CN114848851A - 治疗β-地中海贫血的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗β‑地中海贫血的药物。该治疗β‑地中海贫血的药物包括HBG1突变供载体、HBG2突变供载体、Cas蛋白和sgRNA，HBG1突变供载体和HBG2突变供载体上均包括突变供体片段，突变供体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，sgRNA的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。该药物能够改善传统的基因疗法中HbF的表达水平有限的问题，能够提高HbF的表达，并且由于该治疗β‑地中海贫血的药物采用的是6个突变位点是自然发生的、良性突变，比直接破坏BCL11A转录因子更安全。

Description

治疗β-地中海贫血的药物
技术领域
本发明涉及基因技术领域，特别是涉及一种治疗β-地中海贫血的药物。
背景技术
胎儿血红蛋白(HbF)是由两条α-珠蛋白链和两条γ-珠蛋白链组成的四聚体，在人类生命的胎儿阶段高表达。一般地，HbF的表达在出生后逐渐沉默，直到它仅占总血红蛋白的1％左右。然而，γ-珠蛋白基因(HBG)调控区域中自然发生的突变可以重新激活出生后HbF的表达，但这种遗传性遗传病是良性的，被称为遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(HPFH)。
β-地中海贫血(β-thalassemia，简称β-地贫)是由于β-珠蛋白基因突变引起β珠蛋白链合成减少或缺失的溶血性疾病，是一种常染色体隐性遗传病。重型地贫患者由于溶血性贫血、无效造血、铁负荷过重导致多器官损伤，严重威胁患者生命。临床数据表明合并HPFH有利于改善β-地中海贫血患者的临床结局，遗传了HPFH的β-地贫患者被证明具有更轻的症状，极个别患者的HbF水平超过100g/L，表现为不依赖输血的生存状态。
目前，异体造血干细胞移植作为重型地贫唯一的治愈方法，由于配型十分困难，且供体来源有限，无法使广泛患者受益。随着基因编辑技术的高速发展，基于自体造血干细胞的基因编辑疗法成为目前研究热点。并且，由于BCL11A转录因子在造血红系发育过程中对HbF的关键调控作用，出现了通过靶向BCL11A红系特异性增强子区域或者靶向BCL11A在HBG启动子上的结合位点来提高HbF的基因疗法，但该方法中HbF的表达水平有限。
发明内容
基于此，有必要提供一种治疗β-地中海贫血的药物，该药物能够改善传统的基因疗法中HbF的表达水平有限的问题。
一种治疗β-地中海贫血的药物，所述药物包括HBG1突变供载体、HBG2突变供载体、Cas蛋白和sgRNA，所述HBG1突变供载体和HBG2突变供载体上均包含突变供体片段，所述突变供体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述sgRNA的靶点的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
上述治疗β-地中海贫血的药物包括BG1供体载体、HBG2突变供载体、Cas蛋白和sgRNA，其利用CRISPR/Cas基因编辑技术的原理，在sgRNA和Cas蛋白的作用下，将HBG1突变供载体和HBG2突变供载体中的包括突变供体片段整合到HBG1和HBG2上，从而在HBG1和HBG2的启动子上引入6个自然发生的HPFH突变：-113A>G、-114C>T、-117G>A、-175T>C、-195C>G和-198T>C，从而提高HbF的表达。由该治疗β-地中海贫血的药物引入的6个突变位点是自然发生的(没有人为干扰而在自然界中发生的突变)、良性突变，比直接破坏BCL11A转录因子更安全。
在其中一个实施例中，所述HBG1突变供载体包括位于其突变供体片段的上游的HBG1上同源臂和位于其突变供体的下游的HBG1下同源臂，所述HBG1上同源臂和所述HBG1下同源臂用于与HBG1发生同源重组，以将所述HBG1突变供载体上的突变供体片段整合到HBG1上；
所述HBG2突变供载体也包括位于其突变供体片段的上游HBG2上同源臂和位于其突变供体的下游的HBG2下同源臂，所述HBG2上同源臂和所述HBG2下同源臂用于与HBG2发生同源重组，以将所述HBG2突变供载体上的突变供体片段整合到HBG2上。
在其中一个实施例中，所述HBG1上同源臂、所述HBG1下同源臂、所述HBG2上同源臂和所述HBG2下同源臂的长度分别独立地为500bp～1000bp。
在其中一个实施例中，所述HBG1上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
和/或，所述HBG1下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
和/或，所述HBG2上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
和/或，所述HBG2下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在其中一个实施例中，所述sgRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的核酸片段。
在其中一个实施例中，所述sgRNA的5'端和/或3'端经2'-O-甲基3'-硫代磷酸化修饰。
在其中一个实施例中，所述Cas蛋白为Cas9、Cas12a、Cas12b和Cas12c中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述HBG1突变供载体和所述HBG2突变供载体的空载体为腺相关病毒；
在其中一个实施例中，所述腺相关病毒为AVV6。
在其中一个实施例中，所述HBG1突变供载体和所述HBG2突变供载体上均包括报告基因。
一种治疗β-地中海贫血的药物，所述药物包括HBG1突变供载体、HBG2突变供载体、Cas蛋白载体和sgRNA载体，所述HBG1突变供载体和HBG2突变供载体上均包含突变供体片段，所述突变供体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述sgRNA的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述Cas蛋白载体包括用于表达Cas蛋白的表达元件，sgRNA载体包括用于产生sgRNA的表达元件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1为本发明一实施例的制备治疗β-地中海贫血的药物的原理图；
图2为实施例1中HBG1 AAV6的载体图谱；
图3为实施例1中HBG2 AAV6的载体图谱；
图4为实施例1中GFP+分选前的NGS检测的InDel(Insertion+Deletion的简写)和HDR效率结果；
图5为实施例1中GFP+分选后的NGS检测的InDel和HDR效率结果；
图6为实施例1中的RT-qPCR检测检测γ-球蛋白/β-类球蛋白mRNA的表达情况的结果；
图7为实施例1中的高效液相色谱检测HUDEP-2细胞中HbF的表达情况的结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
本文中，术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
经本申请的研究发现，HBG1(NCBI数据库中的Gene ID:3047)和HBG2(NCBI数据库中的Gene ID:3048)中启动子上引入6个自然发生的HPFH突变：-113A>G、-114C>T、-117G>A、-175T>C、-195C>G和-198T>C来提高HbF的表达。其中，-113>G、-175T>C和-198T>C可以有效激活HbF的正调控转录因子GATA1、TAL1和KLF1的表达；而其他突变则破坏了HbF负调控转录因子BCL11A(-114C>T，-117G>A)和ZBTB7A(-195C>G)的结合位点。需要说明的是，在本文中，突变位点采用该位点距转录起始位点的碱基数表示(以转录起始位点为参考)。例如，-113表示位于转录起始位点上游的第113位(转录起始位点为第0位)。
基于上述，本申请一实施方式提供了一种HBG1和HBG2的突变位点：-113A>G、-114C>T、-117G>A、-175T>C、-195C>G和-198T>C在制备治疗β-地中海贫血的药物中的应用。
请参阅图1，此外，本申请一实施方式还提供了一种治疗β-地中海贫血的药物，该药物能够使得HBG1和HBG2发生突变，其突变位点：-113A>G、-114C>T、-117G>A、-175T>C、-195C>G和-198T>C。
进一步地，该药物包括HBG1突变供载体、HBG2突变供载体、Cas蛋白和sgRNA，HBG1突变供载体和HBG2突变供载体上均包括突变供体片段，突变供体片段的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，sgRNA的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。该治疗β-地中海贫血的药物利用CRISPR/Cas基因编辑技术，在sgRNA和Cas蛋白的作用下，将HBG1突变供载体和HBG2突变供载体中的突变供体片段整合到HBG1和HBG2上，从而在HBG1和HBG2的启动子上引入6个自然发生的HPFH突变：-113A>G、-114C>T、-117G>A、-175T>C、-195C>G和-198T>C，从而提高HbF的表达。并且，由于该治疗β-地中海贫血的药物引入的6个突变位点是自然发生的(在没有人为干扰而在自然界中发生的突变中筛选得到的)、良性突变，比直接破坏BCL11A转录因子更安全。
具体地，HBG1突变供载体和HBG2突变供载体是为治疗β-地中海贫血提供突变片段。在一些实施例中，HBG1突变供载体和HBG2突变供载体的空载体为腺相关病毒(Adreno-Associated Virus，AAV)。腺相关病毒(AAV)是一个常见的人细小病毒，自然缺陷、无包被和无致病原性。AAV复制周期由两个明显的阶段构成：潜伏期和增殖期。在缺少辅助病毒诸如腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或者在基因毒条件下，AAV能复制产生子代病毒颗粒。因此，通过AAV与基因编辑技术的结合，大大提高精准替换的效率。进一步地，HBG1突变供载体和HBG2突变供载体的空载体为AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9中的一种。更进一步地，HBG1突变供载体和HBG2突变供载体的空载体为AAV6。AAV6对血细胞感染效率比较高。可以理解的是，在其他实施例中，HBG1突变供载体和HBG2突变供载体的空载体不限于上述，还可以是其他载体。
在一些实施例中，HBG1突变供载体和HBG2突变供载体上均包括报告基因。报告基因有利于筛选出整合有突变片段的阳性细胞，利于筛选获得HbF表达能力更高的细胞，利于对富集的患者的造血干细胞进行改造后的筛选，使得治疗更有效。在一个可选地具体示例中，报告基因为EGFP。可以理解的是，在其他实施例中，报告基因不限于上述，还可以是其他基因。
具体地，Cas蛋白(CRISPR Associated Protein)是具有反式切割(transcleavage)或附带切割(collateral cleavage)活性的通过向导RNA(sgRNA)介导的核酸内切酶。在一些实施例中，Cas蛋白为Cas9、Cas12a、Cas12b和Cas12c中的至少一种。在一个可选地具体示例中，Cas蛋白为Cas9、Cas12a、Cas12b或Cas12c。可以理解的是，在其他实施例中，Cas蛋白不限于上述。
具体地，sgRNA用于引导Cas蛋白在特定的位置进行剪切。在本实施方式中，gRNA的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。在一些实施例中，sgRNA包括核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示的核酸片段。在一个可选地具体示例中，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。可以理解的是，在其他实施例中，sgRNA的核苷酸序列不限于上述，还可以根据gRNA的靶点进行设计。
进一步地，sgRNA的5'端和/或3'端特异性修饰，以提高sgRNA的稳定性。在一些实施例中，sgRNA的5'端和/或3'端经2'-O-甲基3'-硫代磷酸化修饰。在一个可选地具体示例中，sgRNA的5'端和3'端经2'-O-甲基3'-硫代磷酸化修饰。进一步地，在一些实施例中，HBG1突变供载体包括位于其突变供体片段的上游的HBG1上同源臂和位于其突变供体的下游的HBG1下同源臂，HBG1上同源臂和HBG1下同源臂用于与HBG1发生同源重组，以将HBG1突变供载体上的突变供体片段整合到HBG1上。HBG2突变供载体也包括位于其突变供体片段的上游HBG2上同源臂和位于其突变供体的下游的HBG2下同源臂，HBG2上同源臂和HBG2下同源臂用于与HBG2发生同源重组，以将HBG2突变供载体上的突变供体片段整合到HBG2上。通过在HBG1突变供载体和HBG2突变供载体上设置同源臂，可以使得突变片段快速且正确地整合到HBG1和HBG2上。
可选地，HBG1上同源臂、HBG1下同源臂、HBG2上同源臂和HBG2下同源臂的长度分别独立地为500bp～1000bp。在其他实施例中，HBG1上同源臂、HBG1下同源臂、HBG2上同源臂和HBG2下同源臂的长度不限于上述，还可以是其他。在一个可选地具体示例中，HBG1上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；HBG1下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；HBG2上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；HBG2下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在一些实施例中，治疗β-地中海贫血的药物还包括药学上可接受的辅料。在本文中，药学上可接受的辅料是指与药物制剂的其他成分相容并且适用于受药者(例如人或动物)的组织或器官的接触。在使用时并无或很小的毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或其他问题的并发症。
基于上述，本申请一实施方式还提供了另一种治疗β-地中海贫血的药物，该药物包括HBG1突变供载体、HBG2突变供载体、Cas蛋白载体和sgRNA载体，HBG1突变供载体和HBG2突变供载体上均包括突变供体片段，突变供体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，sgRNA的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，Cas蛋白载体包括用于表达Cas蛋白的表达元件，sgRNA载体包括用于产生sgRNA的表达元件。此治疗β-地中海贫血的药物包括HBG1突变供载体、HBG2突变供载体、Cas蛋白载体和sgRNA载体，通过Cas蛋白载体和sgRNA载体在体内表达产生Cas蛋白和sgRNA，来将突变片段整合到HBG1和HBG2上，而不是直接利用Cas蛋白和sgRNA。由于此治疗β-地中海贫血的药物同样也能将含有6个突变位点得到突变片段整合到HBG1和HBG2上，其同样也能提高HbF的表达，因此，其也可以用于β-地中海贫血治疗。
具体地，HBG1突变供载体和HBG2突变供载体是为治疗β-地中海贫血提供突变片段。HBG1突变供载体和HBG2突变供载体的结构如上文描述，此处不再赘述。
Cas蛋白载体用于表达Cas蛋白，sgRNA载体用于产生sgRNA。在一些实施例中，Cas蛋白载体和sgRNA载体的空载体分别独立地为腺相关病毒。进一步地，Cas蛋白载体和sgRNA载体的空载体分别独立地为AAV6。可以理解的是，在其他实施例中，Cas蛋白载体和sgRNA载体的空载体不限于上述，还可以是其他表达载体。
在一些实施例中，治疗β-地中海贫血的药物还包括药学上可接受的辅料。
此外，本申请一实施方式还提供了一种β-地中海贫血的治疗方法，该治疗方法包括使用上述任一实施例的治疗β-地中海贫血的药物。
可选地，上述的治疗β-地中海贫血的药物的给药方式为包括以下步骤：体外编辑(电转+病毒转染)病人来源的造血干细胞，再将编辑后的造血干细胞回输到患者体内。在一个可选地具体示例中，HBG1突变供载体、HBG2突变供载体、Cas蛋白和sgRNA的用量为每2×105个细胞：12pmol Cas9蛋白、64pmol的sgRNA、病毒2×109基因拷贝数，其中HBG1突变供载体和HBG2突变供载体的数量相同。
上述β-地中海贫血的治疗方法采用上述的治疗β-地中海贫血的药物，具有其相应的优点：产生的HbF多，且较破坏BCL11A转录因子更安全。
具体实施例以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。需要说明的是，在下文和附图中，在表示组别时，“MOCK”是指野生型组；“Control”是指对照组，也即是RNP的组别；“RNP-CtrAAV6”是指添加有RNP和AAV6空载体的试验组；“RNP-HBG1AAV6”是指添加有RNP和HBG1 AAV6载体的试验组；“RNP-HBG2AAV6”是指添加有RNP和HBG1 AAV6载体的试验组；“RNP-HBG1/HBG2AAV6”是指添加有RNP、HBG1 AAV6载体和HBG2 AAV6载体的试验组。
实施例1
1.载体的合成：HBG1 AAV6和HBG2 AAV6的载体图谱如图2和3所示，HBG1 AAV6和HBG2 AAV6载体于云舟生物公司合成。其中：
(1)在HBG1 AAV6中：
同源臂hHBG1_LA的核苷酸序列为：
GTGTGGACTATTAGTCAATAAAAACAACCCTTGCCTCTTTAGAGTTGTTTTCCATGTACACGCACATCTTATGTCTTAGAGTAAGATTCCCTGAGAAGTGAACCTAGCATTTATACAAGATAATTAATTCTAATCCACAGTACCTGCCAAAGAACATTCTACCATCATCTTTACTGAGCATAGAAGAGCTACGCCAAAACCCTGGGTCATCAGCCAGCACACACACTTATCCAGTGGTAAATACACATCATCTGGTGTATACATACATACCTGAATATGGAATCAAATATTTTTCTAAGATGAAACAGTCATGATTTATTTCAAATAGGTACGGATAAGTAGATATTGAGGTAAGCATTAGGTCTTATATTATGTAACACTAATCTATTACTGCGCTGAAACTGTGGCTTTATAGAAATTGTTTTCACTGCACTATTGAGAAATTAAGAGATAATGGCAAAAGTCACAAAGAGTATATTCAAAAAGAAGTATAGCACTTTTTCCTTAGAAACCACTGCTAACTGAAAGAGACTAAGATTTGTCCCGTCAAAAATCCTGGACCTATGCCTAAAACACATTTCACAATCCCTGAACTTTTCAAAAATTGGTACATGCTTTAGCTTTAAACTACAGGCCTCACTGGAGCTAGAGACAAGAAGGTAAAAAACGGCTGACAAAAGAAGTCCTGGTATCCTCTATGATGGGAGAAGGAAACTAGCTAAAGGGAAGAATAAATTAGAGAAAAACTGGAATGACTGAATCGGAACAAGGCAAAGGCTATAAAAAAAATTAGCAGTATCCTCTTGGGGGCCCCT(SEQ ID NO：3)。
同源臂hHBG1_RA的核苷酸序列：
ATAGCCTTGACAAGGCAAACTTGACCAATAGTCTTAGAGTATCCAGTGAGGCCAGGGGCCGGCGGCTGGCTAGGGATGAAGAATAAAAGGAAGCACCCTTCAGCAGTTCCACACACTCGCTTCTGGAACGTCTGAGGTTATCAATAAGCTCCTAGTCCAGACGCCATGGGTCATTTCACAGAGGAGGACAAGGCTACTATCACAAGCCTGTGGGGCAAGGTGAATGTGGAAGATGCTGGAGGAGAAACCCTGGGAAGGTAGGCTCTGGTGACCAGGACAAGGGAGGGAAGGAAGGACCCTGTGCCTGGCAAAAGTCCAGGTCGCTTCTCAGGATTTGTGGCACCTTCTGACTGTCAAACTGTTCTTGTCAATCTCACAGGCTCCTGGTTGTCTACCCATGGACCCAGAGGTTCTTTGACAGCTTTGGCAACCTGTCCTCTGCCTCTGCCATCATGGGCAACCCCAAAGTCAAGGCACATGGCAAGAAGGTGCTGACTTCCTTGGGAGATGCCACAAAGCACCTGGATGATCTCAAGGGCACCTTTGCCCAGCTGAGTGAACTGCACTGTGACAAGCTGCATGTGGATCCTGAGAACTTCAAGGTGAGTCCAGGAGATGTTTCAGCCCTGTTGCCTTTAGTCTCGAGGCAACTTAGACAACGGAGTATTGATCTGAGCACAGCAGGGTGTGAGCTGTTTGAAGATACTGGGGTTGGGGGTGAAGAAACTGCAGAGGACTAACTGGGCTGAGACCCAGTGGTAATGTTTTAGGGCCTAAGGAGTGCCTCTAAAAATCTAGATGGACAATTTT(SEQ ID NO：4)。
含有6个突变的供体片段hHBG1 donor的核苷酸序列为：
CCCGCACACTATCTCAATGCAAACATCTGTCTGAAACGGTCCCTGGCTAAACTCCACCCATGGGTTGGCCAGCCTTGCCTTAACTG(SEQ ID NO：1)。
(2)在HBG2 AAV6中：
同源臂hHBG2_LA的核苷酸序列为：
CACAGTGTGTGGACTATTAGTCAATAAAACAGTCCCTGCCTCTTAAGAGTTGTTTTCCATGCAAATACATGTCTTATGTCTTAGAATAAGATTCCCTAAGAAGTGAACCTAGCATTTATACAAGATAATTAATTCTAATCCATAGTATCTGGTAAAGAGCATTCTACCATCATCTTTACCGAGCATAGAAGAGCTACACCAAAACCCTGGGTCATCAGCCAGCACATACACTTATCCAGTGATAAATACACATCATCGGGTGCCTACATACATACCTGAATATAAAAAAAATACTTTTGCTGAGATGAAACAGGCGTGATTTATTTCAAATAGGTACGGATAAGTAGATATTGAAGTAAGGATTCAGTCTTATATTATATTACATAACATTAATCTATTCCTGCACTGAAACTGTTGCTTTATAGGATTTTTCACTACACTAATGAGAACTTAAGAGATAATGGCCTAAAACCACAGAGAGTATATTCAAAGATAAGTATAGCACTTCTTATTTGGAAACCAATGCTTACTAAATGAGACTAAGACGTGTCCCATCAAAAATCCTGGACCTATGCCTAAAACACATTTCACAATCCCTGAACTTTTCAAAAATTGGTACATGCTTTAACTTTAAACTACAGGCCTCACTGGAGCTACAGACAAGAAGGTGAAAAACGGCTGACAAAAGAAGTCCTGGTATCTTCTATGGTGGGAGAAGAAAACTAGCTAAAGGGAAGAATAAATTAGAGAAAAATTGGAATGACTGAATCGGAACAAGGCAAAGGCTATAAAAAAAATTAAGCAGCAGTATCCTCTTGGGGGCCCCT(SEQ ID NO：5)。
同源臂hHBG2_RA的核苷酸序列：
GATAGCCTTGACAAGGCAAACTTGACCAATAGTCTTAGAGTATCCAGTGAGGCCAGGGGCCGGCGGCTGGCTAGGGATGAAGAATAAAAGGAAGCACCCTTCAGCAGTTCCACACACTCGCTTCTGGAACGTCTGAGGTTATCAATAAGCTCCTAGTCCAGACGCCATGGGTCATTTCACAGAGGAGGACAAGGCTACTATCACAAGCCTGTGGGGCAAGGTGAATGTGGAAGATGCTGGAGGAGAAACCCTGGGAAGGTAGGCTCTGGTGACCAGGACAAGGGAGGGAAGGAAGGACCCTGTGCCTGGCAAAAGTCCAGGTCGCTTCTCAGGATTTGTGGCACCTTCTGACTGTCAAACTGTTCTTGTCAATCTCACAGGCTCCTGGTTGTCTACCCATGGACCCAGAGGTTCTTTGACAGCTTTGGCAACCTGTCCTCTGCCTCTGCCATCATGGGCAACCCCAAAGTCAAGGCACATGGCAAGAAGGTGCTGACTTCCTTGGGAGATGCCATAAAGCACCTGGATGATCTCAAGGGCACCTTTGCCCAGCTGAGTGAACTGCACTGTGACAAGCTGCATGTGGATCCTGAGAACTTCAAGGTGAGTCCAGGAGATGTTTCAGCACTGTTGCCTTTAGTCTCGAGGCAACTTAGACAACTGAGTATTGATCTGAGCACAGCAGGGTGTGAGCTGTTTGAAGATACTGGGGTTGGGAGTGAAGAAACTGCAGAGGACTAACTGGGCTGAGACCCAGTGGCAATGTTTTAGGGCCTAAGGAGTGCCTCTGAAAATCTAGATGGACAACT(SEQ ID NO：6)。
含有6个突变的供体片段hHBG2 donor的核苷酸序列：
CCCGCACACTATCTCAATGCAAACATCTGTCTGAAACGGTCCCTGGCTAAACTCCACCCATGGGTTGGCCAGCCTTGCCTTAACTG(SEQ ID NO：1)。
2.Cas9蛋白及sgRNA合成：
TrueCut Cas9蛋白购自Invitrogen。特异性化学修饰的sgRNA，包括5'和3'端的2'-O-甲基3'-硫代磷酸化修饰，购自Synthego。sgRNA的目标序列为：5'-CCTTGACCAATAGCCTTGACAAG-3'(SEQ ID NO：2)；特异性化学修饰的sgRNA的核苷酸序列为：
5’-mC*mU*mU*GUCAAGGCUAUUGGUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU-3’(SEQ ID NO：8)，其中特异性识别目标序列的序列为：mC*mU*mU*GUCAAGGCUAUUGGUCA(SEQ ID NO：7)。“m”代表2'-O-甲基，“*”代表硫代磷酸化修饰。
电转步骤：将12pmol Cas9蛋白与64pmol sgRNA于5μL BufferT(Thermo FisherScientific)中混合并孵育20min，形成核糖核蛋白复合物(Ribonucleoproteincomplexes，RNP)。将2×105HUDEP-2细胞重悬于7μL BufferT中，与RNP混合后取10μL使用Neon电转仪进行转染，注意不要有气泡。电转条件：1400V，3plus，20ms。电穿孔后立即加入500μL HUDEP-2细胞扩增培养基中，向培养基中加入AAV6病毒(MOI＝10000，MOI值＝病毒滴度(TU/mL)×病毒体积(mL)/细胞个数，加入培养基的HBG1 AAV6和HBG2 AAV6的滴度和体积相同)后置于37℃，5％CO2的培养箱中培养12h后，加入1mL培养基继续培养12h后换液。经流式细胞仪分选的GFP阳性细胞，分别再做GFP+分选前后细胞的以下检测：
细胞扩增5天后通过二代测序检测InDels和同源重组(Homology DirectedRepair，HDR)效率，RT-qPCR检测γ-球蛋白/β-类球蛋白mRNA的表达，在分化第8天，用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)法检测HUDEP-2细胞中HbF的表达。具体地：
二代测序检测InDels和同源重组(Homology Directed Repair，HDR)效率的步骤包括：(1)用“扩增最佳伴侣”(北京聚合美生物科技有限公司)95℃裂解细胞10min以获得DNA。(2)对于靶位点序列的检测：采用巢式PCR扩增HBG1/2启动子的编辑位点。A：第一对PCR引物设计在同源臂外，扩增出一个约4kb的片段：Primer-F：5'-AGCCTGAGCCCTTCTGTCTA-3'；Primer-R：5'-ACGCTGATGCTGACTTGTGA-3'；B：使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)从第一轮PCR产物中回收4kb的片段。接下来，使用第二对引物扩增出包括编辑位点的200bp左右的片段：Primer-F:5'-GGAGTGAGTACGGTGTGCATCGGAACAAGGCAAAGGCTAT-3'；Primer-R:5'-GAGTTGGATGCTGGATGGCCTGGCCTCACTGGATACTCTA-3'。C：通过二代测序(10000×reads)检测InDel和HDR占比，结果如图4和图5所示，其中图4是GFP+分选前的NGS检测的InDel和HDR效率结果，图5是GFP+分选后的NGS检测的InDel和HDR效率结果。
由图4和图5可知，经过分选之后，HDR效率提高。
RT-qPCR检测γ-球蛋白/β-类球蛋白mRNA的表达的步骤包括：(1)组织或细胞加Trizol后，温放置5min，使其充分裂解；(2)12000rpm，离心5min，弃沉淀；(3)按200μL氯仿/mLTrizol加入氯仿，震荡混匀后室温放置15min，(4)4℃，12000g，离心15min；(5)吸取上层水相，至另一离心管中；(6)按0.5mL异丙醇/mLTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5～10min；(7)4℃12000g离心10min,弃上清，RNA沉于管底；(8)按1m1 75％乙醇/mLTrizol加入75％乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀；(9)4℃8000g离心5min，尽量弃上清；(10)室温晾干5～10min；(11)可用30μL ddH20溶解RNA样品；(11)OD值定量RNA浓度。(12)进行RT-qPCR检测，结果如图6所示。
由图6可知，相比于Control组和RNP-CtrAAV6组，基因编辑成功地提高了γ-球蛋白/β-类球蛋白mRNA水平，并且通过RNP-CtrAAV6组与整合上突变片段的RNP-HBG1AAV6组、RNP-HBG2AAV6组和RNP-HBG1/HBG2AAV6组的对比发现，仅经过Cas9剪切但没有发生同源重组和定点替换的RNP-CtrAAV6组的γ-球蛋白/β-类球蛋白mRNA水平显著较低。
用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)法检测HUDEP-2细胞中HbF的表达的步骤包括：分化后的1×107细胞300g离心5min，去上清后加入100μL ddH2O，放-80℃3min，37℃溶解，反复冻融3次，使用VARIANT-Ⅱ血红蛋白分析系统检测HbF比例，结果如图7所示。
由图7可知，启动子HBG1/HBG2经定点突变之后其HbF的表达量有明显提高。与野生型的相比，RNP-HBG1/HBG2AAV6组的HbF表达量提高到54.15±2.45％，提高了5倍，这表明定点突变6个位点能够明显提高HbF表达量。与RNP-CtrAAV6组相比，RNP-HBG1/HBG2AAV6组的HbF表达量提高到54.15±2.45％，提高了约32％，这表明虽然通过Cas蛋白的作用破坏了启动子的某些位点或区域(经测序验证，被破坏的位点包括但不限于BCL11A转录因子结合的位点)而提高HbF表达，但其效果不如定点突变上述6个位点。并且，经分选后，HbF的表达量有明显提高，可以达到67.2±0.56％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院）
<120> 治疗β-地中海贫血的药物
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccgcacact atctcaatgc aaacatctgt ctgaaacggt ccctggctaa actccaccca 60
tgggttggcc agccttgcct taactg 86
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttgaccaa tagccttgac aag 23
<210> 3
<211> 815
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgtggacta ttagtcaata aaaacaaccc ttgcctcttt agagttgttt tccatgtaca 60
cgcacatctt atgtcttaga gtaagattcc ctgagaagtg aacctagcat ttatacaaga 120
taattaattc taatccacag tacctgccaa agaacattct accatcatct ttactgagca 180
tagaagagct acgccaaaac cctgggtcat cagccagcac acacacttat ccagtggtaa 240
atacacatca tctggtgtat acatacatac ctgaatatgg aatcaaatat ttttctaaga 300
tgaaacagtc atgatttatt tcaaataggt acggataagt agatattgag gtaagcatta 360
ggtcttatat tatgtaacac taatctatta ctgcgctgaa actgtggctt tatagaaatt 420
gttttcactg cactattgag aaattaagag ataatggcaa aagtcacaaa gagtatattc 480
aaaaagaagt atagcacttt ttccttagaa accactgcta actgaaagag actaagattt 540
gtcccgtcaa aaatcctgga cctatgccta aaacacattt cacaatccct gaacttttca 600
aaaattggta catgctttag ctttaaacta caggcctcac tggagctaga gacaagaagg 660
taaaaaacgg ctgacaaaag aagtcctggt atcctctatg atgggagaag gaaactagct 720
aaagggaaga ataaattaga gaaaaactgg aatgactgaa tcggaacaag gcaaaggcta 780
taaaaaaaat tagcagtatc ctcttggggg cccct 815
<210> 4
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atagccttga caaggcaaac ttgaccaata gtcttagagt atccagtgag gccaggggcc 60
ggcggctggc tagggatgaa gaataaaagg aagcaccctt cagcagttcc acacactcgc 120
ttctggaacg tctgaggtta tcaataagct cctagtccag acgccatggg tcatttcaca 180
gaggaggaca aggctactat cacaagcctg tggggcaagg tgaatgtgga agatgctgga 240
ggagaaaccc tgggaaggta ggctctggtg accaggacaa gggagggaag gaaggaccct 300
gtgcctggca aaagtccagg tcgcttctca ggatttgtgg caccttctga ctgtcaaact 360
gttcttgtca atctcacagg ctcctggttg tctacccatg gacccagagg ttctttgaca 420
gctttggcaa cctgtcctct gcctctgcca tcatgggcaa ccccaaagtc aaggcacatg 480
gcaagaaggt gctgacttcc ttgggagatg ccacaaagca cctggatgat ctcaagggca 540
cctttgccca gctgagtgaa ctgcactgtg acaagctgca tgtggatcct gagaacttca 600
aggtgagtcc aggagatgtt tcagccctgt tgcctttagt ctcgaggcaa cttagacaac 660
ggagtattga tctgagcaca gcagggtgtg agctgtttga agatactggg gttgggggtg 720
aagaaactgc agaggactaa ctgggctgag acccagtggt aatgttttag ggcctaagga 780
gtgcctctaa aaatctagat ggacaatttt 810
<210> 5
<211> 827
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cacagtgtgt ggactattag tcaataaaac agtccctgcc tcttaagagt tgttttccat 60
gcaaatacat gtcttatgtc ttagaataag attccctaag aagtgaacct agcatttata 120
caagataatt aattctaatc catagtatct ggtaaagagc attctaccat catctttacc 180
gagcatagaa gagctacacc aaaaccctgg gtcatcagcc agcacataca cttatccagt 240
gataaataca catcatcggg tgcctacata catacctgaa tataaaaaaa atacttttgc 300
tgagatgaaa caggcgtgat ttatttcaaa taggtacgga taagtagata ttgaagtaag 360
gattcagtct tatattatat tacataacat taatctattc ctgcactgaa actgttgctt 420
tataggattt ttcactacac taatgagaac ttaagagata atggcctaaa accacagaga 480
gtatattcaa agataagtat agcacttctt atttggaaac caatgcttac taaatgagac 540
taagacgtgt cccatcaaaa atcctggacc tatgcctaaa acacatttca caatccctga 600
acttttcaaa aattggtaca tgctttaact ttaaactaca ggcctcactg gagctacaga 660
caagaaggtg aaaaacggct gacaaaagaa gtcctggtat cttctatggt gggagaagaa 720
aactagctaa agggaagaat aaattagaga aaaattggaa tgactgaatc ggaacaaggc 780
aaaggctata aaaaaaatta agcagcagta tcctcttggg ggcccct 827
<210> 6
<211> 809
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatagccttg acaaggcaaa cttgaccaat agtcttagag tatccagtga ggccaggggc 60
cggcggctgg ctagggatga agaataaaag gaagcaccct tcagcagttc cacacactcg 120
cttctggaac gtctgaggtt atcaataagc tcctagtcca gacgccatgg gtcatttcac 180
agaggaggac aaggctacta tcacaagcct gtggggcaag gtgaatgtgg aagatgctgg 240
aggagaaacc ctgggaaggt aggctctggt gaccaggaca agggagggaa ggaaggaccc 300
tgtgcctggc aaaagtccag gtcgcttctc aggatttgtg gcaccttctg actgtcaaac 360
tgttcttgtc aatctcacag gctcctggtt gtctacccat ggacccagag gttctttgac 420
agctttggca acctgtcctc tgcctctgcc atcatgggca accccaaagt caaggcacat 480
ggcaagaagg tgctgacttc cttgggagat gccataaagc acctggatga tctcaagggc 540
acctttgccc agctgagtga actgcactgt gacaagctgc atgtggatcc tgagaacttc 600
aaggtgagtc caggagatgt ttcagcactg ttgcctttag tctcgaggca acttagacaa 660
ctgagtattg atctgagcac agcagggtgt gagctgtttg aagatactgg ggttgggagt 720
gaagaaactg cagaggacta actgggctga gacccagtgg caatgtttta gggcctaagg 780
agtgcctctg aaaatctaga tggacaact 809
<210> 7
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cuugucaagg cuauugguca 20
<210> 8
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cuugucaagg cuauugguca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims (10)

1.一种治疗β-地中海贫血的药物，其特征在于，所述药物包括HBG1突变供载体、HBG2突变供载体、Cas蛋白和sgRNA，所述HBG1突变供载体和HBG2突变供载体均包含突变供体片段，所述突变供体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述sgRNA的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的治疗β-地中海贫血的药物，其特征在于，所述HBG1突变供载体包括位于其突变供体片段的上游的HBG1上同源臂和位于其突变供体的下游的HBG1下同源臂，所述HBG1上同源臂和所述HBG1下同源臂用于与HBG1发生同源重组，以将所述HBG1突变供载体上的突变供体片段整合到HBG1上；
所述HBG2突变供载体也包括位于其突变供体片段的上游HBG2上同源臂和位于其突变供体的下游的HBG2下同源臂，所述HBG2上同源臂和所述HBG2下同源臂用于与HBG2发生同源重组，以将所述HBG2突变供载体上的突变供体片段整合到HBG2上。
3.根据权利要求2所述的治疗β-地中海贫血的药物，其特征在于，所述HBG1上同源臂、所述HBG1下同源臂、所述HBG2上同源臂和所述HBG2下同源臂的长度分别独立地为500bp～1000bp。
4.根据权利要求3所述的治疗β-地中海贫血的药物，其特征在于，所述HBG1上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
和/或，所述HBG1下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
和/或，所述HBG2上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
和/或，所述HBG2下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的治疗β-地中海贫血的药物，其特征在于，所述sgRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的核酸片段。
6.根据权利要求5所述的治疗β-地中海贫血的药物，其特征在于，所述sgRNA的5'端和/或3'端经2'-O-甲基3'-硫代磷酸化修饰。
7.根据权利要求1～4和6中任一项所述的治疗β-地中海贫血的药物，其特征在于，所述Cas蛋白为Cas9、Cas12a、Cas12b和Cas12c中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的治疗β-地中海贫血的药物，其特征在于，所述HBG1突变供载体和所述HBG2突变供载体的空载体为腺相关病毒；
进一步地，所述腺相关病毒为AVV6。
9.根据权利要求8所述的治疗β-地中海贫血的药物，其特征在于，所述HBG1突变供载体和所述HBG2突变供载体上均包括报告基因。
10.一种治疗β-地中海贫血的药物，其特征在于，所述药物包括HBG1突变供载体、HBG2突变供载体、Cas蛋白载体和sgRNA载体，所述HBG1突变供载体和HBG2突变供载体均包含突变供体片段，所述突变供体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述sgRNA的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述Cas蛋白载体包括用于表达Cas蛋白的表达元件，sgRNA载体包括用于产生sgRNA的表达元件。
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