调、转录下调、转录激活或转录抑制。
5.多核苷酸
在又一个方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包含（1）编码本公开的IscB多肽的第一多核苷酸；和/或（2）编码本公开的指导RNA的第二多核苷酸。
在一些实施方式中，所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸为在真核（例如哺乳动物，如人类）细胞中表达而进行了密码子优化。
在一些实施方式中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸被编码在同一个或不同的多核苷酸上。在一些实施方式中，当被编码在同一个多核苷酸上时，所述第一多核苷酸在所述第二多核苷酸的3’端或5’端。
6.载体
在又一个方面，本公开提供了一种载体，其包含本公开的多核苷酸。
在一些实施方式中，所述载体是质粒。在一些实施方式中，所述载体是逆转录病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒（HSV）载体、AAV载体或慢病毒载体。在一些实施方式中，所述AAV载体是血清型为AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAV.PHP.eB，AAV1-AAV13中的任一者所属的进化枝的成员，或其功能性截断变体或功能性突变体的重组AAV载体。
7.修改方法
在又一个方面，本公开提供了一种用于修改靶DNA中的靶序列的方法，其包括将所述靶DNA与以下接触：本公开的IscB多肽、本公开的IscB系统或组合物、本公开的多核苷酸、或者本公开的载体，其中所述靶序列被所述复合物修改。
在又一个方面，本公开提供了本公开的IscB多肽、本公开的IscB系统或组合物、本公开的多核苷酸、或者本公开的载体在制备用于修改靶DNA中的靶序列的试剂中的用途。
在又一个方面，本公开提供了本公开的IscB多肽、本公开的IscB系统或组合物、本公开的多核苷酸、或者本公开的载体用于修改靶DNA中的靶序列。
本公开中提及的序列如下：
SEQ ID NO: 1，IscB.m3氨基酸序列，503 aa
MDTYVYVINKDGEPLMPTTRCGHVRILLKQRKAVVVERKPFTIQLLYECENKTQRLLYGNDPGRTNIGVCVVKEDGTPVFAANVETRNKDIPTLMAARKKYRQQHRHQKRRCKRQRRALKAGTYTKEIIERKLPGCEKSIICHYIKNKEARFNNRKRPNGWLTPTARQLLQTYINLLIRVSKFLPITDVVMEVNKFAFMELDDPNVRKWQYAKGPLYKKGSVDNAVYEQQHGHCIFCKNEIDAYHHIIPVSKYGSDTLQNKAGLCERHHHLVHTEDIWKEKLKAKKAGLNKKYGALSVLNQIIPYLVKEYAKLYPTYITDGRSTKEFREDHNLKKDHYIDAYCIACSILNDPETKETEPYHIKQYRRHDRQACHQEMVDRKYYLNDKVIAVNRHKRKEQFADSLEEYRKTHSEAEVSKLKVRPHPAAYKNMDRVMPGALMVYEPRISKKDKEKGIVAHNIIFIFKGSNGTHDGKPDYYISENGKRYSAGRCKALLQNRGLIFI
SEQ ID NO: 2，IscB.m3编码序列，1509 bp
ATGGACACCTACGTTTACGTGATCAACAAGGACGGAGAGCCTCTGATGCCGACAACCAGATGTGGCCATGTGAGAATCCTGCTTAAGCAGAGAAAGGCTGTCGTGGTGGAACGGAAACCTTTCACCATCCAGCTGCTCTACGAGTGTGAGAACAAGACACAACGGCTCCTGTACGGAAATGATCCCGGCCGTACCAACATCGGCGTTTGTGTGGTGAAGGAGGACGGCACCCCTGTGTTCGCTGCTAACGTGGAAACCCGGAACAAAGACATTCCTACACTGATGGCCGCCAGAAAGAAGTACAGACAACAGCACAGGCACCAGAAGAGACGGTGCAAAAGACAGAGACGGGCCCTGAAGGCTGGAACCTACACCAAGGAGATCATCGAGCGCAAGCTGCCTGGCTGCGAGAAATCTATCATCTGCCACTACATTAAAAACAAGGAAGCTAGATTCAACAACCGGAAAAGACCAAACGGCTGGCTGACACCAACCGCCCGGCAGCTGCTGCAGACCTACATCAACCTGCTGATCCGGGTGTCCAAATTCCTGCCTATCACAGATGTGGTGATGGAGGTCAACAAGTTCGCCTTCATGGAACTGGACGACCCTAATGTGCGCAAGTGGCAGTACGCCAAAGGCCCTCTGTACAAGAAAGGCAGCGTGGACAATGCCGTGTACGAACAGCAGCACGGCCACTGCATCTTCTGCAAGAACGAGATCGATGCCTATCATCACATCATTCCCGTGTCCAAGTACGGCTCTGATACACTGCAGAACAAGGCCGGCCTGTGCGAGAGACACCACCACCTGGTGCACACCGAAGATATTTGGAAGGAGAAGCTGAAGGCCAAGAAGGCCGGGCTGAACAAGAAGTACGGCGCCCTGAGCGTGCTGAACCAGATCATCCCCTACCTGGTGAAGGAATACGCTAAGCTGTACCCTACCTACATCACCGACGGAAGAAGCACCAAGGAGTTTCGCGAGGACCACAACCTGAAGAAGGACCACTACATCGACGCCTACTGCATCGCCTGCAGCATCCTGAACGATCCCGAAACCAAAGAGACAGAGCCCTACCACATCAAGCAATACAGACGGCACGACAGACAGGCCTGTCACCAGGAGATGGTCGATAGAAAGTATTACCTGAATGACAAGGTGATCGCCGTGAATAGACATAAGAGAAAAGAGCAGTTCGCCGACAGCCTGGAGGAATATCGGAAAACCCACAGCGAGGCCGAGGTGAGCAAGCTGAAGGTGCGGCCCCACCCTGCCGCCTACAAGAACATGGACAGAGTGATGCCTGGCGCGCTGATGGTGTATGAACCTAGAATCAGCAAGAAGGACAAAGAAAAGGGCATCGTGGCCCACAACATCATCTTCATCTTTAAGGGCTCTAATGGCACACACGATGGCAAGCCTGACTACTACATCAGCGAAAACGGAAAAAGATACAGCGCCGGCAGATGCAAGGCACTGCTGCAGAACAGGGGCCTGATCTTTATC
SEQ ID NO: 3，支架序列，180 nt
GGCTATGTGTCATGAGTGGTGGAAACACTACTAATGGAGCATAGCACAGGCGAATAAATATGCATGCACTTGCGAGGTTTTCCCAGCCCGCGACCTGCTCAATGTATATTTAGTCAGGGGAAACATTCACCCGTCTTCGAGACGGAGTTTTACAAAATTTTAATGAAAGGAGAAGCGGAT
SEQ ID NO: 4，指导序列，14 nt
CAGTAGGAGCATAC
SEQ ID NO: 5，指导RNA，194 nt
CAGTAGGAGCATACGGCTATGTGTCATGAGTGGTGGAAACACTACTAATGGAGCATAGCACAGGCGAATAAATATGCATGCACTTGCGAGGTTTTCCCAGCCCGCGACCTGCTCAATGTATATTTAGTCAGGGGAAACATTCACCCGTCTTCGAGACGGAGTTTTACAAAATTTTAATGAAAGGAGAAGCGGAT
SEQ ID NO: 6，指导RNA的编码序列，194 nt
CAGTAGGAGCATACGGCTATGTGTCATGAGTGGTGGAAACACTACTAATGGAGCATAGCACAGGCGAATAAATATGCATGCACTTGCGAGGTTTTCCCAGCCCGCGACCTGCTCAATGTATATTTAGTCAGGGGAAACATTCACCCGTCTTCGAGACGGAGTTTTACAAAATTTTAATGAAAGGAGAAGCGGAT
SEQ ID NO: 7，靶序列，14 nt
CAGTAGGAGCATAC
应理解，本公开的任何标题或小标题都仅仅是出于说明而非限制目的使用，在任何标题或小标题下的任何章节中的任何实施方式都可以与同一章节或不同章节中的任何其他实施方式进行组合而不脱离本公开的范围。
实施例1：评估代表性IscB多肽的内切核酸酶活性。
申请人新近鉴定的一种代表性IscB多肽，称为IscB.m3（SEQ ID NO: 1），被选择用于评估其内切核酸酶活性。
本实施例展示了该代表性IscB多肽的内切核酸酶活性。
设计和构建：
构建了表达质粒和目标切割质粒用于检测代表性IscB多肽IscB.m3的内切核酸酶活性。
该表达质粒包含在lacI启动子调控下的IscB.m3（SEQ ID NO: 1）的编码序列（SEQID NO: 2）和在J23119启动子调控下的指导RNA（SEQ ID NO: 5）的编码序列（SEQ ID NO:6），所述指导RNA由5’-3’方向上的指导序列（SEQ ID NO: 4）和支架序列（SEQ ID NO: 3）组成。
该目标切割质粒包含cat启动子调控下的氯霉素抗性基因CmR，以及旨在被指导RNA靶向的靶序列（SEQ ID NO: 7）。该氯霉素抗性基因CmR旨在使得被该目标切割质粒转化的大肠杆菌可以在含有氯霉素的培养器上生长。考虑到IscB.m3可能具有靶序列识别偏好性，受到紧邻所述靶序列的3’端的TAM（target adjacent motif，靶序列邻近基序）序列的影响，还在目标切割质粒中设置了紧邻所述靶序列的3’端的8N TAM序列，其中N代表核苷酸A、T、C或G，也即给出4^8=65536种TAM，因而构成了包含所有可能TAM的一个目标切割质粒文库。
当表达质粒与目标切割质粒文库被共同转化到大肠杆菌中时（每个大肠杆菌细胞可能被转化了表达质粒和一种或多种目标切割质粒），表达质粒表达IscB.m3和指导RNA，两者形成复合物，指导RNA（且因此复合物）靶向目标切割质粒包含的靶序列。如果IscB.m3具有内切核酸酶活性且能够识别靶序列的3’端的TAM，则其会对靶序列进行切割，导致目标切割质粒降解而不能表达氯霉素抗性基因CmR，进而导致大肠杆菌无法在含有氯霉素的培养器上生长。
具体地，根据生产商说明书，将100 ng的表达质粒和100 ng的目标切割质粒文库通过电穿孔来转化到30 μL的感受态大肠杆菌（TransforMax EC100 Electrocompetent E.coli）中（实验组），同时准备空白对照（对照组）。转化后将大肠杆菌在37°C下振摇培养1小时，然后铺在覆盖有含氯霉素的常规细菌培养基的培养板上，在37°C下生长12-16小时。然后从板上将大肠杆菌刮下来，用培养基重悬，混合均匀，用于提质粒（MN）。将300 ng的提取质粒用于对含TAM区域进行PCR扩增，并添加Illumina接头和条形码，进行高通量测序，以确认切割情况。
结果：
测序结果总结如图1所示。图上的每个点代表65536种TAM之一。图1中的实线表示实验组大肠杆菌中的每个TAM的丰度与对照组大肠杆菌中的相应TAM的丰度相同（比率为1:1）的情况（例如，前者为10-4，后者也为10-4），实线左侧和右侧的虚线分别表示统计学上的+3σ或-3σ。
在对某个TAM没有识别和相应切割的情况下，实验组大肠杆菌中的每个TAM的丰度应当与未经处理的对照组大肠杆菌中的相应TAM的丰度基本上相同，则代表该TAM的点会基本上落在实线上。
如果代表某个TAM的点落在右侧虚线的右下方（即，<-3σ），则表示对于该点所代表的TAM及其相邻靶序列，IscB.m3识别并导致了具有统计学显著性差异的切割，导致目标切割质粒降解，不表达抗性基因，进而导致实验组大肠杆菌死亡，使得最后收集的实验组大肠杆菌中的TAM的丰度（例如10-5）低于未经处理的对照组中的相应TAM的丰度（例如10-4），因此落在实线右下方，当不仅是落在实线右下方而且是落在实线右侧的虚线的右下方时，则表明该等TAM丰度差异超过了统计学上的3σ，具有统计学显著性。
图1示出有大量点落在右侧虚线的右下方，证明对于相应的大量TAM，IscB.m3均识别并表现出内切核酸酶活性，可用于切割3’端为该等TAM的DNA靶序列。
Claims (5)
1.一种IscB多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1所述的IscB多肽的多核苷酸。
3.权利要求2所述的多核苷酸，其如SEQ ID NO: 2所示。
4.一种载体，其包含权利要求2或3所述的多核苷酸。
5.权利要求1所述的IscB多肽、权利要求2或3所述的多核苷酸、或者权利要求4所述的载体在用于制备用于修改靶DNA中的靶序列的试剂中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311617088.7A CN117384884B (zh) | 2023-11-30 | 2023-11-30 | IscB多肽及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311617088.7A CN117384884B (zh) | 2023-11-30 | 2023-11-30 | IscB多肽及其用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117384884A CN117384884A (zh) | 2024-01-12 |
| CN117384884B true CN117384884B (zh) | 2024-03-08 |
Family
ID=89468615
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311617088.7A Active CN117384884B (zh) | 2023-11-30 | 2023-11-30 | IscB多肽及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117384884B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023097228A1 (en) * | 2021-11-23 | 2023-06-01 | The Broad Institute, Inc. | Reprogrammable iscb nucleases and uses thereof |
| WO2023097282A1 (en) * | 2021-11-24 | 2023-06-01 | Metagenomi, Inc. | Endonuclease systems |
| CN116583599A (zh) * | 2020-10-23 | 2023-08-11 | 博德研究所 | 可重编程IscB核酸酶及其用途 |
| CN116656649A (zh) * | 2023-06-02 | 2023-08-29 | 南京医科大学 | 一种is200/is60s转座子iscb突变蛋白及其应用 |
| CN116783295A (zh) * | 2021-08-30 | 2023-09-19 | 辉大(上海)生物科技有限公司 | 指导rna的新型设计及其用途 |
| CN116790556A (zh) * | 2022-03-14 | 2023-09-22 | 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 | Dna靶向基因编辑工具的开发 |
| CN116790555A (zh) * | 2022-03-14 | 2023-09-22 | 上海鲸奇生物科技有限公司 | Rna靶向基因编辑工具的开发 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110275135A1 (en) * | 2010-05-05 | 2011-11-10 | Battelle Energy Alliance, Llc | Genetic elements, proteins, and associated methods including application of additional genetic information to gram (+) thermoacidophiles |
| CN115698296A (zh) * | 2020-03-31 | 2023-02-03 | 日商基因编辑力股份有限公司 | 编辑靶标rna的方法 |
-
2023
- 2023-11-30 CN CN202311617088.7A patent/CN117384884B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116583599A (zh) * | 2020-10-23 | 2023-08-11 | 博德研究所 | 可重编程IscB核酸酶及其用途 |
| CN116783295A (zh) * | 2021-08-30 | 2023-09-19 | 辉大(上海)生物科技有限公司 | 指导rna的新型设计及其用途 |
| WO2023097228A1 (en) * | 2021-11-23 | 2023-06-01 | The Broad Institute, Inc. | Reprogrammable iscb nucleases and uses thereof |
| WO2023097282A1 (en) * | 2021-11-24 | 2023-06-01 | Metagenomi, Inc. | Endonuclease systems |
| CN116790556A (zh) * | 2022-03-14 | 2023-09-22 | 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 | Dna靶向基因编辑工具的开发 |
| CN116790555A (zh) * | 2022-03-14 | 2023-09-22 | 上海鲸奇生物科技有限公司 | Rna靶向基因编辑工具的开发 |
| CN116656649A (zh) * | 2023-06-02 | 2023-08-29 | 南京医科大学 | 一种is200/is60s转座子iscb突变蛋白及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 基于CRISPR系统基因编辑与基因调控技术的发展;杨明辉;陶景丽;柴孟龙;吴昊;连正兴;刘国世;;农业生物技术学报;20180225(第02期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117384884A (zh) | 2024-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9738908B2 (en) | CRISPR/Cas systems for genomic modification and gene modulation | |
| US20230272380A1 (en) | Engineered Guide RNA Sequences for In Situ Detection and Sequencing | |
| EP3350327B1 (en) | Engineered crispr class 2 cross-type nucleic-acid targeting nucleic acids | |
| US20200224221A1 (en) | Genome editing method | |
| CN1890373B (zh) | Dna克隆载体质粒及其使用方法 | |
| CN1981047B (zh) | Dna克隆载体质粒的动态载体装配方法 | |
| WO2018218188A2 (en) | Base editors with improved precision and specificity | |
| WO2017040709A1 (en) | Directed nucleic acid repair | |
| CN109689875B (zh) | 基因组编辑系统和方法 | |
| CN113373130A (zh) | Cas12蛋白、含有Cas12蛋白的基因编辑系统及应用 | |
| WO2020224611A1 (en) | Improved gene editing system | |
| CN113913405A (zh) | 一种编辑核酸的系统及方法 | |
| CN117384884B (zh) | IscB多肽及其用途 | |
| CN117511912B (zh) | IscB多肽、包含其的系统及其用途 | |
| CN117925573A (zh) | Dna编辑工具、系统及其用途 | |
| US20240026381A1 (en) | Split prime editing platforms | |
| US20230374479A1 (en) | Technique for modifying target nucleotide sequence using crispr-type i-d system | |
| CN111278983A (zh) | 基因敲除方法 | |
| WO2021081384A1 (en) | Synthetic nucleases | |
| US20240043820A1 (en) | Enzyme variants | |
| CN117897481A (zh) | 一种外源基因定点整合的系统及方法 | |
| US20240076655A1 (en) | Mammalian cells and methods for engineering the same | |
| Sparks | CONSTRUCTING PLASMIDS WITH A NOVEL UBIQUITIN PROMOTER FOR USE IN THE TRANSFORMATION OF CANNABIS SATIVA L. | |
| WO2023167860A1 (en) | Insect cells and methods for engineering the same | |
| WO2024089629A1 (en) | Cas12 protein, crispr-cas system and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |