CN110283795A - 同时展示ev71病毒和cva16病毒中和抗原表位的重组腺病毒 - Google Patents

同时展示ev71病毒和cva16病毒中和抗原表位的重组腺病毒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种能同时展示EV71病毒和CVA16病毒中和抗原表位的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒的六邻体HVR1区插入有EV71病毒SP70中和抗原表位基因，所述重组腺病毒的六邻体HVR2区插入有CVA16病毒PEP55中和抗原表位基因。本发明还提供了该重组腺病毒的制备方法。本发明的重组腺病毒能够诱导机体产生有效的EV71病毒和CVA16病毒的中和抗体，从而预防由EV71病毒和CVA16病毒引起的手足口病。

Description

同时展示EV71病毒和CVA16病毒中和抗原表位的重组腺病毒
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及同时展示EV71病毒和CVA16病毒中和抗原表位的重组腺病毒疫苗，以及该重组腺病毒疫苗的制备方法。
背景技术
EV71病毒(肠道病毒71型)和CVA16病毒(柯萨奇病毒A组16型)是引起手足口病主要的病原体，每年均能引起手足口病疫情流行，给东南亚地区带来较大的社会负担。其中EV71病毒危害性最大，能够引起神经性重症，比如无菌性脑膜炎、神经原性肺水肿、脊髓灰质炎样麻痹、脑干脑炎等，严重时可导致病人死亡。CVA16病毒危害性也比较大，常导致较为严重的手足口症状，需要住院治疗。目前EV71病毒和CVA16病毒尚无有效的药物可以治疗，临床医生一般是采取对症治疗的方式，因此开发一种有效的疫苗显得尤为重要。EV71病毒灭活疫苗2015年已经获得中国药监局的批准上市，但是CVA16病毒的疫苗还在临床研究阶段。要想有效预防和控制手足口病流行，单独预防控制EV71病毒的流行是不够的，因此本项目计划采用腺病毒载体展示技术，构建一种能够同时展示EV71病毒和CVA16病毒中和抗原表位的重组腺病毒疫苗，能够同时预防EV71病毒和CVA16病毒。
腺病毒是一个二十面体对称结构的病毒颗粒，病毒的外壳是由252个壳体亚单位组成，其中六邻体占据240个，是最主要的外壳蛋白。六邻体能够刺激机体产生中和抗体，是腺病毒最重要的中和抗原。腺病毒六邻体上存在着区别型特异性中和抗体的高变区，这些高变区包括E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7。基本高变区都位于腺病毒外壳，可以诱导产生强烈的中和抗体。而且高变区的基因存在极大的突变几率，在高变区内插入外源的基因一般不会改变腺病毒的结构特性和病毒活性。因此，在不影响腺病毒的病毒特性(复制性、感染性、稳定性)的情况下，可以在腺病毒的高变区插入EV71病毒和CVA16病毒的中和抗原基因。
目前已经发现EV71和CVA16病毒的多个中和性抗原表位，如EV71病毒的VP1蛋白的163-177位氨基酸(SP55)和208-222位氨基酸(SP70)、VP2蛋白的136-150位氨基酸(VP2-28)，其中208-222位氨基酸为型特异性；CVA16病毒的多个中和表位，94-108位氨基酸(PEP32)、109-123位氨基酸(PEP37)、163-177位氨基酸(PEP55)、187-201位氨基酸(PEP63)、211-225位氨基酸(PEP71)、271-285位氨基酸(PEP91)。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够同时诱导机体产生有效的EV71病毒和CVA16病毒的中和抗体的重组疫苗。
为了实现以上目的，本发明提供了一种同时展示EV71病毒和CVA16病毒中和抗原表位的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒的六邻体HVR1区插入有EV71病毒SP70中和抗原表位基因，所述重组腺病毒的六邻体HVR2区插入有CVA16病毒PEP55中和抗原表位基因。
优选地，根据本发明所述的重组腺病毒是3型腺病毒，特别是人3型腺病毒，更优选是E3区缺陷的3型腺病毒，特别是E3区缺陷的人3型腺病毒。
术语“E3区缺陷的3型腺病毒”意指3型腺病毒E3区大部分基因(即腺病毒非必需E3区nt 27,737–30,900)被去除，被置换为CMV-EGFP基因。
在另一方面，本发明还提供了制备所述重组腺病毒的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1：扩增腺病毒的突变六邻体基因，其中所述腺病毒的突变六邻体基因在其HVR1区插入有EV71病毒SP70中和抗原表位基因，在HVR2区插入有CVA16病毒PEP55中和抗原表位基因，将所述腺病毒的突变六邻体基因通过酶切连接至穿梭质粒；
步骤2：将上述连接有所述腺病毒的突变六邻体基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒酶切回收相应片段后，在大肠杆菌中进行同源重组，获得六邻体突变的重组腺病毒质粒；
步骤3：用所述六邻体突变的重组腺病毒质粒转染293细胞，培养，得到所述重组腺病毒。
作为本发明的一种实施方式，所述腺病毒骨架质粒优选但不限于为pBRAd△E3GFP。
作为本发明的一种实施方式，所述穿梭质粒优选但不限于为pBRLHR。
作为本发明的一种实施方式，所述大肠杆菌优选但不限于为BJ5183。
在另一方面，本发明还提供了用于治疗/预防由EV71病毒和CVA16病毒引起的手足口病的组合物，该组合物包括所述重组腺病毒疫苗作为活性成分。优选地，该组合物还可以包括药学上可接受的载体，包括但不限于赋形剂、辅料等。
在另一方面，本发明还提供了所述重组腺病毒疫苗用于制备治疗/预防由EV71病毒和CVA16病毒引起的手足口病的药物的用途。
本发明的重组腺病毒疫苗能够将EV71病毒和CVA16病毒的中和抗原展示于重组腺病毒的外壳，构建的重组腺病毒可以诱导机体产生有效的EV71病毒和CVA16病毒的中和抗体，从而预防由EV71病毒和CVA16病毒引起的手足口病。
附图说明
图1是3型腺病毒骨架质粒pBRAd△E3GFP的图谱示意图。
图2是穿梭质粒pBRLHR的图谱示意图。
图3是本发明的重组腺病毒热稳定性曲线图。
图4是本发明的重组腺病毒生长曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
值得注意的是，如未特别提及，以下实施例中所使用的试剂、仪器、材料均可通过商业渠道购买获得。为简要起见，部分本领域常规技术操作并未进行详细描述，这些技术操作通常按照常规实验方法进行，应当理解，本领域技术人员知晓这些技术操作(如酶切、PCR反应条件)的细节，并且可重现以达到最终的技术效果。
实施例1：重组腺病毒构建
首先以人3型腺病毒骨架质粒pBRAd△E3GFP(由实验室按照本领域常规基因工程技术构建，将编号为GZ01的人3型腺病毒(商购获得，全基因组Genbank号：DQ099432)E3区nt27,737–30,900(SEQ ID NO：10)敲除，置换为CMV-EGFP基因(SEQ ID NO：11))为模板，分别用引物对HexU/hr1-sp70R和HexD/hr1-sp70U进行PCR扩增(常规反应条件)得到pBRAd△E3GFP的1L片段(nt16,764–21,140)(SEQ ID NO：12)和1R片段(nt 21125–24569)(SEQ IDNO：13)，胶回收纯化后，1L和1R各取50ng混合作为模板，加六邻体上下游引物对HexU和HexD进行PCR扩增(常规反应条件)，得到HVR1区嵌入SP70序列的六邻体片段R1SP70。
用同样的方法通过CVA16病毒引物将PEP55抗原表位基因插入到HVR2区：以六邻体片段R1SP70基因为模板，用引物对HexonF/A3R2-CA16-1R扩增上游片段，用HexonR/A3R2-CA16-1U扩增下游片段；将上游片段和下游片段混合作为模板，用引物对HexonF/HexonR扩增全长双表位突变型六邻体片段(HVR1区嵌入SP70序列且HVR2区嵌入PEP55抗原表位基因序列)。
ClaI+BamHI双酶切上述双表位突变型六邻体片段和六邻体穿梭载体pBRLHR(六邻体穿梭载体pBRLHR由实验室按照本领域常规基因工程技术构建，具体为将人3型腺病毒骨架质粒pBRAd△E3GFP的L1片段(nt16,764–21,140)和L2片段(nt 21125–24569)扩增(常规反应条件)，然后用双酶切的方法将L1片段(酶切位点EcoRI和BamHI)和L2片段(酶切位点是BamHI和SalI)分别连接到PBR322质粒(天根生化科技有限公司，货号：MD-206)中，将二者连接，转化DH5a感受态，获得突变型六邻体穿梭质粒。该突变型六邻体穿梭质粒用EcoRI+SalI酶切，3型腺病毒骨架质粒pBRAd△E3GFP(构建方法参考中国专利申请公开文献CN103966263A)用AvrII+PacI双酶切，分别回收大片段后，在BJ5183细菌内进行同源重组，获得嵌合SP70表位基因和PEP55表位基因的六邻体突变型3型腺病毒质粒pR1SP70-CA16R1-A3egf。
该搭桥PCR技术相关的PCR扩增所使用的引物序列见以下表1。
表1.构建腺病毒重组病毒所有引物名称及序列
取300ng线性化的上述已嵌合SP70表位基因和PEP55表位基因的六邻体突变型3型腺病毒质粒pR1SP70-CA16R1-A3egf、300ng线性化的腺病毒骨架质粒pBRAd△E3GFP，加入100μl BJ5183大肠杆菌感受态细胞，混匀并转移入电击杯；启动电击仪，将电击杯放入电击仪中，调整电击仪到细菌类电击程序进行电击操作。电击程序结束后，电击产物加入37℃预热的800μL LB无抗性培养基，转化的细胞转至1.5mL EP管中，37℃100rpm摇培30-60min，然后涂布含Amp(氨苄西林)的LB琼脂平板，37℃培养过夜后挑单菌落进行筛选和鉴定。
挑取将鉴定正确的单克隆重组菌接种5mL含Amp(氨苄西林)的LB液体培养基，37℃摇培大约8h，然后将其接种至100-200ml含Amp(氨苄西林)的LB液体培养基，培养过夜。用质粒抽提试剂盒(Qiagen大抽试剂盒)提取重组腺病毒质粒。24孔板铺板293细胞，细胞浓度为105个/ml，培养细胞16-18小时。按照转染试剂Lipofectamine 3000说明书，将0.5μg的重组腺病毒质粒转入293细胞中，然后放置37℃二氧化碳培养培养3天。每天观察细胞病变和荧光EGFP蛋白的表达情况，选取病变和荧光EGFP蛋白信号最强的重组腺病毒，收集细胞和病毒上清，放置-80℃冰箱中保存备用。
实施例2：重组腺病毒的生物学特征测试
2.1重组腺病毒的热稳定测试。
将重组腺病毒放置45℃水浴锅中分别作用5、10、20、40分钟，然后将不同热作用时间的重组腺病毒接种于293细胞中，病毒感染48小时后，取病毒上清测试TCID50数据，以未重组的3型腺病毒为对照，对比重组腺病毒的热稳定曲线。热稳定性曲线见图3。
通过实验发现，重组腺病毒与3型腺病毒的差异不显著，表明嵌合了EV71病毒和CVA16病毒的中和抗原基因片段对重组腺病毒的热稳定没有影响。
2.2重组腺病毒的中和抗原表位ELISA数据测试。
将重组腺病毒进行超速密度梯度离心取得纯化的重组腺病毒颗粒。
具体步骤：配置25％质量浓度的氯化铯和45％质量浓度的氯化铯，先将5mL 45％质量浓度的氯化铯溶液加入到12mL的超速离心管中，再沿着管壁缓慢加入25％质量浓度的氯化铯溶液。然后将1.5mL重组腺病毒溶液加入到离心管上方，平衡各个离心管，超速离心22000g，4℃离心4小时。取出离心管，收集中间白色的病毒带。最后将获得的病毒带过脱盐柱，收集过柱液体，测试病毒浓度，并分装保存于-80℃冰箱中备用。
将重组腺病毒颗粒包被在酶标板上，分别加入EV71病毒和CVA16病毒中和抗原片段的抗体，然后再加入羊抗鼠IgG-HRP酶标记物(Sigma公司，货号A5278)进行标示，发现重组腺病毒颗粒对EV71病毒和CVA16病毒中和抗原片段的抗体均有发现，初步判断重组腺病毒可以将EV71病毒和CVA16病毒中和抗原表位展示于腺病毒表面。
2.3重组腺病毒生长曲线测试
将上述重组腺病毒与3型腺病毒按照100TCID50的病毒浓度接种于A549细胞中，分别在不同时间段(12、24、48、72、96小时)收集病毒的培养上清，并对不同时间收集的病毒培养上清进行病毒TCID50测试。以未重组的3型腺病毒为对照。重组腺病毒生长曲线见图4。
通过实验测试，由结果可见，重组腺病毒与未重组的3型腺病毒的生长曲线基本一致。
实施例3：重组腺病毒的中和抗体测试
将上述重组腺病毒采用离子交换吸附的方法进行纯化。
操作步骤如下：将重组腺病毒的培养物反复冻融3次，冻融产物放入离心管中，高速离心6000g，4℃离心30min。离心的上清经过超滤的方法进行浓缩，选用500KD截留分子量超滤柱(GE)来进行腺病毒颗粒悬液的超滤浓缩。浓缩后的重组腺病毒用DEAE SepharoseFF(GE公司)进行纯化，上样缓冲液选用10mM NaCl+10mM PBS(PH7.4)，洗脱缓冲液选用1.2MNaCl+10mM PBS(PH7.8)，收集蛋白浓度高的洗脱液进行混合，纯化的重组腺病毒采用BCA法测试蛋白浓度，保存于-80℃备用。
纯化的重组腺病毒加入弗氏不完全佐剂(Sigma)制备疫苗，免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠3次，免疫量50ug/只，每隔两周免疫一次。免疫最后一次时，采集小鼠血液。分离小鼠的血清，按照微量中和实验方法分别测试EV71病毒和CVA16病毒的中和效价，EV71病毒和CVA16病毒浓度均为100TCID50。以未重组的3型腺病毒为对照，PBS(磷酸缓冲盐溶液)为空白对照。
实验结果表明小鼠免疫重组腺病毒的血清对EV71病毒和CVA16病毒均具有免疫保护作用，见表2。
表2.重组腺病毒中和抗体效价测试
由以上可见，根据本发明的重组腺病毒双价疫苗能够同时展示EV71病毒和CVA16病毒中和抗原表位，从而诱导机体产生有效的EV71病毒和CVA16病毒的中和抗体。
上述的实施项为本发明最佳的实现方式，本发明并不局限于上述实施方式，任何对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的原理和技术也属于本发明的保护范畴。
序列表
<110> 广州市妇女儿童医疗中心
<120> 同时展示EV71病毒和CVA16病毒中和抗原表位的重组腺病毒
<160> 13
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cgccccgccg cccagccccg ccatctccga cgcggcccca gacatgcaag agatggagga 2280
atccatcgag attgacctgg gctatgtgac gcccgcggag cacgaggaag agcttgcagt 2340
gcgcttttca acccaggaag agatacacca agaacagcca gagcaggaag cagagagtga 2400
gcgtgactac ctccacctca gcggggggga ggacgcgctc atcaagcatc tggcccgaca 2460
ggccatcatc gtcaaggacg cgctgcttga ccgcaccgag gtgcccctca gcgtggagga 2520
gcttagccgc gcctacgagc tcaacctttt ctcgccgcgc gtgcccccca agcgccagcc 2580
caacggcacc tgcgagccca acccacgcct caacttctac ccggtctttg cggtgcccga 2640
ggccctggct acctaccaca tctttttcaa gaaccaaagg atccccgtct cctgtcgcgc 2700
caaccgcacc cgcgccgacg cccttttcga cctgggcccc ggtgcccgca tacctgatat 2760
cgcctccttg gaagaggttc ccaagatctt cgagggtctg ggcagcgacg agactcgggc 2820
cgcaaacgct ctgcaaggag aaggaggaga gcatgagcac cacagcgccc tggtggagtt 2880
ggaaggcgac aacgcgcgtc tggcggtgct caagcgcacg atcgagctga cccatttcgc 2940
ctacccggcg ctgaatcttc cccccaaagt catgagcacg gttatggacc aggtgcttat 3000
taagcgcgcg tcgcccatct ccaaggagat gcaagacccc gagagctccg aggagggcaa 3060
gcccgtggtc agcgacgagc agctggcgcg gtggctgggt ccccaagcta gtccccagag 3120
cttggaagag cggcgcaagc tcataatggc cgtggtcctg gtgaccgcgg agctggagtg 3180
tctgcgccgc ttcttcgccg acgcagaaac tttgcgcaag gtcgaggaga acctgcacta 3240
catcttcagg cacgggtttg tacgccaggc ctgcaagatc tccaacgtgg agctgaccaa 3300
cctggtctcc tacatgggca tcttgcacga gaaccgcctg gggcaaaacg tgctgcacac 3360
caccctgcgc ggggaggccc gccgcgacta cattcgcgac tgcgtctacc tctacctttg 3420
ccacacctgg cagacggcca tgggc 3445

Claims (10)

1.一种同时展示EV71病毒和CVA16病毒中和抗原表位的重组腺病毒，其特征在于：所述重组腺病毒的六邻体HVR1区插入有EV71病毒SP70中和抗原表位基因，所述重组腺病毒的六邻体HVR2区插入有CVA16病毒PEP55中和抗原表位基因。
2.根据权利要求项1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒是3型腺病毒。
3.根据权利要求项1或2所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒是人3型腺病毒。
4.根据权利要求项1或2所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒是E3区缺陷的3型腺病毒。
5.制备权利要求1至4任一项所述的重组腺病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：扩增腺病毒的突变六邻体基因，其中所述腺病毒的突变六邻体基因在其HVR1区插入有EV71病毒SP70中和抗原表位基因，在HVR2区插入有CVA16病毒PEP55中和抗原表位基因，将所述腺病毒的突变六邻体基因通过酶切连接至穿梭质粒；
步骤2：将上述连接有所述腺病毒的突变六邻体基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒酶切回收相应片段后，在大肠杆菌中进行同源重组，获得六邻体突变的重组腺病毒质粒；
步骤3：用所述六邻体突变的重组腺病毒质粒转染293细胞，培养，得到所述重组腺病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述腺病毒骨架质粒是pBRAd△E3GFP。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述穿梭质粒是pBRLHR。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌是BJ5183。
9.一种用于治疗/预防由EV71病毒和CVA16病毒引起的手足口病的疫苗组合物，其特征在于包括根据权利要求项1至4任一项所述的重组腺病毒作为活性成分。
10.根据权利要求项1至4任一项所述的重组腺病毒用于制备治疗/预防由EV71病毒和CVA16病毒引起的手足口病的药物的用途。
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