CN1981047B - Dna克隆载体质粒的动态载体装配方法 - Google Patents

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Abstract

使用克隆载体质粒，在单一步克隆步骤中制备DNA分子如转基因的方法。该转基因可用于基因表达和基因表达分析。根据载体的最终用户和他们的使用方法，对该质粒克隆载体进行人工改造，以使DNA片段组分的操作量最小化。使用本发明制备的转基因可用在一种生物或多种生物中，包括细菌、酵母、小鼠和其它经过微小的或没有经过进一步修饰的真核生物。

Description

DNA克隆载体质粒的动态载体装配方法
发明背景
总体上说，本发明涉及克隆载体质粒领域，特别地，涉及用克隆载体质粒快速装配DNA构建物或转基因的方法。
分子生物学的基础是重组DNA技术，在这里，重组DNA技术可以被概括为：为研究核酸及其蛋白产物的结构和功能而进行的核酸修饰与增殖。
单个基因、基因调控区、基因亚群和包含它们的完整的染色体都是由腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的双链反向平行序列构成的，这些核苷酸通常分别用首字母A、T、G和C表示。这些DNA序列，以及来源于mRNA(信使RNA)分子的双链DNA拷贝——cDNA序列，可以切割成不同的片段、分离并插入载体如细菌质粒中，从而研究基因产物。质粒是最初来源于细菌的染色体外DNA片段，可以对它进行操作并重新导入宿主细菌中，用于研究或制备基因产物。质粒DNA与所有染色体DNA相似，这是因为质粒DNA是由相同的A、T、G和C核苷酸构成的，编码基因和基因调控区，然而它是相对较小的分子，包含大约30,000以下个碱基对或者30千碱基(kb)以下。此外，双链质粒的核苷酸碱基对形成连续的环状分子，并将质粒DNA与染色体DNA区别开来。
质粒增强了细菌生物间遗传物质的快速交换，并使其能够快速适应环境的变化如温度、食物供应或其它挑战。任何所获得的质粒必定表达有助于其宿主存活的一个或一些基因，否则将会被该生物破坏或丢弃，这是因为保留非必需质粒将是对资源的浪费使用。细胞的克隆群落含有相同的遗传物质，包括它可能含有的任何质粒。在这样的宿主细胞克隆群落中使用带有DNA插入片段的克隆载体质粒将扩增可获得的感兴趣DNA的量。然后，可以分离这样克隆得到的DNA并回收之，用于随后在构建DNA构建物所需的步骤中进行操作。因此，应当认识到，克隆载体质粒是研究基因功能的有用工具，它提供了快速制备大量感兴趣的DNA插入片段的能力。
尽管在质粒中发现的一些元件是天然存在的，已经人工改造了其它一些元件以增强质粒作为DNA载体的效用。这些元件包括抗生素-或化学品-抗性基因和多克隆位点(MCS)，和其他元件。这些元件中的每一个在本发明以及现有技术中发挥作用。对每个元件所起作用的描述将凸显出现有技术的局限性并证明本发明的用途。
宿主能够获得的特别有用的质粒产生的基因是赋予抗生素抗性的基因。在重组DNA技术的日常实践中，抗生素抗性基因被开发作为阳性或阴性选择元件，以优先增强期望质粒的培养和扩增，使其超过其它质粒。
为了能被宿主细菌所维持，质粒还必须含有指导宿主复制该质粒的序列片段。被称为复制起点(ORI)元件的序列指导宿主使用其自身的细胞酶产生该质粒的拷贝。当这样的细菌分裂时，每个子代细胞将保留一个或多个拷贝的任何这样的质粒。已经衍生得到某些大肠杆菌(E.coli)菌株以使这种复制最大化，从而每个细菌产生高达300个拷贝。按照这种方式，可以增强期望质粒的培养。
在任何克隆载体中的另一个基本元件是用于插入感兴趣的遗传物质的位置。这是已经被人工改造入“野生型”质粒的合成元件，因此赋予了作为克隆载体的效用。任何典型的商业上可获得的克隆载体质粒含有至少一个这样的区域，称为多克隆位点(MCS)。MCS一般包括被一种内切核酸酶或一系列内切核酸酶切割的核苷酸序列，每一种内切核酸酶都有不同的识别序列和切割方式。DNA分子中编码的限制性内切核酸酶(RE)位点的所谓的识别序列包括双链回文序列。尽管一些RE酶需要8个或者更多个核苷酸的序列，然而对于一些RE酶来说，少至4-6个核苷酸就足以提供识别位点。例如RE酶EcoR1识别双链六聚体核苷酸序列：5’G-A-A-T-T-C3’，其中5’表示习惯上称为“上游”末端的分子末端，同样地3’表示“下游”末端。识别序列的互补链将是其反向平行链，3’G-A-A-T-T-C5’。由于每一个内切核酸酶位点都是双链核苷酸序列，所以6核苷酸的识别位点实际上是6个碱基对(bp)。因此双链识别位点可以在其所在的较大双链分子中表示出，如下所示：5’......G-A-A-T-T-C......3’3’.....C-T-T-A-A-G......5’。
如同许多其它RE酶，EcoR1不是在二重对称轴上准确切割，而是在两条DNA链中相距4个核苷酸的位置上切割，其间的核苷酸用“/”表示出：5’......G/A-A-T-T-C......3’3’......C-T-T-A-A/G......5’这样，双链DNA分子被切割并且在新形成的“末端”获得如下核苷酸构型：5’......G3’5’A-A-T-T-C......3’3’......C-T-T-A-A5’3’G......5’。
这种交错的切割方式产生了具有突出的5’末端的DNA片段。因为当相互接近时，A-T和G-C对会自发形成，所以诸如这样的突出末端被称为粘性末端或粘末端。这些末端中任何一个可以与用相同限制性酶切割的任何其它互补末端形成氢键。由于含有特定识别序列的任何DNA将以与含有相同序列的任何其它DNA相同的方式被切割，那些被切割的末端将是互补的。因此，用相同RE酶切割的任何DNA分子的末端以邻近片段七巧板“匹配”的方式相互配对，并可以酶促连接在一起。正是这种特性使得能够形成重组DNA分子，并使外源DNA片段能够引入细菌质粒或引入任何其它DNA分子中。
当构建重组DNA分子时还要考虑的一般原则是分子中出现的所有内切核酸酶位点都将被特定的RE酶切开，而不仅仅是感兴趣的位点。DNA分子越大，任何内切核酸酶位点越有可能重复出现。假设任何内切核酸酶位点是沿DNA分子随机分布的，按平均值计算，四聚体核苷酸位点将每44(即256)个核苷酸或bp出现一次，而六聚体核苷酸位点将每46(即4096)个核苷酸或bp出现一次，八聚体核苷酸位点将每48(即114,688)个核苷酸或bp出现一次。因此，可以容易地认识到较短的识别序列将频繁出现，而较长的识别序列将很少出现。在计划构建转基因或其它重组DNA分子时，这是个至关重要的问题，因为这样的方案经常需要装配几个不同大小的DNA片段。这些片段越大，希望使用的位点越有可能在DNA组分的几个片段中出现，从而最大限度地给操作制造困难。
经常出现的内切核酸酶位点在本文中是指常见位点，切割这些位点的内切核酸酶是指常见内切核酸酶。具有6个bp以上同源限制性位点的限制性酶是指罕见限制性酶，且它们的同源限制性位点是指罕见限制性位点。然而，一些6bp的内切核酸酶位点的出现频率比统计学预测的要低，这些位点以及切割它们的内切核酸酶也是罕见的。因此，名称“罕见的”和“常见的”不是指任何特定限制性酶的相对丰度或有效性，而是指任何DNA分子或分离的DNA分子片段、或者任何基因或其DNA序列中构成其同源识别位点的核苷酸序列的出现频率。
近来，已经分离出第二类内切核酸酶，称为归巢内切核酸酶(HE)。HE酶具有大的非回文不对称识别位点(12-40个碱基对)。HE识别位点极其罕见。例如，称为I-SceI的HE具有18bp的识别位点，(5’...TAGGGATAACAGGGTAAT...3’)，预计在每7×1010bp的随机序列中仅出现一次。这一出现频率等同于在20个哺乳动物大小的基因组中仅有一个位点。如果HE识别位点包含在克隆载体质粒的合适位置中，那么HE识别位点的罕见性特征就极大地增加了遗传工程师可以切割最终转基因产物的可能性，而不破坏转基因的完整性。
因为来自任何生物来源的DNA分子都将被内切核酸酶以相同的方式切割，所以来自任何物种的外源DNA片段都可以用内切核酸酶切割，插入到用相同内切核酸酶切割的细菌质粒载体中，并在合适的宿主细胞中扩增。例如，如果人类基因可以用称为EcoR1的RE酶在两个部位切割，那么就可以分离带有EcoR1末端的期望片段，并与同样用EcoR1切割的质粒在通常称作连接混合物的体系中混合。在适当条件下，于连接混合物中，一些分离的人类基因片段将与质粒分子的末端相匹配。这些新结合的末端可以连接在一起(被连接)从而酶促重新环化该质粒，该质粒现在含有其新的DNA插入片段。然后将该连接混合物导入大肠杆菌或另一种合适的宿主中，当细菌分裂时该新的工程质粒将被扩增。以这种方式，可以从细菌中获得并收获相对大量的人类基因拷贝。然后可以进一步操作这些基因拷贝，用于研究、分析或制备该基因产物蛋白。
重组DNA技术经常是以产生所谓的“转基因”的方式来实施的。转基因通常包括来源于一种或多种供体生物并被导入宿主生物的各种遗传物质。一般地，转基因是使用克隆载体作为实验方案的起点或“骨架”来构建的，并设计一系列复杂的克隆步骤从而在该载体内装配最终产物。转基因的元件——包含核苷酸序列，包括但不限于1)调控启动子和/或增强子元件，2)将表达为mRNA分子的基因，3)赋予mRNA信息稳定性的DNA元件，4)模拟哺乳动物内含子基因区域的核苷酸序列，和5)mRNA加工的信号，如添加在天然发生的mRNA末端的多聚-A尾巴。在一些情况下，实验设计可能要求添加定位信号，以将基因产物运输到特定的亚细胞位置。
转基因的每一个元件可以作为较大DNA分子的片段获得，其是从供体基因组中切割而来的，或者在一些情况下是在实验室合成的。尽管本发明将内切核酸酶应用于本文中要求保护的方法，但是应当理解的是，每一个较小的元件——其包含例如在本文的方法中所使用的插入片段或模块，都可以通过从头合成、重组工程、和/或PCR末端突出端克隆方法来产生。合成转基因组成元件的一种这样的方法包括Jarrell等在美国专利6,358,712中公开的方法，该专利在此作为参考以其全文并入本文。尽管Jarrell公开了将转基因元件“焊接”在一起的方法，但只有本发明的方法公开了一旦这些元件被装配之后可将其“解焊接”并重新装配的方式。根据本发明的一个方面，每一个片段都是以精确的顺序和5’-3’方向与其它片段一起被装配入克隆载体质粒中。
任何基因的启动子都可以作为DNA片段分离得到，并置于合成的分子如质粒中，以指导期望基因的表达，假定可以提供激活感兴趣的启动子所必需的条件的话。例如，可以分离胰岛素基因的启动子序列，并与报告基因一起置于克隆载体质粒中，用于研究在适当的细胞类型中表达胰岛素基因所需的条件。可选地，该胰岛素基因的启动子可以与克隆载体质粒中任何感兴趣基因的蛋白质编码序列相连，并用于引发感兴趣的基因在胰岛素-表达细胞中表达，假定在如此构建的DNA转基因中存在所有必需的元件。
报告基因是某些类型的转基因中特别有用的组分。报告基因包括编码蛋白的核苷酸序列，该蛋白将在转基因中与之连接的感兴趣的特定启动子的指导下表达，从而给出针对该启动子活性的可测量的生物化学应答。相对于内源细胞蛋白背景，报告基因一般是易于检测或测量的。通常使用的报告基因包括但不限于LacZ、绿色荧光蛋白和萤光素酶，以及其它报告基因，其中许多报告基因都是本领域的普通技术人员所熟悉的。
内含子，是哺乳动物基因中的非编码区，在细菌基因组中没有被发现，但却是哺乳动物细胞中mRNA分子正确形成所需要的。因此，用于哺乳动物系统中的任何DNA构建物必需含有至少一个内含子。内含子可以从任何哺乳动物基因中分离并连同合适剪接信号一起被插入到DNA构建物中，该剪接信号使哺乳动物细胞能够切除内含子并将剩余的mRNA末端剪接在一起。
mRNA稳定性元件是为保护一些mRNA免于降解的结合蛋白所识别的DNA序列。包含有mRNA稳定性元件通常将增强该mRNA在一些哺乳动物细胞类型中的基因表达水平，因此在一些DNA构建物或转基因中可能是有用的。mRNA稳定性元件可以从天然发生的DNA或RNA中分离，或者合成产生，用于包含在DNA构建物中。
定位信号是编码负责感兴趣蛋白亚细胞途经的蛋白质信号的DNA序列。例如，核定位信号将指导蛋白质到细胞核；质膜定位信号将指导它到质膜，等等。因此，定位信号可以整合入DNA构建物中以帮助其蛋白产物易位至期望的亚细胞位置。
标签序列可以在DNA构建物中被编码，以便蛋白质产物连接有独特的区域。此独特区域作为可以与其内源对应物相区别的蛋白质标签。可选地，它可以作为鉴定物，其可以通过本领域所熟悉的大量的各种技术，包括但不限于RT-PCR、免疫组织化学术或原位杂交，来加以检测。
使用复合转基因，或使用包括特别大的DNA区域的转基因，将增加在这些DNA片段中含有多个内切核酸酶识别位点的可能性。回想一下，编码任何一个六聚体核苷酸位点的识别序列每4096bp(46)出现一次。如果3000bp的启动子序列和1500bp的感兴趣基因要装配进一个3000bp的克隆载体，那么在统计学上很可能许多6核苷酸或更少核苷酸的位点都将不能使用，因为任何可用的位点必须只能在片段中出现两次。而且，该位点必须出现在待被组装的合适分子的合适区域内。此外，大多数克隆方案将要求含有添加的额外DNA元件，因而增加生长分子的复杂性以及任何特定限制性位点不适当重复的可能性。由于任何限制性酶将在分子中其所有位点上进行切割，如果内切核酸酶限制性位点重复出现，那么所有不合适的位点连同期望的位点一起都将被切割，从而破坏了该分子的完整性。因此，必须小心设计每一步克隆步骤，以免不会因使用已用于整合前面的元件的内切核酸酶进行切割而破坏了该生长分子。最后，当研究者希望将完成的转基因导入哺乳类生物时，完全装配的转基因构建物经常必须在该转基因的至少一个末端的独特识别位点上被线性化，因此还需要另外一个在该构建物中无法找到的独特识别位点。因为大多数DNA构建物都是为单一目的设计的，很少考虑到将来可能需要做出的任何修饰，这进一步增加了将来实验变化的难度。
传统上，由于若干原因，转基因的设计和构建要耗费大量的时间和精力，原因包括如下：
1.尽管有大量可利用的各种内切核酸酶能产生一大批末端，但是这些末端中的大多数相互间都是不相容的。许多内切核酸酶如EcoR1能生成带有突出的5’粘性末端或“尾”的DNA片段；其它内切核酸酶(如Pst1)能生成带有3’突出尾的片段；而还有其他的内切核酸酶(如Bal1)能在对称轴处切割而产生平末端片段。这些片段中的一些将与由其它内切核酸酶切割形成的末端相匹配，但是有用的末端中的大多数将不相匹配。在设计DNA构建物时，必须仔细考虑每一种DNA片段分离物的末端。
2.装配DNA构建物或转基因所需的DNA片段首先必须从其来源基因组分离出来，放入质粒克隆载体，并扩增以获得有用的数量。此步骤可以使用任何数量的商业途经获得或单独改变的克隆载体来进行。通过商业途经获得的每一种不同的克隆载体质粒很大程度上都是独立开发的，因此含有针对感兴趣基因或遗传元件的DNA片段的不同序列及内切核酸酶位点。所以基因必须单独裁剪以适应任何特定的一组实验所需要的每一种这样的载体。相同的DNA片段将经常需要进一步改变用于随后的实验或克隆入其它组合中，以获得新DNA或转基因。由于每一种DNA构建物或转基因都是为特定应用而制备的，没有考虑或了解其下一步将如何使用，因此通常为了随后的应用必须进行“逆装配”。
3.另外，任何特定基因或遗传元件的DNA序列可变化并可以包含使其与目前可用的载体不相匹配的内部内切核酸酶位点，从而使操作复杂化。当把几个DNA片段装配进单个DNA构建物或转基因时，情况尤其如此。
因此，尽管在DNA片段的末端及DNA片段中发现有冗余的内切核酸酶位点，但仍存在对于某种系统的需求，该系统将使用户能够将大量DNA片段快速组装进一个分子。这样的系统可能还会提供快速改变片段末端的简便方法，以便将其它内切核酸酶序列加入这些片段中。包含单个或反向HE位点对将会增强具备独特克隆位点的可能性。系统还将使得能够容易地取代或去除一个或多个片段，这将增加其多功能性水平，这对于用户来说是目前无法得到的。因此，“模块”系统，即使得使用者能够在克隆载体中将DNA片段或“插入片段”插入侧翼与罕见内切核酸酶位点相接的“盒”区中或从“盒”区去除的系统，将会非常有用并且受到重组DNA技术领域的欢迎。
发明简述
因此，本发明提供了使用克隆载体质粒快速装配DNA构建物或转基因的方法。本发明还提供了将多个DNA片段，也称为“插入片段”或“模块”如启动子核苷酸序列、表达核苷酸序列和3’调控核苷酸序列之中的每一个，在单一步骤中整合入克隆载体质粒的方法，而不必按顺序的方式导入每一个插入片段。本文中，这样的方法被称为“动态载体装配(Dynamic Vector Assembly)”。
在一种实施方案中，本发明提供了构建转基因的方法，包括以下步骤：提供带有能够接受顺序排列的插入片段的骨架的克隆载体质粒，提供欲被包括在该转基因中的至少第一插入片段和第二插入片段，和在单一反应中将第一插入片段和第二插入片段转入该骨架中。
在另一种实施方案中，本发明提供了制备转基因的方法，包括以下步骤：提供包含第一停泊点和第二停泊点的克隆载体质粒；将欲被包括在转基因中的第一核苷酸序列导入第一穿梭载体；将欲被包括在转基因中的第二核苷酸序列导入第二穿梭载体；和将第一核苷酸序列和第二核苷酸序列同时从穿梭载体转入克隆载体质粒的第一和第二停泊点之间。
本发明还提供了制备转基因的方法，包括以下步骤：提供包含第一和第二停泊点的克隆载体质粒；将欲被包括在转基因中的启动子核苷酸序列导入启动子穿梭载体；将欲被包括在转基因中的表达核苷酸序列导入表达穿梭载体；将欲被包括在转基因中的调控核苷酸序列导入调控穿梭载体；和将启动子核苷酸序列、表达核苷酸序列和调控核苷酸序列同时从启动子、表达和调控穿梭载体转入克隆载体质粒的第一和第二停泊点之间。
在另一种实施方案中，本发明提供了同时合成大批转基因的方法，包括以下步骤：提供包含第一和第二停泊点的初级克隆载体质粒；将欲被包括在转基因中的至少一个启动子核苷酸序列导入相应的启动子穿梭载体；将欲被包括在转基因中的至少一个表达核苷酸序列导入相应的表达穿梭载体；将欲被包括在转基因中的至少一个调控核苷酸序列导入相应的调控穿梭载体；和将启动子、表达和调控核苷酸序列从启动子、表达和调控穿梭载体同时转入克隆载体质粒的第一和第二停泊点间之，其中一个启动子模块、一个表达模块和一个调控模块的至少两种组合被转入两个不同的初级克隆载体分子中。
又在另一种实施方案中，本发明提供了制备用于合成转基因或其它复杂DNA构建物的模块克隆载体质粒方法，包括以下步骤：提供包含骨架的克隆载体质粒，该骨架包括第一和第二停泊点，每一停泊点被安装在该骨架中并包含内切核酸酶的至少一个非可变的罕见内切核酸酶位点；用与第一停泊点的至少一个非可变的罕见限制性位点相对应的第一内切核酸酶切割第一停泊点，留下带有3’末端的经切割的第一停泊点；用与第二停泊点的至少一个非可变的罕见限制性位点相对应的第二核酸酶切割第二停泊点，留下带有5’末端的经切割的第二停泊点；提供至少第一和第二插入片段，每一插入片段包括5’末端、感兴趣的核苷酸序列和3’末端，其中第一插入片段的5’末端与经切割的第一停泊点的3’末端相匹配，第二插入片段的3’末端与经切割的第二停泊点的5’末端相匹配，第一插入片段的3’末端与第二插入片段的5’末端相匹配以形成第三内切核酸酶的第三非可变的罕见内切核酸酶位点；将插入片段和切割后的克隆载体质粒放入适当的反应混合物中，引起第一插入片段和第二插入片段在骨架中的第一停泊点和第二停泊点之间同时进行连接反应和自我定向，重新形成第一停泊点和第二停泊点，并形成模块克隆载体质粒。
在另一种实施方案中，本发明提供了制备用于合成转基因或其它复杂DNA构建物的模块克隆载体质粒的方法，该方法包括以下步骤：提供包含骨架的初级克隆载体质粒，该骨架包括至少第一停泊点和第二停泊点，每一停泊点被安装在该骨架中并包含非可变的罕见限制性酶的至少一个罕见限制性位点；用与第一停泊点的罕见限制性位点的其中一个相对应的第一非可变罕见限制性酶切割第一停泊点，留下带有3’末端的被切割的骨架；用与第二停泊点的限制性位点的其中一个相对应的第二非可变的罕见限制性酶切割第二停泊点，留下带有5’末端的被切割的骨架；提供启动子插入片段，其中包括感兴趣的启动子序列、与第一停泊点3’末端相匹配的5’末端、和3’末端；提供表达插入片段，包括感兴趣的表达序列、与启动子插入片段3’末端相匹配而形成第三非可变的罕见限制性酶的罕见限制性位点的5’末端、和3’末端；提供调控插入片段，包括感兴趣的调控序列、与表达插入片段3’末端相匹配而形成第四非可变的罕见限制性酶的罕见限制性位点的5’末端、和与在步骤‘c’中被切割的第二停泊点的5’末端相匹配的3’末端；将启动子插入片段、表达插入片段、调控插入片段和切割后的克隆载体质粒放入适当的反应混合物中，引起启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段在第一停泊点和第二停泊点之间同时进行连接、自我定向和顺序放置，重新形成第一停泊点和第二停泊点，和形成模块初级克隆载体质粒。
在还有另一种实施方案中，本发明提供了同时合成大批转基因或其它复杂DNA构建物的方法，包括以下步骤：提供包括骨架的至少一个初级克隆载体质粒，该骨架中可以插入带有5’末端、感兴趣的核苷酸序列和3’末端的插入片段，该骨架能够可操作地接受顺序排列的启动子插入片段、表达插入片段、调控插入片段，并包括至少第一和第二停泊点，每一停泊点被安装在该骨架中并包含非可变的罕见限制性酶的至少一个限制性位点；用与第一停泊点的限制性位点的其中一个相对应的第一非可变的罕见限制性酶切割第一停泊点；用与第二停泊点的限制性位点的其中一个相对应的第二非可变的罕见限制性酶切割第二停泊点；提供至少一个启动子插入片段，其中已插入启动子核苷酸序列，至少一个启动子插入片段的5’末端与步骤‘b’中被切割的第一停泊点的3’末端相匹配；提供至少一个表达插入片段，其中已插入表达核苷酸序列，至少一个表达插入片段的5’末端与至少一个启动子插入片段的3’末端相匹配，形成第三非可变的罕见限制性酶的限制性位点；提供至少一个调控插入片段，其中已插入调控核苷酸序列，至少一个调控插入片段的5’末端与至少一个表达插入片段的3’末端相匹配，形成第四非可变的罕见限制性酶的限制性位点，至少一个调控插入片段的3’末端与在步骤‘c’中被切割的第二停泊点的5’末端相匹配；然后将至少两种不同类型的至少一个启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段，每一剩余插入片段中的至少一个，和被切割的克隆载体质粒放置在合适的反应混合物中，引起启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段中的每一种中的一个在所述骨架中的所述第一停泊点和所述第二停泊点之间同时进行连接、自我定向和顺序放置，从而产生在其骨架中具有启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段的不同组合的大批质粒。
通过下列附图和详细说明，将会更加充分地深入理解本发明的本质和优势。
附图简述
附图被并入本说明书中并构成本说明书的一部分，举例说明了本发明的实施方案，并与上文给出的本发明的一般描述及下文提供的详细描述一起用于解释本发明的原理。
图1是本发明模块概念的线性图，显示了可插入PE3停泊站(docking station)的P穿梭载体，PE3停泊站可插入初级停泊站。
图2是描述骨架载体装配的图示，该装配是通过穿梭载体中限制性位点如启动子、表达和3’调控模块与初级克隆载体质粒上的停泊点之间的关系得以实现的。
图3是描述图2中装配好的骨架载体的图示。
发明详述
如本文中所使用的，术语“染色质修饰域”(CMD)指与保持和/或改变染色质结构的各种相关蛋白相互作用的核苷酸序列。
如本文中所使用的，术语“克隆”指将DNA分子连接到质粒中并将其转入合适的宿主细胞中以便在宿主增殖时得以复制的过程。
如本文中所使用的，术语“克隆载体”和“克隆载体质粒”可以互换使用，指环状DNA分子，最少包含复制起始区、用于对容纳该质粒的宿主细胞进行阳性选择的工具如抗生素-抗性基因；和多克隆位点。
如本文中所使用的，与内切核酸酶位点有关的术语“常见的”指基因组中相对频繁出现的任何内切核酸酶位点。
如本文中所使用的，短语“与......相匹配”指DNA链的5’或3’末端或端，它可以与由相同限制性酶切割产生或通过某些其它方法产生的任何其它互补末端形成氢键。因为含有限制性酶特定识别序列的任何DNA将以与含相同序列的任何其它DNA相同的方式被切割，所以那些被切割的末端将是互补的，并且因此是相匹配的。所以，用相同限制性酶切割的任何DNA分子的末端以邻近片段七巧板“匹配”的方式相互配对，并可以酶促连接在一起。当匹配的末端结合在一起时，它们将形成特定限制性酶的识别位点。
如本文中所使用的，术语“从头合成”指通过连接互补单链DNA分子的相匹配的突出端合成任何长度的双链DNA分子的过程，该相匹配的突出端代表了总的期望DNA分子的亚序列。
如本文中所使用的，术语“DNA构建物”指在克隆载体中通过连续的克隆步骤合成的DNA分子，通常用于在任何适当的细胞宿主如体外培养细胞或转基因小鼠体内指导基因表达。用于制备这样的小鼠的转基因也可以称为DNA构建物，尤其是在设计与合成该转基因期间。
如本文中所使用的，术语“DNA片段”指任何分离的DNA分子，包括但不限于蛋白质编码序列、报告基因、启动子、增强子、内含子、外显子、多聚A尾、多克隆位点、核定位信号、或mRNA稳定性信号、或者任何其它天然发生的或合成的DNA分子、或它们的任何部分。可选地，DNA片段完全可以是合成来源，体外产生的。而且，DNA片段可以包括分离的天然发生的片段和/或合成片段的任何组合。
如本文中所使用的，术语“停泊质粒”(“Docking Plasmid”)指本发明中用于将DNA片段装配进DNA构建物的特异性克隆载体质粒。
如本文中所使用的，术语“内切核酸酶”或“内切核酸酶”指催化分子类别中的一个或多个成员，它们结合编码在DNA分子中的识别位点，并在该序列中或该序列附近的准确位置上切割该DNA分子。
如本文中所使用的，术语“内切核酸酶识别位点”、“识别位点”、“同源序列”或“许多同源序列”，指限制性酶结合并切割DNA分子或基因所需的最小核苷酸片段。
如本文中所使用的，术语“增强子区”指并非靶基因表达所必需的，但是在适当条件下将提高基因表达水平的核苷酸序列。
如本文中所使用的，术语“基因表达的宿主选择子基因”(GEH-S)指可以赋予宿主生物某一特征的遗传元件，该特征可以通过光学传感器、PCR扩增、生物化学分析，或通过细胞/生物存活试验(当使用合适的抗生素或化学品时，细胞或生物的抗性或对细胞或生物的毒性)而被选择、跟踪或检测。
如本文中所使用的，术语“基因启动子”或“启动子”指基因表达所必需的核苷酸序列，或全长启动子的任何部分。
如本文中所使用的，术语“插入片段”和“模块”基本可以互换使用，唯一的细微差别是“插入片段”是用于插入载体的，一旦被插入后则更通常地被称为“模块”。模块然后也可以从载体中去除。同时，术语插入片段通常称为分离的模块，用作插入模块接受载体的插入片段。
如本文中所使用的，术语“内含子”指哺乳动物细胞基因中两个蛋白质编码区或外显子之间发现的非蛋白编码区核苷酸序列。
如本文中所使用的，术语“定位信号”(LOC)指编码感兴趣蛋白亚细胞途经的信号的核苷酸序列。
如本文中所使用的，术语“多克隆位点”(MCS)指包括至少一个独特的内切核酸酶位点，更典型地，包括一组独特的内切核酸酶位点的核苷酸序列，用于将DNA片段克隆到克隆载体质粒。
如本文中所使用的，术语“mRNA稳定性元件”指结合蛋白所识别的DNA序列，该结合蛋白据认为能够保护一些mRNA免受降解。
如本文中所使用的，术语“复制起点”(ORI)是指导质粒在宿主细胞中复制的核苷酸序列。
如本文中所使用的，短语“PCR末端突出端克隆技术”指使用聚合酶链式反应结合单链DNA引物扩增遗传模块的方法，该引物带有受保护的5’突出核苷酸，此核苷酸可以用作与互补DNA突出端的接合位点。
如本文中所使用的，术语“多聚A尾”指通常在信使RNA(mRNA)分子末端发现的腺嘌呤(A)核苷酸序列。多聚A尾信号被整合进DNA构建物或转基因的3’末端，以帮助感兴趣基因表达。
如本文中所使用的，术语“引物位点”指充当DNA模板的核苷酸序列，单链DNA寡核苷酸可以在其上退火，用于起始DNA测序、PCR扩增、和/或RNA转录。
如本文中所使用的，术语“pUC19”指为本领域普通技术人员所熟悉的质粒克隆载体，并可以根据编号L09137在NCBI的Genbank数据库中找到。
如本文中所使用的，术语“随机核苷酸序列”指核苷酸序列的任何组合，该核苷酸序列并不复制编码其它元件的序列，该其它元件指同一分子的组分。随机序列中所要求的核苷酸数目是由位于该随机序列侧翼的内切核酸酶的要求来决定的。大多数内切核酸酶要求最少2-4个额外的随机序列来稳定DNA结合作用。对应于组成密码子的核苷酸数，随机序列的数目优选是3的倍数。因此，随机序列优先的最小数是6，不过也可以使用更少或更多个核苷酸。
如本文中所使用的，与内切核酸酶位点有关的术语“罕见的”指基因组中出现频率相对较低的内切核酸酶位点。
如本文中所使用的，术语“重组臂”指帮助转基因DNA与基因组DNA之间同源重组的核苷酸序列。成功的重组需要在转基因DNA的侧翼区同时存在左翼重组臂(LRA)和右翼重组臂(RRA)，以通过同源重组将该转基因DNA整合进宿主基因组中。
如本文中所使用的，术语“重组工程”指使用随机或位点选择性重组酶结合DNA序列的方法，重组酶可以作用于该DNA序列上，从而使部分遗传物质从一个DNA分子易位至不同的DNA分子上。
如本文中所使用的，术语“报告基因”指编码蛋白的核苷酸序列，该蛋白用于监测感兴趣的特定启动子的活性。
如本文中所使用的，术语“穿梭载体”指本发明中用于制备中间分子的特异性克隆载体质粒，该中间分子将修饰DNA片段的末端。
如本文中所使用的，术语“标记序列”(TAG)指编码独特的蛋白质区的核苷酸序列，该蛋白质区使该蛋白可以被检测，或者在有些情况下使其区别于任何内源性对应物。
如本文中所使用的，术语“非翻译区”(UTR)指mRNA分子中包含非蛋白质编码区的核苷酸序列。这些非翻译区可以位于mRNA分子的5’末端(5’UTR)或3’末端(3’UTR)。
本发明提供了获得含有模块的新制造的转基因并选择性地去除一个或多个模块以及用不同插入片段替换它的方法。这种方法在本文中被称为“二次途经”(second pass)和“多重穿引”(multiplethreading)。本发明进一步提供了创造大批不同转基因的方法，其中每一转基因都具有不同的启动子、表达和调控插入元件，这是通过在单一步骤中将多个不同的启动子、表达和调控插入元件整合入克隆载体质粒而实现的。本发明还提供了包括以下步骤的方法：提供含有组合在一起的新导入的启动子、表达和调控插入元件的克隆载体质粒，去除作为骨架载体的整个组合，并将多重数量的骨架载体插入单个克隆载体质粒中。
本发明还提供了通过提供含有停泊点的骨架来产生用于合成转基因或其它复杂DNA构建物的模块克隆载体质粒的方法。每一个停泊点代表一个区域，其中优选地含有至少一个固定的非可变罕见内切核酸酶位点，更优选地含有固定的几组两个非可变罕见内切核酸酶位点，最优选地含有固定的几组三个非可变罕见内切核酸酶位点。每一停泊点的特定限制性位点被其同源内切核酸酶切割。这将创造出期望的5’或3’末端，该末端与其中一个含有选择的核苷酸序列如启动子、表达或调控核苷酸序列的预构建的插入片段的互补5’或3’末端相匹配。至少两个插入片段，其中每一个都具有和被切割的感兴趣的停泊点相匹配的5’和3’末端，可以与被切割的克隆载体质粒一起加入到适当的反应混合物中，并且假定在合适的热动力学环境中，该插入片段可以自发地，即在单一步骤中，被整合进克隆载体质粒。在此单一的添加及连接反应过程中，停泊点重新形成且克隆载体质粒成为模块，这是因为停泊点以及两模块之间的连接可以用合适的限制性酶重新切割。接着该模块可以被随后去除，新模块可以被放在原模块的位置。
本发明的一项实施方案涉及构建转基因的方法，该方法包括以下步骤：提供带有骨架的克隆载体质粒，该骨架能够接受顺序排列的插入片段；提供将要被包括在转基因中的至少第一插入片段和第二插入片段；和在单一反应中将第一插入片段和第二插入片段转入骨架中。更优选地该插入片段包括三个插入片段，具体来讲就是至少一个启动子、表达和调控模块。
本发明的另一种实施方案是制备转基因的方法，该方法包括以下步骤：提供包括第一和第二停泊点的克隆载体质粒；将欲被包括在转基因中的启动子核苷酸序列导入启动子穿梭载体；将欲被包括在转基因中的表达核苷酸序列导入表达穿梭载体；将欲被包括在转基因中的调控核苷酸序列导入调控穿梭载体；和将启动子、表达和调控核苷酸序列同时从启动子、表达和调控穿梭载体转入克隆载体质粒的第一和第二停泊点之间。
优选的是每一停泊点和每一插入片段的5’和3’末端都与另一个停泊点或插入片段的对应末端相匹配。例如，如果第一停泊点含有非可变罕见限制性酶如SgrAI的限制性位点，且该停泊点随后被切开，那么欲被插入切割的第一停泊点的3’末端的第一插入片段将含有相匹配的5’末端，从而在该插入片段与第一停泊点结合时产生SgrAI的限制性位点。质粒中的第二停泊点可以，例如具有非可变限制性酶如SwaI的限制性位点。任何第二插入片段在其3’末端将具有相匹配的核苷酸序列，从而与被切割的第二停泊点的切割的5’末端相结合，产生SwaI的限制性位点。此外，为了同时被插入模块克隆载体质粒并且以后还在相同位点被去除，第一插入片段的3’末端与第二插入片段的5’末端，必须含有相匹配的末端从而产生第三非可变罕见限制性酶如PacI或SalI的第三限制性位点。
本发明编码模块结构的顺序元件具体可以包括：三个非可变的和独特的常见限制性位点、5’寡核苷酸引物位点、正向独特的HE位点、随机核苷酸序列侧翼的一对的非可变和独特的、常见限制性位点、限定启动子模块5’部分的一组固定的非可变罕见限制性位点、随机核苷酸序列、限定相对于启动子/内含子模块的3’部分和相对于表达模块的5’部分之间的共有接头的一组固定的非可变罕见限制性位点、随机核苷酸序列、限定相对于表达模块的3’部分和相对于3’调控模块的5’部分的接头的一组固定的非可变罕见限制性位点、随机核苷酸序列、限定相对于3’调控模块的3’部分的一组固定的非可变罕见限制性位点、随机核苷酸序列侧翼的一对非可变的和独特的常见限制性位点、与置于5’寡核苷酸引物位点3’末端的HE位点相同的反向独特的HE位点、反向3’寡核苷酸引物位点、和四个限定3’插入位点的非可变的和独特的常见限制性位点。
本发明编码模块结构的其它顺序元件具体地可以包括：限定5’插入位点的两个非可变和独特的常见限制性位点、寡核苷酸引物位点、随机核苷酸序列侧翼的一对反向的独特HE位点、使得能将穿梭载体模块克隆在一对独特的HE位点下游的非可变的和独特的常见限制性位点、一组固定的非可变罕见限制性位点、随机核苷酸序列、一组固定的非可变罕见限制性位点、正向独特的HE位点、随机核苷酸序列侧翼的一对非可变的和独特的常见限制性位点、寡核苷酸引物位点、一对反向独特BstX I位点(其中BstX I识别位点中的可变核苷酸区是通过与非互补尾相同的核苷酸来限定的，该非互补尾是通过排列以反向互补方向排列的两个相同HE识别位点而产生的)、随机核苷酸序列侧翼的一对反向独特HE位点、反向寡核苷酸引物位点、随机核苷酸序列侧翼的一对非可变和独特的常见限制性位点、反向独特HE位点，该HE位点与正向HE位点相同、一组固定的非可变罕见限制性位点、随机核苷酸序列、一组固定的非可变罕见限制性位点、非可变和独特的常见限制性位点、随机核苷酸序列侧翼的一对反向独特的HE位点、反向寡核苷酸引物位点，和三个非可变和独特的常见限制性位点。
本发明是将各种DNA片段装配入从头DNA构建物或转基因的一组方法，该方法是通过使用优化的克隆载体来减少通常需要的操作量实现的。
初级载体，本文中指停泊质粒，含有多克隆位点(MCS)，该MCS优选地携带以线性方式排列的3组罕见内切核酸酶位点。这样的排列方式限定了模块结构，该模块结构使用户能够将多个插入片段装配进单个转基因构建物中，而不破坏在先前克隆步骤中已经整合入停泊质粒的DNA元件的完整性。
为了产生不能自我退火的基因盒受体位点，将至少三个HE的两个识别位点以反向方式放在三个模块区的侧翼。因为HE位点是不对称和非回文的，所以通过反向放置两个HE识别位点，能够产生非互补的突出3’粘性尾。因此，HE I-SceI切割其同源识别位点，如“/”所示：5’...TAGGGATAA/CAGGGTAAT...3’，3’...ATCCC/TATTGTCCCATTA...5’。
将第二位点反向放置在MCS中，将产生两个非互补的粘性突出尾：5’...TAGGGATAA    CCCTA...3’3’...ATCCCAATAGGGAT...5’。
当有必要将较大的转基因亚克隆到载体中时，这是特别有用的。由于插入片段的大小的缘故，从热力学角度讲，更有利地是，载体自身退火而不是接纳大的插入片段。通过放置限制性位点而产生的非互补尾，为抵消自身连接的热力学倾向提供了化学力。
当与BstX I内切核酸酶位点(5’CCANNNNN/NTGG 3’，其中‘N’可以是任何核苷酸)结合使用时，大多数HE突出尾的不对称性质也产生强大的克隆工具。BstX I的序列中性域(sequence-neutraldomain)可以用于产生与两个反向HE突出尾相匹配的粘性末端，同时防止自身退火。
BstX I(I-Sce I Fwd.)I-Sce I正向I-Sce I反向BstX I(I-SceI Rev.)5’-CCAGATAA    CAGGGTAAT//ATTACCCTGTTATGTGG-3’3’-GGTC TATTGTCCC ATTA//TA ATGGGACAATACACC-5’
按照出现的等次，来选择本发明中使用的内切核酸酶位点。为了确定内切核酸酶位点出现的频率，用Vector NTI软件分析了对应于19个不同基因的DNA序列信息。此检索覆盖了总共110,530个核苷酸的DNA序列。根据所分析的110,530个核苷酸中出现的内切核酸酶位点的实例数，计算这些分析获得的结果。然后按四个类别将内切核酸酶位点分配以等级名称，其中“常见”位点每110,530个核苷酸出现25次以上，“较低频率6bp位点”是每110,530个核苷酸出现6-24次，“罕见”位点是每110,530个核苷酸出现0-5次。因此根据它们的出现类别，列出“合适的”酶的部分清单。
常见内切核酸酶：Ase I、BamH I、Bgl II、Blp I、BstX I、EcoR I、Hinc II、Hind III、Nco I、Pst I、Sac I、Sac II、Sph I、Stu I、Xba I。
具有6bp识别位点但出现频率较低的内切核酸酶：Aar I、Aat II、Afl II、Age I、ApaL I、Avr II、Bse A I、BspD I、BspE I、BstB I、Cla I、Eag I、Eco0109I、EcoR V、Hpa I、KpnI、Mfe I、Nar I、Nde I、NgoM IV、Nhe I、Nsi I、Pml I、SexA I、Sma I、Spe I、Xho I。
罕见内切核酸酶：Acl I、Asc I、AsiS I、BsiW I、Fse I、Mlu I、Not I、Nru I、Pac I、Pme I、Pvu I、Rsr II、Sal I、SbfI、Sfi I、SgrA I、SnaB I、Swa I、PI-Sce I、I-Sce I、I-Ceu I、PI-Psp I、I-Ppo I、I-Tli I。
也可以使用这些清单中未包括的其它内切核酸酶，它们具有了相同功能性和本发明的精神和内容。本发明的二级载体，本文中称为穿梭载体，含有多克隆位点，该MCS携带侧翼分布有罕见内切核酸酶位点的常见内切核酸酶位点。该穿梭载体被设计用于将DNA片段克隆入罕见位点之间的常见内切核酸酶位点。随后通过在罕见内切核酸酶一个位点或多个位点上进行切割，可以释放被克隆的片段，并利用与穿梭载体中发现的相同的罕见内切核酸酶一个位点或多个位点，将其整合入停泊质粒中。
因此，不同于常规的克隆载体，MCS的设计使DNA片段的“盒”或模块可以被插入到停泊质粒的模块区。同样，使用相同的罕见内切核酸酶位点可以容易地去除每一个DNA片段，并用任何其它感兴趣的DNA片段来替代。这一特性让使用者能够方便快捷的改变实验项目的方向，而不必重新建立整个DNA构建物。因此，本发明的克隆载体质粒让使用者能够利用常见内切核酸酶位点将DNA片段克隆进中间载体，创造出盒-接纳模块，并随后利用罕见内切核酸酶位点将该片段转入最终物构建的期望模块位点。此外，它使得能够进一步改变该分子，以用其它盒模块来替换停泊质粒中的个别模块。以下的描述突出了本发明与现有技术的差别。
转基因的各组分(启动子增强子P、表达的蛋白E、和/或3’调控区3)可以作为被转移的模块从穿梭载体装配入PE3停泊站质粒。如果需要复杂性更高的顺序，装配的转基因，或者其它核苷酸序列，然后可以转入初级停泊质粒。五类克隆载体质粒中的每一种将被更加详细地解释，从而理解整合入每种质粒中的组分，这将从较为复杂的PE3停泊站质粒和初级停泊质粒开始。
PE3停泊质粒包括带有以下修饰的pUC19骨架，其中序列是按照pUC19的Genbank序列文件，编号L09137，来进行编号的：
1.仅序列806至2617(Afl3-Aat2)用于停泊质粒中。
2.pUC19中1729处的BspH 1位点由TCATGA突变为GCATGA。
3.pUC19中1493处的Acl 1位点由AACGTT突变为AACGCT。
4.pUC19中1120处的Acl 1位点从AACGTT突变为CACGCT。
5.pUC19中的Ahd 1位点从GACNNNNNGTC突变为CACNNNNNGTC。
6.上面列出的突变步骤2之后，将编码BspH 1/I-Ppo1/BspH 1的序列插入pUC 19中唯一留存的BspH 1位点中。
PE3停泊质粒中的多克隆位点(MCS)按照所列顺序，包括以下顺序元件：
1.三个非可变和独特的常见内切核酸酶位点，限定了上述突变的pUC19载体的5’插入位点(表示为，但不限于Aat II、Blp I、和EcoO109I)；
2.T7引物位点；
3.独特的HE位点(例如I-Sce I(正向))；
4.随机核苷酸序列侧翼的一对非可变和独特的常见内切核酸酶位点，其可以作为染色质修饰域接纳体模块(RNAS-CMD-1)(例如Kpn I和Avr II)；
5.限定启动子模块5’部分的一组固定的非可变罕见内切核酸酶位点(例如AsiS I、Pac I、和SbfI)；
6.可以作为启动子/内含子接纳体模块的随机核苷酸序列(RNAS-P)；
7.限定启动子/内含子模块3’部分和表达模块5’部分之间共有接点的一组固定的非可变罕见内切核酸酶位点(例如SgrAI、AscI、和Mlu I)；
8.可以作为表达接纳体模块的随机核苷酸序列(RNAS-E)；
9.限定表达模块3’部分和3’调控模块5’部分之间的接点的一组固定的非可变罕见内切核酸酶位点(例如SnaB I、Not I、和Sal I)；
10.可以作为3’调控域接纳体模块的随机核苷酸序列(RNAS-3)；
11.限定3’调控模块3’部分的一组固定的非可变罕见内切核酸酶位点(例如Swa I、Rsr II、和BsiW I)；
12.随机DNA核苷酸序列侧翼的一对非可变和独特的常见内切核酸酶位点，其可以作为染色质修饰域接纳体模块(RNAS-CMD-2)(例如Xho I和Nhe I)；
13.与上面第3项相同的反向独特的HE位点；
14.反向T3引物位点；和
15.限定上述突变的pUC19载体的3’插入位点的四个非可变和独特的常见内切核酸酶位点(例如BspE I、Pme I、Sap I和BspHI)。
初级停泊质粒可以用于装配首先构建在PE3停泊站质粒中的两个完整的转基因，或用于装配构建基因-靶向转基因，或导入两类阳性或阴性选择元件所需的两条同源臂。初级停泊质粒中的多克隆位点按所列顺序，包括以下顺序元件：
1.两个非可变和独特的常见内切核酸酶位点，它们限定了上述突变的pUC19载体的5’插入位点(例如Aat II和Blp I)；
2.M13反向引物位点；
3.随机DNA核苷酸序列侧翼的一对独特的内切核酸酶位点，其可以作为基因组表达宿主选择基因接纳体模块(RNAS-GEH-S1)；
4.使得能在HE对下游克隆穿梭载体模块的非可变和独特的常见内切核酸酶位点(例如EcoO109I)；
5.限定左重组臂模块5’部分的固定的一组非可变罕见内切核酸酶位点(例如AsiS I、Pac I、和SbfI)；
6.可以作为左重组臂接纳体模块的随机核苷酸序列(RNAS-LRA)；
7.限定左重组臂接纳体模块3’部分的固定的一组非可变罕见内切核酸酶位点(例如SgrAI、Mlu I和Asc I)；
8.独特的HE位点(例如I-Ceu I(正向))；
9.随机DNA核苷酸序列侧翼的一对非可变和独特的常见内切核酸酶位点，其可以作为染色质修饰域接纳体模块(RNAS-CMD-1)(例如Kpn I和Avr II)；
10.T7引物位点；
11.随机DNA核苷酸序列侧翼的一对反向独特的BstX I位点(其中BstX I识别位点中的可变核苷酸区是通过与非互补尾相同的核苷酸来限定的，该非互补尾是通过排列以反向互补方向排列的两个相同HE识别位点而产生的；例如PI-Sce I(正向)和PI-Sce I(反向))，其可以作为复杂转基因接纳体模块(RNAS-PE3-1)；
12.随机DNA核苷酸序列侧翼的一对唯一的内切核酸酶位点，该随机DNA核苷酸序列可以作为复杂转基因接纳体模块(RNAS-PE3-2)；
13.反向T3引物位点；
14.随机DNA核苷酸序列侧翼的一对非可变和独特的常见内切核酸酶位点，该随机DNA核苷酸序列可以作为染色质修饰域接纳体模块(RNAS-CMD-2)(例如Xho I和Nhe I)；
15.与上面第8项相同的反向独特的HE位点；
16.限定右侧重组臂接纳体模块5’部分的固定一组非可变罕见内切核酸酶位点(例如SnaB I、Sal I、和Not I)；
17.可以作为右侧重组臂接纳体模块的随机核苷酸序列(RNAS-RRA)；
18.限定右侧重组臂接纳体模块3’部分的固定一组非可变罕见内切核酸酶位点(例如Rsr II、Swa I、和BsiW I)；
19.使得能用于克隆穿梭载体模块的非可变和独特的常见内切核酸酶位点(例如BspE I)；
20.随机DNA核苷酸序列侧翼的一对独特的内切核酸酶，该随机DNA核苷酸序列可以作为基因组表达宿主选择基因接纳体模块(RNAS-GEH-S2)；
21.反向放置的M13正向引物位点；
22.三个非可变和独特的常见内切核酸酶位点，限定上述突变的pUC19载体的3’插入位点(例如Pme I、Sap I和BspH I)。
本发明的三种克隆载体质粒被称为穿梭载体。该穿梭载体，如同PE3及初级停泊质粒，也是从pUC19构建而成的。正如PE3及初级停泊质粒，每一个穿梭载体都对pUC19骨架做了与上面1至6所列相同的修改。各穿梭载体(SV)分别命名为启动子/内含子穿梭载体(P)、表达穿梭载体(E)、和3’调控穿梭载体(3)；此后称为SVP、SVE、和SV3。下面对每个穿梭载体做了更充分的描述。
穿梭载体P(SVP)：
SVP是可以用于制备启动子和内含子序列以装配入转基因构建物的克隆载体质粒。SVP质粒的例子在MCS中按所列顺序可以包括以下顺序元件：
1.两个非可变和独特的常见内切核酸酶位点，其限定了上述突变的pUC19载体的5’插入位点(例如Aat II和Blp I)；
2.T7引物位点；
3.能有效地在T7引物位点下游克隆穿梭载体模块的非可变和独特的常见内切核酸酶位点(例如Eco0109I)；
4.限定启动子模块5’部分的固定一组非可变罕见内切核酸酶位点(例如AsiS I、Pac I、和SbfI)。这些非可变罕见内切核酸酶位点提供了停泊位点，其由图2中启动子载体5’末端的星号来表示；
5.可变的MCS，包括对于该穿梭载体来说独特的任何组的常见或罕见内切核酸酶位点；
6.限定启动子模块3’部分的固定的一组非可变罕见内切核酸酶位点(例如SgrA I、Asc I、和Mlu I)。这些非可变罕见内切核酸酶位点提供了停泊点，其由图2中启动子载体3’末端的圆圈来表示；
7.能有效地在T3引物位点下游克隆穿梭载体模块的非可变和独特的常见内切核酸酶位点(例如BspE I)；
8.反向的T3引物位点；和
9.两个非可变和独特的常见内切核酸酶位点，限定了上述突变的pUC19载体的3’插入位点(例如Pmel I和Sap I)。
穿梭载体E(SVE)：
这是可以用于制备将被转基因所表达的序列以装配入转基因构建物的克隆载体质粒。SVE质粒的例子在MCS中按所列顺序可以包括以下顺序元件：
1.两个非可变和独特的常见内切核酸酶位点，其限定了上述突变的pUC19载体的5’插入位点(例如Aat II和Blp I)；
2.T7引物位点；
3.能有效地在T7引物位点下游克隆穿梭载体模块的非可变和独特的常见内切核酸酶位点(例如Eco0109I)；
4.限定表达模块5’部分的固定的一组非可变罕见内切核酸酶位点(例如SgrA I、Asc I、和Mlu I)。这些非可变罕见内切核酸酶位点提供了停泊位点，其由图2中表达载体5’末端的圆圈来表示；
5.可变的MCS，包括对于该穿梭载体来说独特的任何组的常见或罕见内切核酸酶位点；
6.限定表达模块3’部分的固定的一组非可变罕见内切核酸酶位点(例如SnaB I、Not I、和Sal I)。这些非可变罕见内切核酸酶位点提供了停泊点，其由图2中表达载体3’末端的三角形来表示；
7.能有效地在T3引物位点上游克隆穿梭载体模块的非可变和独特的常见内切核酸酶位点(例如BspE I)；
8.反向的T3引物位点；和
9.两个非可变和独特的常见内切核酸酶位点，其限定了上述突变的pUC19载体的3’插入位点(例如Pmel I和Sap I)。
穿梭载体3(SV3)：
这是可以用于制备3’调控序列以装配入转基因构建物的克隆载体质粒。SV3质粒的例子在MCS中按所列顺序可以包括以下顺序元件：
1.两个非可变和独特的常见内切核酸酶位点，其限定了上述突变的pUC19载体的5’插入位点(例如Aat II和Blp I)；
2.T7引物位点；
3.能有效地在T7引物位点下游克隆穿梭载体模块的非可变和独特的常见内切核酸酶位点(例如Eco0109I)；
4.限定3’调控模块5’部分的固定的一组非可变罕见内切核酸酶位点(例如SnaB I、Not I、和Sal I)。这些非可变罕见内切核酸酶位点提供的停泊点，其由图2中调控载体5’末端的三角形来表示；
5.可变MCS，包括对于该穿梭载体独特的任何组的常见或罕见内切核酸酶位点；
6.限定3’调控模块3’部分的固定组的非可变罕见内切核酸酶位点(例如Swa I、Rsr II、和BsiW I)。这些非可变罕见内切核酸酶位点提供了停泊点，其由图2中调控载体3’末端的方框来表示；
7.能有效地在T3引物位点上游克隆穿梭载体模块的非可变和独特的非罕见内切核酸酶位点(例如BspE I)；
8.反向的T3引物位点；和
9.两个非可变和独特的非罕见内切核酸酶位点，其限定了上述突变的pUC19载体的3’插入位点(例如Pmel I和Sap I)。
尽管本发明公开了在质粒克隆载体中构建转基因的方法，使用相似的方法同样可以在较大的染色体外DNA分子如粘粒或人工染色体，包括细菌人工染色体(BAC)中构建转基因。为了用于植物中，也可以使用T1载体。可以整合入质粒克隆载体的广泛种类的遗传元件也允许将最终转基因产物转入广泛种类的宿主生物中，而无需进一步的操作或者仅需很小的操作。
图2和图3是本发明模块的一般图示。如图2中所示，有启动子穿梭载体、表达穿梭载体、和3’调控穿梭载体中的每一个。在这些穿梭载体中的每一个插入元件的侧翼都有专门用于产生停泊点的内切核酸酶限制性位点。更具体地，在图2中，启动子插入片段(P)的侧翼在5’末端有用星号表示的第一组一种或多种内切核酸酶限制性位点，和在3’末端有用圆圈表示的第二组一种或多种内切核酸酶限制性位点；表达模块的侧翼在5’末端有用圆圈表示的第二组内切核酸酶限制性位点，和在3’末端有用三角表示的第三组一种或多种内切核酸酶限制性位点；和3’调控模块(S)的侧翼在5’末端有用三角表示的第三组内切核酸酶限制性位点，和在3’末端有用方框表示的第四组一种或多种内切核酸酶限制性位点。用对内切核酸酶识别位点特异性的内切核酸酶切割每一识别位点在每一个模块的5’和3’末端产生粘性末端，如在图2底部部分中通过虚线箭头末端的插入片段所示。现在模块可以与克隆载体质粒结合，该克隆载体质粒也已经在其两个固定的停泊点被内切核酸酶切开，该内切核酸酶对第一组内切核酸酶限制性位点(以星号表示)和第四组内切核酸酶限制性位点(以方框表示)具有特异性。当模块载体与克隆载体质粒一起放入适当的反应混合物时，每一个模块载体的切割的粘性末端(以中空的星号、圆圈、三角和方框表示)将在质粒中自我定向，并且顺序连接，切割的星号末端结合、切割的圆圈末端结合、切割的三角末端结合、以及切割的方框末端结合。这产生了图3中所示的装配成的骨架载体。进而，用星号、圆圈、三角和方框表示的组合的各组内切核酸酶位点中的每一组都可以再次用其相应的特异性内切核酸酶切开，这样，以后特定的插入序列就可以被去除并用另一个感兴趣的插入片段来替代。
多个骨架载体(例如PE3-1和PE3-2)可以被插入单个停泊质粒。当与BstX I内切核酸酶位点(5’CCANNNNN/NTGG 3’，其中‘N’可以是任何核苷酸)结合使用时，内切核酸酶如I-Sce I的突出尾的不对称特性，如同与其它HE，产生强大的克隆工具。BstX I的序列-中性域可以用于生成与两个反向的I-Sce I突出尾匹配的粘性末端，同时避免自我退火。用此方法，通过在BstX1/Sce1内切核酸酶位点切割质粒，第一插入片段，PE3-1，其末端具有I-Sce-1位点，可以被放入克隆载体质粒。然后使用者可以用I-Sce1将此质粒再次切开，并插入末端具有I-Sce-1位点的PE3-2。然后可以用PI-Sce I将此完整的骨架从其停泊质粒上切下，并插入到含有BstX I/PI-Sce I内切核酸酶位点的另一个停泊质粒中。该第二停泊质粒也含有PI-Sce I内切核酸酶的位点，在该位点中仍可以插入独立的停泊质粒的另一个模块，该模块可能包含了PE3-3和PE3-4(未表示出)。以这种方式，研究者可以将更多信息导入一种细胞，即研究者可以将多个基因插入单个载体中，这之前未曾被本领域普通技术人员实现过。这样的新方法可以为在本领域工作的研究人员节省费用和时间。
实施例
实施例1：PE3停泊质粒
作为实践本发明的方法的例子，可以构建含有这些元件的转基因：
1.表面活性蛋白C(SP-C)人类启动子的核苷酸序列；
2.编码小鼠基因粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子受体βc(GMRβc)蛋白产物的序列；
3.兔β球蛋白内含子序列；和
4.SV40多聚A信号。
SP-C序列含有内部BamH 1位点，并可以仅用Not 1和EcoR1从其亲本质粒中释放出来。GMRβc具有内部Not 1位点，并可以用BamH 1和Xho 1从其亲本质粒中切下来。兔β球蛋白内含子序列可以用EcoR 1从其亲本质粒中切下来。SV-40多聚A尾可以用Xho 1和Sac 1从其亲本质粒中切下来。因为几种内切核酸酶位点的冗余，所以亲本质粒中没有一种可以用于装配所有需要的片段。
在PE3停泊质粒发明中用于构建期望的转基因的步骤如下：
1.由于Not 1和PspOM 1产生相匹配的粘性末端，用Not 1和EcoR 1切割人类SP-C启动子序列，并将其克隆入穿梭载体P的PspOM 1和EcoR 1位点。该反应的产物被称为pSVP-SPC。
2.经本领域普通技术人员所熟悉的扩增和回收步骤后，将兔β球蛋白内含子序列克隆入pSVP-SPC的EcoR 1位点中。通过对称为pSVP-SPC-rβG的产物进行测序，来确定所产生的中间构建物中内含子的方向。
3.作为一个连续片段，用AsiS 1和Asc 1从pSVP-SPC-rβG中切割并分离该启动子及内含子。与此同时，PE3停泊质粒用AsiS 1和Asc 1切割，进行制备用于与该启动子/内含子片段连接。将该启动子/内含子片段连接入停泊质粒，扩增并回收。
4.使用本领域普通技术人员所熟悉的技术，将GMRβc片段的Xho I位点补平以生成3’平末端。然后将其克隆入pSVP-SPC-rβG的BamH I位点和平末端的Pvu2位点。扩增和回收所得的质粒(pDP-SPC-GMRβc-rβG)。
5.最后的克隆步骤是添加SV-40多聚A尾。用Xho1和Sac1切下SV-40多聚A片段，受体载体pDS1-SPC-GMRβc-rbβG用相同的酶切割。凝胶纯化并回收两种DNA片段。以10∶1摩尔比的SV-40多聚A与pDS 1-SPC-GMRβc-rβG制备连接混合物。扩增并收集连接产物。新质粒pDS1-SPC-GMRββc-rβG-pA含有转基因所需的所有元件，包括3’端独特的内切核酸酶位点，用其可以将完整的pDS 1-SPC-GMRβc-rβG-pA质粒线性化，以转染入真核细胞或微注射入受精卵的原核中。
实施例2：动态载体装配
以下实施例举例说明了动态载体装配：
1.将来自人类细胞肥大病毒(CMV)的启动子序列插入P穿梭载体(SVP)，该载体在5’和3’部分分别含有AsiS I和Ase I内切核酸酶位点。扩增质粒，并通过AsiS I和Asc I内切核酸酶消化反应从载体中切下该启动子模块并分离之。
2.将编码萤光素酶蛋白的序列插入表达穿梭载体(SVE)，该载体在5’和3’部分分别含有Asc I和Not I内切核酸酶位点。扩增质粒，并通过Asc I和Not I内切核酸酶消化反应从载体中切下该表达模块并分离之。
3.将编码哺乳动物内含子和SV40多聚位点的序列插入3’调控穿梭载体(SV3)，该载体在5’和3’部分分别含有Not I和BsiWI内切核酸酶位点。扩增质粒，并通过Not I和BsiW I内切核酸酶消化反应从载体中切下该调控模块并分离之。
4.在启动子模块5’部分和调控模块3’部分分别含有AsiSI和BsiW I内切核酸酶的停泊质粒中的内切核酸酶识别位点，用AsiS I和BsiWI内切核酸酶切割并分离之。
5.该启动子模块、表达模块和调控模块与停泊载体质粒一起在连接反应混合物中结合。温育2小时后，将连接反应混合物用于转化大肠杆菌，然后将该大肠杆菌混合物涂布在带氨苄青霉素的LB琼脂平板上。将该培养板在37℃下温育过夜。分离多个细菌菌落，并在各液体LB肉汤培养物中扩增。从每个LB肉汤培养物中分离该质粒DNA。通过内切核酸酶作图分析该DNA，以确定来自每一菌落的质粒是否含有三种模块插入片段(启动子、表达和调控)。含三种模块插入片段的质粒命名为转基因pCMV-luc-SV40pA。它可以用I-Sce I内切核酸酶线性化，并注射入小鼠原核中以产生CMV-萤光素酶小鼠。在该实施例中的CMV启动子指导萤光素酶基因在宿主生物如CMV-萤光素酶小鼠的所有组织中表达。
实施例3：动态载体装配的重新设计
如果研究者现在希望优化表达模式以便萤光素酶仅在特定组织或细胞类型中表达，他或她可以快捷方便地用将提供限制性性表达模式的启动子替换该CMV启动子。下述实施例举例说明了使用本发明来帮助快速重新设计pCMV-luc-pA：
1.如同前面实施例中的启动子模块，将神经元-特异性启动子，神经元-特异性烯醇化酶(NSE)插入P穿梭载体(SVP)并制备。
2.用AsiS I和Asc I切割pCMV-luc-pA以去除CMV启动子模块。分离含有完整表达和调控模块的剩余部分的停泊载体质粒。
3.将NSE启动子模块与含完整表达和调控模块的剩余部分的停泊载体质粒一起放入连接混合物。温育2小时后，将新的连接混合物用于转化大肠杆菌。将该大肠杆菌混合物涂布在带氨苄青霉素的LB琼脂平板上，如同前面的实施例中所述的。第二天分离多个菌落，扩增，并从每个菌落分离质粒DNA。内切核酸酶作图用于鉴定含期望NSE启动子模块的质粒。
实施例4：大批转基因
下列实施例是举例说明了使用本发明来迅速装配大批转基因，其中每一转基因包含启动子模块、表达模块和调控模块的不同组合。应用组合装配，可以用一系列的六个穿梭载体和PE3停泊站载体产生八种不同的载体产物。这一系列六个穿梭载体由两个P-穿梭载体(SVP)、两个E-穿梭载体(SVE)和两个3-穿梭载体(SV3)组成。两个不连续的P-穿梭载体(SVP)含有人巨细胞病毒(VMV)启动子或者小鼠SPC肺特异性启动子，每一种启动子分别在5’部分和3’部分具有AsiSI和Asc I内切核酸酶。两个不连续的E-穿梭载体含有萤光素酶cDNA或EGFP cDNA，每一个分别在5’部分和3’部分具有Asc I和Not I内切核酸酶。两个不连续的3-穿梭载体含有SV40多聚A信号或人生长激素(hGH)的3’调控区，每一个分别在5’部分和3’部分具有Not I和BsiWI内切核酸酶。
通过用AsiS I和Asc I内切核酸酶单独消化合适的穿梭载体，启动子模块从它们各自的SVP穿梭载体中被释放出来。对得到的限制性产物单独进行凝胶电泳，对相应于合适的启动子模块的DNA条带进行凝胶纯化。此过程将产生CMV启动子模块或SCP启动子模块，它们在5’侧连接有AsiS I突出端，在3’端连接有Asc I突出端。
通过用Asc I和Not I限制性内切核酸酶单独消化合适的穿梭载体，表达模块从它们各自的SVE穿梭载体中被释放出来。对得到的限制性产物单独进行凝胶电泳，对相应于合适的表达模块的DNA条带进行凝胶纯化。此过程将产生萤光素酶表达模块或EGFP表达模块，它们在5’侧连接有Asc I突出端，在3’端连接有Not I突出端。
通过用Not I和BsiW I限制性内切核酸酶单独消化合适的穿梭载体，3’调控模块从它们各自的SV3穿梭载体被释放出来。对得到的限制性产物单独进行凝胶电泳，对相应于合适的3’调控模块的DNA条带进行凝胶纯化。此过程将产生SV403’调控模块或hGH 3’调控模块，它们在5’侧连接有Not I突出端，在3’端连接有BsiW I突出端。
通过用AsiS I和BsiW I限制性核酸内切酶进行消化，制备PE3停泊站载体。为了帮助防止载体再次重新连接，将载体限制性消化物暴露于牛小肠磷酸酶(CIP)，37℃1小时。对得到的经CIP-处理的载体限制性产物进行凝胶电泳，对相应于线性化PE3载体骨架的DNA条带进行凝胶纯化。
通过在诊断性电泳凝胶上跑胶，分析来自7个生成的凝胶纯化DNA片段的样品的身份、完整性、纯度和数量。有关纯化的PE3停泊站载体和各个DNA模块的相对丰度的定量数据被用来限定组合连接反应所需的每一组分的量。
当建立连接反应时，有两种策略通常导致成功的结果。第一种策略是，建立连接反应混合物，其中插入片段与载体的比例约3∶1。第二种策略在将多于一个插入片段同时导入单个载体时应用，是导入欲被插入载体的等摩尔的每一遗传组件。这可以通过将不同体积的模块加入反应容器以便在连接反应混合物中获得等量摩尔数来实现，或者也可以通过将中性缓冲液加入每一纯化的模块以便它们以摩尔比为基础的浓度相等来实现。在本实施例中，经凝胶纯化的载体和插入片段均已用缓冲液10mM Tris，pH8.0调节为摩尔等量。连接反应总体积设定为150微升。连接反应混合物由下列组分组成：39微升的超纯水、15微升的10×连接酶缓冲液、5微升纯化的PE3载体骨架、15微升纯化的CMV启动子模块、15微升纯化的SPC启动子模块、15微升纯化的萤光素酶表达模块、15微升纯化的EGFP表达模块、15微升纯化的SV403’调控模块、15微升纯化的hGH 3’调控模块和1微升的连接酶。将得到的反应组分充分混合，随后于16℃温育过夜。
预测的载体连接产物包括下列：pCMV-EGFP-SV40pCMV-EGFP-hGHpCMV-萤光素酶-SV40pCMV-萤光素酶-hGHpSPC-EGFP-SV40pSPC-EGFP-hGHpSPC-萤光素酶-SV40pSPC-萤光素酶-hGH
随后用连接混合物转化大肠杆菌，随后将其铺板在带有氨苄青霉素的LB琼脂平板上。将平板在37℃温育过夜。分离菌落并使其在单独的液体LB肉汤培养物中繁殖。从每一LB肉汤培养物中分离质粒DNA。通过内切核酸酶绘图分析DNA，以便确定整合入每一菌落的得到的载体的身份。
在前述实施例中，第一次组合过程期间不产生其中一种预测的载体产物(pCMV-EGFP-SV40)。然而，成功产生的一种载体(pCMV-萤光素酶-SV40)可以作为产生期望的pCMV-EGFP-SV40载体的载体骨架。这种技术称为“二次途经装配”。
实施例5：二次途经装配(Second Pass Assembly)
为了构建期望的pCMV-EGFP-SV40载体，用Asc I和Not I消化实施例4中的pCMV-萤光素酶-SV40载体产物，用CIP处理，随后进行凝胶纯化。将该线性化的载体片段——其中萤光素酶模块已经被去除——在含有EGFP模块的连接混合物中温育，EGFP模块在前述组合载体装配实施例中产生。
用连接混合物转化大肠杆菌，随后将其铺板在带有氨苄青霉素的LB琼脂平板上。将平板在37℃温育过夜。分离菌落并将其在单独的液体LB肉汤培养物中繁殖。从每一LB肉汤培养物中分离质粒DNA。通过内切核酸酶绘图分析DNA，以便确定来自每一菌落的质粒是否含有EGFP插入片段。
在本发明的许多优势中，可以容易地理解，可以在短时间内迅速地装配大量转基因，每一转基因包括启动子组件、表达组件和调控组件的不同组合，以及迅速地且容易地变化或重新设计新的装配转基因。在过去，用已知方法改变装配的转基因以创建大量不同的转基因，每一转基因具有不同的启动子组件、表达组件和调控组件，这通常需要一年或更长的实验室时间。应用本发明的方法，可以在数天或数周内制备出相同数目的期望的转基因，随后对每一转基因进行期望的测试，从而为研究者节省了此前所需要的大量时间。进一步地，动态载体装配以及上述的组合方法都可以被用于为研究者节省宝贵的时间和金钱，其中，在动态载体装配中，每一启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段可以被同时插入一个骨架中，而在上述的组合方法中，两个P-穿梭载体、两个E-穿梭载体和两个调控穿梭载体全部组合起来，产生八种不同类型的转基因。可以采用原来通过从头合成、重组工程和PCR末端突出端克隆方法产生的穿梭载体，并与本发明的停泊点技术应用，以便迅速地将这些预先制备的元件组装进大量的转基因中。
虽然本发明已通过对实施方案的描述进行阐述，以及虽然对实施方案进行了详细描述，但是这不意味着将所附权利要求的范围约束或者以任何方式限制到如此详细的范围内。其它的优势和修改对本领域技术人员将是显而易见的。因此，本发明在其较宽方面不限于这些具体的细节、代表性的方法和结构，所示出和描述的示例性实施例。因此，可以对这些细节进行改变而不背离申请人总的发明思想的范围和精神。

Claims (18)

1.构建转基因的方法，包括步骤：
a.提供带有骨架的克隆载体质粒，所述骨架能够接受顺序排列的插入片段，所述克隆载体质粒包含至少一个非可变的罕见内切核酸酶位点；
b.用与所述至少一个非可变的罕见限制位点相对应的内切核酸酶切割所述限制位点；
c.提供欲被包含在所述转基因中的至少第一插入片段和第二插入片段，每个插入片段包括5’末端、感兴趣的核苷酸序列和3’末端，其中所述第一插入片段的5’末端与所述被切割的克隆载体质粒的3’末端相匹配，所述第二插入片段的3’末端与所述被切割的克隆载体质粒的5’末端相匹配，且所述第一插入片段的3’末端与所述第二插入片段的5’末端相匹配；和
d.在单一反应中将所述第一插入片段和所述第二插入片段转入所述骨架中。
2.制备转基因的方法，包括步骤：
a.提供包括第一停泊点和第二停泊点的克隆载体质粒，所述的停泊点的每一个包含至少一个非可变的罕见内切核酸酶位点；
b.用与所述第一停泊点的所述至少一个非可变的罕见限制位点相对应的第一内切核酸酶切割所述第一停泊点，留下带有3’末端的经切割的第一停泊点；
c.用与所述第二停泊点的所述至少一个非可变的罕见内切核酸酶位点相对应的第二核酸酶切割所述第二停泊点，留下带有5’末端的经切割的第二停泊点；d.将欲被包含在所述转基因中的第一核苷酸序列导入第一穿梭载体，所述第一核苷酸序列包括5’末端和3’末端；
e.将欲被包含在所述转基因中的第二核苷酸序列导入第二穿梭载体，所述第二核苷酸序列包括5’末端和3’末端；和
f.将所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列同时从所述穿梭载体转入所述克隆载体质粒中的所述第一停泊点和所述第二停泊点之间，
其中所述第一核苷酸序列的5’末端与所述经切割的第一停泊点的3’末端相匹配，所述第二核苷酸序列的3’末端与所述经切割的第二停泊点的5’末端相匹配，且所述第一核苷酸序列的3’末端与所述第二核苷酸序列的5’末端相匹配。
3.制备转基因的方法，包括步骤：
a.提供包括第一停泊点和第二停泊点的克隆载体质粒，所述的停泊点的每一个包含至少一个非可变的罕见内切核酸酶位点；
b.用与所述第一停泊点的所述至少一个非可变的罕见限制位点相对应的第一内切核酸酶切割所述第一停泊点，留下带有3’末端的经切割的第一停泊点；
c.用与所述第二停泊点的所述至少一个非可变的罕见内切核酸酶位点相对应的第二核酸酶切割所述第二停泊点，留下带有5’末端的经切割的第二停泊点；
d.将欲被包含在所述转基因中的启动子核苷酸序列导入启动子穿梭载体，所述启动子核苷酸序列包括5’末端和3’末端；
e.将欲被包含在所述转基因中的表达核苷酸序列导入表达穿梭载体，所述表达核苷酸序列包括5’末端和3’末端；
f.将欲被包含在所述转基因中的调控核苷酸序列导入调控穿梭载体，所述调控核苷酸序列包括5’末端和3’末端；和
g.将所述启动子核苷酸序列、所述表达核苷酸序列和所述调控核苷酸序列同时从所述启动子穿梭载体、所述表达穿梭载体和所述调控穿梭载体转入所述克隆载体质粒中的所述第一停泊点和所述第二停泊点之间，
其中所述启动子核苷酸序列的5’末端与所述经切割的第一停泊点的3’末端相匹配，所述启动子核苷酸序列的3’末端与所述表达核苷酸序列的5’末端相匹配，所述表达核苷酸序列的3’末端与所述调控核苷酸序列的5’末端相匹配，且所述调控核苷酸序列的3’末端与所述经切割的第二停泊点的5’末端相匹配。
4.同时合成大批转基因的方法，包括步骤：
a.提供包含第一停泊点和第二停泊点的初级克隆载体质粒，所述的停泊点的每一个包含至少一个非可变的罕见内切核酸酶位点；
b.用与所述第一停泊点的所述至少一个非可变的罕见限制位点相对应的第一内切核酸酶切割所述第一停泊点，留下带有3’末端的经切割的第一停泊点；
c.用与所述第二停泊点的所述至少一个非可变的罕见内切核酸酶位点相对应的第二核酸酶切割所述第二停泊点，留下带有5’末端的经切割的第二停泊点；d.将欲被包含在所述转基因中的至少一个启动子核苷酸序列导入相应的启动子穿梭载体，所述启动子核苷酸序列包括5’末端和3’末端；
e.将欲被包含所述在转基因中的至少一个表达核苷酸序列导入相应的表达穿梭载体，所述表达核苷酸序列包括5’末端和3’末端；
f.将欲被包含在所述转基因中的至少一个调控核苷酸序列导入相应的调控穿梭载体，所述调控核苷酸序列包括5’末端和3’末端；和
g.将所述启动子核苷酸序列、所述表达核苷酸序列和所述调控核苷酸序列从所述启动子穿梭载体、所述表达穿梭载体和所述调控穿梭载体同时转入所述克隆载体质粒中的所述第一停泊点和所述第二停泊点之间，
其中所述启动子核苷酸序列的5’末端与所述经切割的第一停泊点的3’末端相匹配，所述启动子核苷酸序列的3’末端与所述表达核苷酸序列的5’末端相匹配，所述表达核苷酸序列的3’末端与所述调控核苷酸序列的5’末端相匹配，且所述调控核苷酸序列的3’末端与所述经切割的第二停泊点的5’末端相匹配，且
其中一个启动子模块、一个表达模块和一个调控模块的至少两种组合被转入两个不同的初级克隆载体分子中。
5.制备用于合成转基因或其它复杂DNA构建物的模块克隆载体质粒的方法，所述方法包括步骤：
a.提供包含骨架的所述克隆载体质粒，所述骨架包含第一停泊点和第二停泊点，每一停泊点被安装在所述骨架中并包含内切核酸酶的至少一个非可变的罕见内切核酸酶位点；
b.用与所述第一停泊点的所述至少一个非可变的罕见限制位点相对应的第一内切核酸酶切割所述第一停泊点，留下带有3’末端的经切割的第一停泊点；
c.用与所述第二停泊点的所述至少一个非可变的罕见内切核酸酶位点相对应的第二核酸酶切割所述第二停泊点，留下带有5’末端的经切割的第二停泊点；
d.提供至少第一插入片段和第二插入片段，每一插入片段包括5’末端、感兴趣的核苷酸序列和3’末端，其中所述第一插入片段的5’末端与所述经切割的第一停泊点的3’末端相匹配，所述第二插入片段的3’末端与所述经切割的第二停泊点的5’末端相匹配；所述第一插入片段的3’末端与所述第二插入片段的5’末端相匹配，形成第三内切核酸酶的第三非可变的罕见内切核酸酶位点；和
e.将所述插入片段和所述被切割的克隆载体质粒放置在合适的反应混合物中，引起所述第一插入片段和所述第二插入片段在所述骨架中的所述第一停泊点和所述第二停泊点之间同时发生连接反应和自我定向，重新形成所述第一停泊点和所述第二停泊点，并形成所述模块克隆载体质粒。
6.权利要求5所述的方法，其提供用于修饰所述模块克隆载体质粒，还包括步骤：
f.随后，通过用所述第一内切核酸酶和所述第三内切核酸酶在所述第一停泊点和所述第三非可变的罕见内切核酸酶位点对所述模块克隆载体质粒进行切割，去除所述第一插入片段，在所述被切割的第一停泊点留下3’末端，在所述被切割的第三内切核酸酶位点留下5’末端；
g.提供包括5’末端、感兴趣的核苷酸序列和3’末端的第三插入片段，其中所述第三插入片段的5’末端与所述被切割的第一停泊点的3’末端相匹配，所述第三插入片段的3’末端与所述被切割的第三内切核酸酶位点的5’末端相匹配；和
h.将所述第三插入片段和所述被切割的模块克隆载体质粒放置在合适的反应混合物中，引起所述第三插入片段在所述第一停泊点和所述第三内切核酸酶位点之间同时发生连接反应和自我定向，并重新形成所述第一停泊点和所述第三内切核酸酶位点。
7.权利要求5所述的方法，其提供用于修饰所述模块克隆载体质粒，还包括步骤：
i.随后，通过用所述第二内切核酸酶和所述第三内切核酸酶在所述第一停泊点和所述第三非可变的罕见内切核酸酶位点对所述模块克隆载体质粒进行切割，去除所述第二插入片段，在所述被切割的第三内切核酸酶位点留下3’末端，在所述被切割的第二停泊点留下5’末端；
j.提供包括5’末端、感兴趣的核苷酸序列和3’末端的第四插入片段，其中所述第四插入片段的5’末端与所述被切割的第三内切核酸酶位点的3’末端相匹配，所述第四插入片段的3’末端与所述被切割的第二停泊点的5’末端相匹配；和
k.将所述第四插入片段和所述被切割的模块克隆载体质粒放置在合适的反应混合物中，引起所述第四插入片段在所述第三内切核酸酶位点和所述第二停泊点之间同时发生连接反应和自我定向，并重新形成所述第三内切核酸酶位点和所述第二停泊点。
8.权利要求5所述的方法，其中所述插入片段是通过选自从头合成、重组工程和PCR末端突出端克隆的方法产生的。
9.用于合成转基因或其它复杂DNA构建物的方法，包括步骤：
a.提供包含骨架的初级克隆载体质粒，所述骨架包括至少第一停泊点和第二停泊点，每一停泊点被安装在所述骨架中并包含非可变的罕见限制性内切核酸酶的至少一个罕见限制性位点；
b.用与所述第一停泊点的其中一个所述罕见限制性位点相对应的第一非可变的罕见限制性内切核酸酶切割所述第一停泊点，留下带有3’末端的被切割的骨架；
c.用与所述第二停泊点的其中一个所述限制性位点相对应的第二非可变的罕见限制性酶切割所述第二停泊点，留下带有5’末端的被切割的骨架；
d.提供启动子插入片段，其包括感兴趣的启动子序列、与所述第一停泊点的3’末端相匹配的5’末端，和3’末端；
e.提供表达插入片段，其包括感兴趣的表达序列、与所述启动子插入片段的3’末端相匹配以形成第三非可变的罕见限制性酶的罕见限制性位点的5’末端，和3’末端；
f.提供调控插入片段，其包括感兴趣的调控序列、与所述表达插入片段的3’末端相匹配而形成第四非可变的罕见限制性酶的罕见限制性位点的5’末端，和与在步骤‘c’中被切割的所述被切割的第二停泊点的5’末端相匹配的3’末端；和
g.将所述启动子插入片段、所述表达插入片段和所述调控插入片段和所述被切割的克隆载体质粒放置在合适的反应混合物中，引起所述启动子插入片段、所述表达插入片段和所述调控插入片段在所述第一停泊点和所述第二停泊点之间同时进行连接、自我定向和顺序放置，重新形成所述第一停泊点和所述第二停泊点，和形成模块式初级克隆载体质粒。
10.权利要求9所述的方法，其提供用于修饰所述模块式初级克隆载体质粒，还包括步骤：
h.在所述启动子插入片段、所述表达插入片段和所述调控插入片段中的至少其中之一的相应的一对罕见限制性位点对处，用一对罕见限制性酶切割所述模块式初级克隆载体质粒，留下带有3’末端和5’末端的被切割的载体质粒；
i.提供选自启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段的至少一个第五插入片段，所述第五插入片段具有与所述被切割的载体质粒的所述3’末端相匹配的5’末端，和与所述被切割的载体质粒的所述5’末端相匹配的3’末端；和
j.将所述第五插入片段和所述被切割的载体质粒放置在合适的反应混合物中，引起所述第五插入片段以相同的顺序同时连接入所述模块式初级克隆载体质粒并自我定向，重新形成所述的一对罕见限制性位点。
11.权利要求10所述的方法，还包括重复步骤h、i和j的步骤，用于插入选自启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段的一个或多个附加插入片段。
12.用于同时合成大批转基因或其它复杂DNA构建物的方法，包括步骤：
a.提供至少一个包含骨架的初级克隆载体质粒，具有5’末端、感兴趣的核苷酸序列和3’末端的插入片段可以被插入到所述骨架中，所述骨架可操作性地接受顺序排列的启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段，并且包含至少一个第一停泊点和第二停泊点，每一停泊点被安装在所述骨架中并包含非可变的罕见限制性酶的至少一个限制性位点；
b.用相应于所述第一停泊点的其中一个限制性位点的第一非可变的罕见限制性酶切割所述第一停泊点；
c.用相应于所述第二停泊点的其中一个限制性位点的第二非可变的罕见限制性酶切割所述第二停泊点；
d.提供已插入了启动子核苷酸序列的至少一个启动子插入片段，所述至少一个启动子插入片段的5’末端与在步骤‘b’中被切割的所述第一停泊点的3’末端相匹配；
e.提供已插入了表达核苷酸序列的至少一个表达插入片段，所述至少一个表达插入片段的5’末端与所述至少一个启动子插入片段的3’末端相匹配，形成第三非可变的罕见限制性酶的限制性位点；
f.提供已插入了调控核苷酸序列的至少一个调控插入片段，所述至少一个调控插入片段的5’末端与所述至少一个表达插入片段的3’末端相匹配，形成第四非可变的罕见限制性酶的限制性位点；所述至少一个调控插入片段的3’末端与在步骤‘c’中被切割的所述第二停泊点的5’末端相匹配；和
g.然后将启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段中至少一种的至少两个不同类型，每种剩余插入片段的至少一个，和被切割的克隆载体质粒放置在合适的反应混合物中，引起启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段中的每一种中的一个在所述骨架中的所述第一停泊点和所述第二停泊点之间同时进行连接、自我定向和顺序放置，从而产生在其骨架中具有启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段的不同组合的大批质粒。
13.权利要求12所述的方法，其中步骤‘g’包括，将启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段中至少两种的至少两个不同类型，剩余插入片段中的至少一个，和被切割的克隆载体质粒放置在合适的所述反应混合物中，引起所述启动子插入片段、所述表达插入片段和所述调控插入片段中的每一种中的一个在所述骨架中的所述第一停泊点和所述第二停泊点之间同时进行连接、自我定向和顺序放置，从而产生在其骨架中具有启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段的不同组合的大批质粒。。
14.权利要求12所述的方法，其中步骤‘g’包括，将启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段中每一种的至少两个不同类型和被切割的克隆载体质粒放置在合适的反应混合物中，引起所述启动子插入片段、所述表达插入片段和所述调控插入片段中的每一种中的一个在所述骨架中的所述第一停泊点和所述第二停泊点之间同时进行连接、自我定向和顺序放置，从而产生在其骨架中具有启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段的不同组合的大批质粒。
15.权利要求12、13或14所述的方法，其提供用于修饰模块式初级克隆载体质粒，还包括步骤：
h.用高通量筛选分析步骤‘g’的产物；
i.分离步骤‘g’的特定产物，所述产物是初级克隆载体质粒；
j.用相应的罕见限制性酶对，在启动子插入片段、表达插入片段和调控插入片段之一的5’末端和3’末端，切割来自步骤‘i’的初级克隆载体质粒的骨架；
k.提供第六插入片段，所述第六插入片段的5’末端与在步骤‘j’中被切割的所述骨架的所述3’末端相匹配，所述第六插入片段的3’末端与在步骤‘j’中被切割的所述骨架的5’末端相匹配；和
l.其后，将所述第六插入片段和在步骤‘j’中被切割的所述骨架放置在合适的反应混合物中，引起所述第六插入片段同时连接入所述骨架中并在其中自我定向。
16.权利要求15所述的方法，还包括重复步骤h、i、j、k和l的步骤，用于任意数目的插入片段，目的是用另一个插入片段顺序替代一个插入片段进入所述骨架。
17.权利要求12所述的方法，其中所述插入片段是通过选自从头合成、重组工程、PCR、末端突出端克隆技术和限制性内切核酸酶作图的方法产生的。
18.权利要求5、9或12中的任一项所述的方法，其中所述骨架还包括位于所述第一停泊点的5’末端上游的正向独特的HE位点和位于所述第二停泊点的3’末端下游的反向独特的HE位点，所述方法还包括步骤：
m.用独特的HE限制性酶在每一所述独特HE位点处切割所述骨架；
n.纯化含有所述插入片段的所述被切割部分；和
o.将所述被切割的部分插入感兴趣的宿主基因组中。
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