CN114457119B - 慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了慢病毒载体在制备治疗β‑地中海贫血药物中的应用，所述慢病毒载体由pCCL‑SIN‑cPPT‑MCS‑RbPA骨架、A调控序列、B启动子序列、C增强子序列和D基因序列构成。本发明慢病毒可增强基因的特异性表达，降低载体大小从而提高病毒包装效率，降低病毒载体对受试细胞潜在致癌风险，将慢病毒载体感染β‑地中海贫血患者造血干细胞（CD34+细胞），用高效液相色谱定量含有第87位氨基酸突变的外源β珠蛋白（HbβA‑T87Q）表达水平，可与内源基因表达的或输血来源的野生型β‑珠蛋白区分开，观察到HbβA‑T87Q高表达。

Description

慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用。
背景技术
β-地中海贫血是世界上最常见的单基因常染色体隐性遗传性疾病之一，其主要是由于β珠蛋白基因或其调控序列缺陷导致β-珠蛋白链合成减少或障碍，进而致使α/β-珠蛋白比例失调无法产生足够的血红蛋白所引起。β-地中海贫血的临床表现与α/β-珠蛋白链失衡的程度密切相关。大多数β0/β0基因型患者和部分βE/β0基因型患者几乎不产生β链，常常表现为输血依赖型β-地中海贫血，临床症状尤为严重，每年需要>100 mL/kg的浓缩RBC(红细胞)或进行≥8次输血。中、重度β-地中海贫血在婴幼儿期就表现为严重的低红色素小细胞性贫血，总Hb（血红蛋白）≤7g/dL。
规范性长期输血和去铁治疗是目前临床缓解中、重度地中海贫血症状的常规方案。但是年均治疗费用10万元以上，而且长期大量输血会加重患者铁离子沉积，最终因铁超载导致器官衰竭而死亡。HLA 相合的骨髓移植、脐带血移植是目前临床能根治输血依赖β地贫的唯一方法，年均医疗费用40万元左右。由于合适供者来源受限及费用昂贵，大部分患者难以得到及时的救治。并且异体骨髓移植存在一些重大风险，如移植过程中的感染、移植失败和移植物抗宿主病（GvHD）等，其中一些甚至是致命的。因此，基于基因治疗的自体CD34+细胞移植目前正成为“一站式”治愈β-地中海贫血的新希望，其最大的优势在于不需要骨髓捐赠和异体移植，而且一次治疗可永久性“治愈”，可取代异体骨髓移植的治疗方案。
针对β-地中海贫血的基因治疗策略大致分作两个方面：基因替代和基因矫正。前者通过整合或染色体外分子的形式用正常基因替代内源功能缺陷基因；后者通过基因打靶或基因编辑手段完全修复突变基因为野生型。β-地中海贫血基因治疗多采用慢病毒载体介导的CD34+细胞的β-珠蛋白基因替代策略，2019年在欧洲获批上市的蓝鸟生物基因治疗药物LentiGlobin便是基于该策略，通过对患者自体CD34+细胞补充正常β-珠蛋白，避免了因异体骨髓移植引起移植物抗宿主病和后续免疫抑制导致严重机会性感染的风险，同时达到使患者脱离输血依赖的治疗效果。但是，LentiGlobin病毒载体采用β-珠蛋白全基因序列反向插入的常规构建策略，载体结构臃肿庞大（>10kb），存在产毒滴度低、生产成本高等一系列限制规模化生产的问题，以及潜在的致肿瘤风险，同时β-珠蛋白体内表达水平中等，仅适用于部分β-地中海贫血和镰状细胞贫血患者，无法满足国内及国际市场需求。
发明内容
解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用，能有效解决上述LentiGlobin病毒载体结构臃肿庞大、产毒滴度低、生产成本高、β-珠蛋白表达水平欠佳等不足之处。
技术方案：慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用，所述慢病毒载体由pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架、A调控序列、B启动子序列、C增强子序列和D基因序列构成，所述A调控序列为2.7kb β-LCR或3.6kb β-LCR或4.6kb β-LCR，其中β-LCR为β-globinlocus control region的简写；所述B启动子序列为AHSP启动子序列或β-globin启动子序列；所述C增强子序列为chimeric intron增强子序列或β-globin intron增强子序列；所述D基因序列为编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列，删除其内含子且在密码子87处编码包含突变T87Q。
优选的，所述pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架的序列如SEQ ID No:1所示。
优选的，2.7kb β-LCR调控序列如SEQ ID No:2所示，3.6kb β-LCR调控序列如SEQID No:3所示，4.6kb β-LCR调控序列如SEQ ID No:4所示。
优选的，所述AHSP启动子序列如SEQ ID No:5所示，β-globin启动子序列如SEQ IDNo:6所示。
优选的，chimeric intron增强子序列如SEQ ID No:7所示，β-globin intron增强子序列如SEQ ID No:8所示。
优选的，编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列如SEQ ID No:9所示。
有益效果：本发明慢病毒载体包含红系特异人启动子和β-珠蛋白基因调控序列（β-LCR），增强基因的特异性表达；删除了β-珠蛋白基因的内含子序列，降低了载体大小从而显著提高了病毒包装效率；进行了基因编码区密码子优化，并加入了增强子元件以提高珠蛋白基因表达效率；利用质粒转染HEK293T细胞产慢病毒工艺，提升病毒产量，降低病毒载体对受试细胞潜在致癌风险；将慢病毒载体感染β-地中海贫血患者造血干细胞（CD34+细胞），用高效液相色谱定量含有第87位氨基酸突变的外源β珠蛋白（HbβA-T87Q）表达水平，可与内源基因表达的或输血来源的野生型β-珠蛋白区分开，观察到HbβA-T87Q高表达。
附图说明
图1是本发明慢病毒载体示意图；
图2是本发明实施例1空白对照红细胞的反相高效液相色谱检测结果图；
图3是被本发明实施例1慢病毒载体感染造血干细胞体外红系分化后反相高效液相色谱检测结果图；
图4是本发明实施例2空白对照红细胞的反相高效液相色谱检测结果图；
图5是被本发明实施例2慢病毒载体感染造血干细胞体外红系分化后反相高效液相色谱检测结果图；
图6是本发明实施例3空白对照红细胞的反相高效液相色谱检测结果图；
图7是被本发明实施例3慢病毒载体感染造血干细胞体外红系分化后反相高效液相色谱检测结果图;
图8是本发明实施例4空白对照红细胞的反相高效液相色谱检测结果图；
图9是被本发明实施例4慢病毒载体感染造血干细胞体外红系分化后反相高效液相色谱检测结果图;
图10是本发明实施例5空白对照红细胞的反相高效液相色谱检测结果图；
图11是被本发明实施例5慢病毒载体感染造血干细胞体外红系分化后反相高效液相色谱检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明，
主要仪器：
台式离心机（Eppendorf 5424R）、恒温水浴锅（上海知信 ZX-S24）、恒温摇床（上海智诚分析ZXY-240）、凝胶成像系统（天能 Tanon-1600）恒温细菌培养箱（上海博讯 BPX-162）、生物安全柜(海尔 HR40-IIA2)、二氧化碳培养箱（Thermo 150i）、荧光显微镜（ZEISSAX10）、AKTA-avant150(Cytiva 28976337)、AKTA-Fluxs（Cytiva 29038437）、液相HPLC（岛津 SPD-40V）；
主要材料和试剂：
内切酶XhoI（Thermo FD0694）、内切酶MluI（Thermo FD0564）、内切酶KpnI（ThermoFD0524）、琼脂糖DNA凝胶回收与纯化试剂盒（Axygen AP-GX-50）、PCR试剂盒（TOYOBO KMM-201）、T4 DNA连接酶（Thermo EL0014）、卡那霉素（Sigma K1377）、DH5α（Takara 9057）、ViraPower™ Lentiviral Packaging Mix（invitrogen K497500）UFP-750-E-3X2MA(Cytiva 56-4101-55)、UFP-750-E-2U（Cytiva 11-0005-50）、Capto-Core700（Cytiva17548102）、Capto-Q impres(Cytiva 17547010)、DMEM培养基（Gibco 11995065）、opti-MEM培养基(Gibco 11058021)、DPBS(Gibco 14190144)、胰酶（Gibco 25200072）、IMDM培养基(Gibco 12440053)、FBS（Gibco 10100147）、TFA(Thermo 85183)、乙腈(Fisher ChemicalA995-4)，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购。
实施例1
1. 慢病毒载体pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA的构建，包括载体pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA（SEQ ID No:1），2.7kb β-LCR（LCR2.7K）调控序列（SEQ ID No:2），β-globin启动子（pHBB）序列（SEQ ID No:6），chimeric intron（CI）增强子序列（SEQ IDNo:7）和编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列（SEQ ID No:9），且在密码子87处编码包含突变T87Q，即由苏氨酸突变为谷氨酰胺。
1.1 以本公司载体质粒pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA（SEQ ID No:1）作为制备慢病毒载体的载体，将其用限制性内切酶XhoI和MluI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收得到pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架片段；
将LCR2.7K调控序列（SEQ ID No:2）进行PCR扩增，且5’端加上保护碱基和XhoI酶切位点，3’端加上保护碱基和MluI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用XhoI和MluI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收2.7kb β-LCR（LCR2.7K）片段，所用PCR引物为LCR2.7K-1（SEQ ID No:10）和LCR2.7K-2（SEQ ID No:11）。
SEQ ID No:10：
ccgctcgaggcctcaagatgataacttttattttc
SEQ ID No:11：
cgacgcgtatatgtcacattctgtctcaggcatc
1.2 将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA载体片段和LCR2.7K片段，采用T4 DNA连接酶，室温反应10-20min。
1.3将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.4 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA质粒，进行XhoI和MluI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA质粒。
1.5将pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA质粒用限制性内切酶MluI和EcoRI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA载体片段；
将β-globin启动子（pHBB）序列（SEQ ID No:6）和chimeric intron（CI） 增强子序列（SEQ ID No:7）进行PCR扩增，其中pHBB序列片段的3’端和chimeric intron增强子序列片段的5’端有25bp的同源序列，琼脂糖电泳后切胶回收pHBB序列片段和chimeric intron增强子序列片段，随后将胶回收试剂盒回收的pHBB序列片段和chimeric intron增强子序列片段进行overlap PCR，5’端加上保护碱基和MluI酶切位点，3’端加上保护碱基和EcoRI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用MluI和EcoRI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pHBB-CI片段，所用PCR引物为P1-β-promoter（SEQ ID No:12）和P2-chimeric-intron（SEQ ID No:13）。
SEQ ID No:12：
cgacgcgttacgtaaatacacttgcaaaggagg
SEQ ID No:13：
ggaattctttgccaaaatgatgagacagcacaac
1.6将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA载体片段和pHBB-CI片段，采用T4DNA连接酶连接，室温反应10-20min。
1.7将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.8 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pHBB-CI-RbPA质粒，进行MluI和EcoRI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pHBB-CI-RbPA质粒。
1.9 将pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pHBB-CI-RbPA载体质粒用限制性内切酶EcoRI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pHBB-CI-RbPA载体片段；
将编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列（SEQ ID No:9）进行PCR扩增，5’端加上保护碱基和EcoRI酶切位点，3’端加上保护碱基和KpnI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用EcoRI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收βA-T87Q基因片段，所用PCR引物为β-up（SEQ ID No:14）和β-down（SEQ ID No:15）。
SEQ ID No:14：
ggaattcgccaccatggtgcatttaacccccgaggaga
SEQ ID No:15：
ggggtacctcagtggtacttgtgggctaaagc
1.10将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pHBB-CI-RbPA载体片段和βA-T87Q基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min。
1.11 将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.12 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取质粒pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA，进行EcoRI和KpnI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA质粒构建成功。
2. 慢病毒的生产和纯化
2.1 将成功构建的pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA质粒与慢病毒包装试剂盒质粒Mix按照1：3的比例共转染前一天接种于10层细胞工厂的HEK293T细胞，转染后6小时更换新鲜DMEM培养基，72小时后收取上清液用于层析纯化；
2.2 纯化采用切向流过滤-层析系统，利用core700层析，Q ImpRes层析纯化工艺，纯化得慢病毒，具体纯化过程如下：
①Benzonase treatment（核酸酶消化）：用25U/mL的Benzonase于37℃处理1小时，去除转染过程残留的质粒DNA和裂解细胞释放的基因组等污染物；
② MF(澄清):病毒收获液经过滤（0.45μm）的处理，以除去HEK293T细胞及碎片等不溶性微粒，提高溶液的澄清度，以便后续的层析纯化处理；
③UF/DF（浓缩洗滤）：澄清消化后样品采用截留分子量750kDa的UFP-750-E-3X2MA中空纤维进行浓缩洗滤，小分子杂质可以有效去除，从而达到了提纯的目的；
④SEC（分子排阻层析）： UF/DF后的样品通过平衡过后的Capto Core700填料进行进一步纯化，将大于700kDa的病毒等颗粒经外水体积排出收集，分子量更小的杂质进入填料孔内吸附其中；
⑤IEX（阴离子交换层析）：分子排阻层析后的样品通过Capto Q impres填料进行精纯，将病毒样品上样至平衡后的Capto Q impres填料中，此时杂质不会被填料吸附而排出，随后通过1M NaCl步级梯度将病毒洗脱；
⑥Preparation（制剂）：将IEX后的病毒液通过截留分子量750kDa UFP-750-E-2U的中空纤维进行浓缩换盐，将病毒置换在含有2%HSA的PBS中；
Figure 291901DEST_PATH_IMAGE001
Storage（保存）：将病毒采用0.2μm膜过滤，分装，于-80℃保存。
3. 以体外诱导β0/β0地中海贫血受试者骨髓造血干细胞（CD34+细胞）红系分化为模型验证慢病毒递送β-珠蛋白系统有效性
利用步骤2.2获得的慢病毒（上述第2部分制备和纯化的慢病毒）感染β0/β0地中海贫血受试者骨髓造血干细胞（CD34+细胞），进行红系分化，体外诱导培养21天，检测其中HbβA-T87Q的表达情况，实验方法如下：
3.1 复苏细胞
①将冻存于液氮的β0/β0骨髓CD34+干细胞置于42℃水浴快速复融；
②酒精消毒冻存管，吸取冻存细胞至15mL离心管，3mL 预热DPBS清洗冻存管，洗涤液合并入离心管；
③室温400g离心10min收集细胞，弃上清，1mL 预热HSC1培养基（含IMDM培养基、FBS、Plasma、Insulin、Heparin、Transferrin、EPO、SCF、IL3）重悬细胞；
④取20μl细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数；
⑤根据细胞数量将细胞铺种于合适的细胞培养板中，记做第0天（D0）。
3.2 β0/β0骨髓干细胞体外分化
Figure 932092DEST_PATH_IMAGE002
D1（第1天）取2.0×105 骨髓造血干细胞（CD34+细胞），置于无血清无血浆的 HSC1培养基中，慢病毒感染1天（下称药物处理组）。同时，另取 2.0×105 骨髓造血干细胞 （CD34+细胞）不进行慢病毒感染，后续操作同药物处理组一致，作为空白阴性对照(Blank)；
Figure 607924DEST_PATH_IMAGE003
D2（第2天）更换新鲜HSC1培养基进行培养6天；
Figure 190215DEST_PATH_IMAGE004
D8 （第8天）更换HSC2培养基（含IMDM培养基、FBS、Plasma、Insulin、Heparin、 Transferrin、EPO、SCF）培养3天；
Figure 584288DEST_PATH_IMAGE005
D11（第11天）更换HSC3培养基（含IMDM培养基、FBS、Plasma、Insulin、Heparin、 Transferrin、EPO）继续诱导培养4天；
Figure 526705DEST_PATH_IMAGE006
D15（第15天）更换HSC4培养基（含IMDM培养基、FBS、Plasma、Insulin、Heparin、 Transferrin）培养6天至红细胞分化成熟；
Figure 57043DEST_PATH_IMAGE007
D21（第21天）收取细胞，反向高效液相色谱（RP-HPLC）定量HbβA-T87Q的表达，以正 常红细胞为阳性对照。
4．RP-HPLC定量HbβA-T87Q的表达
利用RP-HPLC可定量HbβA-T87Q的表达，且能与内源基因表达的野生型β-珠蛋白区分，实验方法如下：
4.1 样品处理
①取2.0×106细胞，300g离心10min，弃上清；
②加60μL水重悬，-80℃冷冻10min，37℃快速融化，振荡混匀；
③如此反复冻融三次以充分裂解细胞；
④9000g，4℃离心10min，收取上清进行检测。
4.2 缓冲液配制
① Buffer A：含1.2%TFA的水溶液，pH3.0；
② Buffer B：含0.08%TFA的乙腈溶液。
4.3检测程序见下表1：
Figure 606973DEST_PATH_IMAGE008
RP-HPLC结果分析如图2和图3所示，峰下面积结果如下表2。
表2：RP-HPLC检测各样品峰下面积结果
Figure 488342DEST_PATH_IMAGE009
由表2可知：经慢病毒pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA感染的β0/β0受试者骨髓CD34+细胞体外红系分化，空白对照组（Blank）没有βA-T87Q珠蛋白的表达，而药物处理组的βA-T87Q珠蛋白与α-珠蛋白的比值为63%，见表2中βA-T87Q/α；空白对照组（Blank）和药物处理组的β-like珠蛋白（β珠蛋白、βA-T87Q -珠蛋白与δ珠蛋白）与α-珠蛋白表达量（HPLC峰下面积）比值分别为50%和93%，见表2中(β+βA-T87Q+δ)/ α；可见慢病毒载体基因药物可以在β0/β0骨髓CD34+中表达，起到补充患者β-珠蛋白的作用。
本实施例结果证明：本发明制备的携带pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA的慢病毒感染CD34+ 造血干细胞后红系分化，可实现β珠蛋白的高表达，此项目技术有望达到改善及治愈患者β-地中海贫血的效果；所制得的慢病毒及经基因修饰后的造血干细胞可作为β-地中海贫血的基因治疗药物。
实施例2
1. 慢病毒载体pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA的构建，包括载体pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA（SEQ ID No:1），3.6kb β-LCR（LCR3.6K）调控序列（SEQ ID No:3），β-globin启动子（pHBB）序列（SEQ ID No:6），chimeric intron（CI）增强子序列（SEQ IDNo:7）和编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列（SEQ ID No:9），且在密码子87处编码包含突变T87Q，即由苏氨酸突变为谷氨酰胺。
1.1 以本公司载体质粒pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA（SEQ ID No:1）作为制备慢病毒载体的载体，将其用限制性内切酶XhoI和MluI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收得到pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架片段；
将LCR3.6K调控序列（SEQ ID No:3）进行PCR扩增，且5’端加上保护碱基和XhoI酶切位点，3’端加上保护碱基和MluI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用XhoI和MluI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收3.6kb β-LCR（LCR3.6K）片段，所用PCR引物为LCR3.6K-1（SEQ ID No:16）和LCR3.6K-2（SEQ ID No:17）。
SEQ ID No:16：ccgctcgagggatcccttgagctcaggaggtcaaggctg
SEQ ID No:17：cgacgcgtctgccgcttctaggtatagaggccacctg
1.2 将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA载体片段和LCR3.6K片段，采用T4 DNA连接酶，室温反应10-20min。
1.3将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.4 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-RbPA质粒，进行XhoI和MluI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-RbPA质粒。
1.5将pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-RbPA质粒用限制性内切酶MluI和EcoRI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-RbPA载体片段；
将β-globin启动子（pHBB）序列（SEQ ID No:6）和chimeric intron （CI）增强子序列（SEQ ID No:7）进行PCR扩增，其中pHBB序列片段的3’端和chimeric intron增强子序列片段的5’端有25bp的同源序列，琼脂糖电泳后切胶回收pHBB序列片段和chimeric intron增强子序列片段，随后将胶回收试剂盒回收的pHBB序列片段和chimeric intron增强子序列片段进行overlap PCR，5’端加上保护碱基和MluI酶切位点，3’端加上保护碱基和EcoRI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用MluI和EcoRI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pHBB-CI片段，所用PCR引物为P1-β-promoter（SEQ ID No:12）和P2-chimeric-intron（SEQ ID No:13）。
1.6将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-RbPA载体片段和pHBB-CI片段，采用T4DNA连接酶连接，室温反应10-20min。
1.7将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.8 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-pHBB-CI-RbPA质粒，进行MluI和EcoRI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-pHBB-CI-RbPA质粒。
1.9 将pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-pHBB-CI-RbPA载体质粒用限制性内切酶EcoRI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-pHBB-CI-RbPA载体片段；
将编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列（SEQ ID No:9）进行PCR扩增，5’端加上保护碱基和EcoRI酶切位点，3’端加上保护碱基和KpnI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用EcoRI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收βA-T87Q基因片段，所用PCR引物为β-up（SEQ ID No:14）和β-down（SEQ ID No:15）。
1.10将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-pHBB-CI-RbPA载体片段和βA-T87Q基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min。
1.11 将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.12 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取质粒pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA，进行EcoRI和KpnI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA质粒构建成功。
2. 慢病毒的生产和纯化
包含pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA质粒的慢病毒的生产和纯化的操作过程与实施例1中相应部分操作相同。
3. 以体外诱导β0/β0地中海贫血受试者骨髓造血干细胞（CD34+细胞）红系分化为模型验证慢病毒递送β-珠蛋白系统有效性
利用慢病毒（上述第2部分制备和纯化的慢病毒）感染β0/β0地中海贫血受试者骨髓造血干细胞（CD34+细胞），进行红系分化，体外诱导培养21天，检测其中HbβA-T87Q的表达情况，实验方法同实施例1相应部分的操作。
4．RP-HPLC定量HbβA-T87Q的表达
利用RP-HPLC可定量HbβA-T87Q的表达，且能与内源基因表达的野生型β-珠蛋白区分，实验方法同实施例1相应部分的操作。
RP-HPLC结果分析如图4和图5所示，峰下面积结果如下表3。
表3：RP-HPLC检测各样品峰下面积结果
Figure 985182DEST_PATH_IMAGE010
由表3可知：经慢病毒pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA感染的β0/β0受试者骨髓CD34+细胞体外红系分化， 空白对照组（Blank）没有βA-T87Q珠蛋白的表达，而药物处理组的βA-T87Q珠蛋白与α-珠蛋白的比值为67%，见表3中βA-T87Q/α；空白对照组（Blank）和药物处理组的β-like珠蛋白（β珠蛋白、βA-T87Q -珠蛋白与δ珠蛋白）与α-珠蛋白表达量（HPLC峰下面积）比值分别为44%和97%，见表3中(β+βA-T87Q+δ)/ α；可见慢病毒载体基因药物可以在β0/β0骨髓CD34+中表达，起到补充患者β-珠蛋白的作用。
本实施例结果证明：本发明制备的携带pCCL-SIN-cPPT-LCR3.6K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA的慢病毒感染CD34+ 造血干细胞后红系分化，可实现β珠蛋白的高表达，此项目技术有望达到改善及治愈患者β-地中海贫血的效果；所制得的慢病毒及经基因修饰后的造血干细胞可作为β-地中海贫血的基因治疗药物。
实施例3
1. 慢病毒载体pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA的构建，包括载体pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA（SEQ ID No:1），4.6kb β-LCR（LCR4.6K）调控序列（SEQ ID No:4），β-globin启动子（pHBB）序列（SEQ ID No:6），chimeric intron（CI）增强子序列（SEQ IDNo:7）和编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列（SEQ ID No:9），且在密码子87处编码包含突变T87Q，即由苏氨酸突变为谷氨酰胺。
1.1 以本公司载体质粒pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA（SEQ ID No:1）作为制备慢病毒载体的载体，将其用限制性内切酶XhoI和MluI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收得到pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架片段；
将LCR4.6K调控序列（SEQ ID No:4）进行PCR扩增，且5’端加上保护碱基和XhoI酶切位点，3’端加上保护碱基和MluI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用XhoI和MluI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收4.6kb β-LCR（LCR4.6K）片段，所用PCR引物为LCR3.6K-1（SEQ ID No:16）和LCR4.6K-2（SEQ ID No:18）。
SEQ ID No:18：cgacgcgtccccgtatgtgagcatgtgtcctc
1.2 将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA载体片段和LCR4.6K片段，采用T4 DNA连接酶，室温反应10-20min。
1.3将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.4 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-RbPA质粒，进行XhoI和MluI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-RbPA质粒。
1.5将pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-RbPA质粒用限制性内切酶MluI和EcoRI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-RbPA载体片段；
将β-globin启动子（pHBB）序列（SEQ ID No:6）和chimeric intron （CI）增强子序列（SEQ ID No:7）进行PCR扩增，其中pHBB序列片段的3’端和chimeric intron增强子序列片段的5’端有25bp的同源序列，琼脂糖电泳后切胶回收pHBB序列片段和chimeric intron增强子序列片段，随后将胶回收试剂盒回收的pHBB序列片段和chimeric intron增强子序列片段进行overlap PCR，5’端加上保护碱基和MluI酶切位点，3’端加上保护碱基和EcoRI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用MluI和EcoRI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pHBB-CI片段，所用PCR引物为P1-β-promoter（SEQ ID No:12）和P2-chimeric-intron（SEQ ID No:13）。
1.6将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-RbPA载体片段和pHBB-CI片段，采用T4DNA连接酶连接，室温反应10-20min。
1.7将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.8 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-pHBB-CI-RbPA质粒，进行MluI和EcoRI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-pHBB-CI-RbPA质粒。
1.9 将pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-pHBB-CI-RbPA载体质粒用限制性内切酶EcoRI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-pHBB-CI-RbPA载体片段；
将编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列（SEQ ID No:9）进行PCR扩增，5’端加上保护碱基和EcoRI酶切位点，3’端加上保护碱基和KpnI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用EcoRI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收βA-T87Q基因片段，所用PCR引物为β-up（SEQ ID No:14）和β-down（SEQ ID No:15）。
1.10将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-pHBB-CI-RbPA载体片段和βA-T87Q基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min。
1.11 将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.12 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取质粒pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA，进行EcoRI和KpnI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA质粒构建成功。
2. 慢病毒的生产和纯化
包含pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA质粒的慢病毒的生产和纯化的操作过程与实施例1中相应部分操作相同。
3. 以体外诱导β0/β0地中海贫血受试者骨髓造血干细胞（CD34+细胞）向红细胞分化体系为模型验证慢病毒递送β-珠蛋白系统有效性
利用慢病毒（上述第2部分制备和纯化的慢病毒）感染β0/β0地中海贫血受试者骨髓造血干细胞（CD34+细胞），进行红系分化，体外诱导培养21天，检测其中HbβA-T87Q的表达情况，实验方法同实施例1相应部分的操作。
4．RP-HPLC定量HbβA-T87Q的表达
利用RP-HPLC可定量HbβA-T87Q的表达，且能与内源基因表达的野生型β-珠蛋白区分，实验方法同实施例1相应部分的操作。
RP-HPLC结果分析如图6和图7所示，峰下面积结果如下表4。
表4：RP-HPLC检测各样品峰下面积结果
Figure 383409DEST_PATH_IMAGE011
由表4可知：经慢病毒pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA感染的β0/β0受试者骨髓CD34+细胞体外红系分化， 空白对照组（Blank）没有βA-T87Q珠蛋白的表达，而药物处理组的βA-T87Q珠蛋白与α-珠蛋白的比值为71%，见表4中βA-T87Q/α；空白对照组（Blank）和药物处理组的β-like珠蛋白（β珠蛋白、βA-T87Q -珠蛋白与δ珠蛋白）与α-珠蛋白表达量（HPLC峰下面积）比值分别为44%和91%，见表4中(β+βA-T87Q+δ)/ α；可见慢病毒载体基因药物可以在β0/β0骨髓CD34+中表达，起到补充患者β-珠蛋白的作用。
本实施例结果证明：本发明制备的携带pCCL-SIN-cPPT-LCR4.6K-pHBB-CI-βA-T87Q-RbPA的慢病毒感染CD34+ 造血干细胞后红系分化，可实现β珠蛋白的高表达，此项目技术有望达到改善及治愈患者β-地中海贫血的效果；所制得的慢病毒及经基因修饰后的造血干细胞可作为β-地中海贫血的基因治疗药物。
实施例4
1. 慢病毒载体pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-CI-βA-T87Q-RbPA的构建，包括载体pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA（SEQ ID No:1），2.7kb β-LCR（LCR2.7K）调控序列（SEQ ID No:2），AHSP 启动子（pAHSP）序列（SEQ ID No:5），chimeric intron（CI）增强子序列（SEQ IDNo:7）和编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列（SEQ ID No:9），且在密码子87处编码包含突变T87Q，即由苏氨酸突变为谷氨酰胺。
1.1 以本公司载体质粒pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA（SEQ ID No:1）作为制备慢病毒载体的载体，将其用限制性内切酶XhoI和MluI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收得到pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架片段；
将LCR2.7K调控序列（SEQ ID No:2）进行PCR扩增，且5’端加上保护碱基和XhoI酶切位点，3’端加上保护碱基和MluI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用XhoI和MluI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收2.7kb β-LCR（LCR2.7K）片段，所用PCR引物为LCR2.7K-1（SEQ ID No:10）和LCR2.7K-2（SEQ ID No:11）。
1.2 将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA载体片段和LCR2.7K片段，采用T4 DNA连接酶，室温反应10-20min。
1.3将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.4 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA质粒，进行XhoI和MluI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA质粒。
1.5将pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA质粒用限制性内切酶MluI和EcoRI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA载体片段；
将AHSP启动子（pAHSP）序列（SEQ ID No:5）和chimeric intron （CI）增强子序列（SEQ ID No:7）进行PCR扩增，其中pAHSP序列片段的3’端和chimeric intron增强子序列片段的5’端有25bp的同源序列，琼脂糖电泳后切胶回收pAHSP序列片段和chimeric intron增强子序列片段，随后将胶回收试剂盒回收的pAHSP序列片段和chimeric intron增强子序列片段进行overlap PCR，5’端加上保护碱基和MluI酶切位点，3’端加上保护碱基和EcoRI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用MluI和EcoRI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pAHSP-CI片段，所用PCR引物为P3-AHSP-promoter（SEQ ID No:19）和P2-chimeric-intron（SEQ ID No:13）。
SEQ ID No:19：cgacgcgtgctcttgccttcttgcatttcctgg
1.6将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA载体片段和pAHSP-CI片段，采用T4DNA连接酶连接，室温反应10-20min。
1.7将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.8 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-CI-RbPA质粒，进行MluI和EcoRI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-CI-RbPA质粒。
1.9 将pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-CI-RbPA载体质粒用限制性内切酶EcoRI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-CI-RbPA载体片段；
将编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列（SEQ ID No:9）进行PCR扩增，5’端加上保护碱基和EcoRI酶切位点，3’端加上保护碱基和KpnI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用EcoRI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收βA-T87Q基因片段，所用PCR引物为β-up（SEQ ID No:14）和β-down（SEQ ID No:15）。
1.10将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-CI-RbPA载体片段和βA-T87Q基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min。
1.11 将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.12 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取质粒pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-CI-βA-T87Q-RbPA，进行EcoRI和KpnI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-CI-βA-T87Q-RbPA质粒构建成功。
2. 慢病毒的生产和纯化
包含pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-CI-βA-T87Q-RbPA质粒的慢病毒的生产和纯化的操作过程与实施例1中相应部分操作相同。
3. 以体外诱导β0/β0地中海贫血受试者骨髓造血干细胞（CD34+细胞）向红细胞分化体系为模型验证慢病毒递送β-珠蛋白系统有效性
利用慢病毒（上述第2部分制备和纯化的慢病毒）感染β0/β0地中海贫血受试者骨髓造血干细胞（CD34+细胞），进行红系分化，体外诱导培养21天，检测其中HbβA-T87Q的表达情况，实验方法同实施例1相应部分的操作。
4．RP-HPLC定量HbβA-T87Q的表达
利用RP-HPLC可定量HbβA-T87Q的表达，且能与内源基因表达的野生型β-珠蛋白区分，实验方法同实施例1相应部分的操作。
RP-HPLC结果分析如图8和图9所示，峰下面积结果如下表5。
表5：RP-HPLC检测各样品峰下面积结果
Figure 776344DEST_PATH_IMAGE012
由表5可知：经慢病毒pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-CI-βA-T87Q-RbPA感染的β0/β0受试者骨髓CD34+细胞体外红系分化， 空白对照组（Blank）没有βA-T87Q珠蛋白的表达，而药物处理组的βA-T87Q珠蛋白与α-珠蛋白的比值为53%，见表5中βA-T87Q/α；空白对照组（Blank）和药物处理组的β-like珠蛋白（β珠蛋白、βA-T87Q-珠蛋白与δ珠蛋白）与α-珠蛋白表达量（HPLC峰下面积）比值分别为44%和76%，见表5中(β+βA-T87Q+δ)/ α；可见慢病毒载体基因药物可以在β0/β0骨髓CD34+中表达，起到补充患者β-珠蛋白的作用。
本实施例结果证明：本发明制备的携带pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-CI-βA-T87Q-RbPA的慢病毒感染CD34+ 造血干细胞后红系分化，可实现β珠蛋白的高表达，此项目技术有望达到改善及治愈患者β-地中海贫血的效果；所制得的慢病毒及经基因修饰后的造血干细胞可作为β-地中海贫血的基因治疗药物。
实施例5
1. 慢病毒载体pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-βI-βA-T87Q-RbPA的构建，包括载体pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA（SEQ ID No:1），2.7kb β-LCR（LCR2.7K）调控序列（SEQ ID No:2），AHSP 启动子（pAHSP）序列（SEQ ID No:5），β-globin intron（βI）增强子序列（SEQ IDNo:8）和编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列（SEQ ID No:9），且在密码子87处编码包含突变T87Q，即由苏氨酸突变为谷氨酰胺。
1.1 以本公司载体质粒pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA（SEQ ID No:1）作为制备慢病毒载体的载体，将其用限制性内切酶XhoI和MluI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收得到pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架片段；
将LCR2.7K调控序列（SEQ ID No:2）进行PCR扩增，且5’端加上保护碱基和XhoI酶切位点，3’端加上保护碱基和MluI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用XhoI和MluI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收2.7kb β-LCR（LCR2.7K）片段，所用PCR引物为LCR2.7K-1（SEQ ID No:10）和LCR2.7K-2（SEQ ID No:11）。
1.2 将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA载体片段和LCR2.7K片段，采用T4 DNA连接酶，室温反应10-20min。
1.3将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.4 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA质粒，进行XhoI和MluI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA质粒。
1.5将pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA质粒用限制性内切酶MluI和EcoRI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA载体片段；
将AHSP 启动子（pAHSP）序列（SEQ ID No:5）和 β-globin intron（βI）增强子序列（SEQ ID No:8）进行PCR扩增，其中pAHSP序列片段的3’端和β-globin intron增强子序列片段的5’端有25bp的同源序列，琼脂糖电泳后切胶回收pAHSP序列片段和β-globin intron增强子序列片段，随后将胶回收试剂盒回收的pAHSP序列片段和β-globin intron 增强子序列片段进行overlap PCR，5’端加上保护碱基和MluI酶切位点，3’端加上保护碱基和EcoRI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用MluI和EcoRI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pAHSP-βI片段，所用PCR引物为P3-AHSP-promoter（SEQ IDNo:19）和P4-β-globin-intron（SEQ ID No:20）。
SEQ ID No:20：ggaattcctttgccaaagtgatgggccagcacac
1.6将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA载体片段和pAHSP-βI片段，采用T4DNA连接酶连接，室温反应10-20min。
1.7将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.8 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-βI-RbPA质粒，进行MluI和EcoRI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-βI-RbPA质粒。
1.9 将pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-βI-RbPA载体质粒用限制性内切酶EcoRI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-βI-RbPA载体片段；
将编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列（SEQ ID No:9）进行PCR扩增，5’端加上保护碱基和EcoRI酶切位点，3’端加上保护碱基和KpnI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用EcoRI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收βA-T87Q基因片段，所用PCR引物为β-up（SEQ ID No:14）和β-down（SEQ ID No:15）。
1.10将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-βI-RbPA载体片段和βA-T87Q基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min。
1.11 将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB 琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。
1.12 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取质粒pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-βI-βA-T87Q-RbPA，进行EcoRI和KpnI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-βI-βA-T87Q-RbPA质粒构建成功。
2. 慢病毒的生产和纯化
包含pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-βI-βA-T87Q-RbPA质粒的慢病毒的生产和纯化的操作过程与实施例1中相应部分操作相同。
3. 以体外诱导β0/β0地中海贫血受试者骨髓造血干细胞（CD34+细胞）向红细胞分化体系为模型验证慢病毒递送β-珠蛋白系统有效性
利用慢病毒（上述第2部分制备和纯化的慢病毒）感染β0/β0地中海贫血受试者骨髓造血干细胞（CD34+细胞），进行红系分化，体外诱导培养21天，检测其中HbβA-T87Q的表达情况，实验方法同实施例1相应部分的操作。
4．RP-HPLC定量HbβA-T87Q的表达
利用RP-HPLC可定量HbβA-T87Q的表达，且能与内源基因表达的野生型β-珠蛋白区分，实验方法同实施例1相应部分的操作。
RP-HPLC结果分析如图10和图11所示，峰下面积结果如下表6。
表6：RP-HPLC检测各样品峰下面积结果
Figure 145009DEST_PATH_IMAGE013
由表6可知：经慢病毒pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pAHSP-βI-βA-T87Q-RbPA感染的β0/β0受试者骨髓CD34+细胞体外红系分化， 空白对照组（Blank）没有βA-T87Q珠蛋白的表达，而药物处理组的βA-T87Q珠蛋白与α-珠蛋白的比值为41%，见表6中βA-T87Q/α；空白对照组（Blank）和药物处理组的β-like珠蛋白（β珠蛋白、βA-T87Q -珠蛋白与δ珠蛋白）与α-珠蛋白表达量（HPLC峰下面积）比值分别为50%和76%，见表6中(β+βA-T87Q+δ)/ α；可见慢病毒载体基因药物可以在β0/β0骨髓CD34+中表达，起到补充患者β-珠蛋白的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中吉智药（南京）生物技术有限公司
<120> 慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5427
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggagctgcc gtattgcata cgttgtatcc atatcataat atgtacattt atattggctc 60
atgtccaaca ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 120
tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 180
tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 240
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 300
aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 360
caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 420
tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 480
gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 540
tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 600
caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 660
cagagctcgt ttagtgaacc gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 720
ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag 780
tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 840
cagtgtggaa aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagggaaacc 900
agaggagctc tctcgacgca ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg 960
gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagatgg 1020
gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt 1080
aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct 1140
agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt agaaacatca gaaggctgta gacaaatact 1200
gggacagcta caaccatccc ttcagacagg atcagaagaa cttagatcat tatataatac 1260
agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag gatagagata aaagacacca aggaagcttt 1320
agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag taagaccacc gcacagcaag cggccgctga 1380
tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg acaattggag aagtgaatta tataaatata 1440
aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc 1500
agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag 1560
gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg 1620
gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga gggctattga ggcgcaacag catctgttgc 1680
aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc 1740
taaaggatca acagctcctg gggatttggg gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg 1800
ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata aatctctgga acagatttgg aatcacacga 1860
cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca attacacaag cttaatacac tccttaattg 1920
aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg aacaagaatt attggaatta gataaatggg 1980
caagtttgtg gaattggttt aacataacaa attggctgtg gtatataaaa ttattcataa 2040
tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa tagtttttgc tgtactttct atagtgaata 2100
gagttaggca gggatattca ccattatcgt ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac 2160
ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag gtggagagag agacagagac agatccattc 2220
gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg 2280
ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac agacatacaa actaaagaat 2340
tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttatcgatca cgagactagc ctcgagctag 2400
cgtttaaacg ggccctctag atcggaacgc gttatctgca gaattcccgg gatccttaat 2460
tagtcgacgg tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt 2520
ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaagaca agatctgctt 2580
tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa 2640
ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca ataaaggaaa 2700
tttattttca ttgcaatagt gtgttggttt tttgtgtgct ctcacctata gtgagtcgta 2760
ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 2820
ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc 2880
ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg acgcgccctg 2940
tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 3000
cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 3060
ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 3120
gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg 3180
atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt 3240
ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt 3300
gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt 3360
taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt gatgagccat 3420
attcaacggg aaacgtcttg ctctaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta 3480
tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg 3540
tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat 3600
gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc 3660
atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccggg 3720
aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg 3780
ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc 3840
gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg 3900
agtgattttg atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat 3960
aaacttttgc cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac 4020
cttatttttg acgaggggaa attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca 4080
gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta 4140
cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt 4200
catttgatgc tcgatgagtt tttctaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 4260
attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 4320
ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 4380
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 4440
aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 4500
ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 4560
tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 4620
ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 4680
cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 4740
agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 4800
gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 4860
ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 4920
tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 4980
tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 5040
cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 5100
tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 5160
gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 5220
agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg 5280
agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg 5340
tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc 5400
aagcgcgcaa ttaaccctca ctaaagg 5427
<210> 2
<211> 2697
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcctcaaga tgataacttt tattttctgg acttgtaata gctttctctt gtattcacca 60
tgttgtaact ttcttagagt agtaacaata taaagttatt gtgagttttt gcaaacacag 120
caaacacaac gacccatata gacattgatg tgaaattgtc tattgtcaat ttatgggaaa 180
acaagtatgt actttttcta ctaagccatt gaaacaggaa taacagaaca agattgaaag 240
aatacatttt ccgaaattac ttgagtatta tacaaagaca agcacgtgga cctgggagga 300
gggttattgt ccatgactgg tgtgtggaga caaatgcagg tttataatag atgggatggc 360
atctagcgca atgactttgc catcactttt agagagctct tggggacccc agtacacaag 420
aggggacgca gggtatatgt agacatctca ttctttttct tagtgtgaga ataagaatag 480
ccatgacctg agtttataga caatgagccc ttttctctct cccactcagc agctatgaga 540
tggcttgccc tgcctctcta ctaggctgac tcactccaag gcccagcaat gggcagggct 600
ctgtcagggc tttgatagca ctatctgcag agccagggcc gagaaggggt ggactccaga 660
gactctccct cccattcccg agcagggttt gcttatttat gcatttaaat gatatattta 720
ttttaaaaga aataacagga gactgcccag ccctggctgt gacatggaaa ctatgtagaa 780
tattttgggt tccatttttt tttccttctt tcagttagag gaaaaggggc tcactgcaca 840
tacactagac agaaagtcag gagctttgaa tccaagcctg atcatttcca tgtcatactg 900
agaaagtccc cacccttctc tgagcctcag tttctctttt tataagtagg agtctggagt 960
aaatgatttc caatggctct catttcaata caaaatttcc gtttattaaa tgcatgagct 1020
tctgttactc caagactgag aaggaaattg aacctgagac tcattgactg gcaagatgtc 1080
cccagaggct ctcattcagc aataaaattc tcaccttcac ccaggcccac tgagtgtcag 1140
atttgcatgc tctagctgag ctcagaagag tcaagcattt gcctaaggtc ggacatgtca 1200
gaggcagtgc cagacctatg tgagactctg cagctactgc tcatgggccc tgtgctgcac 1260
tgatgaggag gatcagatgg atggggcaat gaagcaaagg aatcattctg tggataaagg 1320
agacagccat gaagaagtct atgactgtaa atttgggagc aggagtctct aaggacttgg 1380
atttcaagga attttgactc agcaaacaca agaccctcac ggtgactttg cgagctggtg 1440
tgccagatgt gtctatcaga ggttccaggg agggtggggt ggggtcaggg ctggccacca 1500
gctatcaggg cccagatggg ttataggctg gcaggctcag ataggtggtt aggtcaggtt 1560
ggtggtgctg ggtggagtcc atgactccca ggagccagga gagatagacc atgagtagag 1620
ggcagacatg ggaaaggtgg gggaggcaca gcatagcagc atttttcatt ctactactac 1680
atgggactgc tcccctatac ccccagctag gggcaagtgc cttgactcct atgttttcag 1740
gatcatcatc tataaagtaa gagtaataat tgtgtctatc tcatagggtt attatgagga 1800
tcaaaggaga tgcacactct ctggaccagt ggcctaacag ttcaggacag agctatgggc 1860
ttcctatgta tgggtcagtg gtctcaatgt agcaggcaag ttccagaaga tagcatcaac 1920
cactgttaga gatatactgc cagtctcaga gcctgatgtt aatttagcaa tgggctggga 1980
ccctcctcca gtagaacctt ctaaccagct gctgcagtca aagtcgaatg cagctggtta 2040
gacttttttt aatgaggatc tcgggaggcg gaggttgcag tgagctgaga tcgtgccact 2100
gcactccagc ctgggggaca gagcacatta taattaactg ttatttttta cttggactct 2160
tgtggggaat aagatacatg ttttattctt atttatgatt caagcactga aaatagtgtt 2220
tagcatccag caggtgcttc aaaaccattt gctgaatgat tactatactt tttacaagct 2280
cagctccctc tatcccttcc agcatcctca tctctgatta aataagcttc agtttttcct 2340
tagttcctgt tacatttctg tgtgtctcca ttagtgacct cccatagtcc aagcatgagc 2400
agttctggcc aggcccctgt cggggtcagt gccccacccc cgccttctgg ttctgtgtaa 2460
ccttctaagc aaaccttctg gctcaagcac agcaatgctg agtcatgatg agtcatgctg 2520
aggcttaggg tgtgtgccca gatgttctca gcctagagtg atgactccta tctgggtccc 2580
cagcaggatg cttacagggc agatggcaaa aaaaaggaga agctgaccac ctgactaaaa 2640
ctccacctca aacggcatca taaagaaaat ggatgcctga gacagaatgt gacatat 2697
<210> 3
<211> 3669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggatcccttg agctcaggag gtcaaggctg cagtgagaca tgatcttgcc actgcactcc 60
agcctggaca gcagagtgaa accttgcctc acgaaacaga atacaaaaac aaacaaacaa 120
aaaactgctc cgcaatgcgc ttccttgatg ctctaccaca taggtctggg tactttgtac 180
acattatctc attgctgttc gtaattgtta gattaatttt gtaatattga tattattcct 240
agaaagctga ggcctcaaga tgataacttt tattttctgg acttgtaata gctttctctt 300
gtattcacca tgttgtaact ttcttagagt agtaacaata taaagttatt gtgagttttt 360
gcaaacacag caaacacaac gacccatata gacattgatg tgaaattgtc tattgtcaat 420
ttatgggaaa acaagtatgt actttttcta ctaagccatt gaaacaggaa taacagaaca 480
agattgaaag aatacatttt ccgaaattac ttgagtatta tacaaagaca agcacgtgga 540
cctgggagga gggttattgt ccatgactgg tgtgtggaga caaatgcagg tttataatag 600
atgggatggc atctagcgca atgactttgc catcactttt agagagctct tggggacccc 660
agtacacaag aggggacgca gggtatatgt agacatctca ttctttttct tagtgtgaga 720
ataagaatag ccatgacctg agtttataga caatgagccc ttttctctct cccactcagc 780
agctatgaga tggcttgccc tgcctctcta ctaggctgac tcactccaag gcccagcaat 840
gggcagggct ctgtcagggc tttgatagca ctatctgcag agccagggcc gagaaggggt 900
ggactccaga gactctccct cccattcccg agcagggttt gcttatttat gcatttaaat 960
gatatattta ttttaaaaga aataacagga gactgcccag ccctggctgt gacatggaaa 1020
ctatgtagaa tattttgggt tccatttttt tttccttctt tcagttagag gaaaaggggc 1080
tcactgcaca tacactagac agaaagtcag gagctttgaa tccaagcctg atcatttcca 1140
tgtcatactg agaaagtccc cacccttctc tgagcctcag tttctctttt tataagtagg 1200
agtctggagt aaatgatttc caatggctct catttcaata caaaatttcc gtttattaaa 1260
tgcatgagct tctgttactc caagactgag aaggaaattg aacctgagac tcattgactg 1320
gcaagatgtc cccagaggct ctcattcagc aataaaattc tcaccttcac ccaggcccac 1380
tgagtgtcag atttgcatgc actagtggat ccacttgccc agtgttcttc cttagttcct 1440
accttcgacc ttgatcctcc tttatcttcc tgaaccctgc tgagatgatc tatgtgggga 1500
gaatggcttc tttgagaaac atcttcttcg ttagtggcct gcccctcatt cccactttaa 1560
tatccagaat cactataaga agaatataat aagaggaata actcttatta taggtaaggg 1620
aaaattaaga ggcatacgtg atgggatgag taagagagga gagggaagga ttaatggatg 1680
ataaaatcta ctactatttg ttgagacctt ttatagtcta atcaattttg ctattgtttt 1740
ccatcctcac gctaactcca taaaaaaaca ctattattat ctttattttg ccatgacaag 1800
actgagctca gaagagtcaa gcatttgcct aaggtcggac atgtcagagg cagtgccaga 1860
cctatgtgag actctgcagc tactgctcat gggccctgtg ctgcactgat gaggaggatc 1920
agatggatgg ggcaatgaag caaaggaatc attctgtgga taaaggagac agccatgaag 1980
aagtctatga ctgtaaattt gggagcagga gtctctaagg acttggattt caaggaattt 2040
tgactcagca aacacaagac cctcacggtg actttgcgag ctggtgtgcc agatgtgtct 2100
atcagaggtt ccagggaggg tggggtgggg tcagggctgg ccaccagcta tcagggccca 2160
gatgggttat aggctggcag gctcagatag gtggttaggt caggttggtg gtgctgggtg 2220
gagtccatga ctcccaggag ccaggagaga tagaccatga gtagagggca gacatgggaa 2280
aggtggggga ggcacagcat agcagcattt ttcattctac tactacatgg gactgctccc 2340
ctataccccc agctaggggc aagtgccttg actcctatgt tttcaggatc atcatctata 2400
aagtaagagt aataattgtg tctatctcat agggttatta tgaggatcaa aggagatgca 2460
cactctctgg accagtggcc taacagttca ggacagagct atgggcttcc tatgtatggg 2520
tcagtggtct caatgtagca ggcaagttcc agaagatagc atcaaccact gttagagata 2580
tactgccagt ctcagagcct gatgttaatt tagcaatggg ctgggaccct cctccagtag 2640
aaccttctaa ccagctgctg cagtcaaagt cgaatgcagc tggttagact ttttttaatg 2700
atttgggagg ctgaggtggg tggactgctt ggagctcagg agttcaagac catcttggac 2760
aacatggtga taccctgcct ctacaaaaag tacaaaaatt agcctggcat ggtggtgtgc 2820
acctgtaatc ccagctatta gggtggctga ggcaggagaa ttgcttgaac ccgggaggcg 2880
gaggttgcag tgagctgaga tcgtgccact gcactccagc ctgggggaca gagcacatta 2940
taattaactg ttatttttta cttggactct tgtggggaat aagatacatg ttttattctt 3000
atttatgatt caagcactga aaatagtgtt tagcatccag caggtgcttc aaaaccattt 3060
gctgaatgat tactatactt tttacaagct cagctccctc tatcccttcc agcatcctca 3120
tctctgatta aataagcttc agtttttcct tagttcctgt tacatttctg tgtgtctcca 3180
ttagtgacct cccatagtcc aagcatgagc agttctggcc aggcccctgt cggggtcagt 3240
gccccacccc cgccttctgg ttctgtgtaa ccttctaagc aaaccttctg gctcaagcac 3300
agcaatgctg agtcatgatg agtcatgctg aggcttaggg tgtgtgccca gatgttctca 3360
gcctagagtg atgactccta tctgggtccc cagcaggatg cttacagggc agatggcaaa 3420
aaaaaggaga agctgaccac ctgactaaaa ctccacctca aacggcatca taaagaaaat 3480
ggatgcctga gacagaatgt gacatattct agaatatatt atttcctgaa tatatatata 3540
tatatatata cacatatacg tatatatata tatatatata tatttgttgt tatcaattgc 3600
catagaatga ttagttattg tgaatcaaat atttatcttg caggtggcct ctatacctag 3660
aagcggcag 3669
<210> 4
<211> 4644
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatcccttg agctcaggag gtcaaggctg cagtgagaca tgatcttgcc actgcactcc 60
agcctggaca gcagagtgaa accttgcctc acgaaacaga atacaaaaac aaacaaacaa 120
aaaactgctc cgcaatgcgc ttccttgatg ctctaccaca taggtctggg tactttgtac 180
acattatctc attgctgttc gtaattgtta gattaatttt gtaatattga tattattcct 240
agaaagctga ggcctcaaga tgataacttt tattttctgg acttgtaata gctttctctt 300
gtattcacca tgttgtaact ttcttagagt agtaacaata taaagttatt gtgagttttt 360
gcaaacacag caaacacaac gacccatata gacattgatg tgaaattgtc tattgtcaat 420
ttatgggaaa acaagtatgt actttttcta ctaagccatt gaaacaggaa taacagaaca 480
agattgaaag aatacatttt ccgaaattac ttgagtatta tacaaagaca agcacgtgga 540
cctgggagga gggttattgt ccatgactgg tgtgtggaga caaatgcagg tttataatag 600
atgggatggc atctagcgca atgactttgc catcactttt agagagctct tggggacccc 660
agtacacaag aggggacgca gggtatatgt agacatctca ttctttttct tagtgtgaga 720
ataagaatag ccatgacctg agtttataga caatgagccc ttttctctct cccactcagc 780
agctatgaga tggcttgccc tgcctctcta ctaggctgac tcactccaag gcccagcaat 840
gggcagggct ctgtcagggc tttgatagca ctatctgcag agccagggcc gagaaggggt 900
ggactccaga gactctccct cccattcccg agcagggttt gcttatttat gcatttaaat 960
gatatattta ttttaaaaga aataacagga gactgcccag ccctggctgt gacatggaaa 1020
ctatgtagaa tattttgggt tccatttttt tttccttctt tcagttagag gaaaaggggc 1080
tcactgcaca tacactagac agaaagtcag gagctttgaa tccaagcctg atcatttcca 1140
tgtcatactg agaaagtccc cacccttctc tgagcctcag tttctctttt tataagtagg 1200
agtctggagt aaatgatttc caatggctct catttcaata caaaatttcc gtttattaaa 1260
tgcatgagct tctgttactc caagactgag aaggaaattg aacctgagac tcattgactg 1320
gcaagatgtc cccagaggct ctcattcagc aataaaattc tcaccttcac ccaggcccac 1380
tgagtgtcag atttgcatgc actagttcac gtgtgtaaaa aggaggatgc ttctttcctt 1440
tgtattctca cataccttta ggaaagaact tagcaccctt cccacacagc catcccaata 1500
actcatttca gtgactcaac ccttgacttt ataaaagtct tgggcagtat agagcagaga 1560
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taattgtatg actcagtttc ttcatctgta aaatggaggg ttttttaatt agtttgtttt 1680
tgagaaaggg tctcactctg tcacccaaat gggagtgtag tggcaaaatc tcggctcact 1740
gcaacttgca cttcccaggc tcaagcggtc ctcccacctc aacatcctga gtagctggaa 1800
ccacaggtac acaccaccat acctcgctaa ttttttgtat ttttggtaga gatggggttt 1860
cacatgttac acaggatggt ctcagactcc ggagcggatc cacttgccca gtgttcttcc 1920
ttagttccta ccttcgacct tgatcctcct ttatcttcct gaaccctgct gagatgatct 1980
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ccactttaat atccagaatc actataagaa gaatataata agaggaataa ctcttattat 2100
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taatggatga taaaatctac tactatttgt tgagaccttt tatagtctaa tcaattttgc 2220
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catgacaaga ctgagctcag aagagtcaag catttgccta aggtcggaca tgtcagaggc 2340
agtgccagac ctatgtgaga ctctgcagct actgctcatg ggccctgtgc tgcactgatg 2400
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cagggcccag atgggttata ggctggcagg ctcagatagg tggttaggtc aggttggtgg 2700
tgctgggtgg agtccatgac tcccaggagc caggagagat agaccatgag tagagggcag 2760
acatgggaaa ggtgggggag gcacagcata gcagcatttt tcattctact actacatggg 2820
actgctcccc tataccccca gctaggggca agtgccttga ctcctatgtt ttcaggatca 2880
tcatctataa agtaagagta ataattgtgt ctatctcata gggttattat gaggatcaaa 2940
ggagatgcac actctctgga ccagtggcct aacagttcag gacagagcta tgggcttcct 3000
atgtatgggt cagtggtctc aatgtagcag gcaagttcca gaagatagca tcaaccactg 3060
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ctccagtaga accttctaac cagctgctgc agtcaaagtc gaatgcagct ggttagactt 3180
tttttaatga aagcttccag tggggcctct aagactaagt cactctgtct cactgtgtct 3240
tagccagttc cttacagctt gccctgatgg gagatagaga atgggtatcc tccaacaaaa 3300
aaataaattt tcatttctca aggtccaact tatgttttct taatttttaa aaaaatcttg 3360
accattctcc actctctaaa ataatccaca gtgagagaaa cattcttttc ccccatccca 3420
taaatacctc tattaaatat ggaaaatctg ggcatggtgt ctcacacctg taatcccagc 3480
actttgggag gctgaggtgg gtggactgct tggagctcag gagttcaaga ccatcttgga 3540
caacatggtg ataccctgcc tctacaaaaa gtacaaaaat tagcctggca tggtggtgtg 3600
cacctgtaat cccagctatt agggtggctg aggcaggaga attgcttgaa cccgggaggc 3660
ggaggttgca gtgagctgag atcgtgccac tgcactccag cctgggggac agagcacatt 3720
ataattaact gttatttttt acttggactc ttgtggggaa taagatacat gttttattct 3780
tatttatgat tcaagcactg aaaatagtgt ttagcatcca gcaggtgctt caaaaccatt 3840
tgctgaatga ttactatact ttttacaagc tcagctccct ctatcccttc cagcatcctc 3900
atctctgatt aaataagctt cagtttttcc ttagttcctg ttacatttct gtgtgtctcc 3960
attagtgacc tcccatagtc caagcatgag cagttctggc caggcccctg tcggggtcag 4020
tgccccaccc ccgccttctg gttctgtgta accttctaag caaaccttct ggctcaagca 4080
cagcaatgct gagtcatgat gagtcatgct gaggcttagg gtgtgtgccc agatgttctc 4140
agcctagagt gatgactcct atctgggtcc ccagcaggat gcttacaggg cagatggcaa 4200
aaaaaaggag aagctgacca cctgactaaa actccacctc aaacggcatc ataaagaaaa 4260
tggatgcctg agacagaatg tgacatattc tagaatatat tatttcctga atatatatat 4320
atatatatat acacatatac gtatatatat atatatatat atatttgttg ttatcaattg 4380
ccatagaatg attagttatt gtgaatcaaa tatttatctt gcaggtggcc tctataccta 4440
gaagcggcag aatcaggctt tattaataca tgtgtataga tttttaggat ctatacacat 4500
gtattaatat gaaacaagga tatggaagag gaaggcatga aaacaggaaa agaaaacaaa 4560
ccttgtttgc cattttaagg cacccctgga cagctaggtg gcaaaaggcc tgtgctgtta 4620
gaggacacat gctcacatac gggg 4644
<210> 5
<211> 440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctcttgcct tcttgcattt cctgggtttc ctcatttatc tttttttttt ttttttttgg 60
ccttgttatc tttctacctt cagggaagcc tctcccttct tctcctccct agaatgacct 120
atcaccctcc ttcaggacct agatgcaggg cgtttctatc ttaggctgac acttgactcc 180
ttgcctacat ctatagcttg gcacagagag attcacgcac cctcaagagt gtgggtgaga 240
catatacagc ctgttagacc tgaaggtgag cccaacctgg gaaaatcgtg acctcagagc 300
agggcaggat gtgaaaggtt ttggaaagga gatagccctg cagggcagga gggattttta 360
aggggaggaa gtgggttggg ggaaataccc agtgaggagg gaaacagata tgtaaattct 420
acccttttct ctacccagga 440
<210> 6
<211> 319
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tacgtaaata cacttgcaaa ggaggatgtt tttagtagca atttgtactg atggtatggg 60
gccaagagat atatcttaga gggagggctg agggtttgaa gtccaactcc taagccagtg 120
ccagaagagc caaggacagg tacggctgtc atcacttaga cctcaccctg tggagccaca 180
ccctagggtt ggccaatcta ctcccaggag cagggagggc aggagccagg gctgggcata 240
aaagtcaggg cagagccatc tattgcttac atttgcttct gacacaactg tgttcactag 300
caacctcaaa cagacacca 319
<210> 7
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg 60
cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct 120
tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg ctccgggagg gcccctctgc taaccatgtt 180
catgccttct tctctttcct acagctcctg ggcaacgtgc tggttgttgt gctgtctcat 240
cattttggca aa 252
<210> 8
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtacacatat tgaccaaatc agggtaattt tgcatttgta attttaaaaa atgctttctt 60
cttttaatat acttttttgt ttatcttatt tctaatactt tccctaatct ctttctttca 120
gggcaataat gatacaatgt atcatgcctc tttgcaccat tctaaagaat aacagtgata 180
atttctgggt taaggcaata gcaatatttc tgcatataaa tatttctgca tataaattgt 240
aactgatgta agaggtttca tattgctaat agcagctaca atccagctac cattctgctt 300
ttattttatg gttgggataa ggctggatta ttctgagtcc aagctaggcc cttttgctaa 360
tcatgttcat acctcttatc ttcctcccac agctcctggg caacgtgctg gtctgtgtgc 420
tggcccatca ctttggcaaa g 441
<210> 9
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggtgcatt taacccccga ggagaagagc gccgtgactg ctttatgggg caaggtgaac 60
gtggatgagg tcggcggcga ggctttaggc agactgctgg tggtgtaccc ttggacccag 120
aggttcttcg agagcttcgg cgacctcagc actcccgatg ccgtgatggg caatcccaag 180
gtgaaggccc acggcaagaa ggtgctgggc gctttcagcg atggtttagc ccatttagac 240
aatctgaagg gcaccttcgc ccagctgagc gagctgcact gcgataagct gcacgtggac 300
cccgagaatt ttcgtctgct gggcaatgtg ctggtgtgcg tgctggccca ccacttcggg 360
aaggagttca cccctcccgt gcaagctgcc taccagaagg tggtggctgg cgtggctaat 420
gctttagccc acaagtacca ctga 444
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccgctcgagg gcctcaagat gataactttt attttc 36
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgacgcgtat atgtcacatt ctgtctcagg catc 34
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgacgcgtta cgtaaataca cttgcaaagg agg 33
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggaattcttt gccaaaatga tgagacagca caac 34
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggaattcatg gtgcatttaa cccccgagga ga 32
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggggtacctc agtggtactt gtgggctaaa gc 32
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccgctcgagg gatcccttga gctcaggagg tcaaggctg 39
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgacgcgtct gccgcttcta ggtatagagg ccacctg 37
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgacgcgtcc ccgtatgtga gcatgtgtcc tc 32
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgacgcgtgc tcttgccttc ttgcatttcc tgg 33
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggaattcctt tgccaaagtg atgggccagc acac 34

Claims (3)

1.慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用，其特征在于：所述慢病毒载体由pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架、A调控序列、B启动子序列、C增强子序列和D基因序列构成，且A调控序列、B启动子序列、C增强子序列和D基因序列从5’端到3’端顺次连接，所述A调控序列为2.7kb β-LCR或3.6kb β-LCR或4.6kb β-LCR，其中β-LCR为β-globin locuscontrol region的简写；所述B启动子序列为AHSP启动子序列或β-globin启动子序列；所述C增强子序列为chimeric intron增强子序列或β-globin intron增强子序列；所述D基因序列为编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列，删除其内含子且在密码子87处编码包含突变T87Q，同时2.7kb β-LCR调控序列如SEQ ID No:2所示，3.6kb β-LCR调控序列如SEQ IDNo:3所示，4.6kb β-LCR调控序列如SEQ ID No:4所示，chimeric intron增强子序列如SEQID No:7所示，β-globin intron增强子序列如SEQ ID No:8所示，所述编码密码子优化的β-globin基因βA-T87Q序列如SEQ ID No:9所示。
2.根据权利要求1所述的慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用，其特征在于：所述pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架的序列如SEQ ID No:1所示。
3.根据权利要求1所述的慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用，其特征在于：所述AHSP启动子序列如SEQ ID No:5所示，β-globin启动子序列如SEQ ID No:6所示。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116271106B (zh) * 2023-05-24 2023-08-11 中吉智药(南京)生物技术有限公司 慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003070958A1 (en) * 2002-02-19 2003-08-28 The Hospital For Sick Children Retroviral gene therapy vectors including insulator elements to provide high levels of gene expression
CA2865129A1 (en) * 2012-02-24 2013-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
CN110564770A (zh) * 2019-07-29 2019-12-13 上海本导基因技术有限公司 一种适用地中海贫血和镰刀型贫血基因治疗的慢病毒载体
WO2020168004A1 (en) * 2019-02-14 2020-08-20 The Regents Of The University Of California Optimized lentiviral vector compromising minimal enhancer elements for stem cell gene therapy of hemoglobinopathies
WO2020193434A1 (en) * 2019-03-22 2020-10-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Bifunctional vectors allowing bcl11a silencing and expression of an anti-sickling hbb and uses thereof for gene therapy of b- hemoglobinopathies
CN112226438A (zh) * 2020-11-02 2021-01-15 贵州医科大学 一种用于驱动基因在人红细胞系统中特异表达的启动子及应用
CN112921054A (zh) * 2021-04-08 2021-06-08 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用
WO2021150987A1 (en) * 2020-01-22 2021-07-29 Altius Institute For Biomedical Sciences Novel erythroid specific enhancers and uses thereof
WO2021201949A2 (en) * 2020-01-10 2021-10-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for detection of microbes and microbe components
CN114438130A (zh) * 2022-04-11 2022-05-06 中吉智药(南京)生物技术有限公司 一种β-珠蛋白重组慢病毒载体及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150037297A1 (en) * 1999-08-30 2015-02-05 David S Terman Sickled Erythrocytes and Progenitors Target Cytotoxics to Tumors
ATE474460T1 (de) * 2002-12-13 2010-08-15 Genetix Pharmaceuticals Inc Therapeutische retrovirus-vektoren für gentherapie
US10301620B2 (en) * 2010-12-22 2019-05-28 Murdoch Childrens Research Institute Method of treatment
WO2016037138A1 (en) * 2014-09-04 2016-03-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Global gene therapy for treating hemoglobinopathies
MX2018009750A (es) * 2016-02-12 2019-02-07 Bluebird Bio Inc Composiciones potenciadoras de vcn y métodos para su uso.
WO2020056400A1 (en) * 2018-09-14 2020-03-19 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for hemoglobin production
WO2021211454A1 (en) * 2020-04-13 2021-10-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Integration of large adenovirus payloads
CN113817775B (zh) * 2020-08-25 2023-02-17 南京吉迈生物技术有限公司 修饰的阿柏西普、组合物、方法及其在基因治疗中的应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003070958A1 (en) * 2002-02-19 2003-08-28 The Hospital For Sick Children Retroviral gene therapy vectors including insulator elements to provide high levels of gene expression
CA2865129A1 (en) * 2012-02-24 2013-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2020168004A1 (en) * 2019-02-14 2020-08-20 The Regents Of The University Of California Optimized lentiviral vector compromising minimal enhancer elements for stem cell gene therapy of hemoglobinopathies
WO2020193434A1 (en) * 2019-03-22 2020-10-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Bifunctional vectors allowing bcl11a silencing and expression of an anti-sickling hbb and uses thereof for gene therapy of b- hemoglobinopathies
CN110564770A (zh) * 2019-07-29 2019-12-13 上海本导基因技术有限公司 一种适用地中海贫血和镰刀型贫血基因治疗的慢病毒载体
WO2021201949A2 (en) * 2020-01-10 2021-10-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for detection of microbes and microbe components
WO2021150987A1 (en) * 2020-01-22 2021-07-29 Altius Institute For Biomedical Sciences Novel erythroid specific enhancers and uses thereof
CN112226438A (zh) * 2020-11-02 2021-01-15 贵州医科大学 一种用于驱动基因在人红细胞系统中特异表达的启动子及应用
CN112921054A (zh) * 2021-04-08 2021-06-08 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用
CN114438130A (zh) * 2022-04-11 2022-05-06 中吉智药(南京)生物技术有限公司 一种β-珠蛋白重组慢病毒载体及其应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Coordinated β-globin expression and α2-globin reduction in a multiplex lentiviral gene therapy vector for β-thalassemia.;Nualkaew T等;《Mol Ther》;20210501;第29卷(第9期);2841-2853 *
Gene Therapy of the β-Hemoglobinopathies by Lentiviral Transfer of the β(A(T87Q))-Globin Gene;Negre O等;《Hum Gene Ther》;20161231;第27卷(第2期);第148-165页 *
hemoglobin beta, partial [synthetic construct];Hines,L.等;《GenBank Database》;20160726;Accession No.AAX29557.1 *
High-level β-globin expression and preferred intragenic integration after lentiviral transduction of human cord blood stem cells;Suzan Imren等;《J Clin Invest》;20041231;第114卷(第7期);摘要，第953页右栏第3段，第956页左栏第2段，第959页左栏第1段，图1、3 *
In vivo delivery of a microRNA-regulated transgene induces antigen-specific regulatory T cells and promotes immunologic tolerance;Annoni A等;《Blood》;20091210;第114卷(第25期);5152-61 *
β-地中海贫血基因治疗的研究进展;赖颖晖等;《国际病理科学与临床杂志》;20100531;第30卷(第5期);415-420 *
β-地中海贫血基因治疗的研究进展;邓玲等，;《分子诊断与治疗志》;20210228;第13卷(第2期);415-420 *
慢病毒载体介导的转人ahsp基因的β~(654)地中海贫血小鼠的制备;王宝斌等;《生物技术通讯》;20081130(第06期);54-56 *

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