KR102070176B1

KR102070176B1 - 신경회로 연결망을 검출할 수 있는 이중표지 바이러스 벡터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102070176B1
Application number: KR1020180092788A
Authority: KR
Inventors: 박형주; 오준영
Original assignee: 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2018-08-09
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2020-01-28

Abstract

본 발명은 신경회로 연결망을 검출할 수 있는 이중표지 바이러스 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 제1 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 제2 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 신경회로 연결망을 검출할 수 있는 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터 및 본 발명의 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터를 표적 신경세포 또는 표적 뇌 조직에 감염시킨 후, 리포터 단백질의 발색 정도를 측정하는 단계를 포함하는 신경회로 연결망의 검출방법에 관한 것이다.

Description

신경회로 연결망을 검출할 수 있는 이중표지 바이러스 벡터 및 이의 용도{Double labeled virus vector detectable neural network and use thereof}

본 발명은 뇌 신경회로 연결망을 검출할 수 있는 이중표지 바이러스 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.

뇌는 사고, 판단, 기억과 학습 등의 고등 기능에서부터 잠, 욕구 등과 같은 원초적 기능에까지 모든 동물의 기능을 관장한다. 성인의 경우 약 1250-1400g 정도로 몸무게의 약 2%에 불과하지만 전체 에너지의 약 20% 이상을 소비하는 가장 중요한 기관이다. 뇌에는 수많은 뇌세포들이 존재하는데 이 중 약 10% 정도는 신경세포(뉴런)가 차지하며,‘시냅스’라는 특수한 구조를 통해서 신경전달을 매개하게 된다.

또한 이러한 뇌에는 약 1000억개의 신경세포가 존재하고 각각의 신경세포는 다른 신경세포와 수많은 시냅스를 형성하고 있으며 이렇게 복잡하고 다양한 시냅스는 뇌의 다양한 부위에서 존재하며 특정 신경회로망을 만들게 되고, 궁극적으로 뇌기능을 매개하는 기초가 된다. 따라서 시냅스의 기능에 문제가 생기면 신경회로망이 제대로 작동하지 않게 되며 뇌질환을 일으키는 원인이 된다.

시냅스는 하나의 신경세포에서 다른 신경세포로 신호를 전달하는 특수한 접점구조로서, 하나의 신경세포의 축삭돌기(전시냅스)와 다른 신경세포의 수상돌기(후시냅스)가 만나는 부위이다. 이러한 시냅스를 통한 신경전달은, 하나의 신경세포에서 전기신호가 발생하면 신경세포말단에 빠르게 도달하여 신경전달물질을 분비하게 되는데 분비된 신경전달물질은 다른 신경세포에 존재하는 수용체에 결합하여 화학신호를 전달하게 되며 이러한 과정을 통해서 시냅스에서 신경전달이 발생하게 된다.

한편, 뇌영역의 신경세포들은 하나의 뇌영역과 연결되어 있는 것이 아니라 매우 다양한 영역 및 수많은 신경세포들과 연결되어 있어 실제적으로 뇌 신경전달 과정을 정확하게 확인하는 것은 매우 어려운 일이다.

이에 뇌영역 또는 뇌 신경세포간 신호전달 현상을 조금 더 명확하기 확인하기 위한 기술들이 개발되고 있는데, 그 예로 뇌영역 간의 연결성을 보기 위한 trans-synaptic retrograde tracing 기법이 개발되었고 뇌 영역간 연결성을 기반으로 한 전사체 프로파일링 작업이 진행된 바 있으나, 이러한 방법으로는 특정 뇌영역에서의 ‘개별 뉴런’이 어떤 다른 뇌영역으로부터 신호 입력을 받는지 또는 어떤 유형의 뉴런들과 연결되어 있는지를 확인할 수 없는 문제점이 있다. 또한 다른 개발 기술로는 초분자 물질의 분자쌍을 이용한 신경세포의 물질수송 시스템 특히 소포체 막융합에 의한 신경전달물질 기전의 연구가 가능함을 확인하였으나, 이러한 방법 역시 뇌영역간의 신호 연결망 및 어떤 유형의 뉴런들과 연결되어 있는지를 확인할 수 없는 한계가 있다.

이에 본 발명자들은 뇌영역간의 신호 연결망 및 뉴런 연결망의 특이성을 보다 정확히 검출하고 분석하기 위한 방법으로, 특정 재조합 효소에 의해 특이적으로 다른 형광단백질의 발현을 유도할 수 있으며, 다중 신호전달 여부와 신경세포간 또는 뇌영역간의 연결성을 가시적으로 확인할 수 있는 이중표지 바이러스 벡터를 제조하였고 이의 기능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

미국등록특허 제8,324,367호

따라서 본 발명의 목적은 신경회로 연결망을 검출할 수 있는 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터를 표적 신경세포 또는 표적 뇌 조직에 감염시킨 후, 리포터 단백질의 발색 정도를 측정하는 단계를 포함하는 신경회로 연결망의 검출방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 제2 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 신경회로 연결망을 검출할 수 있는 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 리포터 단백질은 형광 단백질 또는 발광 단백질일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 리포터 단백질은 녹색 형광 단백질인 EGFP(Green Fluorescent Protein), 붉은 형광 단백질인 mScarlet 및 푸른 형광 단백질인 mCerulean3으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나이며, 상기 제1 프로모터 또는 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질은 서로 다른 종류의 리포터 단백질일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 양 말단에는 위치-특이적 재조합 효소 인식 염기서열(two site specific recognition site)이 결합되어 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 위치-특이적 재조합 효소 인식 염기서열은 Cre/loxP, Flp/FRT 또는 vCre/vloxP 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이중표지 바이러스 벡터는 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 도 2의 개열지도를 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터를 표적 신경세포 또는 표적 뇌 조직에 감염시킨 후, 리포터 단백질의 발색 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 신경회로 연결망의 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 본 발명의 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터가 감염된 표적 신경세포 또는 표적 뇌 조직과의 신경회로 연결망 형성여부를 분석하기 위한 다른 표적 신경세포 또는 표적 뇌 조직에는 재조합 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 감염시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 효소는 Cre, Flp 또는 vCre일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 효소 Cre를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 도 5의 개열지도를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 효소 Flp를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 서열번호 3의 염기서열을 가지며, 도 6의 개열지도를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 효소 vCre를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 서열번호 4의 염기서열을 가지며, 도 7의 개열지도를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 리포터 단백질의 발색은 재조합 효소의 선택적 반응에 의해 발색되는 것으로, 재조합효소 Cre가 발현되는 경우에만 EGFP(Green Fluorescent Protein)가 발현되어 녹색 형광을 나타내고, 재조합효소 Flp가 발현되는 경우에만 mScarlet가 발현되어 붉은색 형광을 나타내며, 재조합효소 vCre가 발현되는 경우에만 mCerulean3가 발현되어 푸른 형광을 나타내고, 상기 표적 신경세포들 또는 표적 뇌 조직들에서 발색되는 형광색이 서로 동일한 경우, 신경회로가 서로 연결되어 있는 것으로 판단하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터는 시냅스 전달 능력이 없고, 재조합 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 시냅스 전달 능력이 있는 것일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터는 뇌 영역간 또는 뇌 신경세포들 간에 신호전달의 연결망 및 신호전달 방향성을 한 번에 다중으로 분석할 수 있으므로, 다수의 신경세포 또는 다수의 뇌영역으로부터 연결되는 서로 다른 신경세포의 연결성 및 방향성을 동시에 용이하게 표지하여 확인할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 이중표지 바이러스 벡터인 AAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도로서, 1a는 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP 플라스미드 제조과정을 나타낸 것이고, 1b는 pAAV-CMV-fDIO-mScarlet 플라이스미드의 제조과정을 나타낸 것이며, 1c는 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 벡터의 제조과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 제조한 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 이중표지 바이러스 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 재조합 효소인 Cre, Flp 및 vCre를 이용한 특이적 발현 벡터의 작동원리를 모식도로 나타낸 것으로, 3a 및 3b는 Cre 및 Flp의 이중발현 벡터일 경우의 작동원리를 나타낸 것이고 3c는 Cre, Flp 및 vCre 중에서 선택되는 2개의 재조합 효소를 이용한 이중발현 벡터의 작동원리를 나타낸 것이다.
도 4는 재조합 효소인 Cre, Flp 및 vCre을 각각 포함하는 바이러스 벡터의 제조과정을 나타낸 것으로, 4a는 pAAV-hSyn-Cre 바이러스 벡터의 제조과정을 나타낸 것이고, 4b는 pAAV-hSyn-Flp 바이러스 벡터의 제조과정을 나타낸 것이며, 4c는 pAAV-hSyn-vCre 바이러스 벡터의 제조과정을 나타낸 것이다.
도 5는 pAAV-hSyn-Cre 바이러스 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 6은 pAAV-hSyn-Flp 바이러스 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 7은 pAAV-hSyn-vCre 바이러스 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 8은 HEK293 세포주에 본 발명에서 제조한 이중표지 바이러스 벡터와 재조합 효소가 함유된 바이러스 벡터로 형질감염 후, 형광현미경을 통해 본 발명의 이중표지 바이러스 벡터의 작동여부를 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 9는 HEK293 세포주에 본 발명에서 제조한 이중표지 바이러스 벡터와 재조합 효소가 함유된 바이러스 벡터로 형질감염 후, FACS 분석을 통해 본 발명의 이중표지 바이러스 벡터의 작동여부를 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 10은 이중표지 바이러스 벡터와 재조합 효소가 함유된 바이러스 벡터를 마우스 동물모델의 각각의 뇌 영역에 주입하는 모식도 및 실험 스케줄을 나타낸 것이다.
도 11은 실험용 마우스의 후두정엽피질(posterior parietal cortex) 뇌 영역에서 본 발명에서 제조한 이중표지 바이러스 벡터를 이용한 뇌신경회로 연결망을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 이중표지 바이러스 벡터와 재조합 효소가 함유된 바이러스 벡터를 마우스 동물모델의 각각의 뇌 영역에 주입하는 모식도 및 실험 스케줄을 나타낸 것이다.
도 13은 실험용 마우스의 선조체 뇌 영역에서 본 발명에서 제조한 이중표지 바이러스 벡터를 이용한 뇌신경회로 연결망을 분석한 결과(오른쪽 사진) 및 뇌 선조체에서 표지된 세포의 수를 카운팅한 결과(왼쪽 그래프)를 나타낸 것이다.

본 발명은 뇌영역간의 신호 연결망 및 뉴런 연결망의 특이성을 용이하고 정확하게 검출하는데 사용할 수 있는 재조합 이중표지 바이러스 벡터를 제공함에 특징이 있다.

본 발명에 따른 조합 이중표지 바이러스 벡터는 특정 재조합 효소에 의해 특이적으로 다른 색의 형광을 나타내는 리포터 단백질의 발현을 유도하여, 발현되는 색깔의 확인을 통해 신경세포간 또는 뇌영역간에 다중 신호전달 여부와 신경회로 연결성을 가시적으로 확인할 수 있다.

구체적으로 본 발명에 따른 상기 재조합 이중표지 바이러스 벡터는 제1 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 제2 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명에 따른 상기 재조합 이중표지 바이러스 벡터에 삽입되어 있는 리포터 단백질은 형광 단백질 또는 발광 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 리포터 단백질은 녹색 형광 단백질인 EGFP(Green Fluorescent Protein), 붉은 형광 단백질인 mScarlet 및 푸른 형광 단백질인 mCerulean3으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나이며, 상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질은 서로 다른 종류의 리포터 단백질이다.

또한, 본 발명의 리포터 단백질의 발현은 선택적이고 특이적으로 발현이 되는데, 각 리포터 단백질은 각각의 리포터 단백질 특이적으로 반응하는 재조합 효소에 의해서만 발현이 이루어진다.

재조합 효소 특이적 리포터 단백질의 발현을 유도하기 위해 본 발명의 이중표지 바이러스 벡터에는 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 양말단에 위치-특이적 재조합 효소 인식 염기서열(two site specific recognition site)이 결합되어 있으며, 상기 위치-특이적 재조합 효소 인식 염기서열은 Cre/loxP, Flp/FRT 또는 vCre/vloxP 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열이다.

보다 구체적으로 본 발명의 벡터를 이용한 재조합 효소 특이적 리포터 단백질의 발현 작동 원리를 설명하면, Cre/loxP, Flp/FRT 또는 vCre/vloxP 시스템을 이용한 것으로, Cre/loxP 시스템은 loxP와 loxP 역방향체 사이에 위치하고 있는 염기서열인 EGFP 염기서열이 Cre 재조합 효소에 의해 역전위되어 정상적인 발현이 유도된다. 여기서 상기 역방향체는 염기서열의 배열이 반대방향으로 전위된 염기서열을 의미하는 것이다.

Cre는 Cre 재조합 효소를 의미하며, LoxP 염기서열을 인식하여 재조합을 일으키는 효소로서, Cre는 LoxP 사이에 특정 유전자가 삽입된 구조체에 작용하여 LoxP 사이의 특정 유전자를 제거하므로, 이러한 Cre/LoxP 시스템을 이용하여 특정 유전자의 기능을 확인할 수 있다.

본 발명에서의 Cre/LoxP 시스템은 LoxP와 LoxP 역방향체 사이에 특정 염기서열을 삽입시키고, Cre를 이용하여 LoxP와 LoxP 사이의 특정 염기서열을 역위(invert form)시키는 것으로, 본원발명은 동일한 방향성을 가지는 LoxP 사이의 염기서열을 제거하는 것이 아닌, 서로 다른 방향성을 가지는 LoxP 사이의 염기서열을 역위시키는 것이다.

또한, 상기 Flp/FRT 또는 vCre/vloxP 시스템도 Cre/LoxP 시스템과 동일한 원리로 적용되는 시스템으로서, Flp/FRT은 재조합 효소 Flp를 이용하여 FRT와 FRT 역방향체 사이에 위치된 붉은 형광 단백질인 mScarlet을 암호화하는 염기서열을 역위(invert form)시켜 mScarlet의 발현을 유도하고, vCre/vloxP은 재조합 효소 vCre를 이용하여 vloxP와 vloxP 역방향체 사이에 위치된 푸른 형광 단백질인 mCerulean3을 암호화하는 염기서열을 역위(invert form)시켜 mCerulean3의 발현이 유도되도록 하였다. 이러한 원리를 나타내는 모식도를 도 3에 나타내었다.

따라서 본 발명에 따른 이중표지 바이러스 벡터에 삽입된 리포터 단백질은 무작위적으로 발현이 되는 것이 아니라, 특정 재조합 효소에 의해 선택적으로 특정 타겟 단백질의 발현이 유도되어 특정 색을 발광하게 된다.

본 발명의 일실시예에서는 녹색 형광 단백질인 EGFP(Green Fluorescent Protein) 및 붉은 형광 단백질인 mScarlet이 이중으로 도입된 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 바이러스 벡터를 제조하였으며, 상기 벡터를 이루고 있는 염기서열을 서열번호 1에 기재하였으며, 벡터의 개열지도는 도 2에 나타내었다.

상기 서열번호 1로 기재된 본 발명의 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 바이러스 벡터에서, EGFP 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 1570번째에서 2289번째까지의 염기서열로 이루어져 있고, 상기 mScarlet 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 3140번째에서 3838번째까지의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 서열번호 1로 이루어진 이중표지 바이러스 벡터에서, 위치-특이적 재조합 효소 인식 염기서열로서, Cre 재조합 효소가 인식하는 부위(Cre/loxP)인 lox2272에 해당하는 ATAACTTCGTATAAAGTATCCTATACGAAGTTAT 서열은 서열번호 1의 1434번째부터 1467번째까지의 염기서열에 해당하고, 또한 ATAACTTCGTATAGGATACTTTATACGAAGTTAT 서열은 서열번호 1의 2296번째부터 2329번째까지의 염기서열에 해당한다. Cre 재조합 효소가 인식하는 다른 부위인 loxp에 해당하는 ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT 서열은 서열번호 1의 1530번째부터 1563번째까지의 염기서열에 해당하고, 또한 ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT 서열은 서열번호 1의 2400번째부터 2433번째까지의 염기서열에 해당한다.

본 발명의 서열번호 1로 이루어진 이중 바이러스 벡터에서, 위치-특이적 재조합 효소 인식 염기서열로서, Flp 재조합 효소가 인식하는 부위(Flp/FRT)인 FRT에 해당하는 GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC 서열은 서열번호 1의 3014번째부터 3047번째까지의 염기서열에 해당하고, 또한 GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC서열은 서열번호 1의 3848번째부터 3881번째까지의 염기서열에 해당한다. 또한 Flp 재조합 효소가 인식하는 다른 부위인 F5에 해당하는 GAAGTTCCTATTCTTCAAAAGGTATAGGAACTTC 서열은 서열번호 1의 3098번째부터 3131번째까지의 염기서열에 해당하고, GAAGTTCCTATACCTTTTGAAGAATAGGAACTTC 서열은 서열번호 1의 3932번째부터 3965번째까지의 염기서열에 해당한다.

또한, 본 발명에서 상기 '프로모터'는 목적하는 단백질의 유전자가 상기 프로모터의 다운스트림에 융합되어 있고 표적 세포에서 단백질의 발현을 조절할 수 있는 프로모터를 의미한다. 본 발명의 상기 제1 프로모터 또는 제2 프로모터는 일반적인 동물세포 내에서 유전자 발현을 가능하게 하는 프로모터라면 모두 사용이 가능하며, 이에 제한되지는 않지만 EF1a, CMV 또는 UbC 프로모터를 사용할 수 있고, 또한 신경세포 특이적 프로모터도 사용할 수 있다.

또한, 상기 “작동가능하게 연결된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독 과정을 조절하게 된다.

또한, 본 발명의 상기 이중표지 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus)를 이용하였는데, 상기 아데노 연관 바이러스(구체적으로 아데노연관바이러스 1아형 AAV serotype 1)는 시냅스를 통하여 특정 유전자를 전달하는 능력을 가진 바이러스로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 신경세포 또는 뇌 조직에서의 시냅스를 통한 신경회로 연결망을 확인할 수 있도록 아데노 연관 바이러스를 이용하였다. 또한, 이러한 아데노 연관 바이러스는 유전체의 전달에 있어서 우수한 장점을 가지고 있는데, 유전자 전달의 측면에서 감염 가능한 숙주세포의 종류가 다양하고, 분열하지 않는 세포에도 감염이 가능하다는 장점을 지닌다. 또한 높은 역가(10^6~7 pfu/ml)의 바이러스 입자를 얻을 수 있으며 세포분열 여부에 상관없이 다양한 세포에 효율적으로 감염시킬 수 있다. 기존의 물리 화학적인 유전자 전달 방식은 세포에 독성을 일으키기도 하지만 아데노 연관 바이러스는 생물학적인 유전자 전달 방식을 따르므로 독성에 의한 숙주세포의 손상을 최소화할 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터를 신경회로 연결망을 검출하고자 하는 표적 신경세포 또는 표적 뇌 조직에 감염시킨 후 리포터 단백질의 발색 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 신경회로 연결망의 검출방법을 제공함에 특징이 있다.

구체적으로 본 발명의 신경회로 연결망 검출방법은, (1) 본 발명의 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터를 표적 신경세포 또는 표적 뇌 조직 영역으로 감염시키고, (2) 동시에 상기 표적 신경세포 또는 표적 뇌 조직과의 신경회로 연결망 여부를 확인하고자 하는 다른 표적 신경세포 또는 다른 표적 뇌 조직에 재조합 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 감염시킨 후, (3) 상기 신경세포 또는 뇌 조직에서 발현되는 리포터 단백질의 발색 정도를 분석하는 단계를 포함한다.

이때 상기 재조합 효소는 Cre, Flp 또는 vCre일 수 있으며, 상기 재조합 효소 Cre를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 도 5의 개열지도를 갖는 것일 수 있다. 상기 재조합 효소 Cre를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 647번째부터 1711번째의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 상기 재조합 효소 Flp를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 서열번호 3의 염기서열을 가지며, 도 6의 개열지도를 갖는 것일 수 있으며, 상기 재조합 효소 Flp를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 657번째부터 1928번째의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 상기 재조합 효소 vCre를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 서열번호 4의 염기서열을 가지며, 도 7의 개열지도를 갖는 것일 수 있으며, 상기 재조합 효소 vCre를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 653번째부터 1795번째의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

앞서 기술한 바와 같이 본 발명의 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터를 이용하여 상기 벡터내에 삽입된 리포터 단백질의 발현 및 발색은 재조합 효소의 선택적 반응에 의해 발색되는 것으로, 재조합효소 Cre가 발현되는 경우에만 EGFP(Green Fluorescent Protein)가 발현되어 녹색 형광을 나타내고, 재조합효소 Flp가 발현되는 경우에만 mScarlet가 발현되어 붉은색 형광을 나타내며, 재조합효소 vCre가 발현되는 경우에만 mCerulean3가 발현되어 푸른색 형광을 나타낸다.

또한, 예컨대 재조합효소 Cre 및 Flp가 각각의 신경세포 또는 뇌조직에서 발현되어 본 발명의 벡터가 감염된 신경세포 또는 뇌조직으로 신호전달이 이루어지면, 신경세포 또는 뇌조직에서는 녹색 형광 및 붉은색 형광이 이중으로 표지되어 나타날 수 있게 된다.

따라서 상기 표적 신경세포들 또는 표적 뇌 조직들에서 발색여부 또는 발색의 종류를 확인함으로써 신경회로의 연결성 여부를 판단할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 신경회로 연결망 검출방법에서 본 발명의 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터는 시냅스 전달 능력이 없고(아데노 연관 바이러스 serotype 5), 재조합 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 시냅스 전달 능력이 있는 것(아데노 연관 바이러스 serotype 1)을 선택하여 사용할 수 있는데, 즉, 시냅스 전이가 가능한 서로 다른 재조합 효소 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 입력신호를 보내는 신경세포군에 각각 다르게 발현시키고, 여러 입력신호를 동시에 받는 신경세포군에는 재조합 효소 의존적으로 다중 리포터 단백질이 발현되는 본 발명의 이중표지 바이러스 벡터를 발현시켜, 이들 신경세포들 간의 신경회로 연결망을 서로 다른 형광단백질의 발색 종류로 구분함으로써, 신경전달의 연결성 및 신경전달의 방향성을 확인할 수 있다.

본 발명의 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터를 이용할 경우, 실제적으로 신경회로 연결망을 검출할 수 있는지 확인하기 위해, 본 발명의 일실시예에서는 마우스 동물모델을 사용하여 실험을 수행하였다.

구체적으로, 본 발명의 일실시예에 의하면, 재조합 효소 Cre 염기서열을 함유한 아데노 연관 바이러스 벡터(AAV1-hSyn-Cre)를 마우스 뇌의 AUD(Auditory area) 영역으로 주입하였고, 다른 재조합 효소 Flp 염기서열을 함유한 아데노 연관 바이러스 벡터(AAV1-hSyn-Flp)는 마우스 뇌의 V1(primary visual cortex) 영역으로 주입하였으며, 본 발명의 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터(AAV5-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet)는 PPC(posterior parietal cortex) 영역으로 주입한 후, 5주 동안 발현을 유도한 다음, 마우스로부터 뇌 절편을 수득하여 형광현미경으로 발색 정도를 분석하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 이중 표지 바이러스 벡터가 주입된 PPC 영역에서는 녹색 형광과 붉은색 형광이 모두 관찰되었는데, 이는 뇌의 AUD 영역으로부터 재조합효소 Cre가 PPC 영역으로 전달되어 녹색 형광이 발색된 것이며, V1 영역으로부터 Flp이 PPC 영역으로 전달되어 붉은색 형광이 발색된 것으로, 뇌의 AUD 및 V1으로부터 신경회로가 PPC로 전달되어 뇌신경회로 연결망이 형성되고 있음을 확인할 수 있었다.

나아가 본 발명의 다른 일실시예에서는 다른 뇌 영역인 M1 영역(primary motor cortex)에 재조합 효소 Cre 발현 벡터인 AAV1-hSyn-Cre을 감염시켰고, 또는 뇌 영역인 VPM 영역(ventral posteromedial nucleus)에는 재조합 효소 Flp 발현 벡터인 AAV1-hSyn-Flp을 감염시켰으며, 본 발명의 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터(AAV5-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet)는 선조체(striatum)영역으로 주입한 후, 이들 뇌 영역간의 신경회로 연결망을 형광현미경을 분석하였다.

그 결과, M1 영역으로부터 Cre가 선조체 영역으로 전달되고, VPM으로부터 Flp이 선조체 영역 전달되어, 선조체 내로 도입된 AAV5-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 벡터가 신호전달 연결-특이적으로 작동하여 녹색과 붉은색의 형광이 모두 발색됨을 확인함에 따라, M1 영역에서 선조체 방향으로 뇌신경회로가 전달되고, VPM 영역에서 선조체 방향으로 뇌신경회로가 전달되고 있음을 알 수 있었다.

대부분의 뇌 영역의 신경세포들은 하나의 영역과 연결되어 있는 것이 아니며 다양한 영역 및 다수의 신경세포들과 복잡하게 연결되어 있어 다수의 영역 또는 다수의 신경세포들간의 신경전달 연결망을 복합적으로 분석 및 검출하는데 어려움이 있었으나, 본 발명에서 제공하는 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터를 이용하게 될 경우, 뇌 영역간 또는 뇌 신경세포들 간에 신호전달의 연결망 및 신호전달 방향을 한 번에 다중으로 분석할 수 있음을 알 수 있었고, 하나의 본 발명의 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터만으로 다수 신경세포 또는 다수의 뇌영역으로부터 연결되는 서로 다른 신경세포의 연결성을 동시에 표지하여 확인할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<시료 및 실험방법>

실험동물준비

마우스(C57BL / 6J)는 Orient Bio (한국)에서 구입하여 사용하였으며, 모든 실험은 한국 뇌연구소의 기관 동물 케어 및 사용위원회(IACUC-17-00016)의 가이드 라인에 따라 수행하였다.

세포배양 및 형질감염( Transfection )

인간 배아 신장(HEK) 293T 세포는 10% 태아소혈청 (FBS, HyClone ™)이 함유된 Dulbecco 's modified Eagle 's 배지(DMEM, HyClone ™)에서 37℃ 및 5% CO₂ 하에서 배양하였다. 배양된 HEK 293T 세포에 대한 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 도입은 Lipofectamine 2000 방법 (Invitrogen)을 사용하여 형질 감염하였고, 형질 감염 후 HEK 293T 세포를 각 실험 설계에 따라 48~72 시간 동안 배양하여 사용하였다.

FACS 분석

형광 - 활성화된 세포 집단에 대한 FACS 분석을 위해, HEK 293T 세포를 Cre- 및/또는 Flp- 재조합 효소 및 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet으로 형질 감염시켰고, 48 시간 후 형질감염된 세포를 0.25 % 트립신 -EDTA (Gibco)로 수거한 다음, 1X PBS (인산 완충 식염수, pH 7.4)로 세척하고 원심분리 하였다. 이후 수확한 세포를 DMEM 배지로 현탁시키고, Flow Cytometer Cell Sorter (Moflo astrios, Bechman coulter)를 이용하여 Cre 재조합 효소 또는 Flp 재조합 효소에 의한 교차-반응성을 평가하였다. EGFP 및 mScarlet 신호는 각각 488-513/26 및 561-579/16nm 필터를 통해 검출하였다.

마우스 동물의 전방 트랜스- 시냅틱 뉴런 표지( anterograde trans-synaptic neuron labeling)를 위한 바이러스의 주입

수컷 C57BL/6J 마우스(출생 후 6 주)를 노즈 마스크를 통해 2% 이소플루 란으로 마취시키고 stereotaxic frame (Model 900 Small Animal Stereotaxic Instrument, KOPF)에 두었다. 이후 두개골에 작은 구멍을 내고 주사가 가능하도록 하였고, AAV 바이러스는 Nanoject III 인젝터 (Drummond)를 사용하여 유리 모세관을 통해 뇌로 주입시켰다. 이후 AAV5-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet의 이중벡터를 이용한 전방 트랜스-시냅틱의 이중 칼라 세포 표지를 확인하기 위해, AAV 바이러스를 선조체 영역(Str: 400nL 총 부피; 30nl/min 주입율; 브레그마에 대해 0.2mm 앞쪽 및 2.2 mm 외측; 피질 표면으로부터 0.5mm ventral)으로 주입시켰고, AAV1-hSyn-Cre (Vector biolabs, 2.5x10^13 GC/mL) 및 AAV1-hSyn-Flp (Vector biolabs, 5.0x10^13 GC/mL)는 일차 운동 피질영역(M1, 200 nL 총 부피; 6 nl/min 주사 속도, 브래그마에 대해 앞쪽 2 mm 및 외측 1.8 mm, 피질 표면으로부터 0.5 mm 복부) 및 복측 내막 핵(VPM; 총 200 nl 부피, 6nl/min 주사 속도, 브래그마에 대해 후방 1.8mm 및 후방 1.6 mm, 피질 표면으로부터 3.6 mm 복부)으로 각각 주입시켰다. 뇌는 주사 후 6 주째에 분리하였다. 또한 AAV5-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet은 노스캐롤라이나대학(UNC)의 바이러스 벡터 코어에서 패키지 하였고, AAV1-hSyn-Cre 및 AAV1-hSyn-Flp는 Vector biolabs에서 패키지 하였다.

마우스 뇌 조직 슬라이스 제조

뇌 슬라이스의 준비는, 마취된 마우스 동물을 해부하고 1X PBS로 혈관 관류 한 다음, 심장을 통해 고정용액(4 % 파라 포름 알데히드, 1X PBS, pH 7.4)으로 고정시켰다. 이후 전체 뇌를 분리하고 24 시간 동안 고정액을 이용하여 추가 배양하였으며, 이후, 뇌 조직을 30% 수크로스 용액(30% sucrose, 1x PBS)에서 36~48시간 동안 배양하였으며, Frozen Section Embedding Medium (FSC, Leica)를 이용하여 80℃에서 냉동시켰다. 이후 cryostat (Leica CM 1850 UV Cryostat)를 이용하여 40um의 두께로 슬라이스화 하였다. 뇌조직 절편들을 1X PBS로 3회 세척하고 DAPI (Sigma)로 염색하였으며, 염색 후 절편을 형광검출을 위한 마운팅 배지 (VECTASHIELD, Vector Laboratories)에 두었다.

이미징 분석(fluorescence microscopy of brain slice)

형질 전환된 HEK 293T 세포는 형광현미경(Nikon eclipse Ts2, LED 일루미네이터 대물 40X, 예시: 470nm, 예시: 525nm)를 이용하여 관찰하였다. 뇌 슬라이스의 형광이미징은 20×의 대물렌즈가 장착된 Pannoramic 디지털 슬라이드 스캐너(Pannoramic SCAN II, 3D HISTECH)를 이용하여 분석하였다. 레이저 여기 및 방출 필터는 다양한 형광 이미징을 수득하기 위해 사용하였는데, EGFP는 467/498 nm 레이저 여기, 513/556 nm 방출, mScarlet는 561 nm 레이저 여기, 579/16 nm 방출 및 DAPI는 405 nm 여기, 448 / 59 nm 방출 조건 하에서 형광 이미징을 수득하였다. 이미징 획득 시간은 30~200ms 이며, 이미지 분석을 위해 각 뇌 조직 절편의 선조체 영역을 선택하여 사용하였다. 형광 단백질이 Cre- 및/또는 Flp- 재조합 효소에 의해 발현될 수 있는 표지된 세포 수의 측정은 이미지를 역전시키고 획득된 이미지로부터 백그라운드 값을 뺀 후 입자 분석의 계산을 통해 확인하였다. 모든 이미지는 NIH 이미지 분석 소프트웨어 (ImageJ ver : 1.51p)를 사용하여 처리하였다.

또한, Pannoramic digital slide scanner(3D HISTECH Ltd)는 한국 뇌연구원 (KBRI) 연구장비핵심 시설의 것을 사용하였고, 본 연구는 과학기술부가 후원하는 한국 뇌연구원을 통한 KBRI 기초연구프로그램(18-BR-04-01)에 의해 지원되었다.

< 실시예 1>

신경회로 연결망 검출을 위한 이중 표지 바이러스 벡터의 제조

<1-1> 이중 표지 바이러스 벡터인 pAAV - EF1a - cDIO - EGFP - CMV - fDIO - mScarlet 바이러스 벡터 제조

본 발명자들은 뇌영역간 또는 신경세포 간의 신호전달 현상을 분석할 수 있는 방법으로 신호전달 시, 각기 다른 칼라가 발색될 수 있도록 한 이중 표지 바이러스 벡터를 제조하였다. 본 발명에서 제조한 이중 표지 바이러스 벡터는 “pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 벡터”로 명명하였고, 상기 벡터는 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP와 pAAV-CMV-fDIO-mScarlet를 각각 제작한 후 이들을 결합하여 제조하였다.

먼저, pAAV-EF1a-cDIO-EGFP 플라스미드의 제조는, 클론텍(Clontec)으로부터 구입한 pEGFP-C1 플라스미드를 EGFP-SpeI-S → EGFP-SpeI-A 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였고, 증폭한 PCR 산물(EGFP)과 pAAV-EF1a-cDIO-mOrange 플라스미드를 SpeI 제한효소 처리 후, 라이게이션을 통해 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP 플라스미드 제조하였으며, 이의 제조 과정은 도 1a에 모식도로 나타내었다.

또한, pAAV-CMV-fDIO-mScarlet 플라스미드의 제조는, pmScarlet-C1(Addgene #85042사로부터 구입) 으로부터 mScarlet-NheI-S 프라미어 및 mScarlet-AscI-A 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 증폭한 PCR 산물(mScarlet)과 pAAV-EF1a-fDIO-EYFP(Addgene #55641) 플라스미드를 NheI/AscI 제한효소 처리 후, 라이게이션하여 pAAV-EF1a-fDIO-mScarlet을 제조하였다. 이후 pEGFP-C1(Clontech사로부터 구입)을 CMV-MluI-S 프라이머와 CMV-BamHI-A 프라이머를 이용히여 PCR을 수행하였으며, 증폭된 PCR 산물(CMV)과 상기에서 제조된 pAAV-EF1a-fDIO-mScarlet을 MluI/BamHI 제한효소 처리 후 라이게이션하여, pAAV-CMV-fDIO-mScarlet 플라이스미드를 제조하였다. 이의 제조 과정은 도 1b에 모식도로 나타내었다.

그런 뒤, 상기 제조된 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP 및 pAAV-CMV-fDIO-mScarlet 플라스미드를 이용하여 본 발명의 이중 표지 바이러스 벡터인 “pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 벡터”를 제조하였는데, 구체적으로 pAAV-CMV-fDIO-mScarlet 플라스미드를 CMV-EcoRI-S 프라이머 및 WPRE-233n-A 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고 증폭한 PCR 산물(CMV-fDIO-mScarlet)과 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP 플라스미드를 EcoRI 제한효소 처리 후 라이게이션을 통해 “pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 바이러스 벡터”를 제조하였으며, “pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 벡터”의 제조과정에 대한 모식도를 도 1c에 나타내었고, “pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 바이러스 벡터”의 염기서열은 서열번호 1에 나타내었으며, 상기 바이러스 벡터의 개열지도는 도 2에 나타내었다.

<1-2> 재조합효소 발현벡터 제조

상기 <1-1>에서 제조한 이중 표지 바이러스 벡터의 형광발색을 통한 뇌 신경회로망 연결성 여부에 대해 선택적(특이적) 발현 시스템으로 구현될 수 있도록, 재조합 효소인 Cre, Flp 및 vCre의 발현벡터를 사용하였다.

즉, 특정 재조합 효소에 의해 특이적 형광단백질의 발현이 유도될 수 있도록 하였는데, 구체적으로 Cre 재조합 효소가 발현되는 경우 녹색형광을 띄는 EGFP(Green color, G)이 Cre 재조합 효소에 의해 특이적으로 발현되며, Flp 재조합효소에 의해서는 붉은색의 mScarlet(Red color, R)이 특이적으로 발현되며, vCre 재조합 효소에 의해서는 파란색의 mCerulean3(Blue color, B)이 특이적으로 발현되도록 하였다. 이러한 작동원리에 대한 모식도는 도 3에 나타내었다. 또한, 시냅스-전달(transsynaptic transfer)이 가능하다고 알려진 AAV (Adeno Associated Virus)를 전달 매개체로 사용하였다. 하기에서는 상기 본 발명의 이중 표지 바이러스 벡터에 대한 선택적 발현을 통해 신경회로망 연결성 여부를 확인하기 위한 재조합 효소인 Cre, Flp 및 vCre의 발현벡터 제조방법을 개시한다.

① pAAV - hSyn - Cre 바이러스 재조합 발현벡터

pAAV-EF1a-mCherry-IRES-Cre(Addgene #55632에서 구입) 플라스미드를 Cre-KpnI-S 프라이머 및 Cre-EcoRI-A 프라이머를 이용하여 PCR 수행하였고, 증폭한 PCR 산물(Cre)과 pAAV-EF1a-Flpo(Addgene #55637 구입) 플라스미드를 KpnI/EcoRI 제한효소 처리 후, 라이게이션하여 pAAV-EF1a-Cre를 제조하였다. 이후 시중에서 구입한 pAAV-hSyn-BDNF-EGFP 벡터와 상기 제작한 pAAV-EF1a-Cre를 MluI/KpnI 제한효소 처리 후 라이게이션 하여 pAAV-hSyn-Cre 바이러스 재조합 발현벡터를 제조하였으며, 상기 벡터의 제조과정에 대한 모식도는 도 4a에 나타내었고, pAAV-hSyn-Cre 벡터의 개열지도는 도 5에 나타내었으며, 상기 벡터의 염기서열은 서열번호 2에 나타내었다.

② pAAV - hSyn - Flp 바이러스 재조합 발현벡터

pAAV-hSyn-BDNF-EGFP 플라스미드와 pAAV-EF1a-Flpo (Addgene #55637에서 구입) 플라스미드를 MluI/KpnI 제한효소 처리 후, 라이게이션 하여 pAAV-hSyn-Flp 바이러스 재조합 발현벡터를 제조하였으며, 상기 벡터의 제조과정에 대한 모식도는 도 4b에 나타내었고, 제조된 pAAV-hSyn-Flp 바이러스 재조합 발현벡터의 개열지도는 도 6에 나타내었으며, 상기 벡터의 염기서열은 서열번호 3에 나타내었다.

③ pAAV - hSyn - vCre 바이러스 재조합 발현벡터

pAAV-hSyn-BDNF-EGFP 벡터를 hSyn-MluI-S 프라이머와 hSyn-BamHI-A 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 증폭한 PCR 산물(hSyn)과 pAAV-EF1a-vCre (Addgene #55638에서 구입함)를 MluI/KpnI 제한효소 처리 후, 라이게이션하여 pAAV-hSyn-vCre 바이러스 재조합 발현벡터를 제조하였다. 상기 벡터의 제조과정에 대한 모식도는 도 4c에 나타내었고, 제조된 pAAV-hSyn-vCre 바이러스 재조합 발현벡터의 개열지도는 도 7에 나타내었으며, 상기 벡터의 염기서열은 서열번호 4에 나타내었다.

또한, 상기 실시예들에서 사용한 프라이머의 염기서열은 하기 표 1에 나타내었다.

프라이머 서열

Primer	Sequence (5‘→3’)	서열번호
EGFP-SpeI-S	GAC TAG TAT GGT GAG CAA GGG CGA G	5
EGFP-SpeI-A	GGA CTA GTT TAC TTG TAC AGC TCG TCC ATG	6
mScarlet-NheI-S	CTAGCTAGCACCATGGTGAGCAAGGGC	7
mScarlet-AscI-A	AGG CGC GCC TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC	8
CMV-MluI-S	CGA CGC GTT AGT AAT CAA TTA CGG GGT C	9
CMV-BamHI-A	CGC GGA TCC ACC GGT AGC GCT AGC G	10
CMV-EcoRI-S	CCG GAA TTC CCG CGT TAC ATA ACT TAC GG	11
WPRE-233n-A	GTT GCG TCA GCA AAC ACA GT	12
mCerulean3-NheI-S	CTA GCT AGC GCC ACC ATG GTG AGC AAG	13
mCerulean3-AscI-A	AGG CGC GCC TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC	14
EF1a-PacI-SbfI-S	CCT TAA TTA ACC TGC AGG TGC AGC TAA TGG ACC TTC TAG G	15
F5-PacI-A	CCT TAA TTA AAA GCT TGA TAT CGA ATT CGA AGT TCC	16
iRFP670-XbaI-S	GCT CTA GAG CCA CCA TGG CGC GTA A	17
iRFP670-AscI-A	AGG CGC GCC TTA GCG TTG GTG GTG GGC G	18
Cre-KpnI-S	CGG GGT ACC ATG GCC AAT TTA CTG ACC G	19
Cre-EcoRI-A	CGG GAA TTC TAA ATC GCC ATC TTC CAG CAG	20
hSyn-MluI-S	ACG CGT GTG TCT AGA CTG CAG AGG G	21
hSyn-BamHI-A	CGG GAT CCT TCT CGA CTG CGC TCT CAG	22

< 실시예 2>

본 발명의 이중 표지 바이러스 벡터의 작동확인

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 이중 표지 바이러스 벡터가 세포 주입 후, 각각의 재조합 효소에 의해 특이적으로 선택 형광단백질을 발현할 수 있는지를 확인하였으며, 이를 위해 형광현미경 분석 및 FACS 분석을 수행하였다.

<2-1> 형광현미경 분석

HEK293T 세포주에 하기 표 2와 같이 각각의 바이러스 벡터를 형질감염시킨 후, 48h 후 형광현미경을 통해, 각각의 재조합 효소에 의해 특이적으로 선택된 형광단백질의 발현 여부를 관찰하였다. 이때, Cre 재조합 효소에 의해서는 녹색형광의 EGFP이 특이적 발현되며, Flp 재조합 효소에 의해서는 붉은색 형광의 mScarlet이 특이적 발현된다.

실험군	형질감염 세트
1	pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet + W/O
2	pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet + pAAV-hSyn-Cre
3	pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet + pAAV-hSyn-Flp
4	pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet + pAAV-hSyn-Cre + pAAV-hSyn-Flp

분석 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제조된 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 바이러스 벡터는 HEK293T 세포주에서 Cre 재조합 효소가 발현되는 경우, 특이적으로 녹색형광의 EGFP이 특이적 발현되는 것으로 확인되었고, Flp 재조합 효소가 발현되는 경우, 특이적으로 붉은색 형광의 mScarlet이 발현되는 것을 확인하였고, EGFP 및 mScarlet이 모두 포함된 이중 벡터의 경우도 Cre 및 Flp 재조합 효소가 발현되는 경우, 2가지 단백질이 모두 발현되어 녹색과 붉은색의 형광을 나타내었다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 재조합 바이러스 벡터가 잘 작동된다는 것을 알 수 있었다.

<2-2> FACS 분석

상기 <2-1>에서 사용한 실험군에 대해 FACS 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제조된 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 바이러스 벡터는 특정 재조합 효소 발현 시, 목적하는 특정 형광단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 나아가 재조합효소간의 간섭(cross-reactivity)없이 특이적으로 형광단백질이 발현됨을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 pAAV-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet 바이러스 벡터와 pAAV-hSyn-Cre 벡터 및 pAAV-hSyn-Flp 벡터를 함께 처리한 군의 경우, 재조합 효소 간의 간섭이 없이 녹색형광 단백질(EGFP)과 붉은색 형광 단백질(mScarlet)이 모두 잘 검출되는 것을 알 수 있었다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 제조한 이중 표지 바이러스 벡터를 뇌신경회로 연결망 분석에 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 3>

동물실험을 통한 본 발명의 이중 표지 바이러스 벡터를 이용한 뇌신경회로 연결망 분석

<3-1> 후두정엽피질(posterior parietal cortex)에서의 뇌신경회로 연결망 분석

나아가 본 발명자들은 본 발명의 이중 표지 바이러스 벡터를 이용하여 마우스 동물모델을 대상으로 실제적으로 뇌신경회로 연결망 분석이 가능한지를 분석하였다. 이를 위해 6주령의 생쥐(C57BL/6)의 뇌에 입체 외과적 수술(Stereotaxic Surgery)를 통하여 본 발명의 바이러스 벡터들을 주입한 후, 약 5주 동안 발현시킨 후, 뇌 절편(Brain slice)을 얻어 공초점 형광현미경(Confocal microscope, Leica TCS SP8)을 이용하여 촬영하였다. 마우스 모델을 대상으로 수행한 실험 스케줄 및 실험 모식도를 도 10에 나타내었다. 이때 각각의 재조합 효소를 발현하는 바이러스 벡터와 본 발명의 이중 표지 바이러스 벡터는 서로 다른 뇌영역에 주입하여 뇌영역간의 뇌신경회로 연결망을 분석하였다. 마우스 뇌 영역에 주입한 바이러스 벡터는 하기 표 3에 기재된 바와 같다.

재조합 바이러스 벡터명	Serotype	Titer ( GC /ml)	주입량 (nl)	주입영역
AAV1-hSyn-Cre	AAV serotype 1	3.2x10¹³	200nl	AUD (AP: -2.2, ML: ±3.8, DV: -0.5)부위에 주입
AAV1-hSyn-Flp	AAV serotype 1	5.0x10¹³	200nl	V1 (AP: -4.2, ML: ±2.8, DV: -0.5)부위에 주입
AAV5-EF1a-cDIO-EGFP- CMV-fDIO-mScarlet	AAV serotype 5	4.5 x 10¹²	400-500nl	PPC (AP: -2, ML: ±1.6, DV: -0.5)부위에 주입

상기 표에서 PPC는 후두정엽피질(posterior parietal cortex)을 의미하는 것이고, AUD는 청각영역(Auditory area)을 의미하는 것이고, V1은 일차시각피질(primary visual cortex)을 의미하는 것이다.

분석 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 이중 표지 바이러스 벡터를 이용할 경우, 마우스 뇌 영역에서 신경세포간 신호전달 연결망을 확인할 수 있었는데, 구체적으로 본 발명의 이중 표지 바이러스 벡터가 주입된 PPC 영역에서는 녹색 형광과 붉은색 형광이 모두 관찰되었는데, 이는 PPC 영역은 뇌의 AUD로부터 재조합효소 Cre가 전달되고, V1로부터 Flp이 전달되었다는 것을 알 수 있으며, 즉 PPC는 뇌의 AUD 및 V1으로부터 신경회로가 전달되고 있음을 의미한다.

또한, PPC내 신경세포에서 발현된 AAV5-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet는 신경전달의 연결-특이적으로 작동하며 AUD와 연결된 신경세포는 녹색형광을 띄고, V1과 연결된 신경세포는 붉은색의 형광을 띄므로, 뇌영역 또는 뇌 신경세포내에서 신호전달의 연결망을 확인할 수 있다.

<3-2> 선조체 영역에서의 뇌신경회로 연결망 분석

본 발명자들은 상기 후두정엽피질(posterior parietal cortex)이 아닌 다른 뇌 영역인 선조체 영역에서 본 발명의 이중 표지 바이러스 벡터를 이용한 뇌신경전달 연결망 분석을 수행하였다. 이를 위해 6주령의 생쥐(C57BL/6)의 뇌에 입체 수술을 수행하여 바이러스 벡터를 주입한 후, 약 5주 동안 발현시킨 다음, 뇌 절편(Brain slice)을 얻어 슬라이드 스캔 시스템(Pannoramic SCAN, 3DHISTECH)을 이용하여 분석하였다. 본 실험 수행의 모식도를 도 12에 나타내었고, 마우스 뇌 영역에 주입한 바이러스 벡터는 하기 표 4에 기재하였다.

재조합 바이러스 벡터명	Serotype	Titer ( GC /ml)	주입량 (nl)	주입영역
AAV1-hSyn-Cre	AAV serotype 1	3.2x10¹³	200nl	M1 (AP: +2, ML: ±1.8, DV: -0.5)부위에 주입
AAV1-hSyn-Flp	AAV serotype 1	5.0x10¹³	200nl	VPM (AP: -1.8, ML: ±1.6, DV: -3.6)부위에 주입
AAV5-EF1a-cDIO-EGFP- CMV-fDIO-mScarlet	AAV serotype 5	4.5 x 10¹²	400-500nl	Str (AP: +0.2, ML: ±2.2, DV: -3.4)부위에 주입

여기서 상기 M1은 일차운동피질(primary motor cortex)이고, VPM은 배쪽후내측핵(ventral posteromedial nucleus)이며, Str은 선조체(striatum) 영역을 나타낸 것이다.

분석 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 이중 표지 바이러스 벡터는 뇌의 후두정엽피질 영역이외에 다른 영역인 선조체 영역에서도 신경전달 연결망의 확인이 가능한 것을 알 수 있었는데, 즉, M1 영역으로부터 Cre가 전달되고, VPM으로부터 Flp이 전달됨으로써, 선조체 내 신경세포에 발현된 AAV5-EF1a-cDIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet가 신호전달 연결-특이적으로 작동하며, M1과 신경전달이 연결된 세포는 녹색형광을, VPM과 신경전달이 연결된 세포는 붉은색 형광이 발현됨을 통해 뇌영역 또는 뇌 신경세포 내에서 신호전달의 연결망을 정확하고 명확하게 확인할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Korea Institute of Brain Science <120> Double labeled virus vector detectable neural network <130> NPDC67968 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7863 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAAV-EF1a-DIO-EGFP-CMV-fDIO-mScarlet vector sequence <400> 1 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtaagct ttgcaaagat ggataaagtt 180 ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat 240 tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 300 gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 360 tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 420 agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc 480 cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat 540 tacttccact ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 600 gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 660 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 720 ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 780 caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 840 gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 900 gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 960 ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 1020 gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 1080 acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 1140 tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 1200 tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1260 gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1320 ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1380 gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gtaccggatc cccataactt 1440 cgtataaagt atcctatacg aagttatatc 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atactttata cgaagttatc attgggattc 2340 ttcctatttt gatccaagca tcaccatcga ccctctagtc cagatctcac catcgaccca 2400 taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatgtccctc gaagaggttc gaattcccgc 2460 gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 2520 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 2580 tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 2640 agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 2700 atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 2760 atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 2820 tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 2880 gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 2940 cggtgggagg tctatataag cagagctggt ttagtgaacc gtcagatccg gatcctctag 3000 agtcgactcc ggagaagttc ctattctcta gaaagtatag gaacttcgca gaatggtagc 3060 tggattgtag ctgctattag caatatgaaa cctcttagaa gttcctattc ttcaaaaggt 3120 ataggaactt cggcgcgcct tacttgtaca 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accgaccccg acccactgga caagcaccca acccccattc cccaaattgc gcatccccta 300 tcagagaggg ggaggggaaa caggatgcgg cgaggcgcgt gcgcactgcc agcttcagca 360 ccgcggacag tgccttcgcc cccgcctggc ggcgcgcgcc accgccgcct cagcactgaa 420 ggcgcgctga cgtcactcgc cggtcccccg caaactcccc ttcccggcca ccttggtcgc 480 gtccgcgccg ccgccggccc agccggaccg caccacgcga ggcgcgagat aggggggcac 540 gggcgcgacc atctgcgctg cggcgccggc gactcagcgc tgcctcagtc tgcggtgggc 600 agcggaggag tcgtgtcgtg cctgagagcg cagtcgagaa ggtaccatgg ccacaaccat 660 gcccaagaag aagaggaagg tgtccaatct cctgactgtt caccagaacc tccctgcgct 720 gccagtagat gccactagcg atgaggtcag gaaaaatctc atggatatgt ttagggatag 780 acaggcgttt tctgaacaca cctggaaaat gctgcttagc gtgtgccgat cctgggcagc 840 ctggtgtaag ctgaacaatc gcaaatggtt ccccgccgag ccggaggacg tgcgcgatta 900 cctgctgtat ctccaggcaa gagggctggc tgtcaagact atccagcagc acttgggcca 960 actgaatatg ctgcatcgac gcagcgggct cccccggcct agcgattcaa acgcagtctc 1020 ccttgttatg aggagaatta gaaaggaaaa cgtagatgcg ggtgagaggg ctaagcaggc 1080 tctcgctttt gagcggactg atttcgacca ggtcagatcc ctgatggaga acagcgatcg 1140 gtgccaggac atcaggaacc tcgcatttct gggaattgca tataacacac ttctgcgcat 1200 agctgagatc gcccggatca gagtgaaaga catcagtcga acggacggcg gccggatgct 1260 tattcatatt ggacgcacaa agacattggt cagcaccgct ggcgttgaaa aggccttgtc 1320 cctgggcgta acgaagctgg tggaaagatg gatctcagtg tccggcgtgg ctgacgaccc 1380 taataattac ttgttctgtc gagtgagaaa aaacggagtc gccgcgccct ctgccaccag 1440 ccaattgagt acacgggccc ttgaagggat ctttgaggca acccaccgac tcatatacgg 1500 agccaaggat gacagtggcc agaggtatct cgcctggtca ggtcattctg ctagggtggg 1560 ggccgcacga gacatggcgc gggcaggagt ctccatacca gagattatgc aagctggagg 1620 ttggacaaat gtgaacatcg ttatgaacta tatccgcaat cttgactctg aaaccggggc 1680 catggtgaga ctgctcgaag atggtgactg agaattcgat atcaagctta tcgataatca 1740 acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt 1800 tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc 1860 tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc 1920 cgttgtcagg 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gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 5520 ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 5580 acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 5640 caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgt 5693 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-SpeI-S primer <400> 5 gactagtatg gtgagcaagg gcgag 25 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-SpeI-A primer <400> 6 ggactagttt acttgtacag ctcgtccatg 30 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mScarlet-NheI-S primer <400> 7 ctagctagca ccatggtgag caagggc 27 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mScarlet-AscI-A primer <400> 8 aggcgcgcct tacttgtaca gctcgtccat gc 32 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-MluI-S primer <400> 9 cgacgcgtta gtaatcaatt acggggtc 28 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-BamHI-A primer <400> 10 cgcggatcca ccggtagcgc tagcg 25 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-EcoRI-S primer <400> 11 ccggaattcc cgcgttacat aacttacgg 29 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE-233n-A primer <400> 12 gttgcgtcag caaacacagt 20 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCerulean3-NheI-S primer <400> 13 ctagctagcg ccaccatggt gagcaag 27 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCerulean3-AscI-A primer <400> 14 aggcgcgcct tacttgtaca gctcgtccat gc 32 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a-PacI-SbfI-S primer <400> 15 ccttaattaa cctgcaggtg cagctaatgg accttctagg 40 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F5-PacI-A primer <400> 16 ccttaattaa aagcttgata tcgaattcga agttcc 36 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRFP670-XbaI-S primer <400> 17 gctctagagc caccatggcg cgtaa 25 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRFP670-AscI-A primer <400> 18 aggcgcgcct tagcgttggt ggtgggcg 28 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cre-KpnI-S primer <400> 19 cggggtacca tggccaattt actgaccg 28 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cre-EcoRI-A primer <400> 20 cgggaattct aaatcgccat cttccagcag 30 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSyn-MluI-S primer <400> 21 acgcgtgtgt ctagactgca gaggg 25 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSyn-BamHI-A primer <400> 22 cgggatcctt ctcgactgcg ctctcag 27

Claims

서열번호 1의 염기서열을 가지며, 도 2의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는, 신경회로 연결망을 검출할 수 있는 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터.
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인간을 제외한 포유동물에게 제1항의 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터를 표적 신경세포 또는 표적 뇌 조직에 감염시키고, 동시에 상기 표적 신경세포 또는 표적 뇌 조직과의 신경회로 연결망 형성여부를 분석하기 위한 다른 표적 신경세포 또는 표적 뇌 조직에는 재조합 효소인 Cre 또는 Flp를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 감염시킨 후, 리포터 단백질의 발색 정도를 측정하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 재조합 효소인 Cre를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 서열번호 2의 염기서열을 가지며 도 5의 개열지도를 갖는 것이고,
상기 재조합 효소 Flp를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 서열번호 3의 염기서열을 가지며 도 6의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는,
신경회로 연결망의 검출방법.
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제7항에 있어서,
상기 리포터 단백질의 발색은 재조합 효소인 Cre 또는 Flp의 선택적 반응에 의해 발색되는 것으로,
재조합효소 Cre가 발현되는 경우에만 EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)가 발현되어 녹색 형광을 나타내고, 재조합효소 Flp가 발현되는 경우에만 mScarlet가 발현되어 붉은색 형광을 나타내며,
상기 표적 신경세포들 또는 표적 뇌 조직들에서 발색되는 형광색이 서로 동일한 경우, 신경회로가 서로 연결되어 있는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 신경회로 연결망의 검출방법.
제7항에 있어서,
제1항의 재조합 이중표지 아데노 연관 바이러스 벡터는 시냅스 전달 능력이 없고, 재조합 효소인 Cre 또는 Flp를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 시냅스 전달 능력이 있는 것을 특징으로 하는, 신경회로 연결망의 검출방법.