CN111154003A

CN111154003A - 提高基因敲入效率的Cas9融合蛋白和外源基因敲入整合系统

Info

Publication number: CN111154003A
Application number: CN202010038439.9A
Authority: CN
Inventors: 张献伟; 王豪强; 李国玲; 黄广燕; 刘德武; 李紫聪; 蔡更元; 郑恩琴; 吴珍芳; 杨化强
Original assignee: Wens Foodstuff Group Co Ltd
Current assignee: Wens Foodstuff Group Co Ltd
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2040-01-14
Also published as: CN111154003B

Abstract

本发明公开了一种可以提高基因敲入效率的Cas9融合蛋白和一种安全高效的外源基因敲入整合系统。本发明通过将Cas9蛋白和转录因子的DNA结合域融合制得Cas9融合蛋白用于基因敲入，可以有效提高基因的敲入效率。外源基因敲入整合系统在应用上述Cas9融合蛋白的基础上进一步利用小分子化合物对共转染了表达Cas9融合蛋白和gRNA的表达载体和供体载体的细胞进行干预，可以利用Cas9融合蛋白和小分子化合物的协同作用，有效促进不同基因组及细胞系的KI事件的发生，显著提高基因的敲入效率，为模式动物的生产以及基因治疗提供便利。

Description

提高基因敲入效率的Cas9融合蛋白和外源基因敲入整合系统

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种提高基因敲入效率的Cas9融合蛋白和外源基因敲入整合系统。

背景技术

规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)是一种来源于古细菌和细菌的自我防御系统，主要用来抵御外来入侵病毒的攻击。目前，CRISPR/Cas9(CRISPR associated protein 9)系统已经被开发为一种基因组编辑的重要工具，该系统借助20nt左右的引导RNA(guide RNA，gRNA)特异性识别PAM(protospacer adjacent motifs，间隔序列前体旁序列)区，随后Cas9的RuvC和HNH结构域对目的基因组进行切割，形成DNA双链断裂(DNAdouble-strand break,DSB)。DSB的产生进而诱导细胞激活非同源末端连接(Nonhomologous end joining,NHEJ)或同源定向修复(Homologous directed repair,HDR)机制，最后实现基因组的定向敲除或敲入。由于CRISPR/Cas9系统的易操作、高特异特性使得其在农业、生物医学等领域应用广泛。

一般地，限制基因敲入效率有3个主要因素：转染(或病毒包装)效率、Cas9切割效率和细胞HDR效率。通过优化转染(或病毒包装)效率、使用更高效的Cas9切口酶或突变体、融合激活HDR通路因子或小分子化合物抑制NHEJ修复通路等方式均可以一定程度地提高基因组敲入效率。这些方法的应用有利于基因组敲入事件的发生，但存在位点/细胞差异性或对细胞生长不利。因此，寻找一种更安全高效的基因组敲入方法对模式动物的制备、基因治疗和异种器官移植等具有重要意义。

DNA结合域(DNAbinding domain,DBD)是一类能够识别某种特殊序列的功能域，常见于转录因子中，是转录因子发挥正常功能的重要元件。它们通常通过氢键和范德华力组合装配后与识别基序产生化学性结合。Bolukbasi等人通过分别将DNA结合域ZFPs和TALEs串联在Cas9后面，发现这两个DNA结合域可以识别靶位点附近的DNA序列，从而可以提高Cas9的靶向特异性，降低基因编辑的脱靶风险(Bolukbasi,M.F.,Gupta,A.,Oikemus,S.,etal(2015).DNA-binding-domain fusions enhance the targeting range and precisionof Cas9.NAT METHODS 12,1150-1156.)。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种可以提高基因敲入效率的Cas9融合蛋白。

本发明的第二个目的在于提供一种安全高效的外源基因敲入整合系统。

根据本发明的第一方面，提供了一种可以提高基因敲入效率的Cas9融合蛋白，该Cas9融合蛋白包括Cas9蛋白和来源于转录因子THAP11的DNA结合域(以下称为Cas9-THAP11融合蛋白)。

本发明通过将Cas9蛋白和DNA结合域融合一体，并在利用其进行基因敲入时，在同源供体末端融合DBD识别基序，即可通过DNA结合域识别同源供体以及将同源供体主动抓捕至DSB处对目的基因进行修复，从而可以有效提高基因敲入(Knock in,KI)效率。其中，Cas9蛋白和来源于转录因子THAP11的DNA结合域融合得到的Cas9融合蛋白提高KI效率的效果最佳。Cas9融合蛋白用于外源基因敲入整合系统时的工作原理如图1所示。

在一些实施方式中，Cas9-THAP11融合蛋白的氨基酸序列可以包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

根据本发明的第二方面，提供了编码Cas9-THAP11融合蛋白的核苷酸序列，包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

根据本发明的第三方面，提供了一种表达载体，该表达载体含有编码Cas9-THAP11融合蛋白的核苷酸序列。

在一些实施方式中，该表达载体还可以含有gRNA的核苷酸序列。

在一些实施方式中，该表达载体还含有启动子(包括但不限于CMV、CAG、U6、CBh等)、报告基因(包括但不限GFP、EGFP、RFP、mCherry、荧光素酶等)、接头序列(Linker)、酶切位点等。

根据本发明的第四方面，提供了一种外源基因敲入整合系统，包括：

Cas9-THAP11融合蛋白；或编码Cas9-THAP11融合蛋白的核苷酸序列和/或其PCR扩增引物；或表达Cas9-THAP11融合蛋白的表达载体；和

gRNA的核苷酸序列和/或其PCR扩增引物；或含gRNA的核苷酸序列的表达载体；和

表达供体DNA的供体载体。

根据本发明的第五方面，提供了一种外源基因敲入整合系统，包括：

可同时表达的Cas9-THAP11融合蛋白和gRNA的表达载体；和

表达供体DNA的供体载体。

在一些实施方式中，供体DNA的两末端均可以连接有Cas9-THAP11融合蛋白中来源于转录因子THAP11的DNA结合域的识别序列(以下简称为THAP11-DBD识别基序)。

在一些实施方式中，供体DNA的两末端可以分别连接有两个THAP11-DBD识别基序。

在一些实施方式中，外源基因敲入整合系统还可以包括小分子化合物，小分子化合物可以选自沃尼妙林(CAS：101312-92-9)或其药学上可接受的盐、长春碱(CAS：865-21-4)或其药学上可接受的盐中的一种或多种。将表达Cas9-THAP11融合蛋白和gRNA的表达载体和供体载体转染进细胞后，用上述小分子化合物对转染后的细胞进行干预，可以产生协同作用，进一步显著提高不同基因组及细胞系的基因敲入效率。

在一些实施方式中，小分子化合物可以为沃尼妙林盐酸盐。由此，不仅可以显著提高敲入效率，还可以有效促进细胞生长，对细胞无毒性。

相比于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明通过将Cas9蛋白和THAP11的DNA结合域融合，制得Cas9融合蛋白用于基因敲入，可以有效提高基因的敲入效率；此外，Cas9融合蛋白进一步协同小分子化合物，利用小分子化合物对转染后的细胞进行干预，可以有效促进不同细胞及其位点的KI事件的发生，进一步显著提高基因的敲入效率，为模式动物的生产以及基因治疗提供便利。

附图说明

图1为本发明Cas9融合蛋白用于外源基因敲入整合系统时的工作原理示意图，图中，一个M表示一个DBD识别基序，Donor-LR表示供体DNA左右两末端均连接有DBD识别基序，Donor-R表示供体DNA仅右侧末端连接有DBD识别基序，Donor-L表示供体DNA仅左侧末端连接有DBD识别基序，Donor-NC表示供体DNA左右两末端均不连接DBD识别基序；

图2为PX330-HindIII质粒的图谱；

图3为Cas9相关载体主要结构的结构模式图，从上到下依次为：PX330-gRNA-Cas9载体、PX330-gRNA-Cas9-DBD载体、PX330-gRNA-Cas9-DBD-mCherry载体；

图4表示Cas9与不同转录因子DNA结合域的融合蛋白对KI效率的影响，图中，^*表示P<0.05，^**表示P<0.01；

图5表示DBD识别基序在供体DNA左右两末端不同富集形式对KI效率的影响，图中，mTHAP11-L表示仅在供体DNA左侧末端连接mTHAP11的DBD识别基序，mTHAP11-R表示仅在供体DNA右侧末端连接mTHAP11的DBD识别基序，mTHAP11-LR表示仅在供体DNA左右两侧末端均连接mTHAP11的DBD识别基序，mTHAP11-NC表示供体DNA左右两侧末端均不连接mTHAP11的DBD识别基序，其他DBD类似表述的含义同mTHAP11；^*表示P<0.05，^**表示P<0.01；

图6表示通过Western blot实验验证mTHAP11的DBD识别基序在供体DNA左右两末端不同富集形式对KI效率的影响的结果；

图7表示Cas9-mTHAP11融合蛋白的表达情况；

图8-10表示在供体DNA左右两末端连接不同数目的DBD识别基序对KI效率的影响，图中，^*表示P<0.05，^**表示P<0.01，ns表示P>0.05；

图11表示Cas9-mTHAP11融合蛋白在ACTB位点的KI效率，^**表示与Control组相比，P<0.01；

图12表示Cas9蛋白和Cas9-mTHAP11融合蛋白在HEK293T细胞hACTB位点的切割效率；

图13表示不同浓度的Vinblastine和Valnemulin¹干预对KI效率的影响，^**表示与Control组相比，P<0.01；

图14表示Vinblastine和Valnemulin¹单独干预和共同干预分别在HEK293T细胞GAPDH和ACTB位点的KI效率；^*表示与不加Vinblastine和Valnemulin¹的对照组相比，P<0.05，^**表示与不加Vinblastine和Valnemulin¹的对照组相比，P<0.01；

图15表示分别单独用Vinblastine、Valnemulin¹干预和用Vinblastine和Valnemulin¹共同干预对HEK293T细胞的生长抑制效果；

图16-19依次表示Cas9-mTHAP11融合蛋白协同Valnemulin¹在HEK293T细胞、Hela细胞、HepG2细胞和A549细胞hACTB和hGAPDH位点的KI效率，^*表示与不使用Cas9-mTHAP11融合蛋白和Valnemulin¹的对照组相比，P<0.05，^**表示与不使用Cas9-mTHAP11融合蛋白和Valnemulin¹的对照组相比，P<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。如无特殊说明，实施例中所用试剂均为市售，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明实施例中，有关Cas9相关载体的表述中，“PX330-Cas9-mTHAP11”表示以PX330-HindIII质粒为载体骨架，可以融合表达Cas9和mTHAP11的DBD的表达载体；“PX330-hACTB-Cas9-mTHAP11”表示以PX330-HindIII质粒为载体骨架，可以融合表达Cas9和mTHAP11的DBD以及表达以hACTB为靶位点的gRNA的表达载体。其他类似表述的Cas9载体的含义可以参考上述表达载体。

供体载体中，“2mTHAP11-hGAPDH-2mTHAP11”表示外源基因敲入整合系统中以hGAPDH为靶位点的供体载体中，供体DNA两端分别连接有两个mTHAP11的DBD识别基序。其他类似表述的供体载体的含义可以参考上述表达载体。

实施例1

1、PX330-gRNA-Cas9-DBD载体的构建

(1)根据NCBI提供的转录因子DNA结合域的基因CDS序列设计并合成引物进行PCR扩增(引物见表1)，PCR体系及反应程序参见Takara公司的

Max DNAPolymerase(#R045A)使用说明书，回收和纯化PCR产物。回收和纯化PCR产物的方法参见Omega公司的Gel Extraction Kit(#D2500)说明书。

表1 DBD引物信息表

(2)将PX330-HindIII质粒(PX330-HindIII质粒的图谱如图2所示)按照ThermoFisher公司FastDigest HindIII(#FD0504)的说明书进行单酶切。酶切好的质粒与步骤(1)中纯化好的PCR产物进行无缝克隆，详细克隆过程见Takara公司In-Fusion HDCloning Kits(#639648)的说明书。

(3)转化克隆载体并划线涂板，第二天挑单克隆菌进行Sanger测序，测序引物与表1一致，将正确连接的载体菌液扩大培养并进行质粒抽提备份。测序无误的质粒即为可以融合表达Cas9和DBD的载体，记为PX330-Cas9-DBD载体。

(4)将上述PX330-Cas9-DBD载体按照ThermoFisher公司FastDigest BpiI(#FD1014)的说明书进行单酶切。

(5)以hGAPDH和hACTB为靶位点，设计gRNA并设计合成gRNA oligo引物，gRNAoligo引物序列见表2。

表2 gRNA oligo引物信息表

(6)gRNA引物合成后浓度稀释成10μM，上下游各取5μL轻轻混匀后进行退火反应，反应过程如下：95℃，3min→10℃，1min→95℃，3min→10℃，1min→95℃，3min→10℃，1min→95℃，3min→4℃，10min。

(7)将退火后的gRNA与经Bpi I酶切的PX330-Cas9-DBD载体使用T4连接酶16℃连接2h，转化Trans 5α并划线涂板。将单克隆菌PCR验证后送华大基因测序，测序引物为：

U6-promoter(human):5’-CCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3’。

测序结果无误后进行质粒抽提并备份；即得可同时融合表达Cas9和DBD以及表达gRNA的表达载体，记为PX330-gRNA-Cas9-DBD载体，PX330-gRNA-Cas9-DBD载体主要结构的结构模式如图3所示。

2、PX330-gRNA-Cas9载体的构建：将PX330-HindIII质粒按照ThermoFisher公司FastDigest BpiI(#FD1014)的说明书进行单酶切，然后将退火后的gRNA与经Bpi I酶切的PX330质粒使用T4连接酶16℃连接2h，转化Trans 5α并划线涂板。将单克隆菌PCR验证后送华大基因测序，测序引物为：

U6-promoter(human):5’-CCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3’。

测序结果无误后进行质粒抽提并备份，即得可同时表达Cas9蛋白和gRNA的表达载体，记为PX330-gRNA-Cas9载体，PX330-gRNA-Cas9载体主要结构的结构模式如图3所示。

3、红光校正PX330-gRNA-Cas9-DBD-mCherry载体的构建

红光校正PX330-gRNA-Cas9-DBD-mCherry载体的构建过程与PX330-gRNA-Cas9-DBD载体构建步骤类似：根据pMV-mCherry质粒将mCherry的基因序列通过PCR扩增出来，回收和纯化PCR产物；然后使用EcoR I酶切PX330-gRNA-Cas9-DBD载体，并将酶切好的PX330-gRNA-Cas9-DBD载体和mCherry的PCR产物进行无缝克隆，通过无缝连接酶将mCherry克隆至PX330-gRNA-Cas9-DBD载体中；转化克隆载体并划线涂板，第二天挑单克隆菌进行Sanger测序，测序无误后抽提质粒并备份，即得PX330-gRNA-Cas9-DBD-mCherry载体，PX330-gRNA-Cas9-DBD-mCherry载体主要结构的结构模式如图3所示。

PCR扩增及测序引物为：

inf-mCherry-F:5’-CAAAAAAGAAAAAGGAATTCGAGGGCAGAGGAAGTCTGCT-3’；

inf-mCherry-R:5’-TCAGCGAGCTCTAGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’。

4、供体载体的构建

供体载体由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，供体载体包括Puc57载体骨架、供体DNA和连接于供体DNA末端的DBD识别基序，其中，供体DNA包括插入有外源序列T2A-GFP的靶位点基因整合片段和位于靶位点基因整合片段左右两侧的同源臂。DBD识别基序的序列如表3所示。

表3 DBD识别基序序列

DBD名称	识别序列
		ATF3	GTGACGTACAG
THAP11	ACTACAATTCCCAG
		GAL4	CGGAGGACTGTCCTCCG
PDR1	CCGCCGAATAA

供体DNA的结构模式如图1所示，图中M(Motif，基序)表示DBD识别基序。

5、利用外源基因敲入整合系统进行基因敲入

(1)细胞复苏与传代：将从液氮中取出的细胞(包括HEK293T、Hela、HepG2和A549细胞系)迅速转移至37℃水浴锅中摇晃解冻，解冻后的细胞转移至无菌15mL离心管中，并加入3mL含10％FBS完全培养基，混匀后于90g离心机中离心5min。将离心后的细胞用预热的8mL完全培养基重悬并转移至10cm细胞培养皿中培养。将培养皿放置于37℃，5％CO₂培养箱中，每两天换一次新鲜的培养基。当细胞密度达到80％后，吸去培养皿中的培养基，并用PBS缓慢清洗两次，加入2mL 0.05％胰蛋白酶-EDTA消化酶，培养箱中消化1～2min，待细胞变亮变圆后，轻轻吸去消化酶，并加入3～5mL完全培养基终止消化并重悬。将重悬的细胞等量加入3～5个细胞培养皿中，并补加至8mL培养基后置于细胞培养箱中培养。

(2)细胞转染：以24孔板为例，参照Lipofectamine 3000Reagent(#L3000015)说明书进行共转染，其中Cas9载体用量为500ng/孔，供体载体用量为250ng/孔。转染48h后使用流式细胞术检测绿色荧光细胞比例。

(3)转染校正：为排除系统误差，提高试验可信性和准确度，利用海肾校正和红光校正两种校正方法对基因敲入效率(KI效率)进行校正。

I、海肾校正

校正方法如下(以24孔板为例)：将含海肾基因的PGL3.0载体和Cas9系统(即外源基因敲入整合系统，包括Cas9载体和供体载体)共转入HEK293T细胞中，供体DNA用量为250ng/孔，其中，对照组的Cas9载体为PX330-hGAPDH-Cas9，供体载体中的供体DNA两末端无DBD识别基序；实验组的Cas9载体为PX330-hGAPDH-Cas9-DBD，供体载体为M-hGAPDH-M(M表示DBD识别基序)。转染48h后一部分细胞用于流式细胞术，另一部分细胞用于检测双荧光素酶检测实验，详细实验过程参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，#11402ES60)说明书。将流式细胞术检测到的荧光颗粒和双荧光素酶检测的比值进行归一化处理，比较不同DBD对基因敲入效率的影响。结果如图4所示，由图4的结果可知，Cas9融合THAP11结合域能够明显提高基因敲入效率，提高幅度达50％以上。

II、红光校正

校正方法如下：将pMV-mCherry质粒和Cas9系统(包括PX330-gRNA-Cas9-DBD-mCherry载体和供体载体)共转入HEK293T细胞中，供体DNA用量为250ng/孔。转染48h后利用流式细胞术检测红色荧光细胞中绿色荧光细胞所占比例。

在进行红光校正过程中，通过将PX330-hGAPDH-Cas9-DBD-mCherry和DBD识别基序在供体DNA左右两末端不同富集形式的供体载体(靶位点为hGAPDH)组成的Cas9系统和pMV-mCherry质粒共转入细胞中，考察了不同供体富集形式(分别在供体DNA左端、右端或两端连接DBD识别基序)对KI效果的影响。结果如图5所示，图5结果表明两端富集的形式具有最高的KI效果(47％～96％)，其次为右端富集(60％)，不同的DBD对KI的影响不同。

另外取转染48h后的细胞提取总蛋白进行Western blot实验，实验结果如图6-7所示。图6结果证明了两端富集形式最好，图7结果证实已成功融合Cas9与mTHAP11的DBD。

为了更好的富集Cas9和供体，本实施例通过以PX330-hGAPDH-Cas9-mTHAP11-mCherry为Cas9载体以及在供体DNA两端同时加上不同数目的mTHAP11的DBD识别基序，研究了DBD识别基序的数目能否更深程度地促进KI事件的发生。结果如图8-10所示，结果显示，在供体左右两边识别序列各为两个时，KI效率达到饱和，即过多的识别序列并不会再次显著提升KI效率。

同时，本实施例还以PX330-hACTB-Cas9-mTHAP11-mCherry为Cas9载体、以2mTHAP11-hACTB-2mTHAP11为供体载体研究DBD在不同位点是否具有相同的特性，结果如图11所示，图11的结果表明在ACTB位点使用Cas9-mTHAP11融合蛋白同样能够提高KI效率。

7、T7EI实验鉴定DBD对Cas9切割效率的影响

分别用PX330-hACTB-Cas9载体、PX330-hACTB-Cas9-mTHAP11载体和供体载体2mTHAP11-hACTB-2mTHAP11共转染HEK293T细胞，转染48h后收集两种KI细胞，并对其进行细胞DNA抽提，详细抽提步骤见Omega公司的Tissue DNAKit(#D3396)说明书。使用如下引物扩增基因组DNA：

T7-ACTB-F：5’-GAGCTGTCACATCCAGGGTCCT-3’；

T7-ACTB-R：5’-AGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3’。

琼脂糖凝胶电泳后进行切胶回收，回收条带大小为504bp，回收过程详见Omega公司的Gel Extraction Kit(#D2500)说明书。将回收后的DNA进行T7EI实验，具体过程参考New England Biolabs公司的T7 Endonuclease I(#M0302)说明书。琼脂糖电泳后使用Tanon Gis软件对其进行灰度扫描，结果如图12所示，Cas9蛋白和Cas9-mTHAP11融合蛋白在HEK293T细胞hACTB位点的切割效率分别为64％和66％，即mTHAP11的DNA结合域对Cas9的切割效率无明显影响。

实施例2

1、单一药物对KI效率的影响

将PX330-hACTB-Cas9-mTHAP11载体和2mTHAP11-hACTB-2mTHAP11供体载体共转染至HEK293T细胞中(10cm细胞板)，转染6h后将细胞消化下来，1：1接种至24孔板中，12h后待细胞贴壁后加入小分子化合物，控制终浓度为10μM，并确保每孔仅含一种药物。36～48h后使用流式细胞仪检测绿色荧光表达情况，即为细胞的KI效率。筛选出较好的两种小分子化合物分别为Vinblastine和Valnemulin hydrochloride。将药物梯度稀释后重复上述实验过程，药物终浓度分别设置4个梯度：10μM，5μM，2.5μM，1μM。结果如图13所示，Vinblastine和Valnemulin hydrochloride(图中上标1代表盐酸盐，即Valnemulin¹表示Valnemulinhydrochloride)在终浓度为1μM时仍具有显著的提高KI效率的作用。

2、两种药物联合对KI效率的影响

分别共转染PX330-hACTB-Cas9-mTHAP11载体和供体载体2mTHAP11-hACTB-2mTHAP11、共转染PX330-hGAPDH-Cas9-mTHAP11载体和供体载体2mTHAP11-hGAPDH-2mTHAP11至HEK293T细胞中，转染6h后将细胞消化下来，1：1接种至24孔板中，12h后待细胞贴壁后分别往两种KI细胞中加入Vinblastine、Valnemulin¹和按摩尔比1:1混合的Vinblastine、Valnemulin¹混合物，控制终浓度均为1μM。36～48h后使用流式细胞仪检测绿色荧光表达情况，即为细胞的KI效率。结果如图14所示，由图14的结果可知，在GAPDH和ACTB位点，两种药物具有协同作用，联合后均可以显著提高HEK293T细胞的KI效率，相较于未加小分子化合物组分别提高96％和111％。

3、Vinblastine、Valnemulin¹的细胞毒性

将HEK293T细胞接种至96孔板中，12h后待细胞贴壁后分别往细胞中加入Vinblastine、Valnemulin¹和按摩尔比1:1混合的Vinblastine、Valnemulin¹混合物，控制终浓度为1μM，每个组别设置8个重复。药物加入24h后使用上海翊圣生物科技有限公司的CCK8试剂盒(#40203ES60)检测小分子化合物的细胞毒性，结果如图15所示，由图15的结果可知，单一的Vinblastine抑制细胞生长，单一的Valnemulin¹能够促进细胞生长，而两种化合物联合使用细胞生长的抑制效果加剧。

实施例3

分别共转染PX330-hACTB-Cas9-mTHAP11载体和供体载体2mTHAP11-hACTB-2mTHAP11、共转染PX330-hGAPDH-Cas9-mTHAP11载体和供体载体2mTHAP11-hGAPDH-2mTHAP11至不同的细胞系中，即HEK293T细胞、Hela细胞、HepG2细胞和A549细胞，转染6h后将细胞消化下来，1：1接种至24孔板中，12h后待细胞贴壁后分别往各种KI细胞中加入Valnemulin¹，控制终浓度为1μM，36～48h后使用流式细胞仪检测绿色荧光表达情况，以验证Cas9-mTHAP11融合蛋白协同Valnemulin¹对不同基因组和不同细胞系KI效率的影响。结果如图16-19所示，在HEK293T细胞、Hela细胞和HepG2细胞中，Cas9-mTHAP11融合蛋白协同Valnemulin¹均能够提高外源基因敲入整合系统在hACTB和hGAPDH位点的KI效率，且最高能够提高5倍的KI效率；在A549细胞中，Cas9-mTHAP11融合蛋白协同Valnemulin¹能够现在提高外源基因敲入整合系统在hGAPDH位点的KI效率。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 温氏食品集团股份有限公司

<120> 提高基因敲入效率的Cas9融合蛋白和外源基因敲入整合系统

<130> 2020

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1544

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp

1 5 10 15

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20 25 30

Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu

35 40 45

Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr

50 55 60

Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His

65 70 75 80

Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu

85 90 95

Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr

100 105 110

Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu

115 120 125

Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe

130 135 140

Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn

145 150 155 160

Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His

165 170 175

Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu

180 185 190

Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu

195 200 205

Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe

210 215 220

Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile

225 230 235 240

Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser

245 250 255

Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys

260 265 270

Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr

275 280 285

Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln

290 295 300

Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln

305 310 315 320

Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser

325 330 335

Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr

340 345 350

Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His

355 360 365

Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu

370 375 380

Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly

385 390 395 400

Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys

405 410 415

Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu

420 425 430

Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser

435 440 445

Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg

450 455 460

Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu

465 470 475 480

Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg

485 490 495

Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile

500 505 510

Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln

515 520 525

Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu

530 535 540

Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr

545 550 555 560

Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro

565 570 575

Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe

580 585 590

Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe

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Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp

610 615 620

Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile

625 630 635 640

Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu

645 650 655

Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu

660 665 670

Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys

675 680 685

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Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp

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Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile

725 730 735

His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val

740 745 750

Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly

755 760 765

Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp

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Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile

785 790 795 800

Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser

805 810 815

Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser

820 825 830

Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu

835 840 845

Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp

850 855 860

Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile

865 870 875 880

Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu

885 890 895

Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu

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Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala

915 920 925

Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg

930 935 940

Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu

945 950 955 960

Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser

965 970 975

Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val

980 985 990

Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp

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Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His

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Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr

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Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp

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Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr

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Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu

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Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr

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Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala

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Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys

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Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys

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Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys

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Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val

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Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys

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Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn

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Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp

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Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly

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Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln

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Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr

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Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser

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Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Met

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Ser Thr Phe Gln Pro Thr Thr Gly His Arg Leu Cys Ser Val His Phe

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Gln Gly Gly Arg Lys Thr Tyr Thr Val Arg Val Pro Thr Ile Phe Pro

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Ala Ala Ala Arg Arg Arg Gln Gln Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys

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Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1540

<210> 2

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<212> DNA

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ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca 120

aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 180

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ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt 300

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ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag 540

taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc 600

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ggcagcccgc cgtaggcagc agaaaaggcc ggcggccacg aaaaaggccg gccaggcaaa 5880

aaagaaaaag taagaattcc tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 5940

cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 6000

actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 6060

attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga gaatagcagg 6120

catgctgggg agcggccgca ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc 6180

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cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 6660

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<213> 人工序列()

<400> 7

caccagcccc agcaagagca caag 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

aaaccttgtg ctcttgctgg ggct 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

cacccgtcca ccgcaaatgc ttct 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

aaacagaagc atttgcggtg gacg 24

Claims

1.提高基因敲入效率的Cas9融合蛋白，其中，所述Cas9融合蛋白包括Cas9蛋白和来源于转录因子THAP11的DNA结合域。

2.根据权利要求1所述的Cas9融合蛋白，其中，所述Cas9融合蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

3.编码权利要求1或2所述的Cas9融合蛋白的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.含权利要求3所述的核苷酸序列的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其中，所述表达载体中还含有gRNA的核苷酸序列。

6.外源基因敲入整合系统，其中，包括：

权利要求1或2所述的Cas9融合蛋白；或权利要求3所述的核苷酸序列和/或其PCR扩增引物；或权利要求4所述的表达载体；和

表达供体DNA的供体载体。

7.外源基因敲入整合系统，其中，包括：权利要求5所述的表达载体和表达供体DNA的供体载体。

8.根据权利要求6或7所述的外源基因敲入整合系统，其中，所述供体DNA的两末端均连接有权利要求1所述的来源于转录因子THAP11的DNA结合域的识别序列。

9.根据权利要求8所述的外源基因敲入整合系统，其中，所述供体DNA的两末端分别连接有两个权利要求1所述的来源于转录因子THAP11的DNA结合域的识别序列。

10.根据权利要求8所述的外源基因敲入整合系统，其中，还包括小分子化合物，所述小分子化合物选自沃尼妙林或其药学上可接受的盐、长春碱或其药学上可接受的盐中的一种或多种。