CN104284669A - 治疗血红蛋白病的组合物和方法 - Google Patents
治疗血红蛋白病的组合物和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104284669A CN104284669A CN201380017193.5A CN201380017193A CN104284669A CN 104284669 A CN104284669 A CN 104284669A CN 201380017193 A CN201380017193 A CN 201380017193A CN 104284669 A CN104284669 A CN 104284669A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- endonuclease
- homing endonuclease
- nucleotide sequence
- bcl11a
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 87
- 208000034737 hemoglobinopathy Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 95
- 208000018337 inherited hemoglobinopathy Diseases 0.000 title abstract description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 223
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 215
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 164
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 82
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 69
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 69
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 65
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 claims description 59
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 55
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 55
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 55
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 claims description 47
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 40
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 36
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 108010044495 Fetal Hemoglobin Proteins 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 33
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 claims description 33
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 claims description 32
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 27
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 26
- 101000830950 Homo sapiens Three prime repair exonuclease 2 Proteins 0.000 claims description 23
- 102100024872 Three prime repair exonuclease 2 Human genes 0.000 claims description 23
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 claims description 23
- 101150085724 Bcl11a gene Proteins 0.000 claims description 22
- 101100493742 Mus musculus Bcl11a gene Proteins 0.000 claims description 22
- 108010000334 delta-globulin Proteins 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 102000010722 N-Glycosyl Hydrolases Human genes 0.000 claims description 16
- 108010063372 N-Glycosyl Hydrolases Proteins 0.000 claims description 16
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 10
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 8
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 8
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 8
- 241000714192 Human spumaretrovirus Species 0.000 claims description 5
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims 16
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims 7
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 claims 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 67
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 65
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 36
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 abstract description 28
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 abstract description 28
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 16
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 9
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 abstract description 4
- 108091005903 Hemoglobin subunit delta Proteins 0.000 abstract description 3
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 abstract description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 abstract description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 abstract 4
- 108091005886 Hemoglobin subunit gamma Proteins 0.000 abstract 1
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 abstract 1
- 108010038853 gamma-Globins Proteins 0.000 abstract 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 abstract 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 43
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 43
- 230000008859 change Effects 0.000 description 42
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 42
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 39
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 36
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 24
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 19
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 19
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 19
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 18
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 17
- 101100493741 Homo sapiens BCL11A gene Proteins 0.000 description 16
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 16
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 15
- 208000020451 hereditary persistence of fetal hemoglobin Diseases 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 14
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 102100031690 Erythroid transcription factor Human genes 0.000 description 12
- 101710100588 Erythroid transcription factor Proteins 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 10
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 10
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 10
- 102100022976 B-cell lymphoma/leukemia 11A Human genes 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 101000903703 Homo sapiens B-cell lymphoma/leukemia 11A Proteins 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 9
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 9
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 7
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 7
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 6
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 6
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 6
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 6
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 6
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 6
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 5
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 230000000913 erythropoietic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 5
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 206010060872 Transplant failure Diseases 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 4
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 4
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 3
- 101100290380 Caenorhabditis elegans cel-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100342337 Caenorhabditis elegans klf-1 gene Proteins 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 3
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 101150034785 gamma gene Proteins 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- YURDCJXYOLERLO-LCYFTJDESA-N (2E)-5-methyl-2-phenylhex-2-enal Chemical compound CC(C)C\C=C(\C=O)C1=CC=CC=C1 YURDCJXYOLERLO-LCYFTJDESA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150014361 Delta gene Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 101000804877 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) 5'-3' exoribonuclease 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 210000002506 abnormal erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011509 clonal analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 2
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 2
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 229940059904 light mineral oil Drugs 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 2
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 1-oxidanylurea Chemical compound N[14C](=O)NO VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- FSPQCTGGIANIJZ-UHFFFAOYSA-N 2-[[(3,4-dimethoxyphenyl)-oxomethyl]amino]-4,5,6,7-tetrahydro-1-benzothiophene-3-carboxamide Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C(=O)NC1=C(C(N)=O)C(CCCC2)=C2S1 FSPQCTGGIANIJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPVDXIMFBOLMNW-ISLYRVAYSA-N 7-hydroxy-8-[(E)-phenyldiazenyl]naphthalene-1,3-disulfonic acid Chemical compound OC1=CC=C2C=C(S(O)(=O)=O)C=C(S(O)(=O)=O)C2=C1\N=N\C1=CC=CC=C1 MPVDXIMFBOLMNW-ISLYRVAYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 description 1
- 102100034567 Angiopoietin-related protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010065553 Bone marrow failure Diseases 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000028180 Glycophorins Human genes 0.000 description 1
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 108091005880 Hemoglobin F Proteins 0.000 description 1
- 102100039894 Hemoglobin subunit delta Human genes 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000924346 Homo sapiens Angiopoietin-related protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001105486 Homo sapiens Proteasome subunit alpha type-7 Proteins 0.000 description 1
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 1
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 101100018264 Mus musculus Hoxb4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 102100035593 POU domain, class 2, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710084414 POU domain, class 2, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100021201 Proteasome subunit alpha type-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 description 1
- 101710151245 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N Sorbitan monooleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027188 Thyroid peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710113649 Thyroid peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Natural products N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 101150102092 ccdB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 108010022155 hemoglobin Portland Proteins 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011575 immunodeficient mouse model Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- NONJJLVGHLVQQM-JHXYUMNGSA-N phenethicillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C(C)OC1=CC=CC=C1 NONJJLVGHLVQQM-JHXYUMNGSA-N 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000000246 remedial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102200009417 rs121908117 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001743 silencing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明提供治疗诸如地中海贫血和镰状细胞病的血红蛋白病的组合物和方法。组合物和方法包含/包括一种或多种内切核酸酶或内切核酸酶融合蛋白，该内切核酸酶或内切核酸酶融合蛋白包括一种或多种归巢内切核酸酶和/或归巢内切核酸酶融合蛋白和/或CRISPR内切核酸酶和/或CRISPR内切核酸酶融合蛋白：(a)以破坏Bel11a编码区；(b)以破坏Bel11a基因调节区；(c)以修饰成人β-球蛋白基因座；(d)以破坏HbF沉默DNA调节元件或通路，诸如Bel11a-调节的HbF沉默区；(e)以突变一种或多种γ-球蛋白基因启动子来实现γ-球蛋白基因表达增加；(f)以突变一种或多种δ-球蛋白基因启动子来实现δ-球蛋白基因表达增加；和/或(g)以修正一种或多种β-球蛋白基因突变。
Description
相关申请的交叉引用
本申请作为PCT国际专利申请于2013年2月22日提交，并要求2012年2月24日提交的美国临时专利申请No.61/603,231的优先权，其公开内容在此以全文引用的方式并入本文。
序列表
本申请包括作为txt文件的电子形式的序列表，其标题是“序列表54428.0006WOU1_ST25”并于2013年2月22日创建并且其大小为174千字节(KB)。所述txt文件“序列表54428.0006WOU1_ST25”的内容通过引用方式并入本文。
技术领域
本公开总体涉及遗传病的治疗。更具体地，本公开提供用于改变球蛋白基因表达的基于内切核酸酶的组合物和方法，包括基于归巢内切核酸酶和基于Cas9内切核酸酶的组合物和方法，所述组合物和方法用于治疗地中海贫血、镰状细胞病和其它血红蛋白病。
背景技术
血红蛋白病，诸如地中海贫血和镰状细胞病，是在全球导致显著健康负担的非常普遍的红细胞遗传病。每年有超过1,300,000名患有严重血红蛋白病症的患者出生。当全球人口的5％是携带者时，对于临床显著形式的地中海贫血和镰状细胞病(SCD)的出生率分别是0.44个/千人和1.96个/千人。
在正常状态下，哺乳动物红系细胞中存在的血红蛋白主要由两条α样链(多肽)和两条β样链的异源四聚体构成。所述β-球蛋白基因座的五个基因以簇的形式位于染色体11上。所述基因在红系细胞中表达，并且伴随发育在特异性位置进行；所述ε、Αγ和Gγ、及δ和β基因主要分别在胚胎期、胎儿期和产后期表达。出生时95％的β样链是γ，剩下的是β。这一比率在出生后第一年逐渐转变，这解释了为什么限于β-球蛋白基因的表型诸如镰状细胞和大多数β-地中海贫血直到数月大时才表现出来。基于染色体16的α样基因的表达不同；胚胎ζ-基因与ε的表达对应，但是成对的α-基因从胎儿期开始表达。因此，α异常在子宫内表现，潜在地伴有毁灭性的结果(如胎儿水肿)。所得的α-异源四聚体、β-异源四聚体伴随发育表达；胚胎：Hb Gower1(ζ2,ε2)、Hb Gower2(α2,ε2)和Hb Portland(ζ2,γ2)；胎儿：HbF(胎儿)(α2,γ2)以及成人：HbA2(α2,δ2)和HbA(成人)(α2,β2)。
β-地中海贫血的起因是成人β-球蛋白基因座的异常，进而导致β样球蛋白链与α样链的异常化学计量，造成未配对的α样链沉淀。地中海贫血的严重程度直接与该球蛋白链的不平衡度相关。接下来通过数条通路介导的损伤(包括细胞蛋白和膜蛋白的氧化)的最终结果是无效的红细胞生成、凋亡和红细胞存活减少。已经描述了导致β-地中海贫血的超过200个突变。
镰状细胞病的起因是β-球蛋白基因内的单核苷酸置换，进而造成谷氨酸被缬氨酸在肽的第6位氨基酸处所置换，产生βS。与正常成人血红蛋白(HbA)相反，携带该突变的血红蛋白S(α2,βS2)被称为HbS。在低氧浓度的情况下，HbS发生别构变化，在别构位点处其可聚合。脱氧形式的血红蛋白在E和F螺旋之间的蛋白上呈现疏水补丁。在血红蛋白β-链的第6位处的疏水性缬氨酸形成疏水补丁，所述疏水补丁可与其它血红蛋白S分子的疏水补丁相结合，导致血红蛋白S分子聚集并形成纤维沉淀，继而引起红细胞变为镰刀状并导致数条通路变化，这通过血管堵塞和溶血导致组织损伤。
尽管β-地中海贫血和镰状细胞病(SCD)分别是β-球蛋白基因座的定量病症和定性病症，但正常β样球蛋白基因的表达可改善这两种疾病。在地中海贫血中，任何对球蛋白链不平衡的改进都可为每个细胞提供选择优势，并产生临床效益。在镰状细胞病中，正常或某些突变的β样链的存在可通过比突变的镰状细胞链更有效地竞争α样链从而减少HbS的量，通过形成阻断Hbs(如HbF)的聚合的血红蛋白和增加每个细胞非镰变血红蛋白的量，来改善临床表型。例如，在镰状细胞病中，仅8％的胎儿血红蛋白(HbF)水平可抑制HbS聚合，这导致存活率提高，而20％的HbF水平提供近乎完全的表型校正。重要的是，含有正常HbA的供体红系细胞的后代在造血干细胞移植(HSCT)之后具有超过含HbS的内源来源的细胞的较强选择性优势。在骨髓中有11％供体细胞的患者具有35％的供体BFUe和73％的供体红细胞，这导致输血独立性。因此，修正相对小部分的移植HSC具有临床益处。
严重型地中海贫血需要慢性输血，这导致铁过量。尽管费用、副作用和依从性严重限制了功效，但存活率与螯合功效直接相关。FDA批准的唯一针对SCD的药物是羟基脲，其可降低发病率和死亡率。然而，该治疗剂量过小，依从性差，且其不能完全保护健康。
对于每年数以千计的患有恶性血液病和相关病症的患者来说，造血细胞移植(HCT)是重要的治疗选择。根据国际血液和骨髓移植研究中心(CIBMTR)，在2009年进行了大约60,000例移植，与过去的十年相比每年增加超过15,000例的移植。移植的有效性也增加了，更多的近期结果表明复发的风险、非复发的死亡率和总死亡率显著降低。Gooley等,N.Engl.J.Med 363:2091-101(2011)。
来自HLA-匹配的同胞或不相关的供体的同种异体造血细胞移植(HCT)治愈了患有血红蛋白病的患者，但受限于对适度匹配的相关或不相关供体的需要，且并发移植物抗宿主病(GVHD)和感染。此外，主要障碍是高移植失败率，其高于对恶性肿瘤HCT所观察到的移植失败率。可替代的方法包括用供体脐带血细胞进行HCT，因为几乎所有患者的脐带血供体可被鉴别。额外的实验方法着重于使用患者自身的造血干细胞(HSC)并诱导内源球蛋白基因表达，或添加外源β样球蛋白基因。
对于许多不能找到供体的患者特别是那些少数族裔或混血背景的患者来说，脐带血(CB)移植可最有希望治愈疾病。作为供体干细胞(在出生时易于收集，且母亲或婴儿没风险)的来源，CB的优点还为易于获取和可安全用于HLA-不匹配的情况而不增加GVHD风险。
不幸地是，几种因素，包括在许多脐带血单元可获得的低细胞剂量，导致在成人和较大儿童中植入缓慢和移植相关死亡率升高。嗜中性粒细胞和血小板的显著延迟的造血功能重建对于脐血移植(CBT)接受者是已知的风险因素，并且与在单份或双份CB移植物中提供的低的总有核细胞(TNC)和CD34+细胞剂量有关。类似地，这些低的细胞数与较高的移植失败率相关，因此存在移植失败高风险的血红蛋白病特别受到关注。实际上，最近对成人单份CBT接受者的分析表明输注的CD34+细胞剂量是骨髓样植入最重要的预测物。
当与匹配和不匹配的不相关供体接受者相比时，非复发性死亡率(NRM)在双份CBT(dCBT)接受者中最高。Brunstein等，Blood 116：4693-9(2010)。大部分NRM在移植后的前100天内发生，其中感染是最常见死因。重要的是，对dCBT接受者中的NRM风险因素进行的分析显示，如果恢复≥26天(即，植入dCBT接受者的中值时间)，则骨髓样恢复延迟(嗜中性细胞绝对计数(ANC)>500/ml所需的时间)的患者具有较高的风险。然而，当对NRM风险因素的分析限制为仅包括那些在第26天前移植的dCBT接受者时，未发现各种供体来源之间存在差异，这就突出了延迟植入对NRM风险增加的重要作用。
此外，在干细胞移植后给定的任何一天>100的ANC此前已经显示是在移植后第100天之前死亡率风险降低的重要阀值(Offner等，Blood 88：4058-62(1996))。因此，在CBT接受者中观察到的骨髓样恢复的显著延迟仍然是CBT情况下获得成功结果的主要障碍。不仅增加可用于移植的CB祖细胞的绝对数量的能力，而且增加可可靠产生移植后骨髓样更快速恢复的细胞的能力，都应能改进进行CBT的患者的总存活。可开发利用脐带血干/祖细胞离体扩增的策略以克服脐带血移植物中可用的细胞剂量较低，目的是增强CBT的造血恢复和总存活。
为了克服在用脐带血(CB)移植之后发生的嗜中性粒细胞恢复显著延迟，已经研究了Notch信号传导通路在调节造血干/祖细胞的离体扩增中的作用，以产生数量增加的能够在体内快速再生的祖细胞。已经开发了使用工程化的Notch配体(δ1)的临床上可行的方法，该方法使得CD34+细胞的绝对数量呈多对数增长(multi-log increase)并且产生能够在体内快速再生的细胞疗法。
与一个即时性组的29名用两种非操作性的CB单元进行相同治疗的患者所需的25天的中值时间(p<0.0001)相比，扩增的、HLA-部分匹配细胞的输注导致获得500/ml的初始嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)的中值时间显著降低至仅仅11天。尽管治疗的患者的数量较少(即n＝14)，但就本方法的安全和临床可行性而言，仍表现出对骨髓样恢复时间具有显著作用。
尽管在三十多年间许多实验室投入了大量的资源，但在血红蛋白病的治疗方案开发方面几乎未取得进展，主要归因于缺乏经鉴别的可药性靶和需要基因疗法载体能够以相当高的水平持续表达而不引起插入诱变。尽管胎儿血红蛋白(HbF)的表达增加改善了这两种血红蛋白病，但大量的研究并未基于此观察产生可行的新药剂。几个研究人员正在推行使用整合慢病毒载体的造血干细胞(HSC)基因疗法。然而，HSC基因疗法需要高水平的持续表达并且具有潜在的插入诱变和白血病的风险。
本领域迫切需要的是展现出对治疗包括地中海贫血和镰状细胞病的血红蛋白病有改进功效，同时克服现有治疗形式的安全顾虑的组合物和方法。
发明内容
本公开尤其通过提供治疗血红蛋白病的组合物和方法，阐明了本领域的这些和其它相关需求。本文公开的组合物和方法采用编码一种或多种内切核酸酶或内切核酸酶融合蛋白的一种或多种多核苷酸，所述一种或多种内切核酸酶或内切核酸酶融合蛋白包括一种或多种归巢内切核酸酶和/或归巢内切核酸酶融合蛋白和/或一种或多种CRISPR内切核酸酶(即联合一种或多种RNA引导链的Cas9内切核酸酶)和/或CRISPR内切核酸酶融合蛋白(即联合一种或多种RNA引导链的Cas9内切核酸酶融合蛋白)：(a)以破坏Bcl11a编码区或Bcl11a基因调节区；(b)以破坏HbF沉默DNA调节元件或通路，诸如Bcl11a调节的HbF沉默区；(c)以突变一种或多种γ-球蛋白基因启动子来实现γ-球蛋白基因表达增加；(d)以突变一种或多种δ-球蛋白基因启动子来实现δ-球蛋白基因表达增加；和/或(e)以修正一种或多种β-球蛋白基因突变。
在第一个实施方案中，本公开提供包含/包括编码一种或多种诸如归巢内切核酸酶(HE)和/或CRISPR内切核酸酶(即联合一种或多种RNA引导链的Cas9内切核酸酶)的内切核酸酶的多核苷酸的组合物和方法，以实现对Bcl11a编码区或Bcl11a基因调节区内的序列的靶向破坏，从而将诸如γ-球蛋白基因或ε-球蛋白基因的内源基因的表达提高至治疗水平。在相关的方面，这些实施方案的组合物包含编码一种或多种TALEN、一种或多种TALE-HE融合蛋白和/或一种或多种TREX2蛋白的多核苷酸。
在第二个实施方案中，本公开提供包含/包括多核苷酸的组合物和方法，所述多核苷酸编码诸如归巢内切核酸酶(HE)或CRISPR内切核酸酶(即联合一种或多种RNA引导链的Cas9内切核酸酶)的一种或多种内切核酸酶以实现对β-球蛋白基因基因座内的关键调节序列的靶向破坏，从而将诸如γ-球蛋白基因或δ-球蛋白基因的内源基因的表达提高至治疗水平。在相关的方面中，这些实施方案的组合物包含编码一种或多种TALEN、一种或多种TALE-HE融合蛋白和/或一种或多种TREX2蛋白的多核苷酸。
在本实施方案的某些方面，提供靶向β-球蛋白基因基因座(于HG18中的chr11:5212342-5215944)中的3.6kb区(SEQ ID NO:1)的HE和CRISPR内切核酸酶，所述3.6kb区含有调节蛋白Bcl11a的结合位点。
本文描述的归巢内切核酸酶和CRISPR内切核酸酶与常规的基因靶向核酸酶相比展现出独特的优势。因为无论基因型如何它们都广泛有效，故本文描述的联合一种或多种RNA引导链的归巢和Cas9内切核酸酶并不具有患者特异性，它们在杂合的状态下提供了临床益处并且避免载体序列插入。
在第三个实施方案中，本公开提供了组合物和方法，以用于经由基因组编辑扼要重述患者基因组中的一种或多种天然存在的突变，从而提供包括例如缺失或非缺失型遗传性胎儿血红蛋白持续症(HPFH)的临床益处。更具体地，本公开提供通过基因组编辑实现地中海贫血和/或镰状细胞病(SCD)突变的直接修正的组合物和方法。
在本实施方案的某些方面，将一种或多种归巢内切核酸酶与正常或野生型多核苷酸序列(修正模板)联用，以允许编辑和/或修复诸如β样球蛋白基因的一种或多种基因序列。这些归巢内切核酸酶允许通过包含一种或多种天然存在的突变的多核苷酸的瞬时表达，修饰基因座(在本文中以人β-球蛋白基因基因座为例)中的关键调节和/或编码序列。在相关的方面，这些实施方案的组合物包含编码一种或多种TALEN、一种或多种TALE-HE融合蛋白和/或一种或多种TREX2蛋白的多核苷酸。
更具体地，本公开提供用于基因组编辑的包含/包括各自编码HE和修正模板的一种或多种多核苷酸的组合物和方法，其可用于在包括例如造血干细胞(HSC)、胚胎干(ES)细胞和诱导多能干细胞(iPSC)的干细胞内产生天然存在的突变。可将基因组编辑的HSC、ES和iPSC(包括自体HSC和iPSC)移植给患者以治疗诸如地中海贫血和/或镰状细胞病的一种或多种血红蛋白病。
本文公开的组合物和方法允许在不需要外源基因持续表达或插入的情况下，通过编码HE(在有或没有靶向模板的情况下)、Cas9内切核酸酶和/或RNA引导链的多核苷酸的瞬时表达，来有效修饰HSC、ES和iPSC，以在体内成熟的红系细胞和患者细胞中实现血红蛋白病的改善。因为这些治疗方法不需要转基因的整合和/或持续表达，所以可消除与当前可用的基因治疗技术有关的安全顾虑。
在第四个实施方案中，本公开提供用于递送一种或多种归巢内切核酸酶和/或联合一种或多种RNA引导链的一种或多种Cas9内切核酸酶的组合物和方法，所述酶的每一种可在显示出临床益处的人靶区瞬时表达。本文描述的内切核酸酶编码序列可与TAL效应器核酸酶(TALEN)编码序列联合或融合表达。本文中列举的是靶向影响胎儿血红蛋白产生的关键基因组区域的TAL效应器-HE(TALE-HE)融合蛋白和编码那些TALE-HE融合蛋白的多核苷酸。
在这些实施方案的某些方面，将编码一种或多种的HE(在有或没有靶向模板的情况下)、一种或多种Cas9内切核酸酶、一种或多种RNA引导链、一种或多种TALEN、一种或多种TALE-HE融合蛋白和/或一种或多种TREX2蛋白的多核苷酸有效连接到病毒载体内的启动子序列，以实现HE、Cas9、RNA引导链、TALEN、TALE-HE融合蛋白和/或TREX2蛋白的递送和瞬时表达。可较好用于递送HE、TALEN、TALE-HE融合蛋白和/或TREX2蛋白的适合的病毒载体可选自cocal假型化慢病毒载体、泡沫病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒(AAV)载体。
在第五个实施方案中，本公开提供包含/包括离体扩增修饰的造血干细胞(HSC)的组合物和方法，其允许有效植入修正细胞并能够将诱导多能干细胞(iPSC)用于筛选和临床应用。在这些实施方案的某些方面，提供用于有效扩增自体HSC、自体基因修饰的HSC、iPSC-来源的HSC和ES细胞的组合物和方法。可采用脐带血扩增法，所述方法在补充有造血生长因子的不含血清的培养基中采用δ1并使用从正常供体获得的动员的外周血CD34+细胞。这些组合物和方法可与一种或多种额外的试剂联用，以提高造血干/祖细胞的存活率和促进增殖。在其它方面，这些组合物和方法可采用内皮细胞共培养物以促进长期再生细胞(包括修正的iPSC-来源的HSC)的扩增。
在第六个实施方案中，本公开提供用于提供支持性护理的组合物和方法，所述组合物和方法包括消除移植后嗜中性白细胞减少症并改善基因-修正的自体HSC移植之后的结果的现成细胞疗法。例如，可将离体扩增、低温保藏的脐带血(CB)干/祖细胞以支持性护理的形式向正在用自体CD34+基因修正细胞进行清髓性HCT的患有地中海贫血和/或镰状细胞病的患者施用。
附图说明
根据下图，将更好地理解本公开的某些方面：
图1显示了在成人红系细胞组织中的增加β-球蛋白样基因表达的靶。展示了调节胎儿表达形式(两个γ基因)转变为成人程序(δ和β)所涉及的因子。(采用自Wilber等，Blood 117(15)：3945-3953(2011))。
图2描绘了三种示例性的罕见切割核酸酶技术。
图3是显示在双份CBT接受者中非复发性死亡率的风险最高的图表。双份CBT(DUCB)、匹配的不相关供体(MUD)、不匹配的不相关供体(MMUD)和匹配的相关供体(SIB)移植之后的非复发性死亡率。
图4显示在清髓性双份CBT情况下与δlext-IgG一起进行的CB祖细胞的培养导致嗜中性粒细胞恢复更快速。图中呈现了接受用两个非操作单元(“常规的”)对比用一个离体扩增的单元和一个非操作单元(“扩增的”)进行的双份单元CBT的患者达到ANC≥500/μl所需的个体时间和中值时间(实线)。
图5是通过疾病迹象描绘每年进行的脐带血移植数量的柱形图。
图6(SEQ ID NO:1)是3.6kb区的序列，HbF沉默区落入其中，跨越HG18中的chr11:5212342-5215944。
图7(SEQ ID NO:2)是350碱基对区，所述区域来自HbF沉默区中的重复元件(于HG18中的chr11:5,213,912-5,214,261)，跨越通过已知可破坏HbF沉默区内的Bcl11a占据区的上游French HPFH拐点，并包含GATA-1结合基序，且由此设计本公开的示例性归巢内切核酸酶(HE)。
图8(SEQ ID NO:13)是来自帽上游1kb处，通过聚腺苷酸位点的人β-球蛋白基因，其跨越了HG18中的chr11:5203272-5205877(反义链)。
图9(SEQ ID NO:14)是人β-球蛋白的606bp区域，从启动子跨越到内含子2(于HG18中的chr11:5204380-5204985)。该相当小的区域含有导致地中海贫血的大部分的突变以及引起镰状细胞病的突变。该小区域容易进行导致基因修正的同源重组。
图10(SEQ ID NO:24)是人Bcl11a cDNA(CCDS 1862.1)的cDNA序列。
图11是质粒pET-21a(+)的限制性图谱。
图12是质粒pEndo的限制性图谱(Doyon等，J.Am.Chem.Soc.128(7)：2477-2484(2006)。
图13是产生BCL11A基因-靶向内切核酸酶的定向进化的示意图。使构建的文库进行在针对靶点的IVC中的选择，其一部分用BCL11A基因靶来替代。
图14(SEQ ID NO:28)是I-HjeMI(用于BCL11A基因-靶向核苷酶的亲代酶)的核苷酸序列，其作为用于在大肠杆菌中的表达所优化的密码子。
图15(SEQ ID NO:29)是I-HjeMI(BCL11A基因-靶向核苷酶的亲代酶)的核苷酸序列，其作为用于在哺乳动物中的表达所优化的密码子。
图16(SEQ ID NO:30)是归巢内切核酸酶I-HjeMI的氨基酸序列。
图17(SEQ ID NO:31)是BCL11A基因靶向核苷酶(Bcl11Ahje)的核苷酸序列，其基于归巢内切核酸酶I-HjeMI(通过在IVC和细菌中的定向进化获得)，其作为用于在大肠杆菌中表达优化其密码子。
图18(SEQ ID NO:32)是基于归巢内切核酸酶I-HjeMI(通过在IVC和细菌中的定向进化获得)的BCL11A基因靶向核苷酶的核苷酸序列，以在哺乳动物中表达优化其密码子。
图19(SEQ ID NO:33)是基于归巢内切核酸酶I-HjeMI(通过在IVC和细菌中的定向进化获得)的BCL11A基因靶向核苷酶的氨基酸序列。
图20是显示BCL11A基因-靶向内切核酸酶和其亲代LHE I-HjeMI的氨基酸残基分布差异的蛋白模型。在结合至其靶点(PDB ID:3UVF)的I-HjeMI的晶体结构上确定BCL11A基因-靶向内切核酸酶经置换的残基。在变体内切核酸酶中缺失D161。
图21是显示在双质粒切割测定中的BCL11A基因-靶向内切核酸酶活性的柱形图。
图22A(SEQ ID NO:34)是I-OnuI归巢内切核酸酶(靶向HbF沉默区的归巢内切核酸酶的亲代酶)的核苷酸序列，以在大肠杆菌中表达优化其密码子。
图22B(SEQ ID NO:15)是I-OnuI归巢内切核酸酶的氨基酸序列。
图23是显示靶向HbF沉默区的I-OnuI归巢内切核酸酶的活性的琼脂糖凝胶。
图24(SEQ ID NO:35)是MegaTAL:5.5RVD+Y2I-AniI的核苷酸序列。
图25(SEQ ID NO:36)是MegaTAL:5.5RVD+Y2I-AniI的氨基酸序列。
图26(SEQ ID NO:37)是Cas9内切核酸酶的核苷酸序列(来自Mali等，Science(2013))。
图27(SEQ ID NO:38)是与Cas9内切核酸酶一起使用的RNA引导链的核苷酸序列(来自Mali等，Science(2013))。
图28(SEQ ID NO:62)是I-CpaMI归巢内切核酸酶的核苷酸序列(ORF，以在哺乳动物表达中优化其密码子)。
图29(SEQ ID NO:63)是I-CpaMI归巢内切核酸酶的氨基酸序列。
图30是显示如实施例4检测所述的内源人BCL11A基因上的靶向诱变的琼脂糖凝胶。
图31是质粒pCcdB wt6的限制性图谱(Doyon等，J.Am.Chem.Soc.128 (7)：2477-2484(2006))。
图32(SEQ ID NO:64)是BCL11A基因靶向核苷酶-编码质粒(pExodusBCL11Ahje)的核苷酸序列。
图33(SEQ ID NO:65)是TREX2-编码质粒(pExodus CMV.Trex2)的核苷酸序列。
图34是质粒pExodusBCL11Ahje的限制性图谱。
图35是质粒pExodus CMV.Trex2的限制性图谱。
具体实施方式
本公开通常涉及通过瞬时或持续表达多核苷酸来治疗诸如血红蛋白病的遗传病的组合物和方法，所述多核苷酸编码一种或多种内切核酸酶或内切核酸酶融合蛋白，包括一种或多种归巢内切核酸酶和/或归巢内切核酸酶融合蛋白和/或联合一种或多种RNA引导链联合的一种或多种Cas9内切核酸酶和/或Cas9内切核酸酶融合蛋白：(a)以破坏Bcl11a编码区；(b)以破坏HbF沉默DNA调节元件或通路，诸如Bcl11a-调节的HbF沉默区；(c)以突变一种或多种γ-球蛋白基因启动子来实现γ-球蛋白基因表达的增加；(d)以突变一种或多种δ-球蛋白基因启动子来实现δ-球蛋白基因表达的增加；和/或(e)以修正一种或多种β-球蛋白基因突变。本文公开的组合物和方法可用于治疗包括β-地中海贫血和镰状细胞病的血红蛋白病。本文描述的组合物和方法可任选地包含/包括编码一种或多种TALEN、一种或多种TALE-HE融合蛋白和/或一种或多种TREX2蛋白的多核苷酸。
根据以下定义，将更好理解本公开：
定义
如本文所用，术语“血红蛋白病”是指一类导致血红蛋白分子的一条或多条球蛋白链的结构异常、功能异常或表达改变的遗传缺陷。血红蛋白病是遗传性单基因病。常见的血红蛋白病包括地中海贫血和镰状细胞病。
如本文所用，术语“地中海贫血”是指一种由于α样与β样球蛋白多肽链的比率改变导致正常血红蛋白四聚体蛋白产生不足和游离或未配对的α-链或β-链自然增长而产生的血红蛋白病。
如本文所用，术语“镰状细胞病”是指一组常染色体隐性遗传性血液病，其由球蛋白基因突变所导致且特征为呈现出异常、僵硬镰刀状的红细胞。它们由其中谷氨酸被缬氨酸在肽的第6位氨基酸处置换的编码β-球蛋白链变体的βS-基因和具有使得HbS结晶从而产生临床表型的突变的第二β-基因的存在所定义。术语“镰状细胞贫血”是指对于引起HbS的突变是杂合的患者中的一种特定形式的镰状细胞病。其它常见形式的镰状细胞病包括HbS/β-地中海贫血、HbS/HbC和HbS/HbD。表1公开了编码野生型和镰状细胞β-球蛋白链的初始氨基酸的核苷酸序列。
表1
| β-球蛋白链 | 序列 | 序列标识符 |
| 野生型 | GTGCACCTCACTCCAGAGGAG | SEQ ID NO：3 |
| 镰状 | GTGCACCTCACTCCAGTGGAG | SEQ ID NO：4 |
如本文所用，术语“遗传性胎儿血红蛋白持续症”或“HPFH”是指良性疾患，其中胎儿血红蛋白(血红蛋白F)的显著产生可较好地持续到成人期而不考虑正常中止点。
如本文所用，术语“球蛋白”是指参与氧结合和运输的含有血红素的蛋白家族。
如本文所用，术语“归巢内切核酸酶”或“HE”是指一类特征为足够长以致于在基因组中仅出现一次并且随机具有非常低的概率(如，每7×1010bp一次)的识别序列的限制内切核酸酶。
如本文所用，术语“转录激活子样效应器核苷酶”或“TAL效应器核苷酶”或“TALEN”是指一类通过使TAL效应器DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制内切核酸酶。
如本文所用，术语“3'初修复外切核酸酶2”或“TREX2”是指具有3'外切核酸酶活性的核酸酶，其通常参与DNA复制、修复和重组。
如本文所用，术语“Cas9内切核酸酶”是指使用RNA引导链靶向内切核酸酶切割位点的内切核酸酶。术语“CRISPR内切核酸酶”是指联合RNA引导链的Cas9内切核酸酶。参见，Jinek等，Science 337:816-821(2013)；Cong等，Science(2013年1月3日)(先于印刷的电子出版)；和Mali等，Science(2013年1月3日)(先于印刷的电子出版)。
应当理解，除非指出有相反情况，否则术语意为“开放的”(如，术语“包括/包含(including)”应理解为“包括/包含但不限于”，术语“具有”应理解为“至少具有”，术语“包括/包含(includes)”应理解为“包括/包含但不限于”等)。短语诸如“至少一个/一种”和“一种或多种/一个或多个”及术语诸如“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”包括单数和复数形式。
应进一步理解，当本公开的特征或方面以马库什组的形式描述时，本公开还意在以马库什组的任何单独的成员或成员子群的形式描述。类似地，本文公开的所有范围还涵盖所有可能的子范围和子范围的组合，并且诸如“在……之间”、“达”、“至少”、“超过”、“低于/小于”等的措辞包括在所述范围中引用的数目，并各自包括单独的成员。
本文(无论上下文)引用的所有参考文献，包括但不限于无论是美国、PCT还是非美国的国外专利、专利申请和专利公开及所有技术和/或科学出版物，以全文引用的方式并入本文。
尽管本文已公开了各种实施方案，但其它实施方案对本领域的技术人员将显而易知。本文公开的各种实施方案是为了说明的目的而并不意在限制，其真正的范围和精神将由权利要求书说明。
用于实现高效多重基因破坏和基因编辑功能的归巢内切核酸酶
如上所讨论和如下所例举，本公开提供包含/包括可在靶向的细胞中瞬时或持续表达以显示出对人产生临床益处的多核苷酸的组合物和方法，所述多核苷酸编码一种或多种内切核酸酶，包括一种或多种归巢内切核酸酶(HE)(诸如一种或多种I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI归巢内切核酸酶和/或I-OnuI归巢内切核酸酶)和/或联合一种或多种RNA引导链的一种或多种Cas9内切核酸酶。示例性内切核酸酶靶向通过以下方式影响胎儿血红蛋白产生的关键基因组区域：(a)破坏Bcl11a编码区或Bcl11a基因调节区；(b)破坏HbF沉默DNA调节元件或通路，诸如Bcl11a-调节的HbF沉默区；(c)使一种或多种γ-球蛋白基因启动子突变以实现γ-球蛋白基因表达增加；(d)使一种或多种δ-球蛋白基因启动子突变以实现δ-球蛋白基因表达增加；和/或(e)修正一种或多种β-球蛋白基因突变。本文公开的组合物和方法可用于治疗包括β-地中海贫血和镰状细胞病的血红蛋白病。
本文描述的内切核酸酶编码序列可与DNA结合结构域编码序列(诸如TAL效应器(TALE)编码序列)或核酸酶编码序列(诸如3’修复外切核酸酶2(TREX2)编码序列)联合或融合表达。本文例举了TALE-HE融合蛋白和编码一种或多种TALE-HE融合蛋白的多核苷酸。
本领域已知有四种蛋白支架用于在真核生物中实现靶向基因修饰和破坏：锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应器核酸酶(TALEN)、归巢内切核酸酶(HE)和联合RNA引导链的Cas9内切核酸酶。本公开采用单独或联合的TAL效应器核酸酶、归巢内切核酸酶和/或Cas9内切核酸酶。TAL核酸酶比锌指核酸酶能提供更直接的分子设计和更高的DNA识别特异性，而归巢内切核酸酶(诸如LAGLIDADG归巢内切核酸酶(LHE))提供高度特异的切割特性、紧凑结构且由于它们是紧凑单体蛋白，因而不需要像ZFN和TALEN一样二聚化(在多重组合中所用的能力)。相应地，HE和CRISPR内切核酸酶(即联合一种或多种RNA引导链的Cas9内切核酸酶)在调节基因破坏方面极其有效。Stoddard，同上和Mali等，Science(2013)，同上。
作为本公开的一部分，在β-球蛋白基因座内抑制HbF功能的关键区域已被鉴别。该区域提供多个用于HE-和Cas9-介导的切割的靶。可测试特别设计的核酸酶对同源靶点的活性和对任何密切相关的基因组靶的脱靶活性。可使用Stoddard，Structure 19：7-15(2011)和Mali等，Science(2013)中描述的方法，将这些HE和联合一种或多种RNA引导链的Cas9内切核酸酶工程化以避免脱靶基因组切割。本文公开的HE和联合一种或多种RNA引导链的Cas9内切核酸酶能够直接靶向γ-启动子和δ-启动子，并替换跨越大多数地中海贫血突变以及HbS突变的606bp区(SEQ ID NO:14)。
为了促进跨越HbF沉默区或其子集的大片段缺失的产生，可将一种或多种HE和/或联合一种或多种RNA引导链的一种或多种Cas9内切核酸酶与从内切核酸酶切割位点跨越至靶区末端的桥连寡核苷酸共转导。Chen等，Nat.Methods8(9)：753-5(2011)。可通过采用结合和切割位于靶区的两侧侧翼的序列的一种或多种HE，实现较高频率的基因组编辑。类似地，HE和诱变处理寡核苷酸可用于引入启动子区域突变，这将导致γ基因或δ基因表达升高。
本文公开的HE可首先在可被诱导分化为红系细胞的红系细胞系和人CD34+细胞中评估，从而确定改变球蛋白基因表达的能力。根据考虑的精确应用，可递送一种、两种、三种或更多种HE以促进更大片段的缺失的产生。可在另外的培养基和动物模型测定中评估各个HE的适合性以确定它们靶向HSC的能力而不损害多能性和扩增潜力，和以在血红蛋白病模型中评估临床益处。可将一种或多种HE和诸如TREX2外切核酸酶或TAL效应器外切核酸酶的一种或多种外切核酸酶，递送至CD34+HSC以用于在HbF的关键区中诱导靶向遗传缺失。
可针对350bp区(SEQ ID NO:2)中的一系列靶测试各个核酸酶，所述350bp区域由在HbF沉默区中起始于重复元件的边缘并跨越通过已知可破坏Bcl11a占据区的上游French HPFH拐点区定义并包含GATA-1结合基序。初始分析已经鉴别了平均分布于该区域的七个包含DNA序列基序的靶，针对所述DNA序列基序的高活性内切核酸酶变体库已被分离并测序。值得注意的是，一个靶与潜在的Bcl11a结合基序重叠并与GATA-1基序相邻。可通过转导两种、三种或更多种HE实现靶区的连续更大片段的缺失。可替代地，已在基因的5'端鉴别出用于破坏Bcl11a基因的多个靶，以确保消除基因功能。类似地，已鉴别了通过该区域的用于Cas9/RNA引导介导的破坏的多个最佳靶，其可单独使用或联用以产生更大片段的缺失。
可使用整合的基因组报告子在转染的人细胞系中测试各个HE，并可使用如Stoddard(同上)中所描述的方案，采用额外的选择步骤进一步优化切割和基因转化活性。可在验证和递送对球蛋白基因座中的靶有活性的单个靶向的HE之后，在表达体系中将核酸酶矢量化。例如，可采用将每个HE与核苷酶(诸如TALEN和/或TREX外切核酸酶)的共表达联系起来的表达体系，在转导的细胞中获得极大提高的基因破坏效率。
本公开还提供TALE-HE融合蛋白和编码TALE-HE融合蛋白的多核苷酸，其通过由TALE和HE支架对相邻DNA靶的协同识别，诸如在球蛋白基因座内展现出限制工程化的HE募集至目标靶点和对目标靶的活性的目标特征。此类TALE-HE融合物兼备了每个支架的最有利的特性(即，TALE的基序组装和HE的核酸酶特异性)，同时降低了与传统TALEN或锌指核酸酶(ZFN)相关的非特异性核酸酶活性。
已经确定了与它们的同源DNA靶点复合的十个单独的LAGLIDADG归巢内切核酸酶(LHE)的高分辨率晶体结构。Stoddard，Structure 19：7-15(2011)和Takeuchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108：13077-13082(2011)。那些LHE的嵌合‘杂合体’已被构造为可一起为基因特异性应用提供更广泛的LHE靶向蛋白。Baxter等，Nucl.Acids Res.40(16)：7985-8000(2012)。
可通过酵母表面展示策略结合高通量细胞分选，鉴别具有适合靶序列特异性的HE的目标DNA切割特异性。对应于跨越整个靶点的连续接触口袋的一系列蛋白-DNA‘基序’可在单独文库中被系统性地随机化。然后可系统性筛选每个文库的可特异性切割每个基序中的每个可能的DNA变体的酶群体，并且将每个分选的类群深度测序和归档以用于随后的酶组装和设计。可适用于本公开组合物和方法的HE可商购获得(Pregenen,Seattle,WA)。
在某些方面，本文描述的组合物和方法可采用一种或多种HE(包括例如一种或多种LHE)与TREX23'外切核酸酶的共表达。与由ZFN和TALEN的当前变体遗留下的5'突出端相反，HE在靶向双链断裂点处产生3'突出端，这导致HE切割后的末端处理速率提高。可通过HE/TREX2共表达实现原代细胞中的双链断裂点近乎完全的修饰。因为HE/TREX2共表达影响断裂处理，所以该组合在一个区域中实现多次靶向缺失并通过消除断裂持久性和降低由可替代的末端连接通路介导的大规模易位的潜力，来提高核苷酶诱导的靶向基因破坏的安全性。
最近已经确定了结合至其DNA靶点的TAL效应器(PthXol)的晶体结构。Mak等，Science 335(6069)：716-92012；电子出版物，2012年1月5日PubMedPMID:22223736。这些晶体结构数据使得能够精确定义DNA识别区的界限，并促进用于产生表现良好的TALEN-HE或其它TALEN-核苷酶融合构建体的策略，所述策略可应用于实现多种复杂的基因组操作。
对Bcl11a基因表达的基因组破坏
在镰状细胞小鼠模型中敲除Bcl11a可改善疾病，支持了该通路的临床相关性。Xu等，Science 334:993-6(2011)。此外，可将含有跨越人β-球蛋白基因座的YAC转基因的小鼠用于在Bcl11a介导的HbF沉默中模拟干扰。与对照的0.24％相比，在这些小鼠中内源Bcl11a基因的杂合和纯合敲除产生了分别包含20％和76％的总β样mRNA的γ-球蛋白mRNA。Sankaran等，Nature 460：1093-7(2009)。这表明Bcl11a起到了变阻器的作用，调节HbF抑制的程度。与此一致的是，Bcl11a中功能突变减少导致HbF水平升高并减轻临床上地中海贫血和/或镰状细胞病表型。Galanello等，Blood 114：3935-7(2009)。
在某些实施方案中，本公开提供包含/包括一种或多种内切核酸酶的组合物和方法以实现对编码Bcl11a的序列或其关键调节序列的破坏，所述内切核酸酶包括一种或多种归巢内切核酸酶(诸如一种或多种I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI归巢内切核酸酶和/或I-OnuI归巢内切核酸酶)和/或一种或多种Cas9内切核酸酶。如在本文中所详细描述和例举，包含/包括一种或多种Cas9内切核酸酶的组合物和方法进一步包含/包括一种或多种Bcl11a基因-特异的RNA引导链以介导Cas9内切核酸酶靶向Bcl11a基因序列。
Bcl11a基因具有多个跨越超过l00kb的外显子，并产生几种剪接变体，所述剪接变体进而产生与不同活动相关的蛋白。作为本公开的一部分，已经鉴别了转录到多种Bcl11a剪接变体中的几种DNA靶。所有DNA靶破坏了与最佳HbF沉默活性相关的长(L)和特别长(XL)形式，而一种DNA靶破坏了所有形式的Bcl11a。这些靶包括DNA序列基序，针对所述DNA序列基序的高活性内切核酸酶变体库已被分离和测序。本文将人Bcl11a cDNA序列(CCDS1862.1)表示为SEQ ID NO:24(图10)。
因此，在某些方面，本公开提供用于达到HbF治疗水平的组合物，所述组合物包含编码一种或多种归巢内切核酸酶(HE)的多核苷酸，所述归巢内切核酸酶能够介导在该1.3kb区中的核苷酸序列的破坏，从而防止结合Bcl11a和形成相应的抑制型复合物，并对γ-球蛋白表达进行去阻遏。
阻断Bcl11a-介导的HbF沉默的基因组破坏
如上所概述，在某些实施方案中，本公开提供用于治疗和/或改善诸如血红蛋白病(包括地中海贫血和/或镰状细胞病)的遗传病的组合物和方法。这些实施方案的某些方面包括瞬时表达编码一种或多种归巢内切核酸酶的多核苷酸，以在β-球蛋白基因基因座或δ-球蛋白基因基因座中破坏HbF沉默元件或通路，从而提高治疗水平诸如γ-球蛋白基因或δ-球蛋白基因的内源基因的表达。
本文公开的组合物包含编码一种或多种归巢内切核酸酶(HE)和或联合一种或多种RNA引导链的一种或多种Cas9内切核酸酶以及任选的一种或多种转录激活子样(TAL)效应器的多核苷酸，以在β-球蛋白基因基因座中实现关键调节序列的靶向破坏。更具体地，本文公开的组合物和方法通过去除β-球蛋白基因基因座中结合至HbF沉默区的Bcl11a基础元件，实现γ-球蛋白基因表达增加和随后的HbF蛋白产生。
在正常发育中，胚胎β样基因(ε-球蛋白)的表达依次被胎儿中的一对γ-球蛋白基因和成人中的δ-球蛋白基因和β-球蛋白基因所替代。在成人红系细胞组织中，锌指蛋白Bcl11a结合至β-球蛋白基因基因座中的γ-球蛋白和δ-球蛋白基因之间的区域，从而沉默HbF的产生。Bcl11a-介导的HbF沉默的重要性由在人CD34细胞中敲低Bcl11a mRNA，从而提高HbF水平至总β样蛋白的24-36％所支持。Sankaran等，Science 322：1839-42(2008)。在缺失型HPFH中去除该区域以及敲低Bcl11a，阻断了Bcl11a-介导的HbF沉默，并导致在成人红系细胞组织中γ-球蛋白基因表达水平升高和HbF蛋白的产生(Sankaran等，N.Engl.J.Med.365：807-14(2011))。
尽管多种机制造成HbF蛋白水平升高，但3.6kb区仍显示出对HbF沉默(SEQ ID NO:1)的重要性。Sankaran等，N.Engl.J.Med.365：807-14(2011)。尽管在成人红系细胞组织中存在了Bcl11a富集的几个峰，但3.6kb HbF沉默区中的单峰较为突出，因为已知与Bcl11a形成抑制型复合物的蛋白在在该区域中结合(GATA-1和HDAC-1)，并且为了组蛋白H3于赖氨酸27上的抑制型组蛋白标记三甲基化而富集染色质。
值得注意的是，该3.6kb区含有γ-基因的Bcl11a结合下游的单峰。已在γ-球蛋白启动子中鉴别出多个点突变，其作为杂合子导致HbF水平为20-30％，改善了地中海贫血和SCD。这些点突变聚集在三个区域，所有区域都位于200bp的γ-帽位点内：(1)-200，被SP1和阶段特异性蛋白复合物结合的GC-富含区；(2)-175，被GATA-1结合；和(3)被几个额外因子结合的在-117区的Oct1和CCAAT基序。Forget，Ann.NY Acad.Sci.850：38-44(1998)。
在这些三个区域内的突变阻断了在成人红系细胞中抑制型复合物的结合。因此，这些区域是适用于通过本文公开的组合物和方法进行的HE-介导的破坏和靶向突变的靶。这些区域的破坏导致抑制型复合物减少，使得γ-球蛋白基因表达水平升高和HbF蛋白产生相应增加至足够在治疗包括β-地中海贫血和镰状细胞病的血红蛋白病的方法中实现治疗功效的水平。
Bcl11a占据的单峰存在于3.6kb HbF沉默区中(Sankaran等，N.Engl.J.Med.365：807-14(2011))(SEQ ID NO:1)。Bcl11a占据的该区域被French HPFH的上游拐点破坏。Sankaran等，N.Engl.J.Med.365：807-14(2011)。本文描述了350bp区，其起始于在HbF沉默区中的重复元件的边缘并跨越通过已知破坏Bcl11a占据区的上游French HPFH拐点并包含GATA-1结合基序(SEQ ID NO:2)。在上游French HPFH缺失之前的碱基是HG18chr11:5,214,023。GATA-1基序跨越了chr11:5,214,200-5,214,206。不受理论束缚，据信当Bcl11a结合至该350bp区域内时，GATA-1和HDAC-1与Bcl11a形成抑制型复合物，并且这导致抑制γ-球蛋白基因表达并从而降低HbF蛋白的细胞水平的抑制型复合物形成。
通过本文公开的组合物和方法实现的HE-介导的破坏高效发生。不像本领域已知的shRNA敲低方法，由本文公开的归巢内切核酸酶介导的HbF沉默区的高序列特异性破坏避免了在基因组和其它细胞类型(特别是在其中Bcl11a结合为正常发育所需的B细胞)中的其它Bcl11a结合位点处的脱靶效应。
因此，本文描述的归巢内切核酸酶展现出优于常规基因靶向核酸酶的独特优势。因为不论基因型它们如何都广泛有效，所以本文描述的归巢内切核酸酶不具有患者特异性并在杂合状态下提供临床益处。
用于修正地中海贫血或镰状细胞病突变的遗传修饰的概述
在其它实施方案中，本公开提供了用于经由基因组编辑而在患者基因组中扼要重述一种或多种天然存在的突变的组合物和方法，以提供临床益处。更具体地，本公开提供了用于通过基因组编辑实现直接修正地中海贫血和/或镰状细胞病(SCD)突变的组合物和方法。
本文公开的组合物和方法采用修正模板来实现基因编辑和修正，以通过提高在修正模板和患者基因组中相应的突变序列之间的同源重组(HR)率，改善包括地中海贫血和镰状细胞病的血红蛋白病。本文例举了用于修正潜在β-球蛋白突变的组合物和方法，其在杂合状态下提供临床益处同时避免载体序列插入。这些组合物和方法可独立于上述的组合物和方法或者与其联合用于破坏Bcl11a-介导的基因沉默。
与本领域可用的可替代平台相比，本公开提供一组稳健的利用HE优势的基因组编辑技术。这些HE可与TAL效应器基序DNA结合平台联合以获得额外的治疗优势。
尽管编辑基因组的同源重组(HR)是强有力的，但其是无效的。在待修饰区域引入双链断裂导致HR效率得到极大提高。同时引入编码HE的多核苷酸和修正模板(其中修正模板包含少至100bp侧翼同源)使得当引入修正模板时HR的频率能够提高，从而允许基因组编辑。
还可用短的合成修正模板转导细胞，以用于有效引入确定的单碱基对突变。此类方法通常使用单个HE。可替代地，可将靶向区域的两侧的HE转导以用于修饰。可通过如本文所描述的优化方法转导修正模板。如下所详细讨论，可根据Certo等，Nat Methods 8:671-6(2011)和Jarjour等，Nucleic Res 37:6871-80(2009)中描述的方法进行HE的设计、转导和评估。
在这些实施方案的某些方面，可将一种或多种归巢内切核酸酶与正常或野生型多核苷酸序列联用，以允许编辑和/或修复一种或多种β样球蛋白基因。例如，本公开提供治疗血红蛋白病的组合物和方法，所述组合物和方法允许通过瞬时表达包含一种或多种天然存在的突变的多核苷酸，修饰基因座(本文中以人β-球蛋白基因基因座为例)中的关键调节和/或编码序列。
更具体地，本公开提供用于基因组编辑的组合物和方法，其可用于产生扼要重述干细胞(包括例如，造血干细胞(HSC)、胚胎干(ES)细胞和诱导多能干细胞(iPSC))中天然存在的突变的突变。可向患者移植基因组编辑的HSC、ES和iPSC(包括自体HSC和iPSC)，以治疗诸如地中海贫血和/或镰状细胞病的一种或多种血红蛋白病。本文公开的组合物和方法允许有效修饰HSC、ES和iPSC，而不需要外源基因持续表达或插入，以在成熟红系细胞和患者体内细胞中实现血红蛋白病的改善。
因为这些治疗方法不需要转基因的整合和/或持续表达，所以消除了与当前可用的基因治疗技术相关的安全顾虑。在这些实施方案的某些方面，所述组合物和方法采用一种或多种多核苷酸以用于Bcl11a-介导的HbF沉默的靶向破坏。
本文例举了允许扼要重述一种或多种HbF沉默区内的遗传修饰的组合物和方法，所述一种或多种HbF沉默区是遗传性胎儿血红蛋白持续症(HPFH)的原因。因为此类遗传修饰导致治疗有效基因表达增加，所以扼要重述的遗传修饰仅需要以杂合子的形式存在以获得治疗功效。
本文公开的用于改善地中海贫血和镰状细胞病的组合物和方法，通过引入导致HbF和/或HbA2和/或HbA蛋白产生增加的一种或多种突变来获得治疗功效。本文例举的是用于扼要重述β-球蛋白基因和/或区域的一种或多种天然存在的缺失的组合物和方法，其激活γ-球蛋白基因表达从而提高胎儿血红蛋白水平。因为HbF和/或HbA2蛋白产生的温和增加足以改善这些疾病表型，所以杂合突变足以获得显著的治疗益处。
在某些方面，可将修正模板的递送与选择性标记基因的递送同时进行，从而允许离体和体内选择修正细胞，尽管这样的方法需要经由整合选择性标记基因来长期表达。Beard等，J.Clin.Invest.120：2345-54(2010)和Munoz等，Nucleic Res.39(2)：729-743(2011)。
β-球蛋白表达在成人组织中的激活取决于KLF-1在其启动子中的CACCC框处的结合。δ-球蛋白启动子缺乏完整的CACCC盒，KLF-1不结合，并且表达限于2％的β-球蛋白。例如通过引入完整的CACCC盒扼要重述β-球蛋白启动子的δ-启动子突变允许KLF-1结合，并导致δ-球蛋白表达治疗有效增加。
在这些实施方案的某些方面，可产生非缺失型HPFHγ-球蛋白启动子突变。仅有单个碱基对必需修饰以获得功效。例如，可扼要重述-175T->C突变(SEQ IDNO:21)以最大化HbF水平。四个γ-球蛋白基因的任何一个的突变都将提供益处，因而增加潜力靶。
归巢内切核酸酶、Cas9内切核酸酶、TAL效应器核酸酶和TREX2外切核酸酶
的递送
在另外的实施方案中，本公开提供体系，特别是非整合载体体系，以递送本文描述的一种或多种HE、Cas9、TALEN和/或TREX2核酸酶。对于造血干细胞(HSC)的治疗性基因编辑，主要存在三大挑战：(1)核酸酶试剂必须瞬时递送至HSC；(2)在接受核酸酶的细胞中的基因编辑效率必须高；和(3)基因-编辑的HSC必须移入到足以获得治疗效果的水平。这些挑战可通过采用各种载体化方法来克服。
本文例举了用于有效基因转移至HSC的cocal假型化慢病毒载体和泡沫病毒载体。Trobridge等，Mol Ther 18：725-33(2008)。可替选地，可如前所述修饰腺病毒载体以用于向HSC基因转移。Wang等，Exp.Hematol.36：823-31(2008)和Wang等，Nat.Med.17：96-104(2011)。在这些实施方案的其它方面，还可采用基于AAV的载体体系以用于递送HE、Cas9(和/或RNA引导链)、TALE-HE、TALEN和/或TREX2核酸酶。
AAV6-血清型重组AAV载体提供4.5kb有效载荷，足以递送除了小重组模板之外的启动子-HE-外切核酸酶或启动子-TAL-HE融合-外切核酸酶盒。可替选地，其可载有小的Cas9多肽和引导RNA。AAV6提供所有已知的AAV壳体的人CD34+脐带血细胞的有效转导，并能够介导在HSC中的显著水平的瞬时基因表达。可采用自互补和单链AAV6载体，以用于在细胞系中的HSC和原代CD34+细胞中的基于基因敲除和重组的基因编辑。
具有杂交壳体的腺病毒载体能够有效转导多种类型的造血细胞(包括CD34+细胞)。可用使用血清型35纤维(Ad5-F35)和血清型11纤维(Ad5-F11)有效转导造血细胞的嵌合腺病毒载体进行改进的转导。辅助病毒依赖型腺病毒提供多达30kb的有效载荷以及在HSC中的瞬时基因表达，并可用于递送多种HE/外切核酸酶盒、HE-TAL融合物以及非常大的重组模板。可替选地，其可载有小的Cas9多肽和引导RNA。因此，可采用这些修饰的嵌合腺病毒载体，以用于在HSC中的基于基因敲除和重组的基因编辑。
整合缺陷型慢病毒和泡沫病毒载体(IDLV和IDFV)提供6kb(IDLV)和9kb(IDFV)的有效载荷，并且有显而易见的转导人HSC的能力。在某些方面，可采用IDLV和DFV载体以用于在HSC中的基于基因敲除和重组的基因编辑。具有可替代启动子GFP盒的IDLV在CD34+HSC中提供有效和高水平表达。可使用TFF纯化步骤获得高滴度贮液。具有一组启动子/GFP盒的载体可用于在CD34+HSC中提供有效和高水平的HE表达，并可产生以用于表达各个HE、HE/Trex2、多重-HE(即，可共表达的两种、三种或四种HE)和多重-HE/TREX2组合。多重HE表达允许在关键区中进行的多次切割事件，可期望所述切割事件根据具体应用而产生HbF去抑制增强。此类多重策略对LHE可行，因为它们自主起作用并可联合TREX2共表达良好采用以允许高度有效和同时处理紧密靶向的双链断裂。可替代地，其可载有小Cas9多肽和引导RNA。
可在模型生物中确定各种靶向细胞以及细胞类群和它们后代类群中的基因靶向效率、球蛋白基因表达水平、靶向对红细胞生成的影响和对干细胞功能的影响以及对血液学参数和器官功能的影响。
可在转导之后进行β样基因在RNA和蛋白水平的修饰效率和表达的单细胞和混合群落评估。可评估因子结合和染色质结构的改变，以及形态、无效红细胞生成和凋亡的程度。可在体外和体内进一步评估在初始筛选中得分佳的候选物对HSC多能性以及改善疾病特异性表型的能力的影响。
可在含有单个完整的人染色体11(N-MEL)的小鼠红白血病细胞系和临床级CD34+正常人HSC中进行HE候选物和递送体系的初始筛选，评估终点是靶向突变效率和球蛋白基因表达。可诱导这两种细胞类型沿着红系细胞途径分化，其中β样基因的表达被高β-/□-和β-/δ-比率高度诱导，使得能够在单细胞和群体水平定量评估球蛋白基因调节的作用。二级评估可包括对转导的CD34+细胞多能性和红细胞生成的分析。适合的测定体系可包括为评估长期增殖潜力进行的培养、对骨髓样和红系细胞集落进行的分析以用于克隆分析和移植到NOD SCIDγ(NSG)小鼠中，以及随后的对原代和次级接受者的多系植入的评估。可在体外和体内同时评估临床有效性。
敲除鼠Bcl11a导致在含有人β-球蛋白基因座的小鼠中的γ-球蛋白呈显著剂量依赖性增长，并改善人源化小鼠模型中的镰状表型。尽管这两个体系都允许分析球蛋白基因表达，但镰状小鼠允许评估表型在这些小鼠中改善，特别关注血液学参数、肝和肺病状、肾功能和脾大小。在单细胞测定中，表型改进可与含HbF细胞的数目、HbF/HbS比率和表达形式相关。
此外，可通过转导来自血红蛋白病患者的人CD34+HSC来评估红细胞寿命和形态。与正常的相比，培养的地中海贫血症细胞显示出最小扩增、缺乏血红蛋白化、无效红细胞生成和凋亡增加的证据。这些特征允许定量评估靶向后的红细胞生成的表达水平和程度。还可评估在含氧量低的情况下的CD34+细胞的红系后代的镰变程度。可将患者的CD34+细胞移植至NSG小鼠，之后异常红细胞生成的几个特征得以扼要重述，这使得能够评估靶向诱变的作用。
自体HSC、ES和iPSC-来源的HSC的扩增
在另外的实施方案中，本公开提供用于经修饰的造血干细胞(HSC)的离体扩增的组合物和方法，以允许有效植入修正细胞和将诱导多能干细胞(iPSC)用于筛选和临床应用中。在这些实施方案的某些方面，提供了用于自体HSC、自体基因-修饰的HSC、ES和iPSC-来源的HSC的有效扩增的组合物和方法。可采用脐带血扩增方法，所述方法在使用从正常供体获得的动员外周血CD34+的补充有造血生长因子的不含血清的培养基中使用δ1。这些组合物和方法可与一种或多种额外的试剂联用，以增强造血干/祖细胞的存活率和增殖。在其它方面，这些组合物和方法可采用内皮细胞共培养物以用于增强长期再生细胞(包括修正的iPSC-来源的HSC)的扩增。
为了在临床上有效说明本文公开的基因修正策略，本公开提供用于绝对数量的修正的自体HSC的离体扩增的方法。一般来讲，基因修正程序如果以较小规模进行则更有效，并且仅有有限数量的HSC可用于修正。因此，本公开考虑可采用所述扩增方法以允许临床上可行的离体扩增来源于诱导多能干细胞(iPSC)的修正的HSC、ES和/或HSC。在某些方面，本公开提供扩增造血干/祖细胞的方法，以通过利用Notch信号传导在确定干细胞命运中的作用用于治疗应用。Dahlberg等，Blood 117：6083-90(2010)；Delaney等，Nat Med 16：232-6(2010)；和Varnum-Finney等，Nat Med 6：1278-81(2000)。
这些方法通过先使用部分HLA-匹配的新鲜产物(培养后收集并直接输注)和/或通过使用之前扩增和低温保藏的产物作为现成的非HLA匹配的细胞疗法，允许脐带血干/祖细胞的临床相关的离体扩增和扩展的细胞疗法，以用于在进行脐带血移植的患者中治疗骨髓抑制。
基因-修正的自体HSC的离体扩增通过允许移植更多适当修正的再生细胞以使得其能够快速增殖并确保体内基因-修正细胞占优势，增强了基于HSC的基因疗法的安全性和有效性。相应地，本公开经由第三方非HLA-匹配的、供体离体扩增的干/祖细胞提供用于支持性护理的组合物和方法，其能够提供快速但瞬时的骨髓样恢复，这对降低继发于感染的早期移植相关的死亡的风险是必要的，该结果是在清髓性T细胞耗尽的自体移植之后观察到的。Delaney等，Nat Med16：232-6(2010)。
抑制分化的药剂(如，Notch配体)可与促进早期干/祖细胞的增殖和存活的组合物和方法联合，从而获得改进的Notch-介导的离体扩增。脐带血干/祖细胞促进的增殖可通过将Notch配体、δl与芳烃受体抑制物(SR1)(Boitano等，Science 329：1345-8(2011))或HoxB4(Watts等，Blood 116：5859-66(2010)和Zhang等，P LoS Med 3：e173(2006))联合以促进造血前体的增殖和自我更新，和与血管生成素样5联合以提高它们的存活来实现。对于基因疗法的临床应用必要的是扩增长期再生细胞的能力，从而确保寿命修正细胞移植物的寿命。
可将Akt-激活的内皮细胞用于共培养体系中，以确定基因-修正的细胞的扩增。Butler等，Cell Stem Cell 6：251-64(2011)。基因-修正细胞的扩增取决于在造血前体中的Notch信号传导的内皮细胞-诱导的激活。与它们的正常对应物相比，临床应用的第二重要方面是来源细胞的遗传和表观遗传保真，以确保在体内有适当的行为和无致癌潜力。重要的是，与原代分离的CD34+细胞相比，扩增的脐带血干/祖细胞的全基因组评估展现了转录组、染色质结构和DNA甲基化组的保真性。
可将在正常CD34+细胞中的扩增策略连同利用来自患有血红蛋白病的患者的CD34+细胞定义的方法一起使用。脐带血扩增方法可在使用从正常供体获得的动员外周血CD34+的补充有造血生长因子不含血清的培养基中利用δ1。可使用NSG小鼠模型来评估使用建立的体外测定的优化离体扩增条件(免疫表型分型、生长等)和体内再生能力。可将优化的条件与包括SR1(芳烃受体抑制物)、Hox蛋白或血管生成素的组合物联用，以促进早期干/祖细胞的增殖和存活。有前景的组合可在祖细胞体外测定和免疫缺陷小鼠模型(NSG小鼠)中得到评估，然后从来自正常个体的CD34+的扩增延伸，以评价这些用于扩增患有地中海贫血(和其它血红蛋白病)的患者的CD34+细胞的方法。
可使用全基因组方法，评估扩增的细胞的转录、遗传和表观基因的保真性，以评估产生的细胞的致癌潜力。在体内生长后(输注后)，细胞可用于确定是否存在促进任何受感染的克隆体内生长的功能性显著畸变，从而允许选择性扩增并检测罕见细胞。
消除移植后嗜中性白细胞减少症和改进基因-修正的自体HSC移植后结果的细
胞疗法
在另一个实施方案中，本公开提供用于提供支持性护理的组合物和方法，所述组合物和方法包括消除移植后嗜中性白细胞减少症和改进基因-修正的自体HSC移植后结果的现成细胞疗法。例如，可将离体扩增、低温保藏的脐带血(CB)干/祖细胞以支持性护理的方式向患有地中海贫血和/或镰状细胞病且正在用自体CD34+基因修正细胞进行清髓性HCT的患者施用。
在目的在于开发一种能够提供快速嗜中性粒细胞恢复的经济上可行的“现成”来源的祖细胞的研究中，产生了一群预扩增的、低温保藏的造血干/祖细胞产物—各自来源于可适用于将来的临床用途中的单CB单元。
向成人施用该“现成的”非-HLA匹配的产物的安全性在患有恶性血液病的儿科和成人患者的复发性/难治性AML的首次补救性化疗之后以及在清髓性CBT设定下，立即得以证实。
假设，可将缺乏T细胞的该扩增的细胞产物作为现成的细胞疗法输注，以向用自体基因-修正的干细胞移植物进行清髓性HCT的患者提供快速但临时的骨髓样植入并潜在地促进自体造血恢复，从而减少传染性并发症并降低死亡风险。
关键问题是HLA-匹配是否为缺乏T细胞的“现成的”非-HLA匹配的产物的安全输注所需。不需要HLA匹配，可收集新鲜的CB单元用于立即离体扩增和终产物低温保藏，以视需求将来使用。显著促进了患者对现成扩增的CB产物的获取，因为无论患者的HLA配型、种族/民族或位置如何，所有保存的扩增产物将潜在地用于任何给定的患者。
此外，创造一种现成的通用供体扩增的细胞疗法的能力不仅在缩短HCT后严重嗜中性白细胞减少症的持续时间方面有前景，其还可能增强干细胞移植之外的更广范围的研究，如作为提供临时骨髓样植入的方式用于治疗化疗诱导的严重嗜中性白细胞减少症、任何获得性严重嗜中性白细胞减少症或意外的辐射暴露。
离体扩增通过克服延迟的造血恢复消除了CBT的风险，并且总存活将显著改进。已经在进行双份CBT的患者中观察到复发风险降低，并且尽管高度不匹配移植，慢性GVHD较低。如果早期移植相关的死亡率的风险可通过输注离体扩增的脐带血祖细胞以促进造血恢复来降低，则总存活可能超过用常规不相关的供体所观察到的总存活。
在另外的实施方案中，本公开提供细胞疗法以消除移植后嗜中性白细胞减少症和改进基因-修正的自体HSC移植后的结果。用自体基因修正细胞进行清髓性HCT的患有地中海贫血的患者处于增加的继发于输注移植物中有限数量的CD34+细胞的感染和死亡风险中(直至这些基因修正细胞实现离体扩增至临床上可行的数目)。可采用作为现成的支持性护理方法的前期扩增和低温保藏的脐带血祖细胞产物的输注，以通过促进早期但瞬时的骨髓样恢复降低死亡风险直至长期移植物促进造血恢复。
作为预处理方案的直接结果，进行清髓性HCT的患者经历了严重全血细胞减少症，并且在此期间所有患者处于增加的感染和出血的风险中。(嗜中性粒细胞和血小板的)造血恢复时间直接受到CD34+细胞剂量的影响，并因此对于那些用脐带血(其中干细胞剂量为1/10th的常规供体移植物)或用富含自体CD34的低细胞剂量移植物进行清髓性HCT的患者，由于延迟的造血恢复所导致的移植相关的死亡风险甚至更高。
为了克服这些风险和提高这些HCT方法的安全性，极需可消除长期全血细胞减少症和促进更快速造血恢复的新型疗法。如上所讨论，已经开发了这样的策略，其中可通过与Notch配体δ1一起培养来增加骨髓再生脐带血(CB)造血干/祖细胞(HSPC)的绝对数量。向进行脐带血移植(CBT)的儿童或成人输注这些部分HLA-匹配的离体扩增的CB细胞已被证明是安全的，并且作为由扩增的细胞所产生的快速骨髓样植入的结果，可显著将初始嗜中性粒细胞绝对计数达到500的时间从26天缩短到11天。
在目的在于开发一种能够提供快速嗜中性粒细胞恢复的经济上可行的“现成”来源的祖细胞的研究中，我们已经产生一群预扩增、低温保藏的造血干/祖细胞产物，其各自来源于可适用于将来临床用途中的单CB单元。我们还证实，在患有恶性血液病的儿科和成人患者的复发性/难治性AML的首次补救化疗之后以及在清髓性CBT设定下，立即向成人施用该“现成的”非-HLA匹配的产物的安全性。我们假设可将缺乏T细胞的该扩增的细胞产物作为现成的细胞疗法输注，以向用自体基因-修正的干细胞移植物进行清髓性HCT的患者提供快速但临时的骨髓样植入并潜在地促进自体造血恢复，从而减少传染性并发症并降低死亡风险。
可采用一群现成扩增的细胞产物，使用用于产生离体扩增的脐带血干/祖细胞的定义的最佳方法，以确定输注这些细胞(作为自体基因-修正的HCT中的支持性护理)的安全性。
根据以下的非限制性实施例，将最充分的理解本公开。
实施例
实施例1
使用体外区室化(IVC)选择基于I-HjeMI、I-CpaMI和I-OnuI的Bcl11a基因
靶向归巢内切核酸酶
将亲代LAGLIDADG归巢内切核酸酶(LHE)、I-HjeMI的开放读码框(ORF)(图14；SEQ ID NO:28；Jacoby等，Nucl.Acids Res.40(11)：4954-4964(2012)；Taylor等，Nucl.Acids Res.40(网络服务器发行物):W110-6(2012))，用于在大肠杆菌中的表达所优化的密码子，克隆在pET21-a(+)的NcoI和NotI限制性位点之间(图11；Merck KGaA的EMD Millipore(Novagen)部门。为了将定点饱和诱变引入到I-HjeMI的ORF，使用含有简并密码子5'-NNK-3'的引物(编码所有20个氨基酸)，将含有其部分ORF的DNA片段(大约有20个碱基对的区域与两侧的侧翼片段重叠)进行PCR-扩增。使用此类PCR引物的突变的氨基酸残基示于表2。将PCR产物通过从琼脂糖凝胶提取来纯化，并在随后一轮的PCR中用含有2个拷贝的待选择变体内切核酸酶的靶点的序列组装。将成功组装的DNA片段通过凝胶提取再次纯化，并用作体外区室化(IVC)中的文库。
在每轮的定点饱和诱变之后，进行三轮IVC，以富集特异性改变的变体核酸酶基因。将油-表面活性剂混合物(2％ABIL EM 90(Evonik Industries AGPersonal Care,Essen,North Rhine-Westphalia,Germany)，于轻矿物油中的0.05％Triton X-100)与饱和缓冲液(100mM谷氨酸钾(pH 7.5)、10mM醋酸镁(pH7.5)、1mM二硫苏糖醇和5mg/ml牛血清白蛋白)充分混合，于37℃下孵育20分钟并于4℃下在16,000×g下离心15分钟。将五百微升的上相，通过以1,400r.p.m.在冰上持续搅拌3.5分钟，用于乳化30μl体外蛋白合成混合物(25μlPURExpress(New England Biolabs，Ipswich，MA)、20单位的核糖核酸酶抑制剂、1mg/ml牛血清白蛋白和8ng DNA文库)。将乳液在30℃下孵育4小时，并然后在75℃下加热15分钟。通过于4℃下以16,000×g离心15分钟，收集乳化液滴，并通过添加苯酚/氯仿/异戊醇将其破坏。将核酸通过乙醇沉淀回收，并用核糖核酸酶鸡尾酒(Life Technologies Corporation(Invitrogen)，Grand Island，纽约)处理。在使用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化后，将DNA文库用DNA接头(具有与通过在乳化液滴中表达的内切核酸酶变体产生的靶点粘端互补的4-碱基3'突出端序列)连接，并添加至含有一对引物(其中一个引物针对连接的DNA接头是特异性的)的PCR混合物中，以富集连接至切割的靶点的变体内切核酸酶基因。将PCR扩增子凝胶纯化，并将变体基因的ORF进一步的PCR-扩增以制备用于随后一轮IVC的DNA文库。
在第二轮IVC中，用1ng重新创建的文库制备乳液，并在通过在75℃下加热来猝灭体外转录/翻译反应之前，在42℃下孵育75分钟。回收DNA文库，并且如上所述用DNA接头连接之后通过PCR，特异性富集活性内切核酸酶基因。
在第三轮IVC中，将含有0.5ng文库片段的体外蛋白合成混合物在4.5％Span 80/0.5％Triton X-100/轻矿物油中乳化。反应在42℃下进行45分钟，并在75℃下热灭活。在从乳液提取之后，将切割靶点-相关的内切核酸酶基因PCR-扩增，并进行随后一轮的定点诱变。
为了重新设计识别BCL11A基因靶的(-)和(+)半位点的I-HjeMI变体，分别进行4轮和2轮定点饱和诱变(图13)。使靶向前边半位点的变体核酸酶库在与蛋白-DNA界面相反的表面上进行额外(第五)轮诱变，然后进行3轮IVC(表2)。
表2
在IVC中进行饱和诱变的氨基酸位置
*加下划线的核苷酸不同于亲代LHE I-HjeMI靶点中的那些核苷酸。
将编码负责BCL11A基因靶的(-)和(+)半位点的I-HjeMI变体内切核酸酶的N-末端和C-末端半结构域的DNA片段组装，并通过3轮IVC选择切割完整BCL11A基因靶点的核酸酶库(图13)。
表3呈现了包含DNA序列基序的示例性BCL11a靶序列，对于所述DNA序列基序，高活性内切核酸酶变体(基于归巢内切核酸酶I-CpaMI和I-OnuI)库已被分离并且它们序列已得以确定。
表3
实施例2
在细菌中使用双质粒基因消除切割测定优化BCL11A基因-靶向的I-HjeMI变体
的活性
将使用IVC展示选择(如上在实施例1中公开)的选择中获得的I-HjeMI变体的活性，根据Doyon等，J.Am.Chem.Soc.128(7)：2477-2484(2006)的方法，使用细菌细胞中的双质粒选择体系优化。将内切核酸酶基因的ORF插入到pENDO(图12，Doyon等，J.Am.Chem.Soc.128(7)：2477-2484(2006))表达质粒的NcoI位点和NotI位点之间。将包含含有4个拷贝的BCL11A基因靶的pCcdB受体质粒(图31，Doyon等，J.Am.Chem.Soc.128(7)：2477-2484(2006)；Takeuchi等，Nucl.Acids Res.37(3)：877-890(2009)；和Takeuchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.10.1073/pnas.1107719108(2011))的NovaXGF(EMD Millipore(Novagen))感受态细胞用一群编码I-HjeMI变体的pEndo质粒转化。将转化体在2×YT培养基(16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物和5g/LNaCl)中在37℃下生长30分钟，然后用补充有100μg/mL羧苄西林和0.02％L-阿拉伯糖(为了预先诱发I-HjeMI变体的表达)的2×YT培养基稀释10倍。在培养物在30℃下生长15小时之后，收集细胞，将其重新悬浮于无菌水中并涂布于非选择性(1×M9盐、1％甘油、0.8％胰蛋白胨、1mM MgSO4、1mM CaCl2、2μg/mL硫胺和100μg/mL羧苄西林)和选择性平板(即补充有0.02％L-阿拉伯糖和0.4mM IPTG的非选择性平板以诱导有毒CcdB蛋白的表达)上。在30℃下孵育30小时至40小时之后，从选择性平板上的存活集落上提取pEndo质粒。
将编码活性I-HjeMI变体的ORF使用基因形态II随机诱变试剂盒(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)经由易错PCR扩增。在用NcoI、NotI和DpnI消化后，将所得片段重新克隆到pEndo载体中。使质粒在涂布前，在变体内切核酸酶于30℃下表达4小时的条件下进行2轮选择。使用重叠PCR将选择的基因的N-末端半和C-末端半结构域改组，并再次克隆到pEndo载体中。将载有pEndo质粒和pCcdB报告子的转化细胞在含有0.02％L-阿拉伯糖的2×YT培养基中于37℃下生长1小时，并将其在37℃下于选择性平板上涂布16小时至20小时。在2轮相同严格水平的选择之后，从选择性平板上的存活集落提取pEndo质粒，并对质粒上载有的变体基因的ORF测序。
实施例3
在双质粒切割测定中测试的BCL11A基因-靶向的内切核酸酶的活性
将示例性BCL11A基因-靶向的内切核酸酶(BCL11Ahje；图17，SEQ ID NO:31)、其催化非活性变体(BCL11Ahje D18N)和其亲代LHE I-HjeMI(图14，SEQ ID NO:28)的活性在包含含有4个拷贝的I-HjeMI靶点(I-HjeMI靶)或BCL11A基因靶(TCCAAGTGATGTCTCGGTGGTG(SEQ ID NO:39；加下划线的核苷酸不同于亲代LHE I-HjeMI靶点中的那些核苷酸)的pCcdB报告质粒的细菌细胞中测定(Doyon等，J.Am.Chem.Soc.128(7)：2477-2484(2006))。pCcdB报告质粒编码“细胞死亡B的控制”(“ccdB”，细菌中的有毒蛋白，其可通过添加IPTG来诱导)。在报告质粒中切割靶点导致在含有IPTG的选择性培养基上RecBCD-介导的报告质粒的降解和相应的细胞存活。通过用选择性平板上的集落数除以非选择性平板的集落数来确定存活率。误差线是指3次独立实验的±S.D.。
实施例4
内源性人BCL11A基因中的靶向诱变的检测
将HEK 293T细胞(1.6×105)在转染前在12孔板中接种24小时，并用各0.5ug BCL11A基因靶向核苷酶和TREX2的表达质粒转染。在转染后的48小时，将转染的细胞裂解，并使用Quick-gDNA MiniPrep试剂盒(Zymo Research)提取基因组DNA。将来自50ng提取的基因组的跨越BCL11A基因靶的大约500-bp片段，使用一对以下引物进行PCR-扩增：Bcl11A_上游1，5'-GCT GGA ATG GTTGCA GTA AC-3'(SEQ ID NO:66)；Bcl11A_下游1，5'-CAA ACA GCC ATT CACCAG TG-3'(SEQ ID NO:67)。将PCR扩增子在有或没有由过表达重组蛋白的大肠杆菌纯化的0.5uM BCL11A基因靶向核苷酶的情况下，在1×NEB缓冲液4+1×BSA(New England Biolabs)中于37℃下孵育2小时。通过添加5×停止溶液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.5％SDS、25％甘油、0.1橙黄G和0.5mg/mL蛋白酶K)终止反应。在室温下孵育15分钟之后，在含有于TAE中的溴乙啶的1.6％琼脂糖凝胶上分离每个样品的一半(上图)。将每个样品剩下的部分用DNA Clean&Concentrator-5试剂盒(Zymo Research)纯化，并用作为使用一对以下引物的第二轮PCR中的模板：Bcl 11A_上游2，5'-CTG CCA GCTCTC TAA GTC TCC-3'(SEQ ID NO:68)；Bcl 11A_下游2，5'-TGC AAC ACGCAC AGA ACA CTC-3'(SEQ ID NO:69)。将PCR产物用BCL11A基因靶向核苷酶在上述条件下再次消化，并在1.6％琼脂糖凝胶上分析(下图)(参见图30)。
实施例5
使用体外区室化选择基于I-OnuI的胎儿血红蛋白沉默区靶向内切核酸酶
表4呈现了示例性归巢内切核酸酶(HE)靶序列，其均匀分布于整个350bp区(SEQ ID NO:2)，所述350bp区包括在French HPFH缺失中破坏的成人红系细胞HbF沉默区中的Bcl11a占据区。这些靶序列包括DNA序列基序，对于所述DNA序列基序，高活性内切核酸酶变体库已被分离并测序。
表4
表5呈现了球蛋白基因上游的-100bp至210bp区域，其与Αγ-球蛋白基因和Gγ-球蛋白基因都相同并含有许多非缺失型HPFH突变。产生这些突变的基因编辑导致抑制降低，因此激活γ基因并导致HbF增加。
表5
表6呈现了于IVC中进行饱和诱变(如以上实施例1所述)以产生靶向人胎儿球蛋白沉默区的归巢内切核酸酶的亲代LHE I-OnuI归巢内切核酸酶(图22A，SEQ ID NO:34)内的氨基酸位置。
表6
于IVC中进行饱和诱变以产生针对人胎儿球蛋白沉默区的靶向归巢内切核酸酶
的氨基酸位置
*加下划线的核苷酸不同于亲代LHE I-OnuI的靶点中的那些核苷酸。
图23呈现了用来自人胎儿球蛋白沉默区的‘半靶’进行的切割测定的结果。扩增条带含有(通过与互补的双链体寡核苷酸和相应的突出的ssDNA连接而捕获的)切割的半位点和负责产生切割的DNA产物的酶变体的序列。完成富集‘半位点’内切核酸酶文库的最终步骤包括编码负责g球蛋白沉默区靶的左(L)和右(R)半位点的I-OnuI归巢内切核酸酶的N-末端和C-末端半结构域的DNA片段的组装。活性I-OnuI内切核酸酶选自切割全长人胎儿球蛋白沉默区靶的汇集物。
实施例6
提高基因-靶向内切核酸酶的特异性和活性的具有TAL锚的N-末端融合物的
MegaTAL归巢内切核酸酶
可采用TAL锚的N-末端融合物，提高包括一种或多种归巢内切核酸酶(诸如I-HjeMI、I-CpaMI和I-OnuI归巢内切核酸酶的一种或多种)的基因-靶向内切核酸酶的特异性和活性。MegaTAL使用由Cermak等，Nucl.Acids Res.39:e82-e82(2011)描述的使用RVD质粒文库和目的载体来构建的金门组装策略(MegaTAL:5.5RVD+Y21-AniI的核苷酸和氨基酸序列，参见图24，SEQ ID NO:35和图25，SEQ ID NO:36)。
修饰质粒以允许组装含有1.5至10.5TAL重复和它们相应的RVD(‘重复可变双残基’，其接触靶点5'区中连续的DNA碱基并从而限定该区域中的同源DNA序列)的TAL效应器。修饰pthX0l目的载体，以包含NLS紧接下游的血凝素(HA)标签并产生TALEN支架，所述TALEN支架开始于残基154处(相对于野生型PthXol TAL效应器)并终结于超过最终‘半TAL重复’序列的63残基。
使用以下的RVD构建TAL效应器，以靶向各个特定的核苷酸：A–NI，C–HD，G–NN和T–NG。在将TAL效应器重复克隆至目的载体内之后，将单个蛋白接头(‘Ζn4’；VGGS)和工程化归巢内切核酸酶变体替代FokI核酸酶催化结构域克隆在工程化Xba-I和Sal-I限制性位点之间。
这是‘模型试验实例’MegaTAL(在单条蛋白链的N-末端处的TAL效应器的融合物，经由柔性接头与野生型Y2I-AniI归巢内切核酸酶融合，其最初描述于Takeuchi等,Nucl.Acids Res.37(3):877-890(2009)。
实施例7
用于破坏Bcl11a-调节的胎儿血红蛋白(HbF)沉默区的基于Cas9的内切核酸
酶体系
最近，对成簇间隔短回文重复(CRISPR)体系的机械性理解即细菌用于适应性免疫已导致开发了允许基因组编辑哺乳动物细胞的有利工具，其可用于本文公开的治疗血红蛋白病的组合物和方法中：(a)以破坏Bcl11a编码区；(b)以破坏HbF沉默DNA调节元件或通路，诸如Bcl11a-调节的HbF沉默区；(c)以突变一种或多种γ-球蛋白基因启动子而实现γ-球蛋白基因表达的增加；(d)以突变一种或多种δ-球蛋白基因启动子而实现δ-球蛋白基因表达的增加；和/或(e)以修正一种或多种β-球蛋白基因突变。细菌CRISPR体系描述于Jinek等，Science 337：816-821(2013)；Cong等，Science(2013年1月3日)(先于印刷的电子出版)；和Mali等，Science(2013年1月3日)(先于印刷的电子出版)。
Cas9蛋白在特定位点产生了双链断裂，该位点的位置由RNA-引导序列确定。所有引导RNA含有相同的结合Cas9的支架序列，以及提供Cas9-RNA复合切割特异性的结构G-N20-GG的可变靶向序列。Cas9蛋白和引导RNA的共表达导致在人基因组内的序列-特异性位置处的有效切割和破坏，所述序列-特异性切割由引导RNA序列所限定。Cas9和对多个靶有特异性的引导RNA的共表达导致靶点之间的间插区有效缺失。
因此，在本公开的某些方面，采用Cas9-介导的基因组编辑：(1)以破坏HbF沉默区内的Bcl11a结合位点，(2)以破坏Bcl11a基因功能，和(3)以缺失整个HbF沉默区。鉴别靶区并根据对最佳引导RNA靶序列的考量设计和产生引导RNA。本文例举的是靶向HbF沉默区中的Bcl11a结合区以及单个GATA-1结合基序的引导RNA。这些引导RNA可单独或联合使用，以实现HbF沉默区的靶向破坏。具有针对HbF沉默区中对应于Bcl11a占据峰的额外区的引导RNA的Cas9还可单独使用和联合使用。位于Bcl11a结合位点和GATA-1基序以及整个覆盖区的侧翼的若干对引导RNA，还可与Cas9共表达以在HbF沉默区中产生缺失。
来自Mali等，Science(2013年1月3日)的人密码子优化的Cas9的序列呈现于图26，SEQ ID NO:37中。引导RNA(Mali等)的遗传序列呈现于图27，SEQ ID NO:38中，其关键序列元件呈现于表7中。靶特异性结合至和切割人胎儿血红蛋白(HbF)沉默区的示例性Cas9引导RNA序列(图6，SEQ ID NO:1和图7，SEQ ID NO:2)呈现于表8中。
表7
遗传性Cas9引导RNA的序列元件
表8
示例性Cas9引导RNA的靶特异性序列
实施例8
用于表达内切核酸酶的载体体系
对于NSG、镰状细胞和地中海贫血小鼠模型，将人CD34细胞或小鼠骨髓有核细胞与荧光标记一起转导，以允许在移植前的基于流式细胞术的细胞富集。适合的转导方法包括以下：
AAV6载体。AAV6-血清型重组AAV载体提供了4.5kb有效载荷，足以递送除了小重组模板之外的启动子-HE-外切核酸酶或启动子-TAL-HE融合物-外切核酸酶盒。可替选地，它们可载有Cas9和引导RNA。此外，我们掌握的初步数据显示AAV6提供所有已知的AAV壳体的人CD34+脐带血细胞的最有效转导，并且能够介导HSC中的显著水平的瞬时基因表达。
经修饰的腺病毒载体。具有杂交壳体的腺病毒载体能够有效转导许多类型的造血细胞(包括CD34+细胞)。用使用血清型35纤维(Ad5-F35)的嵌合载体进行的改进的转导由Dr.Rawlings(SCH)所论证，并且最近数据表明血清型11纤维(Ad5-F11)甚至可能在造血细胞中更加有效。辅助病毒依赖型腺病毒提供达30kb的有效载荷以及在HSC中的瞬时基因表达，并可用于递送多种HE/外切核酸酶盒、HE-TAL融合物以及非常大的重组模板或Cas9表达盒和多种引导RNA。
整合缺陷型慢病毒和泡沫病毒载体(IDLV和IDFV)。这些载体提供6kb(IDLV)至9kb(IDFV)的有效载荷，并具有显而易见的转导人HSC的能力。IDLV和IDFV载体都可用于HSC中的基因敲除和基于重组的基因编辑。Drs.Rawlings(SCH)和Kiem(FHCRC)已经产生并评估了一系列具有可替代启动子GFP盒的IDLV，并已确定了在CD34+HSC中提供有效和高水平表达的构建体。
质粒和mRNA的直接核转染。N-MEL和CD34细胞的有效转导条件已使用Amaxa核转染体系定义。益处包括缺乏整合和同时转导多个表达质粒或RNA种类的能力。
并行地，分选和未分选的细胞将被移植至单独小鼠中。尽管后一种移植物可能含有少数经修饰的细胞，移植后嵌合体的人类研究表明这些细胞将具有选择性存活优势并富集于周边。无论如何，单独网织红细胞RNA和F-细胞分析将允许评估细胞中的基因破坏，即使其以低丰度存在。
二级评估将集中于转导的CD34+细胞的多能性和红细胞生成。测定将包括为评估长期增殖潜力的培养、对骨髓样和红系细胞集落进行的分析以用于克隆分析和移植到NOD scidγ(NSG)小鼠中，以及随后的对原代和次级接受者的多系植入的评估。
通常，将干细胞在全身辐射(对于NSG小鼠为275拉德，或者对于C57小鼠为1000拉德)之后经由尾静脉注射输注。尽管有效，但对于大多数研究，我们将干细胞直接注射到小鼠股骨中是有效的，这是因为需要少于50倍的细胞、理想的或测定潜在有限量的流式细胞术分选和/或修饰的细胞。在提供麻醉和局部麻醉并定义解剖标志之后，将500,000-1,000,000个细胞直接注射至股骨骨髓隙间。
实施例9
用于有效基因靶向的归巢和Cas9内切核酸酶的表征
对于临床影响，有效基因靶向可通过在模型生物中评估球蛋白基因在各种靶向细胞和细胞类群中的表达水平、靶向对红细胞生成和对干细胞功能的影响，以及影响血液学参数和器官功能而证实。
转导之后，进行在RNA和蛋白水平的所有β样基因的基因靶向效率和表达的单细胞和混合群落评估。评估了因子结合和染色质结构的变化，以及细胞形态和无效红细胞生成和凋亡的程度。可在体外和体内进一步评估在初始筛选中得分佳的候选切核酸酶对HSC多能性以及改善疾病特异性表型的能力的影响。
可在含有单个完整的人染色体11(N-MEL)的小鼠红白血病细胞系和临床级CD34+正常人HSC中进行内切核酸酶候选物和递送体系的初始筛选，评估终点是靶向突变效率和球蛋白基因表达。可诱导这两种细胞类型沿着红细胞途径分化，其中β样基因的表达被低□-球蛋白/□-球蛋白+β-球蛋白RNA比率高度诱导。使用HbF特异抗体，可量化“F-细胞”的百分比。这些低比率是理想的，因为体系对于检测和量化单细胞和群体水平的□-球蛋白mRNA以及HbF表达即使很小的增长很灵敏。
N-MEL细胞是含有单个完整的人染色体11的鼠红白血病细胞的衍生物，所述人染色体11含有β-球蛋白基因座。该红系细胞系正常表达低水平的小鼠和人β样球蛋白基因，但可被诱导以分化，在此期间球蛋白表达显著增加。
使用Amaxa核转染体系有效转导N-MEL细胞。使用2μg质粒DNA，试剂盒“L”和程序A20，转导25％的细胞。用设计为破坏Bcl11a基因的含有归巢内切核酸酶的基于RSCS-MCS-PG-WZ的慢病毒载体进行的感染复数(MOI)为20的感染导致大约40％的N-MEL细胞被转导。
使用Cel-1测试测定靶向破坏的效率。将靶区通过PCR扩增、加热变性、再退火和暴露于将来自不匹配区的泡状物有效切割为尽可能小的一个碱基对的酶Cel-1。如果已将靶向的区域以任何方式突变，则切割野生型和突变体链的异源双链体并通过凝胶电泳检测。该测定可用于细胞的混合群落以评估突变效率，或者用于流式细胞术分选的各种细胞，其中对多种细胞的个案分析提供了对突变频率的精确评估。
使用用于混合群落的细胞RNA的常规定量Taqman RT-PCR(qRT-PCR)测定，诱导β-球蛋白表达11倍，并伴有分化且□-球蛋白/□-球蛋白+β-球蛋白比率为0.1％。在用Bcl11a敲低载体感染后，该比率可获得30倍的增加，因此表明了该细胞培养体系提供了BCl11a介导的HbF沉默通路破坏的精确读出。
由于考虑到改变Bcl11a通路可导致□-球蛋白RNA相对增加而球蛋白基因表达减少，所以流式细胞术可用于分选裂解的细胞的1000个细胞库，并且可进行上述qRT-PCR测定。因为直接比较了来自相同数量细胞的RNA，球蛋白RNA量的任何减少由Ct增加所反映，这提供了对β-表达水平和□-表达水平以及□-球蛋白/□-球蛋白+β-球蛋白比率的直接测量。
为了确定显示操作后改变的□-球蛋白/□-球蛋白+β-球蛋白比率的细胞百分比，并确定观察到的表达的变化范围，进行单细胞测定。使流式细胞术分选的各种细胞同时进行数个循环的□-球蛋白和β-球蛋白RNA的常规RT-PCR，并且一旦存在足够物质允许精确分裂样品，就上述的qRT-PCR评估□-球蛋白和β-球蛋白。
最终，HbF蛋白水平而非RNA水平有治疗性，因此进行单细胞和批量细胞HbF测定。使用HPLC在细胞裂解和血红蛋白-专用柱上洗脱之后，测定混合群落的细胞，并确定HbF与HbA和HbA2的比率。使用戊二醛固定的细胞、用去污剂透化和添加HbF特异性抗体及之后通过流式细胞术定量，比较转导前和转导后的表达HbF的细胞数量。
通过流式细胞术分离单细胞之后，在修饰的克隆细胞中评估突变的影响。进行以上测定。此外，为了显示靶向突变破坏Bcl11a抑制型复合物的结合，将细胞固定在甲醛中，分离染色质并通过超声处理剪切。使用可商购获得的抗体，对Bcl11a、GATA-1和HDAC-1进行染色质免疫沉淀(ChIP)。以下描述了这些蛋白与在N-MEL细胞、以及红系细胞-分化的CD34细胞中的靶区的结合。在靶向破坏之后，评估结合的缺乏。
实施例10
临床级CD34+造血干细胞
用纤连蛋白肽CH-296将来自正常人供体的CD34+细胞黏附至培养皿，并在含有G-CSF、SCF、IL-3、IL-6、FLT-3和TPO的培养基中在MOI为20时，用上述的基于RSCS-MCS-PG-WZ的慢病毒载体感染两次。这导致～80％的细胞被感染。使用Douy.Giarratana等，Nat.Biotechnol 23(1)：69-74(2005)的方案，将转导的细胞分化为红系细胞。以上的qRT-PCR测定揭示了□-球蛋白/□-球蛋白+β-球蛋白比率为4％。该低比率允许灵敏检测继发于基因组编辑的增加。
为了评估分化状态的变化，进行使用多种细胞表面标记物(包括CD34、CD71和血型糖蛋白)的流式细胞术，以及在瑞氏-吉姆萨染色之后评估细胞离心涂片的细胞生长和形态。通过在如上所述的混合群落和单细胞上的Cel-1测定评估破坏效率。如上所述，使用对1000个细胞库和各种细胞进行的qRT-PCR以及HPLC和F-细胞测定，对球蛋白基因表达和HbF进行额外的评估。采用ChIP评估Bcl11a、GATA-1和HDAC-1与靶区的结合。
为了在人细胞CD34+人中评估临床有效性，使用相同的方法转导并培养来自来自血红蛋白病患者的HSC。除了对正常细胞的常规分析之外，进行另外的疾病-特异性评估。与正常细胞相比，培养的地中海贫血症细胞显示出最小扩增、缺乏血红蛋白化、无效红细胞生成和凋亡增多的证据。这允许定量评估靶向之后的表达和红细胞生成的改进。类似地，评估在含氧量低的条件下的CD34细胞的红系细胞后代的镰变程度。将来自血红蛋白病患者的这些转导的CD34+细胞移植到NSG小鼠中，此后扼要重述了异常红细胞生成的几种特征，从而允许评估靶向诱变的影响。
在血红蛋白病的小鼠模型中，体内评估临床有效性。敲除鼠Bcl11a导致在转基因上含有人β-球蛋白基因座的小鼠的□-球蛋白的显著剂量依赖性增长，并改善了人源化小鼠模型中的镰状表型。尽管这两种体系都允许分析球蛋白基因表达，但镰状小鼠允许评估这些小鼠中的表型改进，特别关注血液学参数特别是血细胞、肝和肺病状、肾功能和脾大小。与上面类似，在单细胞测定中，表型改进可与含HbF细胞的数目、HbF/S比率和表达形式相关。
对于RNA分析，使用全血，这是因为全血含有足够的用于分析的含RNA网状细胞。对于单细胞分析，用噻唑橙对血液染色，并收集具有红细胞的前向散射和侧向散射特性的含RNA的细胞。在镰状细胞小鼠中，红细胞寿命显著降低，而在腹膜内注射NHS-生物素之后，利用100％标记的RBC，评估寿命的延长。在各时间点，用链霉亲和素FITC将一微升血液染色，并通过流式细胞术评估剩余百分比的标记的RBC。这用来自我们BERK镰状细胞小鼠的小鼠来进行。Pászty等，Science 278(5339):876-878(1997)。此外，在含有A25和A85人β-球蛋白YAC的小鼠中，评估□-球蛋白/□-球蛋白+β-球蛋白比率。Porcu等，Blood90(11)：4602-4609(1997)。
评估了两种地中海贫血症模型，Th-3小鼠杂合子(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(25)：11608-11612(1995))和对LCR缺失杂合的小鼠(Bender等，Mol Cell.5(2)：387-393(2000))。在每种情况下，对地中海贫血症小鼠的分析将集中于血细胞、无效红细胞生成的评估、脾大小、铁超载和器官形态。
Claims (96)
1.一种用于治疗血红蛋白病的组合物，包含选自归巢内切核酸酶(HE)和CRISPR内切核酸酶中的一种或多种内切核酸酶，其中每种所述内切核酸酶结合至选自Bcl11a编码区、Bcl11a基因调节区、成人β-球蛋白基因座、胎儿血红蛋白(HbF)沉默区、Bcl11a-调节的HbF沉默区、γ-球蛋白基因启动子、δ-球蛋白基因启动子和β-球蛋白基因突变位点中的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述内切核酸酶是结合至所述Bcl11a编码区或所述Bcl11a基因调节区的HE。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-OnuI归巢内切核酸酶。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述HE是I-HjeMI归巢内切核酸酶。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、E65、I66、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、N159、D162、D163、I166、I168、S168、D170、I193、L195、R202、K204和T206。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其变体，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶能够特异性结合至Bcl11a编码区。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述内切核酸酶是CRISPR内切核酸酶，其中所述CRISPR包含RNA引导链和Cas9内切核酸酶，其中所述RNA引导链介导所述Cas9内切核酸酶与胎儿血红蛋白(HbF)沉默区的结合。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述RNA引导链包含选自SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQID NO:53和SEQ ID NO:54中的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述Cas9内切核酸酶由编码功能性Cas9内切核酸酶的SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其变体编码。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述内切核酸酶是能够特异性结合至胎儿血红蛋白(HbF)沉默区的HE。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-OnuI归巢内切核酸酶。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述HE是I-OnuI归巢内切核酸酶。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含编码I-OnuI归巢内切核酸酶的SEQ ID NO:34的核苷酸序列的变体编码的氨基酸序列，所述I-OnuI归巢内切核酸酶能够特异性结合至所述胎儿血红蛋白(HbF)沉默区。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80和T82。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自F182、N184、I186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238和T240。
17.根据权利要求1所述的组合物，其还包含TAL效应器核酸酶(TALEN)、TAL-HE或TREX2蛋白。
18.一种用于治疗血红蛋白病的组合物，所述组合物包含编码选自归巢内切核酸酶(HE)和Cas9内切核酸酶中的一种或多种内切核酸酶的一种或多种多核苷酸，其中每种所述内切核酸酶结合至选自Bcl11a编码区、Bcl11a基因调节区、成人β-球蛋白基因座、胎儿血红蛋白(HbF)沉默区、Bcl11a-调节的HbF沉默区、γ-球蛋白基因启动子、δ-球蛋白基因启动子和β-球蛋白基因突变点中的核苷酸序列。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述内切核酸酶是结合至所述Bcl11a编码区或所述Bcl11a基因调节区的HE。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-OnuI归巢内切核酸酶。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述HE是I-HjeMI归巢内切核酸酶。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、E65、I66、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、N159、D162、D163、I166、I168、S168、D170、I193、L195、R202、K204和T206。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其变体，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶能够特异性结合至Bcl11a编码区。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述内切核酸酶是CRISPR内切核酸酶，其中所述CRISPR包含RNA引导链和Cas9内切核酸酶，其中所述RNA引导链介导所述Cas9内切核酸酶与胎儿血红蛋白(HbF)沉默区的结合。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述RNA引导链包括选自SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQID NO:53和SEQ ID NO:54中的核苷酸序列。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述Cas9内切核酸酶由编码功能性Cas9内切核酸酶的SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其变体编码。
28.根据权利要求18所述的组合物，其中所述内切核酸酶是能够特异性结合至胎儿血红蛋白(HbF)沉默区的HE。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-OnuI归巢内切核酸酶。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述HE是I-OnuI归巢内切核酸酶。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由编码I-OnuI归巢内切核酸酶的SEQ ID NO:34的核苷酸序列的变体编码的氨基酸序列，所述I-OnuI归巢内切核酸酶能够特异性结合至所述胎儿血红蛋白(HbF)沉默区。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80和T82。
33.根据权利要求31所述的组合物，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自F182、N184、I186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238和T240。
34.根据权利要求18所述的组合物，还包含编码TAL效应器核酸酶(TALEN)、TALE-HE融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
35.一种编码选自归巢内切核酸酶(HE)和CRISPR内切核酸酶中的内切核酸酶的多核苷酸，其中所述内切核酸酶结合至选自Bcl11a编码区、Bcl11a基因调节区、成人β-球蛋白基因座、胎儿血红蛋白(HbF)沉默区、Bcl11a-调节的HbF沉默区、γ-球蛋白基因启动子、δ-球蛋白基因启动子和β-球蛋白基因突变位点中的核苷酸序列。
36.根据权利要求35所述的多核苷酸，其中所述内切核酸酶是结合至所述Bcl11a编码区或所述Bcl11a基因调节区的HE。
37.根据权利要求36所述的多核苷酸，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-OnuI归巢内切核酸酶。
38.根据权利要求37所述的多核苷酸，其中所述HE是I-HjeMI归巢内切核酸酶。
39.根据权利要求38所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、E65、I66、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、N159、D162、D163、I166、I168、S168、D170、I193、L195、R202、K204和T206。25.根据权利要求24所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
40.根据权利要求39所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其变体，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶能够特异性结合至Bcl11a编码区。
41.根据权利要求40所述的多核苷酸，其中所述内切核酸酶是能够特异性结合至胎儿血红蛋白(HbF)沉默区的HE。
42.根据权利要求41所述的多核苷酸，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-OnuI归巢内切核酸酶。
43.根据权利要求35所述的多核苷酸，其中所述HE是I-OnuI归巢内切核酸酶。
44.根据权利要求43所述的多核苷酸，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由编码I-OnuI归巢内切核酸酶的SEQ ID NO:34的核苷酸序列的变体编码的氨基酸序列，所述I-OnuI归巢内切核酸酶能够特异性结合至所述胎儿血红蛋白(HbF)沉默区。
45.根据权利要求44所述的多核苷酸，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中每种所述氨基酸置换选自L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80和T82。
46.根据权利要求45所述的多核苷酸，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自F182、N184、I186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238和T240。
47.根据权利要求35所述的多核苷酸，还包括编码TAL效应器核酸酶(TALEN)、TALE-HE融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
48.一种编码RNA引导链的多核苷酸，所述RNA引导链介导Cas9内切核酸酶与Bcl11a编码区、Bcl11a基因调节区、成人β-球蛋白基因座、胎儿血红蛋白(HbF)沉默区、Bcl11a-调节的HbF沉默区、γ-球蛋白基因启动子、δ-球蛋白基因启动子和β-球蛋白基因突变位点的结合。
49.根据权利要求48所述的多核苷酸，其中所述RNA引导链介导Cas9内切核酸酶与胎儿血红蛋白(HbF)沉默区的特异性结合。
50.根据权利要求49所述的多核苷酸，其中所述胎儿血红蛋白(HbF)沉默区包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
51.根据权利要求50所述的多核苷酸，其中所述胎儿血红蛋白(HbF)沉默区包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的多核苷酸，其中所述RNA引导链包含选自SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中的核苷酸序列。
53.一种包含载体和编码选自归巢内切核酸酶(HE)和CRISPR内切核酸酶中的内切核酸酶的多核苷酸的载体体系，其中所述内切核酸酶结合至选自Bcl11a编码区、Bcl11a基因调节区、成人β-球蛋白基因座、胎儿血红蛋白(HbF)沉默区、Bcl11a-调节的HbF沉默区、γ-球蛋白基因启动子、δ-球蛋白基因启动子和β-球蛋白基因突变位点中的核苷酸序列。
54.根据权利要求53所述的载体体系，其中所述载体选自AA V6、经修饰的腺病毒载体、整合缺陷型慢病毒载体(IDLV)和整合缺陷型泡沫病毒载体(IDFV)。
55.根据权利要求53所述的载体体系，其中所述内切核酸酶是结合至所述Bcl11a编码区或所述Bcl11a基因调节区的HE。
56.根据权利要求55所述的载体体系，其中所述HE选自I-HjeM归巢内切核酸酶、I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-OnuI归巢内切核酸酶。
57.根据权利要求56所述的载体体系，其中所述HE是I-HjeMI归巢内切核酸酶。
58.根据权利要求57所述的载体体系，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、E65、I66、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、N159、D162、D163、I166、I168、S168、D170、I193、L195、R202、K204和T206。25.根据权利要求24所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由所述SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
59.根据权利要求58所述的载体体系，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由所述SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
60.根据权利要求59所述的载体体系，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其变体，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶能够特异性结合至Bcl11a编码区。
61.根据权利要求53所述的载体体系，其中所述内切核酸酶是能够特异性结合至胎儿血红蛋白(HbF)沉默区的HE。
62.根据权利要求61所述的载体体系，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-OnuI归巢内切核酸酶。
63.根据权利要求62所述的载体体系，其中所述HE是I-OnuI归巢内切核酸酶。
64.根据权利要求63所述的载体体系，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由编码I-OnuI归巢内切核酸酶的SEQ ID NO:34的核苷酸序列的变体编码的氨基酸序列，所述I-OnuI归巢内切核酸酶能够特异性结合至所述胎儿血红蛋白(HbF)沉默区。
65.根据权利要求64所述的载体体系，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80和T82。
66.根据权利要求64所述的载体体系，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自F182、N184、I186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238和T240。
67.根据权利要求53所述的载体体系，还包含编码TAL效应器核酸酶(TALEN)、TALE-HE融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
68.一种包含载体和编码RNA引导链的多核苷酸的载体体系，所述RNA引导链介导Cas9内切核酸酶与选自Bcl11a编码区、Bcl11a基因调节区、成人β-球蛋白基因座、胎儿血红蛋白(HbF)沉默区、Bcl11a-调节的HbF沉默区、γ-球蛋白基因启动子、δ-球蛋白基因启动子和β-球蛋白基因突变位点中的核苷酸序列的结合。
69.根据权利要求68所述的载体体系，其中在成人β-球蛋白基因座中的所述核苷酸序列是胎儿血红蛋白(HbF)沉默区。
70.根据权利要求69所述的载体体系，其中所述胎儿血红蛋白(HbF)沉默区包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
71.根据权利要求69所述的载体体系，其中所述胎儿血红蛋白(HbF)沉默区包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
72.根据权利要求70或权利要求71所述的载体体系，其中所述RNA引导链包含选自SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中的核苷酸序列。
73.一种包含编码选自归巢内切核酸酶(HE)和CRISPR内切核酸酶中的一种或多种内切核酸酶的多核苷酸的细胞，其中每种所述内切核酸酶结合至选自Bcl11a编码区、Bcl11a基因调节区、成人β-球蛋白基因座、胎儿血红蛋白HbF沉默区、Bcl11a-调节的HbF沉默区、γ-球蛋白基因启动子、δ-球蛋白基因启动子和β-球蛋白基因突变位点中的核苷酸序列。
74.根据权利要求73所述的细胞，其中所述细胞是干细胞。
75.根据权利要求73所述的细胞，其中所述细胞是选自造血干细胞(HSC)、诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干(ES)细胞和红系祖细胞中的干细胞。
76.根据权利要求73所述的细胞，其中所述细胞是选自造血干细胞(HSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和红系祖细胞中的干细胞。
77.根据权利要求73所述的细胞，其中所述内切核酸酶是能够特异性结合至所述Bcl11a编码区的HE。
78.根据权利要求77所述的细胞，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-OnuI归巢内切核酸酶。
79.根据权利要求78所述的细胞，其中所述HE是I-HjeMI归巢内切核酸酶。
80.根据权利要求79所述的细胞，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、E65、I66、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、N159、D162、D163、I166、I168、S168、D170、I193、L195、R202、K204和T206.25。
81.根据权利要求80所述的细胞，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
82.根据权利要求81所述的细胞，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其变体，其中所述I-HjeMI归巢内切核酸酶能够特异性结合至Bcl11a编码区。
83.根据权利要求73所述的细胞，其中所述CRJSPR内切核酸酶包含Cas9内切核酸酶和RNA引导链，其中所述RNA引导链介导所述Cas9内切核酸酶与胎儿血红蛋白(HbF)沉默区的结合。
84.根据权利要求83所述的细胞，其中所述RNA引导链包含选自SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQID NO:53和SEQ ID NO:54中的核苷酸序列。
85.根据权利要求84所述的细胞，其中所述Cas9内切核酸酶由编码功能性Cas9内切核酸酶的SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其变体所编码。
86.根据权利要求73所述的细胞，其中所述内切核酸酶是结合至胎儿血红蛋白(HbF)沉默区的HE。
87.根据权利要求86所述的细胞，其中所述HE选自I-HjeMI归巢内切核酸酶、I-CpaMI归巢内切核酸酶和I-OnuI归巢内切核酸酶。
88.根据权利要求87所述的细胞，其中所述HE是I-OnuI归巢内切核酸酶。
89.根据权利要求88所述的细胞，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由编码I-OnuI归巢内切核酸酶的SEQ ID NO:34的核苷酸序列的变体编码的氨基酸序列，所述I-OnuI归巢内切核酸酶能够特异性结合至所述胎儿血红蛋白(HbF)沉默区。
90.根据权利要求89所述的细胞，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80和T82。
91.根据权利要求89所述的细胞，其中所述I-OnuI归巢内切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸置换，其中所述氨基酸置换选自F182、N184、I186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238和T240。
92.根据权利要求73所述的细胞，还包含编码TAL效应器核酸酶(TALEN)、TALE-HE融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
93.一种基因组编辑的干细胞，其中所述基因组编辑的干细胞通过引入归巢内切核酸酶和修正模板产生。
94.根据权利要求93所述的基因组编辑的干细胞，其中所述修正模板包含允许在球蛋白基因基因座中修饰关键调控序列或编码序列的核苷酸序列。
95.根据权利要求93所述的基因组编辑的干细胞，其中所述干细胞选自造血干细胞(HSC)、诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干(ES)细胞和红系祖细胞。
96.根据权利要求93所述的基因组编辑的干细胞，其中所述干细胞选自造血干细胞(HSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和红系祖细胞。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261603231P | 2012-02-24 | 2012-02-24 | |
| US61/603,231 | 2012-02-24 | ||
| PCT/US2013/027459 WO2013126794A1 (en) | 2012-02-24 | 2013-02-22 | Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104284669A true CN104284669A (zh) | 2015-01-14 |
Family
ID=49006265
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201380017193.5A Pending CN104284669A (zh) | 2012-02-24 | 2013-02-22 | 治疗血红蛋白病的组合物和方法 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20150166969A1 (zh) |
| EP (2) | EP2836226B1 (zh) |
| JP (2) | JP6170080B2 (zh) |
| KR (2) | KR20180009383A (zh) |
| CN (1) | CN104284669A (zh) |
| AU (2) | AU2013222170B2 (zh) |
| BR (1) | BR112014020625A2 (zh) |
| CA (1) | CA2865129A1 (zh) |
| DK (1) | DK2836226T3 (zh) |
| ES (1) | ES2641840T3 (zh) |
| HK (1) | HK1249861A1 (zh) |
| IL (2) | IL234225B (zh) |
| IN (1) | IN2014DN07853A (zh) |
| NZ (1) | NZ630900A (zh) |
| RU (2) | RU2650811C2 (zh) |
| SG (2) | SG10201606959PA (zh) |
| WO (1) | WO2013126794A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA201406187B (zh) |
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104805118A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-07-29 | 扬州大学 | 一种苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因进行靶向敲除方法 |
| CN106244555A (zh) * | 2016-08-23 | 2016-12-21 | 广州医科大学附属第三医院 | 一种提高基因打靶的效率的方法及β‑球蛋白基因位点的碱基原位修复方法 |
| CN107532168A (zh) * | 2015-02-23 | 2018-01-02 | 克里斯珀医疗股份公司 | 治疗血红蛋白病的材料和方法 |
| CN108779462A (zh) * | 2015-12-28 | 2018-11-09 | 诺华股份有限公司 | 用于治疗血红蛋白病的组合物和方法 |
| CN109735497A (zh) * | 2017-10-27 | 2019-05-10 | 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 | 一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法 |
| CN109923211A (zh) * | 2016-09-08 | 2019-06-21 | 蓝鸟生物公司 | Pd-1归巢核酸内切酶变体、组合物及使用方法 |
| CN110042124A (zh) * | 2019-04-25 | 2019-07-23 | 国家卫生健康委科学技术研究所 | 基因组碱基编辑增加人红细胞中胎儿血红蛋白水平的试剂盒及应用 |
| CN110546262A (zh) * | 2017-02-06 | 2019-12-06 | 诺华股份有限公司 | 用于治疗血红蛋白病的组合物和方法 |
| CN111629747A (zh) * | 2017-12-05 | 2020-09-04 | 沃泰克斯药物股份有限公司 | Crispr-cas9修饰的cd34+人血色素干细胞和祖细胞及其用途 |
| CN112469823A (zh) * | 2018-04-27 | 2021-03-09 | 西雅图儿童医院d/b/a西雅图儿童研究所 | 布鲁顿氏酪氨酸激酶的基于talen和基于crispr/cas的基因编辑 |
| CN112979823A (zh) * | 2019-12-18 | 2021-06-18 | 华东师范大学 | 一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品及融合蛋白 |
| CN113481184A (zh) * | 2021-08-06 | 2021-10-08 | 北京大学 | 融合蛋白以及其使用方法 |
| CN114072518A (zh) * | 2019-06-28 | 2022-02-18 | Asc治疗公司 | 用于治疗地中海贫血或镰状细胞病的方法和组合物 |
| CN114096666A (zh) * | 2019-02-13 | 2022-02-25 | 比姆医疗股份有限公司 | 治疗血红素病变的组合物和方法 |
| US11268077B2 (en) | 2018-02-05 | 2022-03-08 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies |
| CN114072518B (zh) * | 2019-06-28 | 2024-06-21 | Asc治疗公司 | 用于治疗地中海贫血或镰状细胞病的方法和组合物 |
Families Citing this family (142)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013066438A2 (en) | 2011-07-22 | 2013-05-10 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| US11021737B2 (en) | 2011-12-22 | 2021-06-01 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for analyte detection |
| GB201122458D0 (en) | 2011-12-30 | 2012-02-08 | Univ Wageningen | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof |
| CA2865129A1 (en) | 2012-02-24 | 2013-08-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
| PE20190843A1 (es) | 2012-05-25 | 2019-06-17 | Emmanuelle Charpentier | Arn de direccion a adn generico |
| RS60838B1 (sr) * | 2012-08-29 | 2020-10-30 | Sangamo Therapeutics Inc | Postupci i kompozicije za tretman genskog stanja |
| DK2925864T3 (en) | 2012-11-27 | 2019-02-11 | Childrens Medical Ct Corp | DIRECTIONAL TARGETING OF DISTANT BCL11A CONTROLS FOR FETAL HEMOGLOBIN REINUCTION |
| EP3363902B1 (en) | 2012-12-06 | 2019-11-27 | Sigma Aldrich Co. LLC | Crispr-based genome modification and regulation |
| ES2883590T3 (es) | 2012-12-12 | 2021-12-09 | Broad Inst Inc | Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas |
| WO2014099750A2 (en) | 2012-12-17 | 2014-06-26 | President And Fellows Of Harvard College | Rna-guided human genome engineering |
| EP3578666A1 (en) | 2013-03-12 | 2019-12-11 | President and Fellows of Harvard College | Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix |
| CA2905432C (en) | 2013-03-14 | 2021-09-14 | Caribou Biosciences, Inc. | Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids |
| EP3741868B1 (en) | 2013-03-15 | 2024-05-22 | The General Hospital Corporation | Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
| US10760064B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-01 | The General Hospital Corporation | RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
| CN115261411A (zh) | 2013-04-04 | 2022-11-01 | 哈佛学院校长同事会 | 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途 |
| CN116083487A (zh) | 2013-05-15 | 2023-05-09 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | 用于治疗遗传病状的方法和组合物 |
| WO2014197568A2 (en) | 2013-06-04 | 2014-12-11 | President And Fellows Of Harvard College | Rna-guideded transcriptional regulation |
| US9267135B2 (en) | 2013-06-04 | 2016-02-23 | President And Fellows Of Harvard College | RNA-guided transcriptional regulation |
| DK3011031T3 (da) | 2013-06-17 | 2020-12-21 | Broad Inst Inc | Fremføring og anvendelse af crispr-cas-systemerne, vektorer og sammensætninger til levermålretning og -terapi |
| ES2767318T3 (es) | 2013-06-17 | 2020-06-17 | Broad Inst Inc | Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para generar modelos y actuar sobre enfermedades y trastornos de células posmitóticas |
| CN105793425B (zh) | 2013-06-17 | 2021-10-26 | 布罗德研究所有限公司 | 使用病毒组分靶向障碍和疾病的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用 |
| US10011850B2 (en) | 2013-06-21 | 2018-07-03 | The General Hospital Corporation | Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing |
| EP3019595A4 (en) * | 2013-07-09 | 2016-11-30 | THERAPEUTIC USES OF A GENERIC CHANGE WITH CRISPR / CAS SYSTEMS | |
| CA2917639C (en) | 2013-07-10 | 2024-01-02 | President And Fellows Of Harvard College | Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing |
| US10563225B2 (en) | 2013-07-26 | 2020-02-18 | President And Fellows Of Harvard College | Genome engineering |
| US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
| US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
| US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| CN106459995B (zh) | 2013-11-07 | 2020-02-21 | 爱迪塔斯医药有限公司 | 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物 |
| SI3068881T1 (sl) * | 2013-11-13 | 2019-05-31 | Children's Medical Center Corporation | Z nukleazo posredovano uravnavanje izražanja genov |
| EP3760719A1 (en) * | 2013-11-18 | 2021-01-06 | CRISPR Therapeutics AG | Crispr-cas system materials and methods |
| US10787684B2 (en) | 2013-11-19 | 2020-09-29 | President And Fellows Of Harvard College | Large gene excision and insertion |
| US9074199B1 (en) | 2013-11-19 | 2015-07-07 | President And Fellows Of Harvard College | Mutant Cas9 proteins |
| KR20160089527A (ko) | 2013-12-12 | 2016-07-27 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 게놈 편집을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료적 응용 |
| JP2017501149A (ja) | 2013-12-12 | 2017-01-12 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | 粒子送達構成成分を用いた障害及び疾患の標的化のためのｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用 |
| US20150165054A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting caspase-9 point mutations |
| US9963689B2 (en) | 2013-12-31 | 2018-05-08 | The Regents Of The University Of California | Cas9 crystals and methods of use thereof |
| SG10201805815YA (en) * | 2014-01-08 | 2018-08-30 | Harvard College | Rna-guided gene drives |
| WO2015122967A1 (en) | 2014-02-13 | 2015-08-20 | Clontech Laboratories, Inc. | Methods of depleting a target molecule from an initial collection of nucleic acids, and compositions and kits for practicing the same |
| US11339437B2 (en) | 2014-03-10 | 2022-05-24 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating CEP290-associated disease |
| US11141493B2 (en) | 2014-03-10 | 2021-10-12 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating CEP290-associated disease |
| US9938521B2 (en) | 2014-03-10 | 2018-04-10 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (LCA10) |
| US20170173083A1 (en) * | 2014-03-26 | 2017-06-22 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Compositions and methods for ex vivo expansion of human hematopoietic stem/progenitor cells |
| WO2015148860A1 (en) * | 2014-03-26 | 2015-10-01 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta-thalassemia |
| WO2015148863A2 (en) * | 2014-03-26 | 2015-10-01 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease |
| EP3134130B1 (en) | 2014-04-25 | 2019-06-12 | Children's Medical Center Corporation | Compositions and methods to treating hemoglobinopathies |
| CA2956224A1 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| WO2016025759A1 (en) * | 2014-08-14 | 2016-02-18 | Shen Yuelei | Dna knock-in system |
| WO2016037163A1 (en) | 2014-09-07 | 2016-03-10 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuating gene therapy anti-viral transfer vector immune responses |
| LT3194570T (lt) * | 2014-09-16 | 2021-09-27 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Būdai ir kompozicijos, skirti kraujodaros kamieninių ląstelių genomo inžinerijai ir korekcijai, kuriai tarpininkauja nukleazė |
| CN107205353B (zh) | 2014-09-26 | 2021-03-19 | 谱赛科美国股份有限公司 | 用于甜菊的单核苷酸多态性(snp)标志物 |
| KR20240013283A (ko) | 2014-12-03 | 2024-01-30 | 애질런트 테크놀로지스, 인크. | 화학적 변형을 갖는 가이드 rna |
| WO2016094874A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems |
| WO2016094872A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Dead guides for crispr transcription factors |
| WO2016094880A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs) |
| EP3985115A1 (en) | 2014-12-12 | 2022-04-20 | The Broad Institute, Inc. | Protected guide rnas (pgrnas) |
| EP3702456A1 (en) | 2014-12-24 | 2020-09-02 | The Broad Institute, Inc. | Crispr having or associated with destabilization domains |
| US20180002379A1 (en) * | 2015-01-21 | 2018-01-04 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for identification of highly specific nucleases |
| AU2016211671B2 (en) | 2015-01-26 | 2022-05-26 | Fate Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation |
| WO2016135559A2 (en) * | 2015-02-23 | 2016-09-01 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies |
| ES2884838T3 (es) | 2015-04-06 | 2021-12-13 | Univ Leland Stanford Junior | ARN guía químicamente modificados para la regulación génica mediada por CRISPR/CAS |
| US10155938B2 (en) * | 2015-04-14 | 2018-12-18 | City Of Hope | Coexpression of CAS9 and TREX2 for targeted mutagenesis |
| WO2016178207A1 (en) * | 2015-05-04 | 2016-11-10 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Methods and kits for fragmenting dna |
| EP3294873B1 (en) * | 2015-05-08 | 2020-08-19 | The Children's Medical Center Corporation | Targeting bcl11a enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction |
| JP7030522B2 (ja) * | 2015-05-11 | 2022-03-07 | エディタス・メディシン、インコーポレイテッド | 幹細胞における遺伝子編集のための最適化ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９システムおよび方法 |
| CN108026526B (zh) | 2015-06-09 | 2023-05-12 | 爱迪塔斯医药公司 | 用于改善移植的crispr/cas相关方法和组合物 |
| CA2989831A1 (en) | 2015-06-17 | 2016-12-22 | The Uab Research Foundation | Crispr/cas9 complex for genomic editing |
| CA2989858A1 (en) | 2015-06-17 | 2016-12-22 | The Uab Research Foundation | Crispr/cas9 complex for introducing a functional polypeptide into cells of blood cell lineage |
| CA3012607A1 (en) | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Crispr enzymes and systems |
| US9926546B2 (en) | 2015-08-28 | 2018-03-27 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| US9512446B1 (en) | 2015-08-28 | 2016-12-06 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| CA2996888A1 (en) | 2015-08-28 | 2017-03-09 | The General Hospital Corporation | Engineered crispr-cas9 nucleases |
| US9897378B2 (en) | 2015-10-08 | 2018-02-20 | Nyc Designed Inspirations Llc | Cosmetic makeup sponge/blender container |
| EP4269577A3 (en) | 2015-10-23 | 2024-01-17 | President and Fellows of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| DK3368052T3 (da) * | 2015-10-27 | 2022-03-14 | Childrens Hospital Med Ct | Anvendelse af mapk-hæmmere for at nedbringe tabet af hæmatopoietiske stamceller under ex vivo-dyrkning og -genmanipulation |
| MX2018005611A (es) | 2015-11-03 | 2018-11-09 | Harvard College | Metodo y aparato para la formacion de imagenes volumetricas de una matriz tridimensional que contiene acido nucleico. |
| ES2942309T3 (es) * | 2015-11-04 | 2023-05-31 | Vertex Pharma | Materiales y métodos para el tratamiento de hemoglobinopatías |
| CA3003150A1 (en) | 2015-11-04 | 2017-05-11 | Fate Therapeutics, Inc. | Genomic engineering of pluripotent cells |
| EP3371301A4 (en) | 2015-11-04 | 2019-06-26 | Fate Therapeutics, Inc. | METHOD AND COMPOSITIONS FOR INDUCING THE DIFFERENTIATION OF HEMATOPOIETIC CELLS |
| AR107469A1 (es) | 2016-01-27 | 2018-05-02 | Oncorus Inc | Vectores virales oncolíticos y sus usos |
| US11530253B2 (en) | 2016-02-25 | 2022-12-20 | The Children's Medical Center Corporation | Customized class switch of immunoglobulin genes in lymphoma and hybridoma by CRISPR/CAS9 technology |
| KR20230070331A (ko) * | 2016-03-14 | 2023-05-22 | 에디타스 메디신, 인코포레이티드 | 베타 이상헤모글로빈증의 치료를 위한 crispr/cas-관련 방법 및 조성물 |
| EP3219799A1 (en) | 2016-03-17 | 2017-09-20 | IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH | Conditional crispr sgrna expression |
| LT3445388T (lt) * | 2016-04-18 | 2024-06-10 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Hemoglobinopatijų gydymui skirtos medžiagos ir būdai |
| JP7259182B2 (ja) | 2016-04-25 | 2023-04-18 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ｉｎ ｓｉｔｕ分子検出のためのハイブリダイゼーション連鎖反応法 |
| WO2017191503A1 (en) * | 2016-05-05 | 2017-11-09 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies |
| US10767175B2 (en) | 2016-06-08 | 2020-09-08 | Agilent Technologies, Inc. | High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs |
| CN109689865A (zh) * | 2016-07-25 | 2019-04-26 | 蓝鸟生物公司 | Bcl11a归巢核酸内切酶变体、组合物和使用方法 |
| IL264565B1 (en) | 2016-08-03 | 2024-03-01 | Harvard College | Adenosine nuclear base editors and their uses |
| US11078481B1 (en) | 2016-08-03 | 2021-08-03 | KSQ Therapeutics, Inc. | Methods for screening for cancer targets |
| EP3497214B1 (en) | 2016-08-09 | 2023-06-28 | President and Fellows of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| US11078483B1 (en) | 2016-09-02 | 2021-08-03 | KSQ Therapeutics, Inc. | Methods for measuring and improving CRISPR reagent function |
| SG11201903089RA (en) | 2016-10-14 | 2019-05-30 | Harvard College | Aav delivery of nucleobase editors |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| CA3050514A1 (en) | 2017-01-27 | 2018-08-02 | Children's Hospital Medical Center | Methods of enhancing engraftment activity of hematopoietic stem cells |
| WO2018165504A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| WO2018170184A1 (en) | 2017-03-14 | 2018-09-20 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
| EP3601562A1 (en) | 2017-03-23 | 2020-02-05 | President and Fellows of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
| BR112019021719A2 (pt) | 2017-04-21 | 2020-06-16 | The General Hospital Corporation | Variantes de cpf1 (cas12a) com especificidade para pam alterada |
| EP3615664A4 (en) * | 2017-04-24 | 2021-01-27 | Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) | HOMOLOGY-BASED REPAIR COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF HEMOGLOBINOPATHIES |
| EP3622070A2 (en) | 2017-05-10 | 2020-03-18 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/rna-guided nuclease systems and methods |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| CN111093714A (zh) | 2017-05-25 | 2020-05-01 | 通用医疗公司 | 使用分割型脱氨酶限制不需要的脱靶碱基编辑器脱氨 |
| WO2018218135A1 (en) | 2017-05-25 | 2018-11-29 | The Children's Medical Center Corporation | Bcl11a guide delivery |
| WO2018220210A1 (en) * | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Recombinant lentiviral vector for stem cell-based gene therapy of sickle cell disorder |
| EP3652312A1 (en) | 2017-07-14 | 2020-05-20 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites |
| WO2019023483A1 (en) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Oncorus, Inc. | ONCOLYTIC VIRAL VECTORS AND USES THEREOF |
| EP3658573A1 (en) | 2017-07-28 | 2020-06-03 | President and Fellows of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace) |
| WO2019139645A2 (en) | 2017-08-30 | 2019-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| US11779654B2 (en) | 2017-10-04 | 2023-10-10 | 2Seventy Bio, Inc. | PCSK9 endonuclease variants, compositions, and methods of use |
| KR20200086670A (ko) | 2017-10-13 | 2020-07-17 | 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. | 항바이러스 전달 벡터 IgM 반응을 약화시키기 위한 방법 및 조성물 |
| WO2019079347A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | The Broad Institute, Inc. | USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE |
| US20210180091A1 (en) * | 2017-10-26 | 2021-06-17 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies |
| EP3749767A1 (en) | 2018-02-05 | 2020-12-16 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies |
| US20200405642A1 (en) | 2018-02-26 | 2020-12-31 | AnTolRx, Inc. | Tolerogenic liposomes and methods of use thereof |
| US10968257B2 (en) | 2018-04-03 | 2021-04-06 | The Broad Institute, Inc. | Target recognition motifs and uses thereof |
| US11981892B2 (en) | 2018-04-16 | 2024-05-14 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for improved gene editing |
| US20200102563A1 (en) * | 2018-10-02 | 2020-04-02 | Exosome Therapeutics, Inc. | Exosome loaded therapeutics for treating sickle cell disease |
| CA3122278A1 (en) * | 2018-12-10 | 2020-06-18 | Bluebird Bio, Inc. | Homing endonuclease variants |
| US11384344B2 (en) | 2018-12-17 | 2022-07-12 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-associated transposase systems and methods of use thereof |
| EP3921417A4 (en) | 2019-02-04 | 2022-11-09 | The General Hospital Corporation | ADENINE DNA BASE EDITOR VARIANTS WITH REDUCED OFF-TARGET RNA EDITING |
| WO2020191246A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
| CN111939271A (zh) * | 2019-04-30 | 2020-11-17 | 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 | 一种血红蛋白病治疗有效性预测方法 |
| KR20220002565A (ko) * | 2019-04-30 | 2022-01-06 | 에디진 인크. | 이상헤모글로빈증 치료의 효과를 예측하는 방법 |
| KR20220015425A (ko) | 2019-05-28 | 2022-02-08 | 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. | 약화된 항바이러스 전달 벡터 면역 반응을 위한 방법 및 조성물 |
| CA3153197A1 (en) | 2019-10-03 | 2021-04-08 | Ryan T. Gill | Crispr systems with engineered dual guide nucleic acids |
| AU2020385006A1 (en) * | 2019-11-15 | 2022-06-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Targeted integration at alpha-globin locus in human hematopoietic stem and progenitor cells |
| GB2614813A (en) | 2020-05-08 | 2023-07-19 | Harvard College | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
| JP2023526007A (ja) * | 2020-05-13 | 2023-06-20 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | β－ヘモグロビン異常症の処置のための塩基編集アプローチ |
| CN116887853A (zh) * | 2020-12-21 | 2023-10-13 | 2赛文缇生物公司 | 用于定点诱变的组合物和方法 |
| EP4304633A1 (en) | 2021-03-12 | 2024-01-17 | Mendus B.V. | Methods of vaccination and use of cd47 blockade |
| WO2022256448A2 (en) | 2021-06-01 | 2022-12-08 | Artisan Development Labs, Inc. | Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes |
| US11884915B2 (en) | 2021-09-10 | 2024-01-30 | Agilent Technologies, Inc. | Guide RNAs with chemical modification for prime editing |
| US20230141563A1 (en) | 2021-10-12 | 2023-05-11 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses |
| US20230279442A1 (en) | 2021-12-15 | 2023-09-07 | Versitech Limited | Engineered cas9-nucleases and method of use thereof |
| WO2023167882A1 (en) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Artisan Development Labs, Inc. | Composition and methods for transgene insertion |
| WO2023172624A1 (en) | 2022-03-09 | 2023-09-14 | Selecta Biosciences, Inc. | Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing |
| CN114457119B (zh) * | 2022-04-11 | 2022-08-12 | 中吉智药(南京)生物技术有限公司 | 慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用 |
| EP4273242A1 (en) * | 2022-05-03 | 2023-11-08 | ETH Zurich | Crispr-based modification of human hbd gene |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101802184A (zh) * | 2007-07-23 | 2010-08-11 | 赛莱克蒂斯公司 | 切割来自人血红蛋白β基因的DNA靶序列的大范围核酸酶变体及其用途 |
| WO2011156430A2 (en) * | 2010-06-07 | 2011-12-15 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Generation and expression of engineered i-onui endonuclease and its homologues and uses thereof |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020182673A1 (en) * | 1998-05-15 | 2002-12-05 | Genentech, Inc. | IL-17 homologous polypedies and therapeutic uses thereof |
| EP2522723B1 (en) | 2003-01-28 | 2014-12-03 | Cellectis | Custom-made meganuclease and use thereof |
| WO2007049095A1 (en) | 2005-10-25 | 2007-05-03 | Cellectis | Laglidadg homing endonuclease variants having mutations in two functional subdomains and use thereof |
| WO2008010009A1 (en) | 2006-07-18 | 2008-01-24 | Cellectis | Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from a rag gene and uses thereof |
| CN101679959A (zh) | 2007-02-19 | 2010-03-24 | 赛莱克蒂斯公司 | 具有新的底物特异性的laglidadg归巢核酸内切酶变体及其用途 |
| ES2738980T3 (es) * | 2008-09-15 | 2020-01-28 | Childrens Medical Ct Corp | Modulación de BCL11A para el tratamiento de hemoglobinopatías |
| EP4062927A1 (en) * | 2011-02-28 | 2022-09-28 | Seattle Children's Research Institute | Coupling endonucleases with end-processing enzymes drives high efficiency gene disruption |
| CA2865129A1 (en) | 2012-02-24 | 2013-08-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
| RS60838B1 (sr) * | 2012-08-29 | 2020-10-30 | Sangamo Therapeutics Inc | Postupci i kompozicije za tretman genskog stanja |
-
2013
- 2013-02-22 CA CA2865129A patent/CA2865129A1/en not_active Abandoned
- 2013-02-22 JP JP2014558896A patent/JP6170080B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-02-22 EP EP13751886.6A patent/EP2836226B1/en active Active
- 2013-02-22 WO PCT/US2013/027459 patent/WO2013126794A1/en active Application Filing
- 2013-02-22 IN IN7853DEN2014 patent/IN2014DN07853A/en unknown
- 2013-02-22 RU RU2014138491A patent/RU2650811C2/ru active
- 2013-02-22 CN CN201380017193.5A patent/CN104284669A/zh active Pending
- 2013-02-22 SG SG10201606959PA patent/SG10201606959PA/en unknown
- 2013-02-22 NZ NZ630900A patent/NZ630900A/en not_active IP Right Cessation
- 2013-02-22 US US14/380,935 patent/US20150166969A1/en not_active Abandoned
- 2013-02-22 BR BR112014020625A patent/BR112014020625A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-02-22 RU RU2018109507A patent/RU2018109507A/ru not_active Application Discontinuation
- 2013-02-22 AU AU2013222170A patent/AU2013222170B2/en not_active Ceased
- 2013-02-22 KR KR1020187001150A patent/KR20180009383A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-02-22 ES ES13751886.6T patent/ES2641840T3/es active Active
- 2013-02-22 KR KR1020147026713A patent/KR101833589B1/ko active IP Right Grant
- 2013-02-22 EP EP17178186.7A patent/EP3272356A1/en not_active Withdrawn
- 2013-02-22 DK DK13751886.6T patent/DK2836226T3/en active
- 2013-02-22 SG SG11201405103SA patent/SG11201405103SA/en unknown
-
2014
- 2014-08-21 IL IL234225A patent/IL234225B/en active IP Right Grant
- 2014-08-22 ZA ZA2014/06187A patent/ZA201406187B/en unknown
-
2017
- 2017-02-23 AU AU2017201235A patent/AU2017201235C1/en not_active Ceased
- 2017-03-16 US US15/461,091 patent/US10619140B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2017-04-06 JP JP2017075766A patent/JP2017148056A/ja active Pending
-
2018
- 2018-07-19 HK HK18109352.3A patent/HK1249861A1/zh unknown
-
2019
- 2019-05-13 IL IL266582A patent/IL266582A/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101802184A (zh) * | 2007-07-23 | 2010-08-11 | 赛莱克蒂斯公司 | 切割来自人血红蛋白β基因的DNA靶序列的大范围核酸酶变体及其用途 |
| WO2011156430A2 (en) * | 2010-06-07 | 2011-12-15 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Generation and expression of engineered i-onui endonuclease and its homologues and uses thereof |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JACOBY,K: "《Expanding LAGLIDADG endonuclease scaffold diversity by rapidly surveying evolutionary sequence space》", 《NUCLEIC ACID RESEARCH》 * |
| SANKARAN VG, ET AL.: "《Transcriptional silencing of fetal hemoglobin by Bcl11a》", 《ANN.N.Y.ACAD.SCI》 * |
| SUN,N: "《Optimized TAL effector nucleases (TALENs) for use in treatment of sickle cell disease》", 《MOL .BIO SYST》 * |
| 波莱纳: "《工业酶——结构、功能与应用》", 28 February 2010, 科学出版社 * |
Cited By (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107532168A (zh) * | 2015-02-23 | 2018-01-02 | 克里斯珀医疗股份公司 | 治疗血红蛋白病的材料和方法 |
| CN104805118A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-07-29 | 扬州大学 | 一种苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因进行靶向敲除方法 |
| CN108779462A (zh) * | 2015-12-28 | 2018-11-09 | 诺华股份有限公司 | 用于治疗血红蛋白病的组合物和方法 |
| CN106244555A (zh) * | 2016-08-23 | 2016-12-21 | 广州医科大学附属第三医院 | 一种提高基因打靶的效率的方法及β‑球蛋白基因位点的碱基原位修复方法 |
| CN109923211A (zh) * | 2016-09-08 | 2019-06-21 | 蓝鸟生物公司 | Pd-1归巢核酸内切酶变体、组合物及使用方法 |
| CN110546262A (zh) * | 2017-02-06 | 2019-12-06 | 诺华股份有限公司 | 用于治疗血红蛋白病的组合物和方法 |
| CN111278976A (zh) * | 2017-10-27 | 2020-06-12 | 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 | 一种提高胎儿血红蛋白表达的方法 |
| CN109735497A (zh) * | 2017-10-27 | 2019-05-10 | 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 | 一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法 |
| CN111278977A (zh) * | 2017-10-27 | 2020-06-12 | 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 | 一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法 |
| CN114921415A (zh) * | 2017-10-27 | 2022-08-19 | 广州辑因医疗科技有限公司 | 一种提高胎儿血红蛋白表达的方法 |
| CN114875026A (zh) * | 2017-10-27 | 2022-08-09 | 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 | 一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法 |
| CN109735497B (zh) * | 2017-10-27 | 2021-11-02 | 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 | 一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法 |
| CN111278977B (zh) * | 2017-10-27 | 2022-03-22 | 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 | 一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法 |
| CN111629747A (zh) * | 2017-12-05 | 2020-09-04 | 沃泰克斯药物股份有限公司 | Crispr-cas9修饰的cd34+人血色素干细胞和祖细胞及其用途 |
| US11268077B2 (en) | 2018-02-05 | 2022-03-08 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies |
| CN112469823A (zh) * | 2018-04-27 | 2021-03-09 | 西雅图儿童医院d/b/a西雅图儿童研究所 | 布鲁顿氏酪氨酸激酶的基于talen和基于crispr/cas的基因编辑 |
| CN114096666A (zh) * | 2019-02-13 | 2022-02-25 | 比姆医疗股份有限公司 | 治疗血红素病变的组合物和方法 |
| CN110042124A (zh) * | 2019-04-25 | 2019-07-23 | 国家卫生健康委科学技术研究所 | 基因组碱基编辑增加人红细胞中胎儿血红蛋白水平的试剂盒及应用 |
| CN114072518A (zh) * | 2019-06-28 | 2022-02-18 | Asc治疗公司 | 用于治疗地中海贫血或镰状细胞病的方法和组合物 |
| CN114072518B (zh) * | 2019-06-28 | 2024-06-21 | Asc治疗公司 | 用于治疗地中海贫血或镰状细胞病的方法和组合物 |
| CN112979823B (zh) * | 2019-12-18 | 2022-04-08 | 华东师范大学 | 一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品及融合蛋白 |
| CN112979823A (zh) * | 2019-12-18 | 2021-06-18 | 华东师范大学 | 一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品及融合蛋白 |
| CN113481184A (zh) * | 2021-08-06 | 2021-10-08 | 北京大学 | 融合蛋白以及其使用方法 |
| US12016908B2 (en) | 2022-07-26 | 2024-06-25 | Beam Therapeutics Inc. | Compositions and methods for treating hemoglobinopathies |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104284669A (zh) | 治疗血红蛋白病的组合物和方法 | |
| KR102532663B1 (ko) | 베타 이상헤모글로빈증의 치료를 위한 crispr/cas-관련 방법 및 조성물 | |
| Li et al. | In vivo HSPC gene therapy with base editors allows for efficient reactivation of fetal γ-globin in β-YAC mice | |
| US11713459B2 (en) | Expression of FOXP3 in edited CD34+ cells | |
| CN104704110A (zh) | 用于治疗遗传性病状的方法和组合物 | |
| CN104955943A (zh) | 用于胎儿血红蛋白再诱导的靶向bcl11a远端调控元件 | |
| US20200392533A1 (en) | In vivo gene editing of blood progenitors | |
| US11492614B2 (en) | Stem loop RNA mediated transport of mitochondria genome editing molecules (endonucleases) into the mitochondria | |
| Fang et al. | Treatment of β654‐thalassaemia by TALEN s in a mouse model | |
| AU2019234922A1 (en) | Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies | |
| CN116179580A (zh) | 用于增强pklr的基因表达的组合物和方法 | |
| US20220228142A1 (en) | Compositions and methods for editing beta-globin for treatment of hemaglobinopathies | |
| EP3929294A1 (en) | Pyruvate kinase deficiency (pkd) gene editing treatment method | |
| Cournoyer et al. | Gene therapy: a new approach for the treatment of genetic disorders | |
| CN114072518B (zh) | 用于治疗地中海贫血或镰状细胞病的方法和组合物 | |
| Mondal et al. | Advances in animal genomics | |
| Haisma | Assessment of preclinical gene therapy studies worldwide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150114 |