CN112159809B

CN112159809B - 靶向CTGF基因的gRNA及其应用

Info

Publication number: CN112159809B
Application number: CN202011002055.8A
Authority: CN
Inventors: 梁峻彬; 徐辉; 欧家裕; 古博
Original assignee: Guangzhou Ruifeng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Ruifeng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2040-09-22
Also published as: WO2022062440A1; CA3193112A1; CN112159809A; CN114250228A; US20230212615A1

Abstract

本发明涉及一种靶向CTGF基因的gRNA及其应用，属于基因编辑技术领域。该gRNA靶向切割CTGF基因启动子的SMAD结合位点区域，或者，所述gRNA靶向切割CTGF基因外显子2区域。本发明的gRNA通过CRISPR‑Cas基因编辑系统，可降低人CTGF基因的过表达。将上述gRNA用于制备针对纤维化疾病的药物，具有疗效持久稳定、不良反应小、治疗频率低、患者顺应性好、长期治疗成本低的优势。

Description

靶向CTGF基因的gRNA及其应用

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及一种靶向CTGF基因的gRNA及其应用。

背景技术

特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，简称IPF)，有时也称为普通型间质肺炎(usual interstitial pneumonia,UIP)，是一种慢性、进行性、纤维化性间质性肺疾病，其肺组织学特征性表现为普通型间质性肺炎，是特发性间质性肺炎(idiopathicinterstitial pneumonia,IIP)中最常见的类型。按病程有急性、亚急性和慢性之分。本病多为散发，据统计，每年整体人群中的患病率约(2～29)/10万，且呈逐渐增长趋势。IPF诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤。

特发性肺纤维化(IPF)中的纤维化机制复杂，目前仍然不清楚。已知有许多可能在肺纤维化发病机制中起作用的基因突变，涉及Surfactant proteins、MUC5B、Telomerase-related genes、AKAP13等。

需要指出的是，虽然IPF发病机制的许多研究来自肺纤维化动物模型，但遗憾的是，肺纤维化的动物模型并不能很好地诠释人类IPF。

IPF的发病和肺泡结构中的上皮细胞相关。正常肺泡组织中存在有两类肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cell，简称AEC)，即I型和II型(AEC1和AEC2)。遗传或环境因素导致AEC2细胞功能异常，发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，并在生长因子、细胞因子及一系列信号通路激活的情况下(如TGFβ)，聚集成纤维细胞至肺泡结构，并且引发大量细胞外间质聚集，从而导致肺纤维化。而纤维化结构又会聚集更多的成纤维细胞聚集，形成一种循环反馈效应。

IPF的发生和TGFβ信号通路的激活相关。IPF患者的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage,BAL)含有较多的TGF-β，包括其活性形式TGF-β1。TGF-β1是结缔组织合成最强效的调节因子之一，因其能增加结缔组织合成、下调结缔组织蛋白酶和增加结缔组织蛋白酶抑制剂。TGF-β1还可诱导产生许多参与纤维化的生长因子和细胞因子，包括结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、FGF-2、PDGF、胰岛素样生长因子和白细胞介素。

TGFβ通过结缔组织生长因子(CTGF)向下游传导促纤维化信号，SMAD蛋白(Sma andMad proteins)是该信号通路的重要组成部分。在TGFβ信号由细胞膜传递至细胞核的过程中，SMAD蛋白起到了关键性的作用。SMAD蛋白(SMAD1、SMAD5和SMAD8)被活化的BMPR1受体磷酸化后，从细胞膜受体上脱离下来，并在胞质内结合SMAD4分子(common SMAD，Co-SMAD)后进入细胞核。在细胞核内，SMAD多元复合物在其它DNA结合蛋白的参与下作用于CTGF基因，调控该基因的转录。

正常细胞中，CTGF表达量很低，IPF中，CTGF在肺泡上皮细胞和成纤维细胞大量表达，向下游传导促纤维化信号。针对CTGF蛋白靶标，已有抗体药物在临床实验中表现出较好效果。据文献报道，与SMAD结合位点临近的GTGTCAAGGGGTC序列也是TGFβ的响应元件(JClin Pathol:Mol Pathol 2001；54:192–196)

对于IPF目前尚未有特效药物面市。美国FDA至今已经批准了两种小分子药物，分别为吡非尼酮和尼达尼布，均为口服制剂，需每日服药2次或3次，且经全身分布后引起多种不良反应。吡非尼酮会引起肝酶上升、对光敏感、皮疹、胃肠道不适等症状，而尼达尼布则会引发出血、肝酶上升、胃肠道不适、胎儿损伤等。另外，吡非尼酮和尼达尼布仅能在一定程度上延缓肺纤维化的发病，随着时间进展，疾病仍会逐步加重。

目前进入临床实验的大分子药物主要是单克隆抗体、双靶位点抗体和重组蛋白。然而，这些大分子药物的临床实验由于安全性问题等种种原因被迫中止。目前处于临床前研究阶段的生物药物主要为寡聚RNA，包括siRNA。寡聚RNA的作用层次为RNA水平，主要问题和蛋白抗体类药物类似，需要长期连续给药，带来不便，也使得治疗成本提升。另外，siRNA存在肝脏聚集(肝毒性)、容易被网状内皮系统清除、游离分子靶向性不好，需要接合配体或被载体包裹用于靶向输送等缺陷。一般的寡聚RNA特异性不如siRNA好。

目前临床上对于治疗IPF的药物仍存在迫切的需求。

基因编辑技术是以特异性改变遗传物质靶向序列为目标的技术。近年来，锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)、类转录激活因子效应核酸酶(transcriptionactivator-like effector nuclease,TALEN)、规律成簇间隔短回文重复(regularclustering of short palindrome repeats,CRISPR)和单碱基编辑(base editing,BE)技术的相继出现，不仅为基因功能研究提供了有力的工具，还为生命医学提供了新的治疗方案。

目前普遍认为相比小分子化学药、抗体类药物、重组蛋白、siRNA类药物而言，基因疗法(包括CRISPR基因编辑治疗)通过基因层面的操作达到持久且稳定的疗效，可减少因长期给药导致的不良反应，且治疗方便，长期治疗的成本相对更低。另外，通过编辑非编码区的调控元件进行治疗，相对来说也更容易达到治疗效果与安全性的平衡。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种靶向CTGF基因的gRNA，可用于CRISPR基因编辑治疗中，通过基因层面的操作达到持久且稳定的疗效，可减少因长期给药导致的不良反应，且具有治疗方便，长期治疗的成本相对更低的优势。

本发明提供一种靶向CTGF基因的gRNA，所述gRNA靶向切割CTGF基因启动子的SMAD结合位点区域，或者，所述gRNA靶向切割CTGF基因外显子2区域。

可以理解的，所述SMAD结合位点区域包括SMAD结合位点所在单链的临近序列，以及SMAD结合位点的反向互补序列所在单链的临近序列。

本发明的gRNA可引导Cas核酸酶靶向切割人CTGF基因而改变CTGF基因序列(如启动子、外显子等)，使CTGF基因表达下调>2％、>5％、>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％或>90％；包括但不限于通过本发明的gRNA引入双链断裂(DSB)后通过NHEJ或HDR途径修复CTGF基因并因此使其表达下调，以及通过本发明的gRNA实现碱基替换而破坏相应序列的功能并因此实现CTGF基因表达下调。

为获得能够靶向编辑切割CTGF基因的gRNA，本发明人对人CTGF基因序列进行调研、考察以及实验验证后发现，人CTGF基因位于6号染色体，该基因的启动子区域含有SMAD蛋白的结合位点，该位点的序列在人和小鼠高度保守。人CTGF基因启动子的SMAD结合位点位于转录起始位点上游的CAGACGGA序列。因此，将CTGF基因启动子的SMAD结合位点区域，或外显子2区域作为CRISPR基因编辑的靶向区域，且实验证实具有较好的编辑效率。

本发明中对比了靶向CTGF基因启动子的SMAD结合位点区域以及靶向编辑其他靶点(如TGFβ响应元件)区域的gRNA和CRISPR-Cas系统，实验表明，靶向启动子SMAD结合位点区域能够更显著地降低CTGF基因的过表达，具有较优的编辑效果。

在其中一个实施例中，所述SMAD结合位点区域如SEQ ID NO:38所示或为其反向互补序列；所述CTGF基因外显子2区域为如SEQ ID NO:39所示序列及其反向互补序列。

在其中一个实施例中，所述SMAD结合位点区域如SEQ ID NO:40所示序列或为其反向互补序列。

可以理解的，上述SMAD的结合位点为CAGACGGA序列，在此序列或其反向互补序列的上游或下游10个核苷酸以内的区域(即SEQ ID NO:38所示区域)均可被靶向从而编辑CTGF基因；进一步地，所述靶向结构域靶向SMAD的结合位点CAGACGGA或其反向互补序列上游或下游5个核苷酸以内的区域(即SEQ ID NO:40所示区域)；更进一步地，所述靶向结构域靶向SMAD的结合位点CAGACGGA或其反向互补序列(即SEQ ID NO:41所示区域)。

在其中一个实施例中，所述SMAD结合位点区域序列如SEQ ID NO:40所示或为其反向互补序列。

在其中一个实施例中，所述CTGF基因启动子的SMAD结合位点区域序列如SEQ IDNO:41所示或为其反向互补序列。

在其中一个实施例中，所述gRNA包含靶向结构域，所述靶向结构域选自：

1)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32任一所示的基础序列；

2)与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32任一所示序列具有≥40％序列一致性的扩展序列。

可以理解的，所述扩展序列与所述基础序列的序列一致性也可≥50％、≥60％、≥70％、≥80％或≥90％。靶向结构域具有与靶序列(位于SMAD结合位点区域或外显子2区域)反向互补(部分互补或完全互补)的结构域，所述扩展序列为在基础序列的基础上，通过删减、加入或置换部分碱基，但依然还具有基础序列靶向功能的序列，如与基础序列相差不超过10、5、3或1个核苷酸等。

进一步地，在其中一个实施例中，所述靶向结构域选自：

1)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32任一所示的基础序列；

2)与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32任一所示序列具有至少90％序列一致性的扩展序列。

上述SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32序列如下表所示：

表1.gRNA靶向结构域序列表

编号	gRNA靶向结构域序列
		SEQ ID NO:1	GUGCCAGCUUUUUCAGA
SEQ ID NO:2	UGUGCCAGCUUUUUCAGA
		SEQ ID NO:3	GUGUGCCAGCUUUUUCAGA
SEQ ID NO:4	AGUGUGCCAGCUUUUUCAGA
		SEQ ID NO:5	GAGUGUGCCAGCUUUUUCAGA
SEQ ID NO:6	GGAGUGUGCCAGCUUUUUCAGA
		SEQ ID NO:7	UGGAGUGUGCCAGCUUUUUCAGA
SEQ ID NO:8	CUGGAGUGUGCCAGCUUUUUCAGA
		SEQ ID NO:9	CCAGCUUUUUCAGACGG
SEQ ID NO:10	GCCAGCUUUUUCAGACGG
		SEQ ID NO:11	UGCCAGCUUUUUCAGACGG
SEQ ID NO:12	GUGCCAGCUUUUUCAGACGG
		SEQ ID NO:13	UGUGCCAGCUUUUUCAGACGG
SEQ ID NO:14	GUGUGCCAGCUUUUUCAGACGG
		SEQ ID NO:15	AGUGUGCCAGCUUUUUCAGACGG
SEQ ID NO:16	GAGUGUGCCAGCUUUUUCAGACGG
		SEQ ID NO:17	GUCUGCGCCAAGCAGCU
SEQ ID NO:18	CGUCUGCGCCAAGCAGCU
		SEQ ID NO:19	GCGUCUGCGCCAAGCAGCU
SEQ ID NO:20	CGCGUCUGCGCCAAGCAGCU
		SEQ ID NO:21	CCGCGUCUGCGCCAAGCAGCU
SEQ ID NO:22	GCCGCGUCUGCGCCAAGCAGCU
		SEQ ID NO:23	UGCCGCGUCUGCGCCAAGCAGCU
SEQ ID NO:24	CUGCCGCGUCUGCGCCAAGCAGCU
		SEQ ID NO:25	CGUCUGCGCCAAGCAGC
SEQ ID NO:26	GCGUCUGCGCCAAGCAGC
		SEQ ID NO:27	CGCGUCUGCGCCAAGCAGC
SEQ ID NO:28	CCGCGUCUGCGCCAAGCAGC
		SEQ ID NO:29	GCCGCGUCUGCGCCAAGCAGC
SEQ ID NO:30	UGCCGCGUCUGCGCCAAGCAGC
		SEQ ID NO:31	CUGCCGCGUCUGCGCCAAGCAGC
SEQ ID NO:32	GCUGCCGCGUCUGCGCCAAGCAGC

上述序列中，SEQ ID NO：1～16是针对SMAD结合位点设计，SEQ ID NO：17～32是针对外显子2设计。

在其中一个实施例中，所述基础序列选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:31任一所示序列。本发明人通过实验证实，采用上述序列，具有好的编辑效果。

本发明还公开了一种靶向编辑CTGF基因的gRNA表达载体，包含编码如上述的gRNA的核苷酸序列。

上述表达载体，可表达用于靶向编辑CTGF基因的gRNA，可以理解的，本领域技术人员可参照常规技术构建。

在其中一个实施例中，所述表达载体选自：质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体中的至少一种。进一步地，所述表达载体选自腺相关病毒载体。

本发明还公开了一种靶向编辑CTGF基因的CRISPR系统，包括上述的gRNA。

以该靶向编辑CTGF基因的CRISPR系统，与目标对象细胞进行接触，可改变该细胞基因序列，从而影响纤维化进程，以达到对纤维化疾病的控制。

在其中一个实施例中，所述gRNA为单分子gRNA。

在其中一个实施例中，所述gRNA为双分子gRNA。

在其中一个实施例中，该CRISPR系统还包括Cas9核酸酶。上述gRNA配合Cas9核酸酶，在细胞中编辑效率高，可显著降低CTGF基因的过表达。

本发明还公开了一种靶向编辑CTGF基因的组合物，包括：gRNA系统和Cas酶系统，所述gRNA系统可直接或间接包含上述的gRNA，所述Cas酶系统可直接或间接包含Cas酶。

可以理解的，上述直接包含gRNA指直接使用化学合成的gRNA进行配制，间接包含gRNA指可通过基因工程的转录等常规手段产生gRNA；同样的，对于直接包含Cas酶指直接使用纯化的Cas蛋白进行配制，间接包含Cas酶指通过基因工程的手段间接产生Cas酶。

在其中一个实施例中，所述gRNA系统选自：上述的gRNA，或编码如上述的gRNA的核酸；所述Cas酶系统选自：Cas核酸酶，或编码Cas核酸酶的核酸。

本发明还公开了一种靶向CTGF基因的脂质体，包含活性成分以及作为载体的脂质成分，所述活性成分包含上述的gRNA、上述的gRNA表达载体、上述的CRISPR系统、或上述的组合物。

本发明还公开了上述的gRNA、gRNA表达载体、CRISPR系统、或组合物在制备用于治疗纤维化疾病的药物中的应用。

可以理解的，本发明的gRNA针对CTGF基因设计，能够编辑CTGF基因，从而对受CTGF基因影响或调控的纤维化疾病均具有治疗作用。

在其中一个实施例中，所述纤维化疾病为肺纤维化。

进一步地，所述纤维化疾病为特发性肺纤维化。

在其中一个实施例中，所述药物通过吸入给药。通过吸入直接针对肺部给药，可以降低给药剂量，避免产生全身性不良反应。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种靶向人CTGF基因的gRNA，针对CTGF基因启动子的SMAD结合位点区域或外显子2区域作为靶向区域而设计，以此gRNA通过CRISPR-Cas基因编辑系统可降低人CTGF基因的过表达。本发明提供的靶向CTGF基因的gRNA通过CRISPR-Cas基因编辑系统可降低人CTGF基因的过表达。

将上述gRNA用于制备针对纤维化疾病的药物，具有疗效持久稳定、不良反应小、治疗频率低、患者顺应性好、长期治疗成本低的优势。

并且，本发明通过实验证实，特别是靶向SMAD结合位点的gRNA，可显著降低CTGF基因过表达，效果优于靶向其他TGFβ响应元件的CRISPR-Cas系统。

附图说明

图1为实施例1中示例性的质粒相关的电泳图。

其中：从左到右分别为Exon2-sgRNA2、SMAD-sgRNA2、SMAD-sgRNA6组。

图2为实施例1中示例性的Exon2-sgRNA2、SMAD-sgRNA2、SMAD-sgRNA6组载体测序峰图。

图3为实施例1中转染细胞的示例性的PCR电泳结果。

其中：E1：Exon2-sgRNA2编辑后，用Exon2特异引物扩增产物；E2：NC sgRNA编辑后，用Exon2特异引物扩增产物；E3：WT基因组抽提后，用Exon2特异引物扩增产物；S1：SMAD-sgRNA2编辑后，用SMAD结合位点特异引物扩增产物；S2：SMAD-sgRNA6编辑后，用SMAD结合位点特异引物扩增产物；S3:NC sgRNA编辑后，用SMAD结合位点特异引物扩增产物；S4：WT基因组抽提后，用SMAD结合位点特异引物扩增产物。

图4为实施例1中各组的基因编辑效率。

图5为实施例2中hCTGF mRNA相对表达量测试结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

定义：

本发明所述的gRNA分子包含与CTGF基因序列互补的靶向结构域，以及固定序列结构域(骨架序列)。本发明所述的gRNA分子可在任意核苷酸上进行化学修饰。

本发明所述的“Cas酶”指CRISPR相关核酸酶，包括CRISPR相关核酸酶分子或其融合蛋白，包括但不限于TypeⅡ、Ⅴ、Ⅵ核酸酶。

本发明所述的“Cas9”包括但不限于SpCas9、SaCas9、Nme2Cas9、Nme3Cas9、CjCas9、NmCas9、FnCas9、nCas9和dCas9分子，以及它们的融合蛋白和突变体。

下列实施例中的试剂、材料如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。

实施例1

通过CRISPR基因编辑方法编辑CTGF基因启动子元件或外显子2。

1、载体制备。

1)确定gRNA靶向结构域(与靶序列的序列相同)：

根据人CTGF基因启动子区域SMAD结合位点附近序列和外显子2(Exon2)序列，设计靶向结构域长度为17nt～24nt的gRNA。另外设计了靶向SMAD结合位点临近的TGFβ响应元件GTGTCAAGGGGTC序列的gRNA(Responsive-sgRNAx)。其中部分如表2所示。

表2.设计的gRNA靶向结构域

gRNA名称	靶向结构域序列	靶向结构域序列
			SMAD-sgRNA1	SEQ ID NO:1	GUGCCAGCUUUUUCAGA
SMAD-sgRNA2	SEQ ID NO:4	AGUGUGCCAGCUUUUUCAGA
			SMAD-sgRNA3	SEQ ID NO:6	GGAGUGUGCCAGCUUUUUCAGA
SMAD-sgRNA4	SEQ ID NO:8	CUGGAGUGUGCCAGCUUUUUCAGA
			SMAD-sgRNA5	SEQ ID NO:9	CCAGCUUUUUCAGACGG
SMAD-sgRNA6	SEQ ID NO:12	GUGCCAGCUUUUUCAGACGG
			SMAD-sgRNA7	SEQ ID NO:14	GUGUGCCAGCUUUUUCAGACGG
SMAD-sgRNA8	SEQ ID NO:16	GAGUGUGCCAGCUUUUUCAGACGG
			Exon2-sgRNA1	SEQ ID NO:18	CGUCUGCGCCAAGCAGCU
Exon2-sgRNA2	SEQ ID NO:20	CGCGUCUGCGCCAAGCAGCU
			Exon2-sgRNA3	SEQ ID NO:31	CUGCCGCGUCUGCGCCAAGCAGC
SMAD-sagRNA1	SEQ ID NO:9	CCAGCUUUUUCAGACGG
			SMAD-sagRNA2	SEQ ID NO:12	GUGCCAGCUUUUUCAGACGG
SMAD-sagRNA3	SEQ ID NO:14	GUGUGCCAGCUUUUUCAGACGG
			SMAD-sagRNA4	SEQ ID NO:16	GAGUGUGCCAGCUUUUUCAGACGG
Responsive-sgRNA1	SEQ ID NO:33	AGGAAUGCUGAGUGUCA
			Responsive-sgRNA2	SEQ ID NO:34	CGGAGGAAUGCUGAGUGUCA
Responsive-sgRNA3	SEQ ID NO:35	CAGACGGAGGAAUGCUGAGUGUCA

上述设计的gRNA中，SMAD-sgRNAx、Exon2-sgRNAx和Responsive-sgRNAx(x为序号)对应于后续的SpCas9质粒构建，SMAD-sagRNAx(x为序号)对应于后续的SaCas9质粒构建。

按照常规方法合成得到与上述gRNA靶向结构域对应的DNA序列正义链和反义链(正义链的5’-端加cacc，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在正义链的5’-端加caccg；在反义链的5’-端加aaac，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在反义链的3’-端加C)。

将上述gRNA靶序列对应的DNA序列正义链和反义链混合(针对每对正义链和反义链[F/R链]分别进行试验)，在PCR仪内95℃孵育5分钟，随后立刻取出并在冰上孵育5分钟，退火形成含粘性末端的双链DNA。

取上述2μl退火产物，用去离子水稀释500倍。

2)T4连接反应

采用限制性内切酶Bbs I对PX459质粒(含SpCas9及AmpR对应序列)进行酶切，电泳检测酶切效果并回收PX459载体酶切产物，切胶回收线性化PX459，然后与退火后的双链DNA进行连接反应；反应体系如下表所示，在PCR仪内16℃孵育1小时，使退火产物与线性化的骨架完成连接，得到SpCas9质粒。

表3.连接反应体系

退火产物(稀释1000倍)	2μl
		线性化的骨架载体	5ng
Solution I(Takara)	3μl
		去离子水	加至6μl

参照上述类似方法，用限制性内切酶Bsa I对pX601质粒(含SaCas9及AmpR对应序列)进行酶切，回收，连接，得到SaCas9质粒。

示例性地，SMAD-sgRNA2组、SMAD-sagRNA2组构建得到的质粒序列分别如SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37所示。

2、质粒转化和氨苄抗性固体培养板涂板。

1)在超净台内，将全部T4连接的反应产物迅速加入到1管(50微升)大肠杆菌DH5α感受态细胞内，随后将其放冰上孵育30分钟。

2)将感受态细胞浸入42℃水浴锅中热击90秒，再放回冰上孵育2分钟。

3)在超净台内，加入400μL不含抗生素的LB培养基，随后将菌液放到细菌摇床内，37℃下200rpm培养复苏1小时。复苏期间，开启生化培养箱，将含适量氨苄青霉素的LB琼脂平板放入使其干燥。

4)菌液室温12000rpm离心1分钟，吸取移除大部分上清液，保留约50μL后充分重悬沉淀。

5)吸取菌液滴到含氨苄青霉素LB琼脂平板的边缘，使用移液器吸头在平板上划线。随后将平板倒置放入生化培养箱中，继续培养16-18小时。

3、挑选阳性克隆，扩大培养后提取质粒并测序。

1)超净台内使用1-10μl移液器吸头分别挑取7个单克隆到50μl含氨苄青霉素LB培养基中，吹打数次使菌体与LB培养基混匀。

2)吸取2μL菌液加入到菌落PCR反应液(如下表所示)中，混合均匀后瞬时离心使液体聚集于管底，随后进行PCR反应。剩余菌液置于生化培养箱中继续培养。引物PX459-R序列为GAGTGAAGCAGAACGTGGGG(SEQ ID NO:42)，引物pX601-R序列为GCTGGCA AGTGTAGCGGTCA(SEQ ID NO:43)。

表4.SpCas9质粒菌株对应的PCR反应液

2×Accurate Taq Master Mix(dye plus)	10μl；
		U6 Promoter-F(10μM)	0.25μl；
PX459-R(10μM)	0.25μl；
		去离子水	7.5μl

表5.SaCas9质粒菌株对应的PCR反应液

2×Accurate Taq Master Mix(dye plus)	10μl；
		U6 Promoter-F(10μM)	0.25μl；
pX601-R(10μM)	0.25μl；
		去离子水	7.5μl

3)PCR完成后，取2μl PCR产物与1μl 6×Loading Buffer混合，加入琼脂糖凝胶的加样孔中，进行琼脂糖凝胶电泳。

4)电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果，选取电泳条带大小正确、单一、亮度正常的克隆视为阳性克隆。图1示例性地给出了PX459质粒相关的电泳图，从左到右分别为Exon2-sgRNA2(Exon2)、SMAD-sgRNA2(SMAD bind1)、SMAD-sgRNA6(SMAD bind2)组，NC表示阴性对照。

5)超净台内，将生化培养箱中培养的阳性克隆菌液全部加入含5ml氨苄青霉素LB培养基的50ml离心管中，盖好盖子，将离心管放入细菌摇床倾斜固定，37℃，200rpm培养16-18小时。

6)菌液用于质粒提取，操作流程按照质粒DNA提取试剂盒的说明书，最后用50μlElution Buffer洗脱。

7)按Qubit4 Fluorometer的操作方法，用Qubit dsDNA BR Assay Kit测定浓度。

8)每个质粒选取一个阳性克隆，提供5-10μl用于Sanger测序，测序引物选用通用的U6-Promoter-F(ACGATACAAGGCTGTTAGAG(SEQ ID NO:44))。图2示例性地给出了部分测序结果图，其中，A为Exon2-sgRNA2组载体测序峰图、B为SMAD-sgRNA2组载体测序峰图、C为SMAD-sgRNA6组载体测序峰图，从图中可以看出，成功构建得到目标质粒。

4、转染细胞，提取基因组，鉴定基因型

用Lipofectamine2000转染HEK293T细胞，转染试剂由Lipofectamine2000，Cas9质粒组成。细胞接种于24孔板，每孔5X10⁵个细胞，加入500ng质粒。

转染后72h消化收集细胞，提取基因组。

用以下特异性引物扩增gRNA结合位点上下游约500bp的序列。

CTGF-SMAD-PCR-F：CTCAGCGGGGAAGAGTTGTT(SEQ ID NO:45)

CTGF-SMAD-PCR-R：TGCTGTTTGCCTCTTCAGCT(SEQ ID NO:46)

CTGF-EXON2-PCR-F：CTCAGTCCGAGCGGTTTCTT(SEQ ID NO:47)

CTGF-EXON2-PCR-R：ATGACCGCCGCCAGTATG(SEQ ID NO:48)

Responsive-PCR-F：CTCTTTGGAGAGTTTCAAGAGCC(SEQ ID NO:49)

Responsive-PCR-R：TCGAGCTGGAGGGTGGAGTC(SEQ ID NO:50)

其中，CTGF-SMAD-PCR-F和CTGF-SMAD-PCR-R用于扩增SMAD结合位点上下游约500bp片段，Responsive-PCR-F和Responsive-PCR-R用于扩增TGFβ响应元件GTGTCAAGGGGTC序列上下游约250bp片段，CTGF-EXON2-PCR-F和CTGF-EXON2-PCR-R为扩增CTGF基因第二个外显子中切割位点上下游约500bp片段。

配制PCR反应体系如下，总体积20μl：

以1％琼脂糖电泳检测PCR产物，图3为示例性地给出了部分测试结果，其中，E1为Exon2-sgRNA2编辑后，用Exon2特异引物扩增产物；E2为阴性对照sgRNA编辑后，用Exon2特异引物扩增产物；E3为野生型基因组抽提后，用Exon2特异引物扩增产物；S1为SMAD-sgRNA2编辑后，用SMAD结合位点特异引物扩增产物；S2为SMAD-sgRNA6编辑后，用SMAD结合位点特异引物扩增产物；S3为阴性对照sgRNA编辑后，用SMAD结合位点特异引物扩增产物；S4为WT基因组抽提后，用SMAD结合位点特异引物扩增产物。

随后，对PCR产物用试剂盒回收并进行Sanger测序，各质粒分别重复三次实验。

测序结果导入TIDE分析网站(https://ice.synthego.com/#/)，获取基因编辑效率，结果如下表和图4所示。

表6.各组的基因编辑效率

从上述结果可以看出，通过本发明人精心设计的gRNA，分别靶向SMAD结合位点、TGFβ响应元件GTGTCAAGGGGTC序列或外显子2的GCTGCCGCGTCTGCGCCAAGCAGCT序列时都可达到符合要求的编辑效率。

实施例2

对肺纤维化细胞模型进行基因编辑。

1、实验材料。

核酸纯化试剂盒与2×Accurate Taq master Mix、逆转录试剂盒、2X

Green Pro Taq HS Premix购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，OPTI-MEM以及Lipofectamine 3000转染试剂购自Thermo公司，TGF-β1、SpCas9蛋白以及SaCas9蛋白购自Novoprotein。PCR与测序所用的引物、相关RNA由试剂公司合成。A549细胞为市售。

2、实验方法。

2.1实验分组

按照以下方式进行分组：

A549组：无任何处理的空白对照；

A549 TGF-β1组：仅用TGF-β1处理细胞而未转染RNP。

SMAD-sgRNAx各组(x为序号)：其中gRNA靶向结构域同实施例1，gRNA完整序列为：靶向结构域-骨架序列，所述骨架序列为

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:51)。

SMAD-sagRNAx各组(x为序号)：其中所对应的gRNA靶向结构域同实施例1，gRNA完整序列为：靶向结构域-骨架序列，所述骨架序列为

GUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUU(SEQ ID NO:52)。

Responsive-sgRNAx各组(x为序号)：该组中gRNA靶向编辑与SMAD结合位点临近的TGFβ响应元件GTGTCAAGGGGTC序列，gRNA靶向结构域如下表所示，gRNA完整序列为：靶向结构域-骨架序列，所述骨架序列为

对照Negative组：其中gRNA的靶序列为CTGF基因SMAD结合位点约200nt距离的TGTATGTCAGTGGACAGAAC序列，gRNA完整序列为UGUAUGUCAGUGGACAGAACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:53)。

实际上，SMAD-sgRNAx、SMAD-sagRNAx和Responsive-sgRNAx各组所使用的gRNA与实施例一中质粒转录出的gRNA序列相同。

2.2实验步骤

2.2.1.细胞处理

转染前一天，将A549细胞按1×10⁵/孔接种至24孔板。

2.2.2.RNP转染

①对于SpCas9的RNP转染

用化学方法合成SMAD-sgRNAx组、Responsive-sgRNAx组和Negative组的gRNA分子。

配置转染复合物A1：取25μl OPTI-MEM培养基(Thermo，2120588)加入6pmolSpCas9蛋白(Novoprotein，E365-01A)，随后分别加入12pmol的gRNA，轻柔混匀后室温静置20分钟，使RNP复合物形成；

配置转染复合物B1：取25μl OPTI-MEM培养基，加入3μl Lipofectamine 3000(Thermo，L3000-15)转染试剂，轻柔混匀后室温静置5分钟；

将转染复合物A1加到转染复合物B1中并轻柔混匀，室温静置15分钟，随后将混合物加入细胞中，继续培养24小时。

②对于SaCas9的RNP转染

用化学方法合成SMAD-sagRNAx组的gRNA分子。

配置转染复合物A2：取25μl OPTI-MEM培养基，加入4pmol SaCas9蛋白(Novoprotein，E372-01A)以及8pmol gRNA，轻柔混匀后室温静置20分钟，使RNP复合物形成；

配置转染复合物B2：取25μl OPTI-MEM培养基，加入2μl Lipofectamine 3000转染试剂，轻柔混匀后室温静置5分钟；

将转染复合物A2加到转染复合物B2中并轻柔混匀，室温静置15分钟，随后将混合物加入细胞中，继续培养24小时。

2.2.3.加入TGF-β1(Novoprotein，P01137)至终浓度为10ng/ml，继续培养48小时。

2.2.4.收集细胞样品使用SteadyPure Universal RNA Extraction Kit(艾科瑞生物，AG21017)提取RNA。

2.2.5.对于RNA样品，使用Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR II(艾科瑞生物，AG11711)进行gDNA去除与逆转录反应。

2.2.6.使用相对定量QPCR检测CTGF mRNA的相对表达量变化，以GAPDH为内参。引物设计及QPCR反应体系如下：

引物设计：

hCTGF-QPCR-F：GCGTGTGCACCGCCAAAGAT(SEQ ID NO:54)

hCTGF-QPCR-R：AACGTCCATGCTGCACAGGG(SEQ ID NO:55)

hGAPDH-QPCR-F：GGAAACTGTGGCGTGATGGC(SEQ ID NO:56)

hGAPDH-QPCR-R：GCTTCACCACCTTCTTGATGTC(SEQ ID NO:57)

QPCR反应体系：

2.2.7.各组分别重复3次实验。

3、实验结果

使用2-ΔΔCT方法进行结果分析，结果如下表和图5所示。

表7.hCTGF mRNA相对表达量

注：*表示与Responsive-sgRNAx组相比有统计学差异(P<0.05)。

上述实验结果证明造模成功。发明人意外地发现，相比Responsive-sgRNAx组来说，SMAD-sagRNAx和SMAD-sgRNAx组能更有效地降低hCTGF mRNA表达量。

说明相比靶向编辑TGFβ响应元件GTGTCAAGGGGTC序列而言，靶向编辑SMAD结合位点的gRNA或CRISPR-Cas系统能更有效地降低CTGF基因的过表达。

另外，SaCas9和SpCas9分别联合本发明的gRNA编辑SMAD结合位点后都显著降低了hCTGF mRNA表达量，都有很好的效果，尽管二者使用了不同的Cas酶，涉及到不同的PAM序列。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州瑞风生物科技有限公司

<120> 靶向CTGF基因的gRNA及其应用

<160> 57

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gugccagcuu uuucaga 17

<210> 2

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ugugccagcu uuuucaga 18

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gugugccagc uuuuucaga 19

<210> 4

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agugugccag cuuuuucaga 20

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagugugcca gcuuuuucag a 21

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggagugugcc agcuuuuuca ga 22

<210> 7

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uggagugugc cagcuuuuuc aga 23

<210> 8

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cuggagugug ccagcuuuuu caga 24

<210> 9

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccagcuuuuu cagacgg 17

<210> 10

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gccagcuuuu ucagacgg 18

<210> 11

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ugccagcuuu uucagacgg 19

<210> 12

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gugccagcuu uuucagacgg 20

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ugugccagcu uuuucagacg g 21

<210> 14

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gugugccagc uuuuucagac gg 22

<210> 15

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agugugccag cuuuuucaga cgg 23

<210> 16

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gagugugcca gcuuuuucag acgg 24

<210> 17

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gucugcgcca agcagcu 17

<210> 18

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgucugcgcc aagcagcu 18

<210> 19

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcgucugcgc caagcagcu 19

<210> 20

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgcgucugcg ccaagcagcu 20

<210> 21

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccgcgucugc gccaagcagc u 21

<210> 22

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gccgcgucug cgccaagcag cu 22

<210> 23

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ugccgcgucu gcgccaagca gcu 23

<210> 24

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cugccgcguc ugcgccaagc agcu 24

<210> 25

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgucugcgcc aagcagc 17

<210> 26

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcgucugcgc caagcagc 18

<210> 27

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cgcgucugcg ccaagcagc 19

<210> 28

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ccgcgucugc gccaagcagc 20

<210> 29

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gccgcgucug cgccaagcag c 21

<210> 30

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ugccgcgucu gcgccaagca gc 22

<210> 31

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cugccgcguc ugcgccaagc agc 23

<210> 32

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gcugccgcgu cugcgccaag cagc 24

<210> 33

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aggaaugcug aguguca 17

<210> 34

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cggaggaaug cugaguguca 20

<210> 35

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cagacggagg aaugcugagu guca 24

<210> 36

<211> 9177

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg agtgtgccag ctttttcaga gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 300

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga 360

gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca 420

gacaaatggc tctagaggta cccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 480

cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 540

gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 600

tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattgtgccc 660

agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 720

ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc 780

cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg 840

gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc 900

ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga 960

ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcgc 1020

gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 1080

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 1140

agctgagcaa gaggtaaggg tttaagggat ggttggttgg tggggtatta atgtttaatt 1200

acctggagca cctgcctgaa atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca ccatggacta 1260

taaggaccac gacggagact acaaggatca tgatattgat tacaaagacg atgacgataa 1320

gatggcccca aagaagaagc ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag ccgacaagaa 1380

gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa ctctgtgggc tgggccgtga tcaccgacga 1440

gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac accgaccggc acagcatcaa 1500

gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa acagccgagg ccacccggct 1560

gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac cggatctgct atctgcaaga 1620

gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc ttccacagac tggaagagtc 1680

cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc atcttcggca acatcgtgga 1740

cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac ctgagaaaga aactggtgga 1800

cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc ctggcccaca tgatcaagtt 1860

ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac aacagcgacg tggacaagct 1920

gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag gaaaacccca tcaacgccag 1980

cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc cagactgagc aagagcagac ggctggaaaa 2040

tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa gaatggcctg ttcggaaacc tgattgccct 2100

gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag caacttcgac ctggccgagg atgccaaact 2160

gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac ctgctggccc agatcggcga 2220

ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa gaacctgtcc gacgccatcc tgctgagcga 2280

catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg agcgcctcta tgatcaagag 2340

atacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaagct ctcgtgcggc agcagctgcc 2400

tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca gagcaagaac ggctacgccg gctacattga 2460

cggcggagcc agccaggaag agttctacaa gttcatcaag cccatcctgg aaaagatgga 2520

cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa cagagaggac ctgctgcgga agcagcggac 2580

cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat ccacctggga gagctgcacg ccattctgcg 2640

gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg agaagatcct 2700

gaccttccgc atcccctact acgtgggccc tctggccagg ggaaacagca gattcgcctg 2760

gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa 2820

gggcgcttcc gcccagagct tcatcgagcg gatgaccaac ttcgataaga acctgcccaa 2880

cgagaaggtg ctgcccaagc acagcctgct gtacgagtac ttcaccgtgt ataacgagct 2940

gaccaaagtg aaatacgtga ccgagggaat gagaaagccc gccttcctga gcggcgagca 3000

gaaaaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa gaccaaccgg aaagtgaccg tgaagcagct 3060

gaaagaggac tacttcaaga aaatcgagtg cttcgactcc gtggaaatct ccggcgtgga 3120

agatcggttc aacgcctccc tgggcacata ccacgatctg ctgaaaatta tcaaggacaa 3180

ggacttcctg gacaatgagg aaaacgagga cattctggaa gatatcgtgc tgaccctgac 3240

actgtttgag gacagagaga tgatcgagga acggctgaaa acctatgccc acctgttcga 3300

cgacaaagtg atgaagcagc tgaagcggcg gagatacacc ggctggggca ggctgagccg 3360

gaagctgatc aacggcatcc gggacaagca gtccggcaag acaatcctgg atttcctgaa 3420

gtccgacggc ttcgccaaca gaaacttcat gcagctgatc cacgacgaca gcctgacctt 3480

taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc cggccagggc gatagcctgc acgagcacat 3540

tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa gaagggcatc ctgcagacag tgaaggtggt 3600

ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca caagcccgag aacatcgtga tcgaaatggc 3660

cagagagaac cagaccaccc agaagggaca gaagaacagc cgcgagagaa tgaagcggat 3720

cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca gatcctgaaa gaacaccccg tggaaaacac 3780

ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg atatgtacgt 3840

ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat gtggaccata tcgtgcctca 3900

gagctttctg aaggacgact ccatcgacaa caaggtgctg accagaagcg acaagaaccg 3960

gggcaagagc gacaacgtgc cctccgaaga ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg 4020

gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca gagaaagttc gacaatctga ccaaggccga 4080

gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc cggcttcatc aagagacagc tggtggaaac 4140

ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat cctggactcc cggatgaaca ctaagtacga 4200

cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca agctggtgtc 4260

cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa agtgcgcgag atcaacaact accaccacgc 4320

ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg aaccgccctg atcaaaaagt accctaagct 4380

ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac gtgcggaaga tgatcgccaa 4440

gagcgagcag gaaatcggca aggctaccgc caagtacttc ttctacagca acatcatgaa 4500

ctttttcaag accgagatta ccctggccaa cggcgagatc cggaagcggc ctctgatcga 4560

gacaaacggc gaaaccgggg agatcgtgtg ggataagggc cgggattttg ccaccgtgcg 4620

gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc agacaggcgg 4680

cttcagcaaa gagtctatcc tgcccaagag gaacagcgat aagctgatcg ccagaaagaa 4740

ggactgggac cctaagaagt acggcggctt cgacagcccc accgtggcct attctgtgct 4800

ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc caagaaactg aagagtgtga aagagctgct 4860

ggggatcacc atcatggaaa gaagcagctt cgagaagaat cccatcgact ttctggaagc 4920

caagggctac aaagaagtga aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt actccctgtt 4980

cgagctggaa aacggccgga agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc agaagggaaa 5040

cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc actatgagaa 5100

gctgaagggc tcccccgagg ataatgagca gaaacagctg tttgtggaac agcacaagca 5160

ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttctcc aagagagtga tcctggccga 5220

cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta caacaagcac cgggataagc ccatcagaga 5280

gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc ctgccgcctt 5340

caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag aggtgctgga 5400

cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg acctgtctca 5460

gctgggaggc gacaaaaggc cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa 5520

ggaattcggc agtggagagg gcagaggaag tctgctaaca tgcggtgacg tcgaggagaa 5580

tcctggccca atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc 5640

cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt 5700

cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt 5760

cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac 5820

cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga 5880

gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg 5940

gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac cgtcggagtc tcgcccgacc accagggcaa 6000

gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc 6060

cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac 6120

cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc 6180

cggtgcctga gaattctaac tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 6240

cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 6300

actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 6360

attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga gaatagcagg 6420

catgctgggg agcggccgca ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc 6480

gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg 6540

gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg ggcgcctgat gcggtatttt 6600

ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc aaagcaacca tagtacgcgc 6660

cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 6720

ttgccagcgc cttagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 6780

ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 6840

tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt tgggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 6900

cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 6960

tgttccaaac tggaacaaca ctcaactcta tctcgggcta ttcttttgat ttataaggga 7020

ttttgccgat ttcggtctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 7080

attttaacaa aatattaacg tttacaattt tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 7140

atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg 7200

cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt 7260

gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc 7320

tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc 7380

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 7440

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 7500

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 7560

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 7620

tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 7680

aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 7740

ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 7800

agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 7860

gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 7920

gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 7980

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 8040

tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 8100

ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 8160

cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt ggaagccgcg 8220

gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 8280

cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 8340

tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 8400

aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 8460

aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 8520

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 8580

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 8640

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc 8700

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 8760

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 8820

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 8880

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 8940

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 9000

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 9060

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 9120

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgt 9177

<210> 37

<211> 7446

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggcctcta gactcgaggc gttgacattg attattgact agttattaat 180

agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 240

ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 300

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 360

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 420

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 480

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 540

ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 600

tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 660

aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 720

tctatataag cagagctctc tggctaacta ccggtgccac catggcccca aagaagaagc 780

ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag ccaagcggaa ctacatcctg ggcctggaca 840

tcggcatcac cagcgtgggc tacggcatca tcgactacga gacacgggac gtgatcgatg 900

ccggcgtgcg gctgttcaaa gaggccaacg tggaaaacaa cgagggcagg cggagcaaga 960

gaggcgccag aaggctgaag cggcggaggc ggcatagaat ccagagagtg aagaagctgc 1020

tgttcgacta caacctgctg accgaccaca gcgagctgag cggcatcaac ccctacgagg 1080

ccagagtgaa gggcctgagc cagaagctga gcgaggaaga gttctctgcc gccctgctgc 1140

acctggccaa gagaagaggc gtgcacaacg tgaacgaggt ggaagaggac accggcaacg 1200

agctgtccac caaagagcag atcagccgga acagcaaggc cctggaagag aaatacgtgg 1260

ccgaactgca gctggaacgg ctgaagaaag acggcgaagt gcggggcagc atcaacagat 1320

tcaagaccag cgactacgtg aaagaagcca aacagctgct gaaggtgcag aaggcctacc 1380

accagctgga ccagagcttc atcgacacct acatcgacct gctggaaacc cggcggacct 1440

actatgaggg acctggcgag ggcagcccct tcggctggaa ggacatcaaa gaatggtacg 1500

agatgctgat gggccactgc acctacttcc ccgaggaact gcggagcgtg aagtacgcct 1560

acaacgccga cctgtacaac gccctgaacg acctgaacaa tctcgtgatc accagggacg 1620

agaacgagaa gctggaatat tacgagaagt tccagatcat cgagaacgtg ttcaagcaga 1680

agaagaagcc caccctgaag cagatcgcca aagaaatcct cgtgaacgaa gaggatatta 1740

agggctacag agtgaccagc accggcaagc ccgagttcac caacctgaag gtgtaccacg 1800

acatcaagga cattaccgcc cggaaagaga ttattgagaa cgccgagctg ctggatcaga 1860

ttgccaagat cctgaccatc taccagagca gcgaggacat ccaggaagaa ctgaccaatc 1920

tgaactccga gctgacccag gaagagatcg agcagatctc taatctgaag ggctataccg 1980

gcacccacaa cctgagcctg aaggccatca acctgatcct ggacgagctg tggcacacca 2040

acgacaacca gatcgctatc ttcaaccggc tgaagctggt gcccaagaag gtggacctgt 2100

cccagcagaa agagatcccc accaccctgg tggacgactt catcctgagc cccgtcgtga 2160

agagaagctt catccagagc atcaaagtga tcaacgccat catcaagaag tacggcctgc 2220

ccaacgacat cattatcgag ctggcccgcg agaagaactc caaggacgcc cagaaaatga 2280

tcaacgagat gcagaagcgg aaccggcaga ccaacgagcg gatcgaggaa atcatccgga 2340

ccaccggcaa agagaacgcc aagtacctga tcgagaagat caagctgcac gacatgcagg 2400

aaggcaagtg cctgtacagc ctggaagcca tccctctgga agatctgctg aacaacccct 2460

tcaactatga ggtggaccac atcatcccca gaagcgtgtc cttcgacaac agcttcaaca 2520

acaaggtgct cgtgaagcag gaagaaaaca gcaagaaggg caaccggacc ccattccagt 2580

acctgagcag cagcgacagc aagatcagct acgaaacctt caagaagcac atcctgaatc 2640

tggccaaggg caagggcaga atcagcaaga ccaagaaaga gtatctgctg gaagaacggg 2700

acatcaacag gttctccgtg cagaaagact tcatcaaccg gaacctggtg gataccagat 2760

acgccaccag aggcctgatg aacctgctgc ggagctactt cagagtgaac aacctggacg 2820

tgaaagtgaa gtccatcaat ggcggcttca ccagctttct gcggcggaag tggaagttta 2880

agaaagagcg gaacaagggg tacaagcacc acgccgagga cgccctgatc attgccaacg 2940

ccgatttcat cttcaaagag tggaagaaac tggacaaggc caaaaaagtg atggaaaacc 3000

agatgttcga ggaaaagcag gccgagagca tgcccgagat cgaaaccgag caggagtaca 3060

aagagatctt catcaccccc caccagatca agcacattaa ggacttcaag gactacaagt 3120

acagccaccg ggtggacaag aagcctaata gagagctgat taacgacacc ctgtactcca 3180

cccggaagga cgacaagggc aacaccctga tcgtgaacaa tctgaacggc ctgtacgaca 3240

aggacaatga caagctgaaa aagctgatca acaagagccc cgaaaagctg ctgatgtacc 3300

accacgaccc ccagacctac cagaaactga agctgattat ggaacagtac ggcgacgaga 3360

agaatcccct gtacaagtac tacgaggaaa ccgggaacta cctgaccaag tactccaaaa 3420

aggacaacgg ccccgtgatc aagaagatta agtattacgg caacaaactg aacgcccatc 3480

tggacatcac cgacgactac cccaacagca gaaacaaggt cgtgaagctg tccctgaagc 3540

cctacagatt cgacgtgtac ctggacaatg gcgtgtacaa gttcgtgacc gtgaagaatc 3600

tggatgtgat caaaaaagaa aactactacg aagtgaatag caagtgctat gaggaagcta 3660

agaagctgaa gaagatcagc aaccaggccg agtttatcgc ctccttctac aacaacgatc 3720

tgatcaagat caacggcgag ctgtatagag tgatcggcgt gaacaacgac ctgctgaacc 3780

ggatcgaagt gaacatgatc gacatcacct accgcgagta cctggaaaac atgaacgaca 3840

agaggccccc caggatcatt aagacaatcg cctccaagac ccagagcatt aagaagtaca 3900

gcacagacat tctgggcaac ctgtatgaag tgaaatctaa gaagcaccct cagatcatca 3960

aaaagggcaa aaggccggcg gccacgaaaa aggccggcca ggcaaaaaag aaaaagggat 4020

cctacccata cgatgttcca gattacgctt acccatacga tgttccagat tacgcttacc 4080

catacgatgt tccagattac gcttaagaat tcctagagct cgctgatcag cctcgactgt 4140

gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 4200

aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 4260

taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 4320

agagaatagc aggcatgctg gggaggtacc gagggcctat ttcccatgat tccttcatat 4380

ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca 4440

aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 4500

ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat 4560

ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg tgccagcttt ttcagacggg 4620

ttttagtact ctggaaacag aatctactaa aacaaggcaa aatgccgtgt ttatctcgtc 4680

aacttgttgg cgagattttt gcggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc 4740

tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc 4800

tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcaggg gcgcctgatg 4860

cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat 4920

agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 4980

ccgctacact tgccagcgcc ttagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 5040

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 5100

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg 5160

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 5220

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt 5280

tataagggat tttgccgatt tcggtctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 5340

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa 5400

tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc 5460

cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga 5520

gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg 5580

tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg 5640

gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 5700

atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 5760

agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 5820

ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 5880

gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 5940

gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 6000

tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 6060

acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 6120

aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 6180

cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 6240

gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 6300

cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 6360

tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 6420

tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 6480

gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 6540

tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 6600

gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 6660

ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 6720

tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 6780

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 6840

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 6900

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 6960

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 7020

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 7080

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 7140

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 7200

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 7260

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 7320

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 7380

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 7440

acatgt 7446

<210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ccagcttttt cagacggagg aatgctga 28

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

cgcgtctgcg ccaagcagct 20

<210> 40

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

tttttcagac ggaggaat 18

<210> 41

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cagacgga 8

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gagtgaagca gaacgtgggg 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gctggcaagt gtagcggtca 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

acgatacaag gctgttagag 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ctcagcgggg aagagttgtt 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tgctgtttgc ctcttcagct 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

ctcagtccga gcggtttctt 20

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

atgaccgccg ccagtatg 18

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

ctctttggag agtttcaaga gcc 23

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

tcgagctgga gggtggagtc 20

<210> 51

<211> 80

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugcuuuu 80

<210> 52

<211> 81

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca aaaugccgug uuuaucucgu 60

caacuuguug gcgagauuuu u 81

<210> 53

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

uguaugucag uggacagaac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gcgtgtgcac cgccaaagat 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

aacgtccatg ctgcacaggg 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

ggaaactgtg gcgtgatggc 20

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

gcttcaccac cttcttgatg tc 22

Claims

1.一种靶向CTGF基因的gRNA，所述gRNA包含靶向结构域，所述靶向结构域选自：SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:32任一所示的序列。

2.根据权利要求1所述的靶向CTGF基因的gRNA，其特征在于，所述序列选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:31中的任一所示序列。

3.一种靶向编辑CTGF基因的gRNA表达载体，其特征在于，包含编码如权利要求1-2任一项所述的gRNA的核苷酸序列。

4.一种靶向编辑CTGF基因的CRISPR系统，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的gRNA。

5.一种靶向编辑CTGF基因的组合物，其特征在于，包括：gRNA系统和Cas酶系统，所述gRNA系统包含权利要求1-2任一项所述的gRNA，所述Cas酶系统包含Cas酶。

6.根据权利要求5所述的靶向编辑CTGF基因的组合物，其特征在于，所述gRNA系统选自：权利要求1-2任一项所述的gRNA，或编码如权利要求1-2任一项所述的gRNA的核酸；所述Cas酶系统选自：Cas酶，或编码Cas酶的核酸。

7.一种靶向CTGF基因的脂质体，其特征在于，包含活性成分以及作为载体的脂质成分，所述活性成分包含权利要求1-2中任一项所述的gRNA、权利要求3所述的gRNA表达载体、权利要求4所述的CRISPR系统、或权利要求5所述的组合物。

8.权利要求1-2中任一项所述的gRNA、权利要求3所述的gRNA表达载体、权利要求4所述的CRISPR系统、或权利要求5-6中任一项所述的组合物在制备用于治疗纤维化疾病的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述纤维化疾病为肺纤维化。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物通过吸入给药。