CN112921007A - 用于预防猫感染新冠病毒的重组腺相关病毒及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于预防猫感染新冠病毒的重组腺相关病毒及其构建方法和应用，该重组腺相关病毒以复制缺陷型腺相关病毒为载体，将病原保护性抗原2019新型冠状病毒的S1蛋白及RBD蛋白的基因经过优化设计，包装得到针对新冠病毒SARS‑CoV2的刺突蛋白S1及受体结合域RBD的疫苗vAAV‑S1/vAAV‑RBD。所述疫苗在小鼠和猫模型上均具有良好的免疫原性，能诱导机体产生强烈的免疫反应。假型病毒中和抗体水平检测显示，经免疫后的小鼠和猫血清能够成功中和假型新型冠状病毒，说明该疫苗对2019新型冠状病毒具有免疫保护效果。此外，该疫苗安全性高、包装成本低、可稳定表达，在GMP车间内能够实现大规模生产，用以应对突发疫情。
Description
技术领域
本发明涉及病毒疫苗技术领域，具体涉及一种用于预防猫感 染新冠病毒的重组腺相关病毒及其构建方法和应用。
背景技术
2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒科冠状病毒 属，为单股正链RNA病毒，其上S1蛋白的RBD片段含有多个B 细胞和T细胞表位，并能够引发强烈的保护性抗病毒免疫。该病 患者症状多表现为发热、干咳，并逐渐表现为呼吸困难等重症。
新冠病毒能在猫和雪貂的呼吸、消化系统中高效复制，对宠 物及特种经济动物造成极大的威胁。腺相关病毒作为一种并可长期 表达外源基因、安全性高、成本低的载体，常用于基因工程活疫苗。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种用于预 防猫感染新冠病毒的重组腺相关病毒及其构建方法和应用。
为实现上述目的，本发明所设计一种用于预防猫感染新冠病毒 的重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒表达刺突蛋白S1/RBD蛋 白。
进一步地，所述编码刺突蛋白S1/RBD蛋白的核苷酸序列经过 密码子优化。
再进一步地，所述刺突蛋白S1/RBD蛋白的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示。
再进一步地，所述腺相关病毒为AAV-DJ。
本发明还提供了一种用于预防猫感染新冠病毒的重组腺相关 病毒的构建方法，包括以下步骤：
1)优化刺突蛋白S1/RBD蛋白的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
2)将pAAV-CMV-eGFP用EcoRI及BamHI进行双酶切，回收 载体片段AAV-CMV；
3)将两端含有EcoRI及BamHI酶切位点序列的S1基因片段 /RBD基因片段与载体片段AAV-CMV连接后转化，分别获得核心 质粒pAAV-CMV-S1/pAAV-CMV-RBD；
4)将核心质粒pAAV-CMV-S1/pAAV-CMV-RBD、pAAV-DJ、 pAAV-Helper共转染293T细胞，培养离心，冻融，收集上清；得 到重组腺相关病毒rAAV-S1/rAAV-RBD。
本发明还提供了一种上述的重组腺相关病毒在制备预防猫感 染新冠病毒疫苗中的应用；所述疫苗为重组腺相关病毒载体疫苗。
本发明还提供了一种预防猫感染新冠病毒的重组腺相关病毒 载体疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)构建编码刺突蛋白S1/RBD蛋白的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示；
2)将上述任意一种核苷酸序列插入质粒载体中，得到重组腺 相关病毒核心质粒pAAV-S1/pAAV-RBD
3)将重组腺相关病毒核心质粒pAAV-S1/rAAV-RBD和辅助质 粒感染细胞，产生重组腺相关病毒rAAV-S1/rAAV-RBD
4)回收重组腺相关病毒，重悬于PBS/DMEM，制备高滴度重 组腺相关病毒载体疫苗vAAV-S1/vAAV-RBD。
本发明的有益效果：
本发明获得重组腺相关病毒rAAV-S1/rAAV-RBD重悬于 PBS/DMEM中，形成疫苗vAAV-S1/vAAV-RBD，该疫苗对2019新 型冠状病毒具有免疫保护效果，此外，该疫苗安全性高、包装成本 低、可稳定表达，在GMP车间内能够实现大规模生产，用以应对 突发疫情。
附图说明
图1为双酶切pAAV-CMV-eGFP凝胶电泳图；
图2为S1基因扩增凝胶电泳图；
图3为RBD基因扩增凝胶电泳图；
图4为pAAV-CMV-S1图谱；
图5为pAAV-CMV-RBD图谱；
图6为Western Blot鉴定目标蛋白成功表达图；
图7为IF鉴定蛋白表达图；
图8为IF鉴定小鼠血清结合抗体图；
图9为ELISA检测小鼠血清结合抗体含量图；
图10为包装假病毒测定RLU图；
图11为小鼠血清假病毒中和抗体水平检测图；
图中，图11A为S1组小鼠血清检测图，图11B为RBD组小鼠 血清检测图；
图12为小鼠脾脏生发中心染色图；
图13为ELISpot斑点图；
图14为ELISpot斑点计数图；
图15为rAAV-eGFP感染F81荧光图；
图16为IF鉴定猫血清结合抗体图；
图17为猫血清假病毒中和抗体水平检测图；
图中，图17A为S1组猫血清检测图，图17B为RBD组猫血清 检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领 域技术人员理解。
实施例1构建表达新型冠状病毒S1蛋白及RBD蛋白的腺相 关病毒的制备及鉴定
1.合成病原保护性抗原基因
从GeneBank上获得新冠病毒SARS-CoV-2全基因组序列(ID： MN988668.1)，通过对刺突蛋白S1片段及RBD蛋白片段基因进行 优化，将大多数稀有密码子替换为高频密码子，送基因公司合成对 应基因，分为刺突蛋白S1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和RBD 蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；通过提高了S1及RBD 蛋白的表达水平，从而提高了疫苗的免疫原性。
2.构建载体pAAV-CMV-S1及pAAV-CMV-RBD
将pAAV-CMV-eGFP用EcoRI及BamHI进行双酶切(其双酶 切凝胶电泳图如图1所示)，回收载体片段AAV-CMV；分别设计 刺突蛋白S1及RBD扩增引物，
S1扩增引物：
F：5’-gatccgctagcgccaccatgccactgctgctac-3’，
R：5’-gatcagatcgatttagtgatggtggtgatgatgcc-3’；
RBD扩增引物
F：5’-gaacatcgattgaattcgccaccatgtccatgttccg-3’，
R：5’-caggtcgactctagaggatcctcaggcgtaatcaggc-3’；
以上述优化基因为模板，扩增获得两端含有EcoRI及BamHI 酶切位点序列的S1基因片段和RBD基因片段，(S1基因和RBD 基因扩增凝胶电泳图分别如图2和3所示)，用EcoRI及BamHI进 行双酶切回收后，与载体片段AAV-CMV连接后转化DH5α感受态， 送测序鉴定，获得核心质粒pAAV-CMV-S1(图谱如图4所示)及 pAAV-CMV-RBD(图谱如图5所示)；且pAAV-CMV-S1质粒序列 如SEQ ID NO:3和pAAV-CMV-RBD质粒序列如SEQ ID NO:4；
3.三质粒系统包装腺相关病毒rAAV-S1及rAAV-RBD
菌液接入含有氨苄的LB培养基，14小时后提取pAAV-CMV-S1 及pAAV-CMV-RBD及两个辅助质粒pAAV-DJ、pAAV-Helper， 150mm平皿铺293T细胞，待细胞长好后，A液按照三质粒分子量 等于1:1:1，核心质粒pAAV-eGFP固定加20μg，加入500μL opti-MEM中，涡旋混匀；B液按照PEI(体积，μL)/DNA(质量， μg)＝2，计算PEI用量，加入500μL opti-MEM中，涡旋混匀；静 置5分钟后，将B液加入A液中，涡旋混匀，静置15分钟后加入 平皿培养基中，轻轻晃动平皿，使转染液均匀分布；6-8h后换维持 液(2％FBS，1％双抗DMEM，30mL)。转染72小时后，将细胞 及上清收集起来，分别得到重组腺相关病毒rAAV-S1和重组腺相关 病毒rAAV-RBD。
将获得的病毒1000g离心5min，弃上清，加入1mLPBS，液氮 /37℃水浴反复冻融四次，10000g，4℃，10min，收集上清，加入 50U DNAse I，37℃孵育45min，10000g，4℃，10min，收集上清， 分装后于-80℃保存，即获得重组腺相关病毒载体疫苗vAAV-S1和 vAAV-RBD。
4.目标抗原表达鉴定及病毒颗粒数测定
将上述任一个重组腺相关病毒(rAAV-S1/rAAV-RBD)感染 HEK293细胞，48小时后收集转染的细胞以及空细胞对照，进行目 标抗原的Western blot检测。配制12.5％的SDS-PAGE凝胶，将收 集的细胞裂解，蛋白变性处理，每孔上样量20μL，80V电压跑浓 缩胶，120V跑分离胶，直至溴酚蓝到达底部。通过转膜将凝胶中 对应S1以及RBD位置的蛋白以及β-Actin蛋白转移至硝酸纤维素 膜上，以5％脱脂奶粉封闭处理，引入标签抗体作为一抗孵育两个 小时，TBST洗膜三次，每次五分钟；引入HRP标记的羊抗鼠抗体 作为二抗，孵育一个小时，TBST洗膜三次，每次五分钟。在成像 仪中进行化学发光，采集图片，两个毒种均可检测到目标蛋白的明 显表达。
结果如图6所示，S1及RBD组均检测到了正确大小的蛋白表 达，空白组未检测到，所有组均检出β-Actin内参蛋白表达。
将重组腺相关病毒感染铺在12孔板中的HEK293细胞，72小 时之后PBS洗三次，多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三次。用2％BSA、 0.3％TritonX-100稀释标签抗体作为一抗孵育2小时，PBS洗三次， 引入FITC标记的羊抗鼠抗体作为二抗，孵育一个小时，PBS洗三 次，共聚焦显微镜采集图像，结果如图7所示，S1组及RBD组均 采集到荧光图像，即腺相关病毒能够正常表达相应蛋白，对照组均 无荧光信号。
通过RT-PCR测定病毒颗粒数：以固定量的标准品进行10倍 梯度稀释，重复5个梯度作为标准曲线组。同时，将收获并且纯化 的rAAV-S1病毒以及rAAV-RBD病毒以每孔1μL作为实验组，一 式三份进行检测。
反应体系为：
经过40个循环的扩增，对Ct值进行计算获得标准曲线及公 式，计算得到病毒颗粒数。病毒颗粒数测定结果显示，纯化的重组 腺相关病毒经浓缩后均达到1.0×1013VP/mL以上。
实施例2重组腺相关病毒疫苗vAAV-S1/vAAV-RBD接种 BALB/c小鼠模型及免疫学评价
1.免疫小鼠并验证目的蛋白结合抗体
30只SPF级雌性小鼠(6-8周龄)，10只作为S1组，10只作为 RBD组，5只作为eGFP组，5只作为空白组。在小鼠双侧大腿内 侧分别肌肉注射vAAV-S1/vAAV-RBD，按照1E+8vg/只剂量接种。 断尾或者眼眶采血采集小鼠血液，37℃静置2h，4℃静置1h， 直至血液凝固血清分离，4℃，4000g离心10min。取上清于新的 无菌1.5mL离心管中，存于-20℃。
将重组腺相关病毒(rAAV-S1/rAAV-RBD)感染铺在12孔板 中的HEK293细胞，72小时之后PBS洗三次，多聚甲醛固定15分 钟，PBS洗三次。用2％BSA、0.3％TritonX-100稀释小鼠血清作为 一抗孵育2小时，PBS洗三次，引入FITC标记的羊抗鼠抗体作为 二抗，孵育一个小时，PBS洗三次，共聚焦显微镜采集图像，
结果如图8所示，表明小鼠血清中含有能够结合S1及RBD蛋 白的抗体。
通过ELISA检测小鼠血清中能够结合S1蛋白以及RBD蛋白 的结合抗体水平。将新冠S1/RBD蛋白稀释至2μg/mL，混匀后取 100μL/孔，共8孔，加入酶标板4℃过夜。弃包被液，加入200μL 封闭液，37℃放置2小时。用样本稀释液将小鼠血清稀释8个梯度。 洗涤液洗酶标板1次，取100μL血清稀释液到对应孔中，37℃放置 2小时。洗涤液洗酶标板3次，按1:1000稀释HRP Goat Anti-Mouse IgG(H+L)Ab抗体，100μL/孔，37℃放置1小时。洗涤液洗酶标板4次，加显色液TMB，100μL/孔，避光显色5min。向酶标板中加 入终止液50μL/孔。酶标仪测OD450nm和OD630nm。
实验结果如图9所示，S1组小鼠血清三次抗体水平均相对较 高，差异不大；RBD组小鼠血清呈逐次增高的趋势，差异较大； S1组均显著比RBD组抗体水平高。
2.包装新型冠状病毒假型病毒验证中和抗体水平
将293细胞铺到150mm培养皿中，体积30ml，14h左右观察 细胞并换15ml新鲜培养基(OPTI-MEM，不含双抗)。A液按照 psPAX2(10703bp)：pMD2G(5802bp)：plenti-luc(10249bp)分子量等 于1:1:1，核心质粒plenti-luc固定加20μg，加入500μL opti-MEM 中，涡旋混匀；B液按照PEI或者lipo2000(体积，μL)/DNA(质 量，μg)＝2计算PEI用量加入500μLopti-MEM中，涡旋混匀； 静置5分钟后，将B液加入A液中，涡旋混匀，静置15分钟后加 入平皿培养基中，轻轻晃动平皿，使转染液均匀分布；4-6h后换维 持液(3％FBS，1％双抗DMEM，30mL)。转染48-60h后，将上 清收集起来，800转离心5min，收上清过0.45μm滤器，按慢病毒浓缩试剂盒进行浓缩，-80℃冻存以备进行后续实验。
从-80℃的冰箱中取出假病毒，然后在冰上解冻，准备 ACE2-293细胞，用DMEM完全培养基将细胞浓度调节至2×10 5 细胞/ml，每孔添加100μl细胞悬液。待细胞贴壁后，吸弃旧培养 基，并加入90微升10％血清无抗DMEM。在第一列的孔加10微 升假病毒，设置重复排，之后按十倍梯度倍比稀释(以八排重复为 例，准备10个0.5毫升离心管，分别加入90微升DMEM，之后在 第一管中加入10微升假病毒毒液，混匀，吸出10微升加入下一管 中，重复该操作直到最后一管。之后从第一管中分别取出10微升 加入第二列的各个孔中，在第二管分别取出10微升加入第三列的 各个孔中，以此类推)，最后一排作为不接毒的空细胞对照。6小时 后换液，换成2％血清1％双抗的DMEM 200微升。放置在5％CO2， 37℃的培养箱中60-72小时。弃掉培养基，加入20微升细胞裂解 液使细胞完全裂解。通过移液器操作混合，并将10微升转移至相 应的96孔化学发光检测板。避光条件下加入10微升荧光素酶。孵 育2分钟后，在发光仪中读取RLU。根据滴定Reed-Muench方法 计算假型病毒的TCID 50。
结果如图10所示，表示包装出了高滴度的假型病毒，以用于 假病毒中和抗体检测试验。
56℃15分钟灭活补体的血清进行三倍梯度稀释，加入 100TCID50的假病毒在37℃共孵育1小时，并设置空细胞孔、只 接病毒无血清孔作为对照，设置100TCID50、10TCIDD50、1TCID50、0.1TCID50、0.01TCID50孔作为回归实验组。将混合物 接入铺好的细胞板(密度同TCID50)，48小时后裂解细胞测定RLU 结果如图11所示，A图为S1组小鼠血清，存在中和抗体，B图为 RBD组小鼠血清，中和抗体未能明显检出。
3.分离脾细胞检测细胞因子变化
免疫程序结束后，采集小鼠脾脏，切片并且对生发中心进行 HE染色，结果如图12所示，实验组生发中心均比对照组有明显的 数量和面积上的增加。
剩余脾脏组织进行ELISpot检测小鼠IFN-γ表达水平的变化。 用40μm细胞筛研磨至单细胞，转移至15ml离心管，4℃，300g 离心5min。将细胞重悬于2ml ACK中反应10min，加8ml 1640终 止裂解，4℃，300g离心5min。10ml 1640重悬细胞，4℃，300g 离心5min，重复一次。适量1640重悬，调整细胞浓度。PBS洗板 五次，200μl/孔。加入含有10％血清的培养基室温放置30分钟。弃 去培养基，加入小鼠脾细胞2.5*105个/孔，和1.5μg/ml RBD叠氮 肽库，阴性对照组不加入叠氮肽库，阳性对照组加入ConA刺激， 37℃培养12h。PBS洗板5次，200μl/孔。含0.5％胎牛血清的PBS 稀释酶标检测抗体1μg/ml，100μl/孔，室温2小时。PBS洗板5次， 200μl/孔。加入链霉亲和素-ALP100μl/孔，室温1小时。PBS洗板5 次。加入用0.45μm滤器过滤过的底物显色液，直至斑点出现，洗 板结束显色，风干后计数。在AID ELISPOT读板仪(EliSpot Reader-iSpot，AID,Germany)上进行全自动斑点图像采集和计数。 结果如图13和14所示，接种疫苗后小鼠分泌IFN-γ的免疫细胞总 量及占比明显上调，其中每106个脾细胞中S1组为905个，RBD 组为786个。
实施例3.重组腺相关病毒疫苗vAAV-S1/vAAV-RBD接种猫模 型及免疫学评价
1.免疫猫并验证目的蛋白结合抗体
用rAAV-eGFP感染猫肾细胞F81，72小时后检测荧光表达， 结果如图15所示。该结果验证了腺相关病毒能够感染猫。
准备9只实验猫，3只作为S1组，3只作为RBD组，3只作 为空白组。在猫双侧大腿内侧分别肌肉注射疫苗 vAAV-S1/vAAV-RBD，按照1E+10vg/只剂量接种。
采集猫只血液，分离血清，存于-20℃。将重组腺相关病毒感 染铺在12孔板中的HEK293细胞，72小时之后PBS洗三次，多聚 甲醛固定15分钟，PBS洗三次。用2％BSA、0.3％TritonX-100稀 释猫血清作为一抗孵育2小时，PBS洗三次，引入FITC标记的兔 抗猫抗体作为二抗，孵育一个小时，PBS洗三次，共聚焦显微镜采 集图像，结果如图16所示，表明猫血清中存在相应蛋白的结合抗 体。
2.验证中和抗体水平
56℃15分钟灭活补体的血清进行梯度稀释，加入100TCID50 的假病毒在37℃共孵育1小时，并设置空细胞孔、只接病毒无血清 孔作为对照，设置100TCID50、10TCIDD50、1TCID50、0.1TCID50、 0.01TCID50孔作为回归实验组。将混合物接入铺好的细胞板(密 度同TCID50)，48小时后裂解细胞测定RLU结果如图17所示，A 图为S1组猫血清，结果表明存在中和抗体，B图为RBD组猫血清， 中和抗体未能明显检出。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发 明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全 部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他 实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
武汉康湃特生物科技有限公司
<120> 用于预防猫感染新冠病毒的重组腺相关病毒及其构建方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2016
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 1
gtgtccagcc agtgtgtgaa cctgaccacc aggacccaac ttcctcctgc ctacaccaac 60
tccttcacca ggggagtcta ctaccctgac aaggtgttca ggtcctctgt gctgcacagc 120
acccaggacc tgttcctgcc attcttcagc aatgtgacct ggttccatgc catccatgtg 180
tctggcacca atggcaccaa gaggtttgac aaccctgtgc tgccattcaa tgatggagtc 240
tactttgcca gcacagagaa gagcaacatc atcaggggct ggatttttgg caccaccctg 300
gacagcaaga cccagtccct gctgattgtg aacaatgcca ccaatgtggt gattaaggtg 360
tgtgagttcc agttctgtaa tgacccattc ctgggagtct actaccacaa gaacaacaag 420
tcctggatgg agtctgagtt cagggtctac tcctctgcca acaactgtac ctttgaatat 480
gtgagccaac cattcctgat ggacttggag ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgagg 540
gagtttgtgt tcaagaacat tgatggctac ttcaagattt acagcaaaca cacaccaatc 600
aacctggtga gggacctgcc acagggcttc tctgccttgg aaccactggt ggacctgcca 660
attggcatca acatcaccag gttccagacc ctgctggctc tgcacaggtc ctacctgaca 720
cctggagact cctcctctgg ctggacagca ggagcagcag cctactatgt gggctacctc 780
caaccaagga ccttcctgct gaaatacaat gagaatggca ccatcacaga tgctgtggac 840
tgtgccctgg acccactgtc tgagaccaag tgtaccctga aatccttcac agtggagaag 900
ggcatctacc agaccagcaa cttcagggtc caaccaacag agagcattgt gaggtttcca 960
aacatcacca acctgtgtcc atttggagag gtgttcaatg ccaccaggtt tgcctctgtc 1020
tatgcctgga acaggaagag gattagcaac tgtgtggctg actactctgt gctctacaac 1080
tctgcctcct tcagcacctt caagtgttat ggagtgagcc caaccaaact gaatgacctg 1140
tgtttcacca atgtctatgc tgactccttt gtgattaggg gagatgaggt gagacagatt 1200
gcccctggac aaacaggcaa gattgctgac tacaactaca aactgcctga tgacttcaca 1260
ggctgtgtga ttgcctggaa cagcaacaac ctggacagca aggtgggagg caactacaac 1320
tacctctaca gactgttcag gaagagcaac ctgaaaccat ttgagaggga catcagcaca 1380
gagatttacc aggctggcag cacaccatgt aatggagtgg agggcttcaa ctgttacttt 1440
ccactccaat cctatggctt ccaaccaacc aatggagtgg gctaccaacc atacagggtg 1500
gtggtgctgt cctttgaact gctccatgcc cctgccacag tgtgtggacc aaagaagagc 1560
accaacctgg tgaagaacaa gtgtgtgaac ttcaacttca atggactgac aggcacagga 1620
gtgctgacag agagcaacaa gaagttcctg ccattccaac agtttggcag ggacattgct 1680
gacaccacag atgctgtgag ggacccacag accttggaga ttctggacat cacaccatgt 1740
tcctttggag gagtgtctgt gattacacct ggcaccaaca ccagcaacca ggtggctgtg 1800
ctctaccagg atgtgaactg tactgaggtg cctgtggcta tccatgctga ccaacttaca 1860
ccaacctgga gggtctacag cacaggcagc aatgtgttcc agaccagggc tggctgtctg 1920
attggagcag agcatgtgaa caactcctat gagtgtgaca tcccaattgg agcaggcatc 1980
tgtgcctcct accagaccca gaccaacagc ccaagg 2016
<210> 2
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 2
atgtccatgt tccgggtgca gccaaccgag agcatcgtgc gctttccaaa catcacaaat 60
ctgtgcccct tcggcgaggt gtttaacgcc accaggttcg cttccgtgta cgcctggaac 120
agaaagagga tctccaattg cgtggctgac tacagcgtgc tgtacaatag cgcctccttc 180
agcacattta agtgctacgg agtgtccccc accaaactga acgatctgtg cttcacaaac 240
gtgtacgctg acagctttgt gatcagaggg gatgaagtga ggcagatcgc tcctggacag 300
accgggaaga tcgccgacta caactacaaa ctgccagacg atttcacagg atgcgtgatc 360
gcctggaaca gcaacaatct ggatagcaaa gtgggcggaa actacaatta cctgtaccgg 420
ctgttccgca agtccaacct gaaacccttt gagagagaca tctccaccga gatctaccag 480
gctgggagca caccttgcaa cggcgtggag ggattcaatt gctactttcc tctgcagagc 540
tacggctttc agccaaccaa tggggtgggc taccagccct acagagtg 588
<210> 3
<211> 6736
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 3
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300
ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 540
agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 600
ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660
caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720
cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780
ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840
gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata 900
ggcccacaaa aaatgctttc ttcttttaat atactttttt gtttatctta tttctaatac 960
tttccctaat ctctttcttt cagggcaata atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc 1020
attctaaaga ataacagtga taatttctgg gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata 1080
aatatttctg catataaatt gtaactgatg taagaggttt catattgcta atagcagcta 1140
caatccagct accattctgc ttttatttta tggttgggat aaggctggat tattctgagt 1200
ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc atacctctta tcttcctccc acagctcctg 1260
ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat cactttggca aagaattggg attcgaacat 1320
cgattgaatt cgccaccatg ccactgctgc tactgctgcc cctgctgtgg gcaggggccc 1380
tggctgtgtc cagccagtgt gtgaacctga ccaccaggac ccaacttcct cctgcctaca 1440
ccaactcctt caccagggga gtctactacc ctgacaaggt gttcaggtcc tctgtgctgc 1500
acagcaccca ggacctgttc ctgccattct tcagcaatgt gacctggttc catgccatcc 1560
atgtgtctgg caccaatggc accaagaggt ttgacaaccc tgtgctgcca ttcaatgatg 1620
gagtctactt tgccagcaca gagaagagca acatcatcag gggctggatt tttggcacca 1680
ccctggacag caagacccag tccctgctga ttgtgaacaa tgccaccaat gtggtgatta 1740
aggtgtgtga gttccagttc tgtaatgacc cattcctggg agtctactac cacaagaaca 1800
acaagtcctg gatggagtct gagttcaggg tctactcctc tgccaacaac tgtacctttg 1860
aatatgtgag ccaaccattc ctgatggact tggagggcaa gcagggcaac ttcaagaacc 1920
tgagggagtt tgtgttcaag aacattgatg gctacttcaa gatttacagc aaacacacac 1980
caatcaacct ggtgagggac ctgccacagg gcttctctgc cttggaacca ctggtggacc 2040
tgccaattgg catcaacatc accaggttcc agaccctgct ggctctgcac aggtcctacc 2100
tgacacctgg agactcctcc tctggctgga cagcaggagc agcagcctac tatgtgggct 2160
acctccaacc aaggaccttc ctgctgaaat acaatgagaa tggcaccatc acagatgctg 2220
tggactgtgc cctggaccca ctgtctgaga ccaagtgtac cctgaaatcc ttcacagtgg 2280
agaagggcat ctaccagacc agcaacttca gggtccaacc aacagagagc attgtgaggt 2340
ttccaaacat caccaacctg tgtccatttg gagaggtgtt caatgccacc aggtttgcct 2400
ctgtctatgc ctggaacagg aagaggatta gcaactgtgt ggctgactac tctgtgctct 2460
acaactctgc ctccttcagc accttcaagt gttatggagt gagcccaacc aaactgaatg 2520
acctgtgttt caccaatgtc tatgctgact cctttgtgat taggggagat gaggtgagac 2580
agattgcccc tggacaaaca ggcaagattg ctgactacaa ctacaaactg cctgatgact 2640
tcacaggctg tgtgattgcc tggaacagca acaacctgga cagcaaggtg ggaggcaact 2700
acaactacct ctacagactg ttcaggaaga gcaacctgaa accatttgag agggacatca 2760
gcacagagat ttaccaggct ggcagcacac catgtaatgg agtggagggc ttcaactgtt 2820
actttccact ccaatcctat ggcttccaac caaccaatgg agtgggctac caaccataca 2880
gggtggtggt gctgtccttt gaactgctcc atgcccctgc cacagtgtgt ggaccaaaga 2940
agagcaccaa cctggtgaag aacaagtgtg tgaacttcaa cttcaatgga ctgacaggca 3000
caggagtgct gacagagagc aacaagaagt tcctgccatt ccaacagttt ggcagggaca 3060
ttgctgacac cacagatgct gtgagggacc cacagacctt ggagattctg gacatcacac 3120
catgttcctt tggaggagtg tctgtgatta cacctggcac caacaccagc aaccaggtgg 3180
ctgtgctcta ccaggatgtg aactgtactg aggtgcctgt ggctatccat gctgaccaac 3240
ttacaccaac ctggagggtc tacagcacag gcagcaatgt gttccagacc agggctggct 3300
gtctgattgg agcagagcat gtgaacaact cctatgagtg tgacatccca attggagcag 3360
gcatctgtgc ctcctaccag acccagacca acagcccaag gcatcatcac caccatcact 3420
aaggatcctc tagagtcgac ctgcagaagc ttgcctcgag cagcgctgct cgagagatct 3480
acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 3540
cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 3600
ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 3660
caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 3720
ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 3780
tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 3840
ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 3900
cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc 3960
tgattttgta ggtaaccacg tgcggaccga gcggccgcag gaacccctag tgatggagtt 4020
ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 4080
acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcaggg 4140
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatacgtca 4200
aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 4260
cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 4320
tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 4380
gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt 4440
tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 4500
ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcgggctat 4560
tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 4620
taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact 4680
ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 4740
gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 4800
gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga 4860
aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 4920
acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 4980
atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 5040
tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 5100
gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 5160
gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 5220
gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 5280
ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 5340
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atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 6000
tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 6060
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ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 6360
gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 6420
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gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 6600
cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 6660
cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 6720
ccttttgctc acatgt 6736
<210> 4
<211> 5269
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 4
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
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ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360
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ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840
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ggcccacaaa aaatgctttc ttcttttaat atactttttt gtttatctta tttctaatac 960
tttccctaat ctctttcttt cagggcaata atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc 1020
attctaaaga ataacagtga taatttctgg gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata 1080
aatatttctg catataaatt gtaactgatg taagaggttt catattgcta atagcagcta 1140
caatccagct accattctgc ttttatttta tggttgggat aaggctggat tattctgagt 1200
ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc atacctctta tcttcctccc acagctcctg 1260
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cgattgaatt cgccaccatg tccatgttcc gggtgcagcc aaccgagagc atcgtgcgct 1380
ttccaaacat cacaaatctg tgccccttcg gcgaggtgtt taacgccacc aggttcgctt 1440
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atctgtgctt cacaaacgtg tacgctgaca gctttgtgat cagaggggat gaagtgaggc 1620
agatcgctcc tggacagacc gggaagatcg ccgactacaa ctacaaactg ccagacgatt 1680
tcacaggatg cgtgatcgcc tggaacagca acaatctgga tagcaaagtg ggcggaaact 1740
acaattacct gtaccggctg ttccgcaagt ccaacctgaa accctttgag agagacatct 1800
ccaccgagat ctaccaggct gggagcacac cttgcaacgg cgtggaggga ttcaattgct 1860
actttcctct gcagagctac ggctttcagc caaccaatgg ggtgggctac cagccctaca 1920
gagtgtaccc ctacgacgtg cctgattacg cctgaggatc ctctagagtc gacctgcaga 1980
agcttgcctc gagcagcgct gctcgagaga tctacgggtg gcatccctgt gacccctccc 2040
cagtgcctct cctggccctg gaagttgcca ctccagtgcc caccagcctt gtcctaataa 2100
aattaagttg catcattttg tctgactagg tgtccttcta taatattatg gggtggaggg 2160
gggtggtatg gagcaagggg caagttggga agacaacctg tagggcctgc ggggtctatt 2220
gggaaccaag ctggagtgca gtggcacaat cttggctcac tgcaatctcc gcctcctggg 2280
ttcaagcgat tctcctgcct cagcctcccg agttgttggg attccaggca tgcatgacca 2340
ggctcagcta atttttgttt ttttggtaga gacggggttt caccatattg gccaggctgg 2400
tctccaactc ctaatctcag gtgatctacc caccttggcc tcccaaattg ctgggattac 2460
aggcgtgaac cactgctccc ttccctgtcc ttctgatttt gtaggtaacc acgtgcggac 2520
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tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 3300
ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 3360
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taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat 3480
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agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 3600
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ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 3720
atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 3780
ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 3840
gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 3900
ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 3960
ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 4020
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agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 4800
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 4860
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 4920
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 4980
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 5040
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 5100
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 5160
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 5220
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgt 5269
Claims (8)
1.一种用于预防猫感染新冠病毒的重组腺相关病毒，其特征在于：所述重组腺相关病毒表达刺突蛋白S1/RBD蛋白。
2.根据权利要求1所述用于预防猫感染新冠病毒的重组腺相关病毒，其特征在于：所述编码刺突蛋白S1/RBD蛋白的核苷酸序列经过密码子优化。
3.根据权利要求2所述用于预防猫感染新冠病毒的重组腺相关病毒，其特征在于：所述刺突蛋白S1/RBD蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1所述用于预防猫感染新冠病毒的重组腺相关病毒，其特征在于：所述腺相关病毒为AAV-DJ。
5.一种用于预防猫感染新冠病毒的重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)优化刺突蛋白S1/RBD蛋白的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
2)将pAAV-CMV-eGFP用EcoRI及BamHI进行双酶切，回收载体片段AAV-CMV；
3)将两端含有EcoRI及BamHI酶切位点序列的S1基因片段/RBD基因片段与载体片段AAV-CMV连接后转化，分别获得核心质粒pAAV-CMV-S1/pAAV-CMV-RBD；
4)将核心质粒pAAV-CMV-S1/pAAV-CMV-RBD、pAAV-DJ、pAAV-Helper共转染293T细胞，培养离心，冻融，收集上清；得到重组腺相关病毒rAAV-S1/rAAV-RBD。
6.一种权利要求1所述的重组腺相关病毒在制备预防猫感染新冠病毒疫苗中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述疫苗为重组腺相关病毒载体疫苗。
8.一种预防猫感染新冠病毒的重组腺相关病毒载体疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建编码刺突蛋白S1/RBD蛋白的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
2)将上述任意一种核苷酸序列插入质粒载体中，得到重组腺相关病毒核心质粒pAAV-S1/pAAV-RBD
3)将重组腺相关病毒核心质粒pAAV-S1/rAAV-RBD和辅助质粒感染细胞，产生重组腺相关病毒rAAV-S1/rAAV-RBD
4)回收重组腺相关病毒，重悬于PBS/DMEM，制备高滴度重组腺相关病毒载体疫苗vAAV-S1/vAAV-RBD。
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| CN113912738A (zh) * | 2021-07-19 | 2022-01-11 | 华中农业大学 | 一种猫新型冠状病毒亚单位疫苗及其制备方法及应用 |
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