CN113061620B - 一种t4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统，该系统由三部分组成：第一部分是利用LbCas12a基因编辑系统改造得到的缺失了IPI和IPII基因的T4突变噬菌体；第二部分是表达CRISPR‑LbCas12a基因编辑载体的宿主菌，所述CRISPR‑LbCas12a基因编辑载体在宿主菌内表达产生的CRISPR‑LbCas12a蛋白复合体能特异性切割所述T4突变噬菌体的IPIII基因的靶向序列；第三部分是用于将IPIII基因替换成目标蛋白基因的供体质粒。本发明还公开了该系统的构建方法及其应用。将蛋白包装到噬菌体衣壳内，能够避免其受外界环境的影响，提高蛋白的稳定性，同时也可做为蛋白运送载体，具有较高的应用价值。本发明提供了一种简单高效的方法，能将目标蛋白高密度包装到T4噬菌体衣壳内腔。

Description

一种T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统及其构建方法和 应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于将目标蛋白高密度包装在T4噬菌体衣壳内腔的包装系统，本发明还涉及该包装系统的构建方法和应用。

背景技术

T4噬菌体是一种特异感染大肠杆菌的烈性噬菌体，病毒粒子由头部和尾部组成。头部蛋白质衣壳包裹着病毒的双链基因组DNA，主要由gp23、gp24、Soc和Hoc等4种蛋白组成，其中HOC和SOC是非必需蛋白。敲除Hoc和Soc(Hoc^-Soc^-T4)不影响T4噬菌体的增殖，且重组的Hoc和Soc蛋白在体外能特异地结合Hoc^-Soc^-T4衣壳。因此，外源蛋白与 HOC或SOC融合后，能高密度展示在Hoc^-Soc^-T4噬菌体衣壳表面。T4噬菌体是目前已知的唯一能够高密度展示完整外源蛋白的噬菌体，具有巨大的应用潜力。

除了展示在衣壳表面外，外源蛋白还能被包装到T4噬菌体的衣壳内腔。这主要得益于 T4噬菌体独特的衣壳特征，即衣壳内腔内除了含有病毒基因组外，还包装了一些蛋白分子。 T4噬菌体的衣壳组装起始于内核支架(internal core scaffold)，它是一种蛋白核团，主要由gp21、gp22、alt和三种非必需内部蛋白(Internal Protein，即IPI、IPII和IPIII)组成，其中gp21具有丝氨酸蛋白酶活性。T4噬菌体的主要衣壳蛋白gp23和gp24围绕内核支架组装，形成衣壳前体(procapsid)。衣壳前体能够激活gp21的蛋白酶活性，从而将大部分内核支架蛋白切割成短肽并释放出衣壳，为后续基因组DNA包装提供空间。IPII和IPIII 的N端均有一段10个氨基酸的保守序列，称为CTS(Caspid Targeting Sequence)，它负责引导IPII和IPIII蛋白到内核，与其它内核支架蛋白一起形成内核支架。在实验室条件下IPI、 IPII和IPIII是非必需的，即敲除这些基因不影响T4噬菌体增殖。研究表明，N端融合了 CTS的外源蛋白能够被引导到内核，进而被包装到T4噬菌体衣壳内腔，但衣壳内腔仅能包装有限数量的外源蛋白。

T4噬菌体衣壳表面可以高密度展示外源蛋白，衣壳内也可以包装高浓度外源DNA，是一种非常好的纳米材料，具有巨大的应用潜力。本发明提供了一种能将外源蛋白高密度包装到T4噬菌体衣壳内腔的便捷方法，进一步提升T4噬菌体衣壳的应用潜力。由于T4 噬菌体内核支架大小较为恒定，含有IPI、IPII和IPIII三种非必需内部蛋白，因此，用外源蛋白代替这三种非必需蛋白，与gp21、gp22、alt等形成内核支架，衣壳蛋白gp23和gp24 在围绕内核支架组装时就能将更多的外源蛋白包装到T4衣壳内。活化的gp21蛋白酶仅会切割CTS序列，不会降解外源蛋白。本发明基于实验室近期开发的新型噬菌体基因组编辑技术(LiuYuepeng等.Journal of Virology,2020.94:e01630-20)，敲除野生型T4噬菌体的IPI 和IPII基因，构建了T4ΔIPIΔIPII突变体；构建了表达特异切割T4ΔIPIΔIPII噬菌体的IPIII 基因的CRISPR-LbCas12a的大肠杆菌工程菌；构建了用于将IPIII基因替换成目标基因的供体质粒载体。在包装外源目标蛋白时，只需将其编码基因克隆到供体质粒中并转化到大肠杆菌工程菌，然后用T4ΔIPIΔIPII噬菌体感染，就可以将外源目标蛋白高密度包装到T4 噬菌体衣壳内腔。

发明内容

本发明的第一个目的是开发T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统。

本发明的第二个目的是提供一种T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种将目标蛋白包装在T4噬菌体衣壳内腔的方法。在衣壳的保护下，包装在内腔的目标蛋白免受外界复杂环境的干扰，稳定性更好，同时T4噬菌体衣壳也可作为一种蛋白递送系统。

为实现第一个目的，本发明提供一种T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统，该系统包含三个部分：第一部分是利用LbCas12a基因编辑系统改造得到的缺失IPI和IPII基因的 T4突变噬菌体(T4ΔIPIΔIPII噬菌体)，与野生型T4噬菌体相比，该突变体衣壳内腔具有更大的物理空间，能包装更多拷贝的目标蛋白；第二部分是含有CRISPR-LbCas12a基因编辑载体的宿主菌，所述CRISPR-LbCas12a基因编辑载体在宿主菌内表达产生的 CRISPR-LbCas12a蛋白复合体能特异性切割所述缺失IPI和IPII基因T4突变噬菌体的IPIII 基因的靶向序列；第三部分是用于将IPIII基因替换成目标蛋白基因的供体质粒，其中，

所述IPI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述IPII基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述IPIII基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述IPIII基因中被特异性切割的靶向序列如SEQ ID NO.4所示。

为实现第二个目的，本发明提供一种构建所述T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统的方法，该方法包括以下步骤：

1)利用LbCas12a基因编辑系统改造T4噬菌体，得到缺失IPI和IPII基因的T4突变噬菌体(T4ΔIPIΔIPII噬菌体)；

2)构建一种靶向T4噬菌体IPIII基因的CRISPR-LbCas12a基因编辑载体，转化至宿主菌内，得到含有CRISPR-LbCas12a基因编辑载体的宿主菌，所述CRISPR-LbCas12a基因编辑载体在宿主菌内表达产生的CRISPR-LbCas12a蛋白复合体能特异性切割所述缺失IPI 和IPII基因T4突变噬菌体的IPIII基因的靶向序列；

3)利用一步克隆法将线性化pUC19载体、目标蛋白编码序列、IPIII基因上下游同源臂连接在一起，得到用于将T4噬菌体IPIII基因替换成目标蛋白基因的供体质粒。

其中，所述供体质粒含有T4噬菌体衣壳靶向序列(Capsid Targeting Sequence,CTS)，该序列如SEQ ID NO.6所示。

步骤1)中，所述利用LbCas12a基因编辑系统改造T4噬菌体，得到缺失IPI和IPII基因的T4突变噬菌体的具体方法如下：

1)构建靶向T4噬菌体IPI基因的LbCas12a基因编辑载体，命名为LbCas12a-IPI；构建靶向T4噬菌体IPII基因的LbCas12a基因编辑载体，命名为LbCas12a-IPII；

2)构建用于缺失IPI基因的供体质粒，命名为pMD18-T-IPI；构建用于缺失IPII基因的供体质粒，命名为pMD18-T-IPII；

3)将1)和2)中的LbCas12a-IPI和pMD18-T-IPI质粒转化至宿主菌，得到含有LbCas12a-IPI和pMD18-T-IPI质粒的宿主菌；将1)和2)中的LbCas12a-IPII和pMD18-T-IPII质粒转化到宿主菌，得到含有LbCas12a-IPII和pMD18-T-IPII质粒的宿主菌；

4)用野生型T4噬菌体感染上述含有LbCas12a-IPI和pMD18-T-IPI质粒的宿主菌，得到缺失IPI基因的突变体，命名为T4ΔIPI；

5)用T4ΔIPI噬菌体感染上述含有LbCas12a-IPII和pMD18-T-IPII质粒的宿主菌，得到缺失IPI和IPII基因的突变体，命名为T4ΔIPIΔIPII。

其中，所述LbCas12a-IPI基因编辑载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述LbCas12a-IPII基因编辑载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

其中，所述pMD18-T-IPI供体质粒的同源臂序列如SEQ ID NO.9所示；所述pMD18-T- IPII供体质粒的同源臂序列如SEQ ID NO.10所示。

为实现第三个目的，本发明提供一种利用所述的包装系统将目标蛋白包装在T4噬菌体衣壳内腔的方法，该方法包括以下步骤：

1)将所述用于将IPIII基因替换成目标蛋白基因的供体质粒转化到所述含有CRISPR-LbCas12a基因编辑载体的宿主菌，得到含有供体质粒和CRISPR-LbCas12a基因编辑载体的宿主菌；

2)用缺失IPI和IPII基因的T4突变噬菌体感染上述含有两种质粒的宿主菌，得到衣壳内腔包装有目标蛋白的重组T4突变噬菌体。

本发明提供的T4噬菌体衣壳内腔蛋白包装系统，在蛋白递送、疫苗、噬菌体治疗、病原体检测等领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：T4ΔIPⅠ重组噬菌体PCR产物电泳鉴定结果。

图2：T4ΔIPⅠΔIPⅡ重组噬菌体PCR产物电泳鉴定结果。

图3：T4ΔIPⅠΔIPⅡ-M1重组噬菌体PCR产物电泳鉴定结果。

图4：T4ΔIPⅠΔIPⅡ-M1重组噬菌体的SDS-PAGE鉴定与WB鉴定结果。

图5：T4ΔIPⅠΔIPⅡ-NP重组噬菌体PCR产物电泳鉴定结果。

图6：T4ΔIPⅠΔIPⅡ-NP重组噬菌体的SDS-PAGE鉴定与WB鉴定结果。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的保护范围。

实施例1：分别构建LbCas12a-IPI，LbCas12a-IPII和LbCas12a-IPIII编辑载体

1.酶切线性化pLbCas12a载体

1)QuickCutTM XhoI/QuickCutTM EcoRI(Takara)将pLbCas12a(Liu Yuepeng等.Journal of Virology,2020.94:e01630-20)载体双酶切，制备线性化载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用，pLbCas12a载体序列如SEQ IDNO.11所示，酶切体系如下：

反应条件：

酶切产物置于37℃水浴锅孵育1h,然后80℃孵育15min灭活内切酶。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收备用。

2.制备含有特定Spacer序列的DNA片段

合成两条3’端末尾有17个碱基互补的单链DNA(序列如下表)，作为PCR扩增的模板，通过复性、延伸得到双链DNA片段，分别命名为Sp-I，Sp-II和Sp-III。得到的PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。PCR扩增体系与扩增条件、引物序列、合成的单链DNA序列如下：

PCR扩增体系:

PCR扩增条件：

98℃3min，98℃15sec，52℃15sec，72℃10sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

合成的单链DNA的序列以及通过复性，延伸得到的DNA片段。

3.片段拼接

1)采用南京诺唯赞公司一步克隆法试剂盒(货号C112)，将上述含有特定Spacer序列的DNA片段：Sp-IPI，Sp-IPII和Sp-IPIII分别与线性化载体pLbCas12a片段在体外重组拼接在一起，就分别得到含有LbCas12a-IPI，LbCas12a-IPII和LbCas12a-IPIII质粒的重组产物，体外重组反应体系及反应条件如下：

反应体系(20μl)：

反应条件：

重组产物置于37℃下孵育30min,然后立即置于冰上冰浴冷却5min

2)质粒的转化与鉴定

将上述重组产物分别转化到大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，次日挑取单菌落接种到含有50μg/ml壮观霉素的LB培养基，37℃培养12h后进行菌液PCR鉴定。选取PCR阳性克隆，提取质粒后送公司测序，然后分别得到含有LbCas12a-IPI，LbCas12a-IPII和LbCas12a-IPIII质粒的大肠杆菌，然后对大肠杆菌进行质粒提取，就分别得到了靶向T4噬菌体基因组IPI基因的LbCas12a-IPI编辑载体，靶向T4噬菌体基因组IPII基因的LbCas12a-IPII编辑载体和靶向T4噬菌体基因组IPIII基因的LbCas12a-IPIII编辑载体。

实施例2：分别构建用于缺失T4噬菌体IPI基因和IPII基因的供体质粒

1.制备IPI基因和IPII基因同源臂DNA片段

用5‘端特异性同源臂扩增引物(Larm-F和Larm-R)扩增出IPI基因的左侧同源臂DNA 片段，即片段A1；用3’端特异性同源臂扩增引物(Rarm-F和Rarm-R)扩增出IPI基因的右侧同源臂DNA片段，即片段A2；以上得到PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，得到回收的DNA片段备用。然后以A1片段和A2片段为模板， Larm-F和Rarm-R为引物，通过SOE-PCR技术，得到融合片段A3，即IPI基因同源臂DNA 片段。用5‘端特异性同源臂扩增引物(Larm-F2和Larm-R2)扩增出IPII基因的左侧同源臂DNA片段，即片段B1；用3’端特异性同源臂扩增引物(Rarm-F2和Rarm-R2)扩增出 IPII基因的右侧同源臂DNA片段，即片段B2；以上得到PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，得到回收的DNA片段备用。然后以B1片段和B2片段为模板，Larm-F2和Rarm-R2为引物，通过SOE-PCR技术，得到融合片段B3，即IPII 基因同源臂DNA片段。涉及的扩增体系及条件如下：

片段A1的PCR扩增体系：

引物序列：

Larm-F：5’-tctagaggatccccgggtacccgtttcattttattctcctcagtagttg-3’

Larm-R：5’-ggaaaataaaataaaaatcttttgtaataaatatttcacaaag-3’

片段A1的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃8sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

片段A2的PCR扩增体系：

引物序列：

Rarm-F：5’-agatttttattttattttcctaattaattttgatgagg-3’

Rarm-R：5’-aaaacgacggccagtgaattcctcgattgggcagatgatttaaa-3’

片段A2的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃8sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

片段A3的PCR扩增体系：

引物序列：

Larm-F：5’-tctagaggatccccgggtacccgtttcattttattctcctcagtagttg-3’

Rarm-R：5’-aaaacgacggccagtgaattcctcgattgggcagatgatttaaa-3’

片段A3的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃12sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

片段B1的PCR扩增体系：

引物序列：

Larm-F2：5’-tctagaggatccccgggtacctactaaagtaaggttgatacgagtcatttt-3’

Larm-R2：5’-aaggaaacattaaagataaataacagtttacatctcctgtagg-3’

片段B1的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃8sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

片段B2的PCR扩增体系：

引物序列：

Rarm-F2：5’-tttatctttaatgtttcctttaaatgtaaatatttttattattc-3’

Rarm-R2：5’-aaaacgacggccagtgaattcggacgcttaaataaaagcagtttaca-3’

片段B2的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃8sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

片段B3的PCR扩增体系：

引物序列：

Larm-F2：5’-tctagaggatccccgggtacctactaaagtaaggttgatacgagtcatttt-3’

Rarm-R2：5’-aaaacgacggccagtgaattcggacgcttaaataaaagcagtttaca-3’

片段B3的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃12sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

2.将IPI基因和IPII基因同源臂片段分别连接到pMD18-T载体

将IPI基因同源臂DNA片段A3与IPII基因同源臂DNA片段B3，分别与pMD18-T 连接(TaKaRa)，分别得到含有用于缺失IPI基因和IPII基因的供体质粒的连接产物，连接产物中所含的供体质粒分别命名为pMD18-T-IPI，pMD18-T-IPII。连接反应体系及条件如下所示：

反应条件：链接产物置于16℃下孵育12h。

3.质粒转化与鉴定

将上述连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，次日挑取单菌落接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养12h后进行菌液PCR鉴定。选取PCR阳性克隆，提取质粒后送公司测序，对测序正确的阳性克隆进行质粒提取，就分别得到供体质粒pMD18-T-IPI，pMD18-T-IPII，供体质粒中所插入的IPI和IPII基因的同源臂序列分别如SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

实施例3：构建缺失IPI和IPII基因的T4突变噬菌体(T4ΔIPIΔIPII)

1.制备用于构建T4ΔIPIΔIPII突变噬菌体的重组大肠杆菌

1)将LbCas12a-IPI质粒与供体质粒pMD18-T-IPI转化至大肠杆菌B40中，挑取单菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml壮观霉素LB培养基中培养12h备用。于此同时，将LbCas12a-IPI质粒单独转化到大肠杆菌B40中，制备只含有LbCas12a-IPI的大肠杆菌作为对照。

2)将LbCas12a-IPII质粒与供体质粒pMD18-T-IPII转化至大肠杆菌B40中，挑取单菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml壮观霉素LB培养基中培养12h备用。于此同时，将LbCas12a-IPII质粒单独转化到大肠杆菌B40中，制备只含有LbCas12a-IPII质粒的大肠杆菌作为对照。

2.构建缺失IPI基因的T4突变噬菌体(T4ΔIPI)

取500μl含有LbCas12a-IPI和pMD18-T-IPI质粒的大肠杆菌培养物，加入约3*10³PFU T4噬菌体，混匀。37℃孵育7min后，加入含氨苄青霉素(100μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml) 的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养。于此同时，取500μl仅含有相应LbCas12a-IPI质粒的重组大肠杆菌培养物，加入约3*10³PFUT4噬菌体，混匀。37℃孵育7min后，加入壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养。结果发现，T4噬菌体感染含有LbCas12a-IPI和pMD18-T-IPI质粒大肠杆菌时，在双层平板上长出25个噬菌斑。用同样数量的T4噬菌体侵染仅含有LbCas12a-IPI质粒的重组大肠时，在双层平板上长出21个噬菌斑。

3.T4ΔIPI重组噬菌体的鉴定

取500μl的P301大肠杆菌培养物，加入半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，待半固体培养基凝固，用10μl规格小枪头点取重组平板上的单斑，进行传代，当传至第三代时进行PCR鉴定，得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，鉴定结果如图1所示。阳性克隆送公司测序进一步验证。得到T4ΔIPI重组噬菌体。RCR鉴定体系和条件，引物序列如下：

鉴定体系：

引物序列：

Larm-F3：5’-gaccatgattacgccaagcttttctgctgtagttaataatccgcat-3’

Rarm-R3：5’-ggtacccggggatcctctagaaccgcatataacattgtcttataatgtt-3’

鉴定PCR扩增条件：

95℃5min，95℃15sec，56℃15sec，72℃1min，进行30个循环，72℃延伸5min。

4.构建T4ΔIPⅠΔIPⅡ重组噬菌体

将上述敲除IPI基因后的T4ΔIPⅠ重组噬菌体的噬菌斑挑到1.5mlEP管中，加入400μl Pi-Mg缓冲液。室温静置10min，轻微震荡帮助噬菌体释放到溶液中，然后取10μl浸出液，用Pi-Mg缓冲液进行100倍稀释，然后取100μl稀释液至10ml的EP管，并各自加入500μl 的含有上述LbCas12a-IPII和pMD18-T-IPII质粒的大肠杆菌培养物，混匀。37℃孵育7min 后，加入含氨苄青霉素(100μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养，作为实验组。于此同时，取同量的上述噬菌体稀释浸出液和500μl仅含有LbCas12a-IPII质粒的大肠杆菌培养物混匀，作为对照组。37℃孵育7min后，加入壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养，作为对照组。结果发现，实验组的双层平板长出多个噬菌斑，而对照组的双层平板没有长出噬菌斑。

5.T4ΔIPIΔIPII重组噬菌体的鉴定

取500μl的P301大肠杆菌培养物，加入半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，待半固体培养基凝固，用10μl规格小枪头点取上述实验组双层平板上的单斑，进行传代，当传至第三代时进行PCR鉴定，得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，鉴定结果如图2所示。阳性克隆送公司测序进一步验证。得到T4ΔIPIΔIPⅡ重组噬菌体。

鉴定体系：

引物序列：

Larm-F4：5’-gaccatgattacgccaagcttcacgaacacgtttaccgttagc-3’

Rarm-R4：5’-ggtacccggggatcctctagaaatagatacctctaaaggtaagtttaaagacg-3’

鉴定PCR扩增条件：

95℃5min，95℃15sec，56℃15sec，72℃1min，进行30个循环，72℃延伸5min。

实施例4：将A型流感病毒PR8株M1蛋白包装在T4ΔIPIΔIPⅡ噬菌体衣壳内

1.构建含有M1蛋白基因序列的供体质粒

1)利用PCR技术扩增得到M1片段

用引物D-M1-F/D-M1-R，以PHW-2000-MS质粒中的M1基因序列为模板扩增出M1 片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。 PHW-2000-MS质粒为本实验室现有A型流感病毒PR8株MS的反向遗传系统， PHW-2000-MS质粒中M1基因序列如SEQ ID NO.12所示。PCR反应体系、引物序列与扩增条件如下：

M1片段的PCR扩增体系：

引物序列：

D-M1-F:5’-atcatcatcacggtggttctatgagtcttctaaccgaggtcgaa-3’

D-M1-R:5’-cgtcccaagtataagctttatcacttgaaccgttgcatctgc-3’

M1片段的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，60℃15sec，72℃20sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

2)利用PCR技术扩增获得IPIII基因的上下游同源臂

用引物IPIII-L-F/IPIII-L-R，以T4基因组为模板扩增出IPIII上游同源臂序列片段，即IPIII-L；用引物IPIII-R-F/IPIII-R-R，以T4基因组为模板扩增出IPIII下游同源臂序列片段，即IPIII-LR。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备。PCR反应体系、引物序列与扩增条件如下：

IPIII-L片段的PCR扩增体系：

引物序列：

IPIII-L-F:5’-tctagaggatccccgggtacctggaattgtgatagtatattcacaattactt-3’

IPIII-L-R:5’-agaaccaccgtgatgatgatgatg-3’

IPIII-L片段的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，60℃15sec，72℃10sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

IPIII-R片段的PCR扩增体系：

引物序列：

IPIII-R-F:5’-taaagcttatacttgggacgctta-3’

IPIII-R-R:5’-aaaacgacggccagtgaattcgtaaatatttttattattctatcctagaattgtga-3’

IPIII-R片段的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，60℃15sec，72℃10sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

3)酶切线性化载体pUC19

利用QuickCut^TM KpnI/QuickCut^TM EcoRI(Takara)将pUC19质粒(Addgeneno.50005) 进行双酶切，制备线性化载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。酶切体系如下：

反应条件：

酶切产物置于37℃水浴锅孵育1h,然后80℃孵育15min灭活内切酶。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收备用。

4)片段连接

采用南京诺唯赞公司一步克隆法试剂盒(货号C113)，将M1，线性化pUC19,IPIII-L和IPIII-R，4个DNA片段体外重组拼接在一起，得到了含有供体质粒pUC19-M1的重组产物。体外重组反应体系及反应条件如下：

反应条件：

将上述混合物置于37℃下孵育30min，然后立即置于冰上冰浴冷却5min。

5)重组产物转化

将上述重组产物转化到大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，次日挑取单菌落接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养12h后进行菌液PCR鉴定。选取PCR阳性克隆，提取质粒后送公司测序，对测序正确的阳性克隆进行质粒提取，就得到供体质粒pUC19-M1。序列如SEQ ID NO.13所示。

2.制备用于构建预期突变噬菌体的重组大肠杆菌

将上述LbCas12a-IPIII质粒转化到大肠杆菌B834中，然后再将供体质粒pUC19-M1也转化进去，随后挑取单菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml壮观霉素LB培养基中培养12h备用。于此同时，将仅含有LbCas12a-IPIII质粒的大肠杆菌B834作为对照。

3.制备能将M1蛋白包装在衣壳内腔的基因重组T4噬菌体

取500μl上述含有LbCas12a-IPIII质粒与供体质粒pUC19-M1大肠杆菌培养物，加入约 6*10⁸PFU T4ΔIPIΔIPII噬菌体，混匀。37℃孵育7min后，加入含氨苄青霉素(100μg/ml) 和壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养。于此同时，取300μl仅含有LbCas12a-IPIII质粒的重组大肠杆菌培养物，加入约6*10⁸PFU T4噬菌体，混匀。37℃孵育7min后，加入壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养。结果发现， T4ΔIPIΔIPII噬菌体感染含有上述LbCas12a-IPIII质粒与供体质粒pUC19-M1的重组大肠杆菌时，在双层平板上长出了1194个噬菌斑。用同样数量的T4ΔIPIΔIPII噬菌体侵染仅含有LbCas12a-IPIII质粒重组大肠杆菌时，在双层平板上长出70个噬菌斑。这表明，靶向IPIII基因的LbCas12a蛋白复合体可以有效切割T4ΔIPIΔIPII噬菌体的基因组，所以对照组平板长出的噬菌斑远远少于实验组平板。但当大肠杆菌中同时存在供体质粒时，噬菌体基因上的切口能够通过同源重组得以修复，所以能在双层平板上形成大量噬菌斑。

4.基因重组T4噬菌体的鉴定

取500μl的P301大肠杆菌培养物，加入半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，待半固体培养基凝固，用10μl规格小枪头点取重组平板上的单斑，进行传代，当传至第三代时进行PCR鉴定，得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图3所示。阳性克隆送公司测序进一步验证。

引物序列：

D-M1-F:5’-atcatcatcacggtggttctatgagtcttctaaccgaggtcgaa-3’

D-M1-R:5’-cgtcccaagtataagctttatcacttgaaccgttgcatctgc-3’

当对含有LbCas12a-IPIII和pUC19-M1质粒的大肠杆菌平板上长出的噬菌斑进行PCR 扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定时，发现阳性克隆率约为61％，得到的预期突变体，命名为T4ΔIPIΔIPII-M1。

5.对测序正确的T4ΔIPIΔIPII-M1噬菌体进行增殖纯化

取1.5mL的EP管，加入200μl Pi-Mg缓冲液(26mM Na₂HPO₄、68mM NaCl，22mMKH₂PO₄、1mM MgSO₄，pH 7.5)。在无菌条件下挑取测序阳性噬菌斑置于缓冲液中，室温静置10min，轻微震荡帮助噬菌体释放到溶液中。吸取100μl混匀的样品，用Pi-Mg缓冲液进行10倍稀释。取500μl P301大肠杆菌培养物于3个不同的灭菌10ml的EP管中，分别加入100μl上述稀释后重组噬菌体，混匀。加入8ml半固体培养基，倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，制成3个含相同亲代背景的重组噬菌体双层平板，37℃温箱内过夜培养。用灭菌载玻片刮取上述重组噬菌体平板的上层培养物，转至500ml含2×10⁸CFU/ml P301培养基(50％M9CA+50％LB)中，置于摇床，37℃220rpm培养5h左右，直至培养基变清亮，且出现大量丝状物，加入5ml氯仿，继续置于摇床中摇10min。用灭菌纱布滤除培养基残渣，30000×g 4℃离心30min，弃上清，用20mlPi-Mg缓冲液重悬，加入氯仿1ml， DnaseI(公司：Solarbio，产品货号：D8071-100mg)50μl，继续置于摇床37℃摇30min。4300×g 离心10min，取上清，去除细胞碎片，分离细菌与噬菌体。30000×g离心30min沉下噬菌体，弃掉上清，1ml Pi-Mg缓冲液重悬。用CsCl(8mM CsCl、100mM Tris-HCl、85mM NaCl、 20mM NH₄Cl)梯度离心的方法纯化噬菌体，将CsCl按照70％、60％、50％、40％、30％、 20％的顺序各1.8ml设置梯度，将上述得到的噬菌体加至最上层，180000×g离心1h，吸取乳白色的噬菌体(约在60％的CsCl浓度附近)。之后分别在透析液I(10mM Tris-HCl、 200mM NaCl、5mM MgCl，pH 7.5)与透析液II(10mM Tris-HCl、50mM NaCl、5mM MgCl， pH 7.5)中透析4h。即可得到纯的重组噬菌体。

6.T4ΔIPIΔIPII-M1噬菌体衣壳内腔包装有M1蛋白的鉴定

包装在T4ΔIPIΔIPII-NP噬菌体衣壳内腔的M1蛋白的N端(羧基端)融合有His蛋白标签，所以可以通过用Western Blot技术检测His蛋白标签的存在，来验证是否M1蛋白被包装在T4ΔIPIΔIPII-NP噬菌体衣壳内腔。具体步骤如下：

1)准备2块12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，其中一块用来考马斯亮蓝染色，一块用来作Western Blot分析。

2)将重组噬菌体用去离子水进行2倍稀释，以实验室现有T4噬菌体做对照进行SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，以80V电压跑完浓缩胶，待marker条带分开切换至120V电压跑分离胶。

3)电泳完毕将胶块置于2.5g/L考马斯亮蓝染液中染色2h，之后转至脱色液(10％冰醋酸，5％乙醇)中进行脱色，结果如图4A所示。取另一块凝胶切下胶块，在65V的电压下转30min将蛋白转至PVDF膜上。TBST洗膜2*5min，5％脱脂奶粉封闭2h，TBST洗膜3*5min，一抗室温孵育2h，TBST洗膜4*8min，二抗孵育45min，TBST洗膜4*8min，在显色液A:B＝1：1情况下使用化学发光仪显色，结果如图4B所示。其中一抗是鼠抗His-Tag 单克隆抗体(公司：Abclonal货号：AE003)用TBST以1：4000倍稀释；二抗是HRP标记的山羊抗小鼠IgG(公司：Abbkine货号：A21010)用TBST以1：8000倍稀释；显色液为ECL化学发光底物试剂盒(公司：Biosharp货号：BL520A)。

实施例5：将A型流感病毒PR8株NP蛋白包装在T4ΔIPIΔIPⅡ噬菌体衣壳内

1.利用PCR技术扩增获得NP片段

用引物D-NP-F/D-NP-R，以PHW-2000-NP质粒中的NP序列为模板扩增出NP片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。 PHW-2000-NP质粒为本实验室现有A型流感病毒PR8株NP的反向遗传系统， PHW-2000-NP质粒中的NP序列如SEQ ID NO.14所示。PCR反应体系、引物序列与扩增条件如下：

引物序列：

D-NP-F:5’-atcatcatcacggtggttctagcaaaagcagggtagataatcact-3’

D-NP-R:5’-cgtcccaagtataagctttaagtagaaacaagggtatttttctttaattg-3’

NP片段的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃30sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

2.pUC19-M1质粒的线性化

用引物19-r-F和19-r-R，以上述pUC19-M1质粒为模板进行反向PCR扩增，得到含有CTS及6×His-Tag的线性载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。PCR反应体系、引物序列及反应条件如下：

引物序列：

19-r-F:5’-agaaccaccgtgatgatgatgatg-3’

19-r-R:5’-taaagcttatacttgggacgctta-3’

扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，53℃15sec，72℃3min，进行30个循环，72℃延伸5min。

3.片段连接

采用南京诺唯赞公司一步克隆法试剂盒(货号C112)，将NP片段和线性化pUC19-M1, 2个片段体外重组拼接在一起，得到含有供体质粒pUC19-NP的重组产物。体外重组反应体系及反应条件如下：

反应条件：

将上述混合物置于37℃下孵育30min，然后立即置于冰上冰浴冷却5min。

4.重组产物转化

将上述重组产物转化到大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，次日挑取单菌落接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养12h后进行菌液PCR鉴定。选取PCR阳性克隆，提取质粒后送公司测序，对测序正确的阳性克隆进行质粒提取，就得到了供体质粒pUC19-NP。序列如SEQ ID NO.15所示。

5.制备用于构建预期突变噬菌体的重组大肠杆菌

将供体质粒pUC19-NP转化至含有上述LbCas12a-IPIII质粒的大肠杆菌B834中，挑取单菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml壮观霉素LB培养基中培养12h备用。于此同时，将上述构建的仅含有LbCas12a-IPIII质粒的重组大肠杆菌B834作为对照。

6.制备衣壳内包装有NP蛋白的基因重组T4噬菌体

取500μl上述含有LbCas12a-IPIII质粒与供体质粒pUC19-NP的重组大肠杆菌培养物，加入约6*10⁸PFU T4ΔIPIΔIPII噬菌体，混匀。37℃孵育7min后，加入含氨苄青霉素(100μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养。于此同时，取300μl仅含有LbCas12a-IPIII质粒的重组大肠杆菌培养物，加入约6*10⁸PFU T4ΔIPIΔIPII噬菌体，混匀。37℃孵育7min后，加入壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养。结果发现，T4ΔIPIΔIPII噬菌体感染含有上述LbCas12a-IPIII质粒与供体质粒的重组大肠杆菌时，在双层平板上长出67个噬菌斑。用同样数量的T4ΔIPIΔIPII噬菌体侵染仅含有LbCas12a-IPIII质粒重组大肠杆菌时，在双层平板上长出70个噬菌斑。这表明，靶向IPIII基因的LbCas12a蛋白复合体可以有效切割T4噬菌体的基因组，但可能由于 NP片段过大，所以重组效率偏低。

7.基因重组T4噬菌体的鉴定

取500μl的P301大肠杆菌培养物，加入半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，待半固体培养基凝固，用10μl规格小枪头点取重组平板上的单斑，进行传代，当传至第三代时进行PCR鉴定，得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图5所示，得到的阳性克隆命名为T4ΔIPIΔIPII-NP。阳性克隆送公司测序进一步验证。

引物序列：

D-NP-F:5’-atcatcatcacggtggttctagcaaaagcagggtagataatcact-3’

D-NP-R:5’-cgtcccaagtataagctttaagtagaaacaagggtatttttctttaattg-3’

NP片段的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃30sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

8.对T4ΔIPIΔIPII-NP噬菌体进行增殖纯化

取1.5mL的EP管，加入200μl Pi-Mg缓冲液(26mM Na₂HPO₄、68mM NaCl，22mMKH₂PO₄、1mM MgSO₄，pH 7.5)。在无菌条件下挑取测序阳性噬菌斑置于缓冲液中，室温静置10min，轻微震荡帮助噬菌体释放到溶液中。吸取100μl混匀的样品，用Pi-Mg缓冲液进行10倍稀释。取500μl P301大肠杆菌培养物于3个不同的灭菌10ml的EP管中，分别加入100μl上述稀释后重组噬菌体，混匀。加入8ml半固体培养基，倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，制成3个含相同亲代背景的重组噬菌体双层平板，37℃温箱内过夜培养。用灭菌载玻片刮取上述重组噬菌体平板的上层培养物，转至500ml含2×10⁸CFU/ml P301培养基(50％M9CA+50％LB)中，置于摇床，37℃220rpm培养5h左右，直至培养基变清亮，且出现大量丝状物，加入5ml氯仿，继续置于摇床中摇10min。用灭菌纱布滤除培养基残渣，30000×g 4℃离心30min，弃上清，用20mlPi-Mg缓冲液重悬，加入氯仿1ml，DnaseI 50μl，继续置于摇床37℃摇30min。4300×g离心10min，取上清，去除细胞碎片，分离细菌与噬菌体。30000×g离心30min沉下噬菌体，弃掉上清，1ml Pi-Mg缓冲液重悬。用CsCl (8mM CsCl、100mM Tris-HCl、85mM NaCl、20mM NH₄Cl)梯度离心的方法纯化噬菌体，将CsCl按照70％、60％、50％、40％、30％、20％的顺序各1.8ml设置梯度，将上述得到的噬菌体加至最上层，180000×g离心1h，吸取乳白色的噬菌体(约在60％的CsCl浓度附近)。之后分别在透析液I(10mM Tris-HCl、200mM NaCl、5mMMgCl，pH 7.5)与透析液II(10mM Tris-HCl、50mM NaCl、5mM MgCl，pH 7.5)中透析4h。即可得到纯的重组噬菌体。

9.T4ΔIPIΔIPII-NP噬菌体衣壳内腔包装有NP蛋白的鉴定

包装在在T4ΔIPIΔIPII-NP噬菌体衣壳内腔的NP蛋白的N端(羧基端)融合有His蛋白标签，所以可以通过用Western Blot技术检测His蛋白标签的存在，来验证是否NP蛋白被包装在T4ΔIPIΔIPII-NP噬菌体衣壳内腔。具体步骤如下：

1)准备2块10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，其中一块用来考马斯亮蓝染色，一块用来作Western Blot分析。

2)将重组噬菌体用去离子水进行2倍稀释，以实验室现有T4噬菌体做对照进行SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，以80V电压跑完浓缩胶，待marker条带分开切换至120V电压跑分离胶。

3)电泳完毕将胶块置于2.5g/L考马斯亮蓝染液中染色2h，之后转至脱色液(10％冰醋酸，5％乙醇)中进行脱色，结果如图6A。取另一块凝胶切下胶块，在65V的电压下转60min将蛋白转至PVDF膜上。TBST洗膜2*5min，5％脱脂奶粉封闭2h，TBST洗膜3*5min，一抗室温孵育2h，TBST洗膜4*8min，二抗孵育45min，TBST洗膜4*8min，在显色液A:B＝1： 1情况下使用化学发光仪显色，结果如图6B。

附：序列表说明：

SEQ ID NO.1：T4噬菌体IPI基因的核苷酸序列

SEQ ID NO.2：T4噬菌体IPII基因的核苷酸序列

SEQ ID NO.3：T4噬菌体IPIII基因的核苷酸序列

SEQ ID NO.4：IPIII基因的靶向序列

SEQ ID NO.5：靶向T4噬菌体IPIII基因的LbCas12a编辑载体序列

SEQ ID NO.6：CTS序列

SEQ ID NO.7：靶向T4噬菌体IPI基因的LbCas12a编辑载体序列

SEQ ID NO.8：靶向T4噬菌体IPII基因的LbCas12a编辑载体序列

SEQ ID NO.9：IPI基因供体质粒的同源臂序列

SEQ ID NO.10：IPII基因供体质粒的同源臂序列

SEQ ID NO.11：pLbCas12a载体序列

SEQ ID NO.12：A型流感病毒M1蛋白的编码基因序列

SEQ ID NO.13：供体质粒pUC19-M1的核苷酸序列

SEQ ID NO.14：A型流感病毒的NP核苷酸序列

SEQ ID NO.15：供体质粒pUC19-NP的核苷酸序列。

<110> 华中农业大学

<120> 一种T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统及其构建方法和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 288

<212> DNA

<213> T4噬菌体(Bacteriophage T4)

<400> 1

ttacaaaaga tttttagcaa taatcttgag atgtgccgca gaaatgtgtt tagctttaaa 60

caacgcagtt tcttcagcag gagagataac gattgtagca ccatcctttt tagcagacca 120

cccatcacct aggtaaacag tacctttgat ttcttcgcca tcaaccagac taatcattgg 180

tttaccttct cgtcctttat ttgctttaat aacttcagaa gtaagagtag cttcggtaat 240

ggtagaaacc ggggtagttg tagaagtaaa ttctttaaat gttttcat 288

<210> 2

<211> 303

<212> DNA

<213> T4噬菌体(Bacteriophage T4)

<400> 2

ttatttatct ttaattgctt tagctgcttc gatagccgct tgctgaaggt catccataga 60

catgccgaac ttagaagcaa agttatcaat tttcttttcg acggcattca aaggcttggc 120

ctgtttacct tcattagcgc caggaagagc gagaatacgc tctctgtcaa tataaaggct 180

tacaagtttc ttacggtctt tatcgggcaa atcatgaaat gaatgggcct ttttatttac 240

agcggcttct aatttacctg cgcccactcg cgcttcggca ataaattctt gatatgtttt 300

cat 303

<210> 3

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ttaagaatta ccacgggctg cattagcaac ggcgtaagcg tactgaatat tagcgtcttt 60

aaacttacct ttagaggtat ctatttctgc cttaaagccg cctttagtca taacatcggc 120

aaattcttta cggaaagcca ttgcatcaag acctttccat gatgatttat gcttggcaaa 180

ttcaagacct gcgaagttga cagctttagc caatttatta tcaatgaccc atttaccggc 240

tttaggcaca aacttcgggc ctttctgttt agagaacagt tttaaattcc agcggcgaag 300

gtctgcatca gctttaacaa attctgagtc taagttacta gcaacaacat cttcaatatg 360

agcaaattta agtccgtcaa cttcaatatt taaatcggta cgccagcgaa gtccttccca 420

agcgaaggct ttaaagtcgg aagcctttgt agctaagtac cgttcaatag gagctgtttt 480

agggtcaaag ccgtttcctg atcggtaggt ccactcatct ttgttaatgc ctttggcctt 540

tactacagaa gcttcggcaa taaattcttg atatgttttc at 582

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> T4噬菌体(Bacteriophage T4)

<400> 4

agtccgtcaa cttcaatatt taa 23

<210> 5

<211> 6266

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

atgagcaaac tggaaaaatt tacgaattgt tatagcctgt ccaagaccct gcgtttcaaa 60

gccatccccg ttggcaaaac ccaggagaat attgataata aacgtctgct ggttgaggat 120

gaaaaaagag cagaagacta taagggagtc aaaaaactgc tggatcggta ctacctgagc 180

tttataaatg acgtgctgca tagcattaaa ctgaaaaatc tgaataacta tattagtctg 240

ttccgcaaga aaacccgaac agagaaagaa aataaagagc tggaaaacct ggagatcaat 300

ctgcgtaaag agatcgcaaa agcttttaaa ggaaatgaag gttataaaag cctgttcaaa 360

aaagacatta ttgaaaccat cctgccggaa tttctggatg ataaagacga gatagcgctc 420

gtgaacagct tcaacgggtt cacgaccgcc ttcacgggct ttttcgataa cagggaaaat 480

atgttttcag aggaagccaa aagcacctcg atagcgttcc gttgcattaa tgaaaatttg 540

acaagatata tcagcaacat ggatattttc gagaaagttg atgcgatctt tgacaaacat 600

gaagtgcagg agattaagga aaaaattctg aacagcgatt atgatgttga ggattttttc 660

gagggggaat tttttaactt tgtactgaca caggaaggta tagatgtgta taatgctatt 720

atcggcgggt tcgttaccga atccggcgag aaaattaagg gtctgaatga gtacatcaat 780

ctgtataacc aaaagaccaa acagaaactg ccaaaattca aaccgctgta caagcaagtc 840

ctgagcgatc gggaaagctt gagcttttac ggtgaaggtt ataccagcga cgaggaggta 900

ctggaggtct ttcgcaatac cctgaacaag aacagcgaaa ttttcagctc cattaaaaag 960

ctggagaaac tgtttaagaa ttttgacgag tacagcagcg caggtatttt tgtgaagaac 1020

ggacctgcca taagcaccat tagcaaggat atttttggag agtggaatgt tatccgtgat 1080

aaatggaacg cggaatatga tgacatacac ctgaaaaaga aggctgtggt aactgagaaa 1140

tatgaagacg atcgccgcaa aagctttaaa aaaatcggca gctttagcct ggagcagctg 1200

caggaatatg cggacgccga cctgagcgtg gtcgagaaac tgaaggaaat tattatccaa 1260

aaagtggatg agatttacaa ggtatatggt agcagcgaaa aactgtttga tgcggacttc 1320

gttctggaaa aaagcctgaa aaaaaatgat gctgttgttg cgatcatgaa agacctgctc 1380

gatagcgtta agagctttga aaattacatt aaagcattct ttggcgaggg caaagaaaca 1440

aacagagacg aaagctttta tggcgacttc gtcctggctt atgacatcct gttgaaggta 1500

gatcatatat atgatgcaat tcgtaattac gtaacccaaa agccgtacag caaagataag 1560

ttcaaactgt atttccagaa cccgcagttt atgggtggct gggacaaaga caaggagaca 1620

gactatcgcg ccactattct gcgttacggc agcaagtact atctcgccat catggacaaa 1680

aaatatgcaa agtgtctgca gaaaatcgat aaagacgacg tgaacggaaa ttacgaaaag 1740

attaattata agctgctgcc agggcccaac aagatgttac cgaaagtatt tttttccaaa 1800

aaatggatgg catactataa cccgagcgag gatatacaga agatttacaa aaatgggacc 1860

ttcaaaaagg gggatatgtt caatctgaat gactgccaca aactgatcga tttttttaaa 1920

gatagcatca gccgttatcc taaatggtca aacgcgtatg attttaattt ctccgaaacg 1980

gagaaatata aagacattgc tggtttctat cgcgaagtcg aagaacaggg ttataaagtt 2040

agctttgaat cggccagcaa gaaagaggtt gataaactgg tggaggaggg taagctgtat 2100

atgtttcaga tttataacaa agactttagc gacaaaagcc acggtactcc taatctgcat 2160

acgatgtact ttaaactgct gtttgatgag aataaccacg gccaaatccg tctctccggt 2220

ggagcagaac tttttatgcg gcgtgcgagc ctaaaaaagg aagaactggt ggtgcatccc 2280

gccaacagcc cgattgctaa caaaaatcca gataatccta agaagaccac cacactgtcg 2340

tacgatgtct ataaggataa acgtttctcg gaagaccagt atgaattgca tataccgata 2400

gcaattaata aatgcccaaa aaacattttc aaaatcaaca ctgaagttcg tgtgctgctg 2460

aaacatgatg ataatccgta tgtgatcgga attgaccgtg gggagagaaa tctgctgtat 2520

attgtagtcg ttgatggcaa gggcaacatc gttgagcagt atagcctgaa tgaaataatt 2580

aataatttta acggtatacg tattaaaacc gactatcata gcctgctgga taaaaaggag 2640

aaagagcgtt ttgaggcacg ccaaaattgg acgagcatcg aaaacatcaa ggaactgaag 2700

gcaggatata tcagccaagt agtccataaa atctgtgaac tggtggagaa gtacgacgct 2760

gtcattgccc tggaagacct caatagcggc tttaaaaaca gccgggtgaa ggtggagaaa 2820

caggtatacc aaaagtttga aaagatgctc attgataagc tgaactatat ggttgataaa 2880

aagagcaacc cgtgcgccac tggcggtgca ctgaaagggt accaaattac caataaattt 2940

gaaagcttta aaagcatgag cacgcagaat gggtttattt tttatatacc agcatggctg 3000

acgagcaaga ttgaccccag cactggtttt gtcaatctgc tgaaaaccaa atacacaagc 3060

attgcggata gcaaaaaatt tatttcgagc ttcgaccgta ttatgtatgt tccggaggaa 3120

gatctgtttg aatttgccct ggattataaa aacttcagcc gcaccgatgc agattatatc 3180

aaaaaatgga agctgtacag ttatggtaat cgtatacgta tcttccgtaa tccgaagaaa 3240

aacaatgtgt tcgattggga agaggtctgt ctgaccagcg cgtataaaga actgttcaac 3300

aagtacggaa taaattatca gcaaggtgac attcgcgcac tgctgtgtga acagtcagat 3360

aaagcatttt atagcagctt tatggcgctg atgagcctga tgctccagat gcgcaacagc 3420

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ggtttcgccc gtactgtcag attcatggtt gagcctcacg gctcccacag atgcaccgga 4800

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gagctagcta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 5040

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<210> 9

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

cgtttcattt tattctcctc agtagttgat agggtaatag tatcacagct aaaaccctat 60

gtaaacaact ttgtgaaata tttattacaa aagattttta ttttattttc ctaattaatt 120

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<210> 10

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

tactaaagta aggttgatac gagtcatttt agtgttctcc tgtagttgat aggtctatag 60

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

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gccatccccg ttggcaaaac ccaggagaat attgataata aacgtctgct ggttgaggat 120

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tgggtaactt tgtatgtgtc cgcagcgccc gccgcagtct cacgcccgga gcgtagcgac 4860

cgagtgagct agctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 4920

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<210> 12

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<212> DNA

<213> A型流感病毒(Influenza A virus)

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<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

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gccagtgggt acgactttga aagagaggga tactctctag tcggaataga ccctttcaga 960

ctgcttcaaa acagccaagt gtacagccta atcagaccaa atgagaatcc agcacacaag 1020

agtcaactgg tgtggatggc atgccattct gccgcatttg aagatctaag agtattaagc 1080

ttcatcaaag ggacgaaggt ggtcccaaga gggaagcttt ccactagagg agttcaaatt 1140

gcttccaatg aaaatatgga gactatggaa tcaagtacac ttgaactgag aagcaggtac 1200

tgggccataa ggaccagaag tggaggaaac accaatcaac agagggcatc tgcgggccaa 1260

atcagcatac aacctacgtt ctcagtacag agaaatctcc cttttgacag aacaaccatt 1320

atggcagcat tcactgggaa tacagagggg agaacatctg acatgaggac cgaaatcata 1380

aggatgatgg aaagtgcaag accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag 1440

ctctcggacg aaaaggcagc gagcccgatc gtgccttcct ttgacatgag taatgaagga 1500

tcttatttct tcggagacaa tgcagaggag tacgacaatt aaagaaaaat acccttgttt 1560

ctact 1565

<210> 15

<211> 4481

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 60

caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 120

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 180

tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 240

acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 300

ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 360

gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc 420

tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 480

agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc 540

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 600

cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag 660

aggatccccg ggtacctgga attgtgatag tatattcaca attacttgaa tagacaatta 720

ctaattaaaa tatttaaagg aaacatatga aaacatatca agaatttatt gccgaaggtg 780

gttctcatca tcatcatcat cacggtggtt ctagcaaaag cagggtagat aatcactcac 840

tgagtgacat caaaatcatg gcgtcccaag gcaccaaacg gtcttacgaa cagatggaga 900

ctgatggaga acgccagaat gccactgaaa tcagagcatc cgtcggaaaa atgattggtg 960

gaattggacg attctacatc caaatgtgca ccgaacttaa actcagtgat tatgagggac 1020

ggttgatcca aaacagctta acaatagaga gaatggtgct ctctgctttt gacgaaagga 1080

gaaataaata cctggaagaa catcccagtg cggggaaaga tcctaagaaa actggaggac 1140

ctatatacag gagagtaaac ggaaagtgga tgagagaact catcctttat gacaaagaag 1200

aaataaggcg aatctggcgc caagctaata atggtgacga tgcaacggct ggtctgactc 1260

acatgatgat ctggcattcc aatttgaatg atgcaactta tcagaggaca agagctcttg 1320

ttcgcaccgg aatggatccc aggatgtgct ctctgatgca aggttcaact ctccctagga 1380

ggtctggagc cgcaggtgct gcagtcaaag gagttggaac aatggtgatg gaattggtca 1440

ggatgatcaa acgtgggatc aatgatcgga acttctggag gggtgagaat ggacgaaaaa 1500

caagaattgc ttatgaaaga atgtgcaaca ttctcaaagg gaaatttcaa actgctgcac 1560

aaaaagcaat gatggatcaa gtgagagaga gccggaaccc agggaatgct gagttcgaag 1620

atctcacttt tctagcacgg tctgcactca tattgagagg gtcggttgct cacaagtcct 1680

gcctgcctgc ctgtgtgtat ggacctgccg tagccagtgg gtacgacttt gaaagagagg 1740

gatactctct agtcggaata gaccctttca gactgcttca aaacagccaa gtgtacagcc 1800

taatcagacc aaatgagaat ccagcacaca agagtcaact ggtgtggatg gcatgccatt 1860

ctgccgcatt tgaagatcta agagtattaa gcttcatcaa agggacgaag gtggtcccaa 1920

gagggaagct ttccactaga ggagttcaaa ttgcttccaa tgaaaatatg gagactatgg 1980

aatcaagtac acttgaactg agaagcaggt actgggccat aaggaccaga agtggaggaa 2040

acaccaatca acagagggca tctgcgggcc aaatcagcat acaacctacg ttctcagtac 2100

agagaaatct cccttttgac agaacaacca ttatggcagc attcactggg aatacagagg 2160

ggagaacatc tgacatgagg accgaaatca taaggatgat ggaaagtgca agaccagaag 2220

atgtgtcttt ccaggggcgg ggagtcttcg agctctcgga cgaaaaggca gcgagcccga 2280

tcgtgccttc ctttgacatg agtaatgaag gatcttattt cttcggagac aatgcagagg 2340

agtacgacaa ttaaagaaaa atacccttgt ttctacttaa agcttatact tgggacgctt 2400

aaataaaagc agtttacaac tcctagaatt gtgaatatat tatcacaatt ctaggataga 2460

ataataaaaa tatttacgaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac 2520

cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 2580

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 2640

cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc 2700

actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca 2760

cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg 2820

accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga 2880

cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 2940

tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 3000

taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 3060

tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 3120

gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 3180

gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 3240

cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 3300

tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 3360

tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 3420

atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 3480

ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 3540

gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 3600

gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 3660

gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 3720

gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 3780

gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 3840

cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 3900

atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 3960

tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 4020

ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 4080

gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 4140

tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 4200

ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt 4260

ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 4320

gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 4380

ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 4440

tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac t 4481

Claims (8)

1.一种T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统，其特征在于包含三个部分：第一部分是利用LbCas12a基因编辑系统改造得到的缺失IPI和IPII基因T4突变噬菌体；第二部分是含有CRISPR-LbCas12a基因编辑载体的宿主菌，所述CRISPR-LbCas12a基因编辑载体在宿主菌内表达产生的CRISPR-LbCas12a蛋白复合体能特异性切割所述缺失IPI和IPII基因T4突变噬菌体的IPIII基因的靶向序列；第三部分是用于将IPIII基因替换成目标蛋白基因的供体质粒，其中，

所述IPI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述IPII基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述IPIII基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述IPIII基因的靶向序列如SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)利用LbCas12a基因编辑系统改造T4噬菌体，得到缺失IPI和IPII基因T4突变噬菌体；

2)构建一种靶向T4噬菌体IPIII基因的CRISPR-LbCas12a基因编辑载体，转化至宿主菌，得到含有CRISPR-LbCas12a基因编辑载体的宿主菌，所述CRISPR-LbCas12a基因编辑载体在宿主菌内表达产生的CRISPR-LbCas12a蛋白复合体能特异性切割所述缺失IPI和IPII基因T4突变噬菌体的IPIII基因的靶向序列；

3)利用一步克隆法将线性化pUC19载体、目标蛋白编码序列、IPIII基因上下游同源臂连接在一起，得到用于将T4噬菌体IPIII基因替换成目标蛋白基因的供体质粒。

3.如权利要求2所述T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统的构建方法，其特征在于：所述供体质粒含有T4噬菌体衣壳靶向序列，该序列如SEQ ID NO.6所示。

4.如权利要求2所述T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统的构建方法，其特征在于，所述利用LbCas12a基因编辑系统改造T4噬菌体，得到缺失IPI和IPII基因的T4突变噬菌体的具体方法如下：

1)构建靶向T4噬菌体IPI基因的LbCas12a基因编辑载体，命名为LbCas12a-IPI；构建靶向T4噬菌体基因组IPII基因的LbCas12a基因编辑载体，命名为LbCas12a-IPII；

2)构建用于缺失IPI基因的供体质粒，命名为pMD18-T-IPI；构建用于缺失IPII基因的供体质粒，命名为pMD18-T-IPII；

3)将1)和2)中的LbCas12a-IPI和pMD18-T-IPI质粒转化至宿主菌，得到含有LbCas12a-IPI和pMD18-T-IPI质粒的宿主菌；将1)和2)中的LbCas12a-IPII和pMD18-T-IPII质粒转化到宿主菌，得到含有LbCas12a-IPII和pMD18-T-IPII质粒的宿主菌；

4)用野生型T4噬菌体感染上述含有LbCas12a-IPI和pMD18-T-IPI质粒的宿主菌，得到缺失IPI基因的突变体，命名为T4ΔIPI；

5)用T4ΔIPI噬菌体感染上述含有LbCas12a-IPII和pMD18-T-IPII质粒的宿主菌，得到缺失IPI和IPII基因的突变体，命名为T4ΔIPIΔIPII。

5.如权利要求4所述T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统的构建方法，其特征在于：所述LbCas12a-IPI基因编辑载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述LbCas12a-IPII基因编辑载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

6.如权利要求4所述T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统的构建方法，其特征在于：所述pMD18-T-IPI供体质粒的同源臂序列如SEQ ID NO.9所示；所述pMD18-T-IPII供体质粒的同源臂序列如SEQ ID NO.10所示。

7.权利要求1所述的包装系统用于将目标蛋白包装在T4噬菌体衣壳内腔的用途。

8.一种利用权利要求1所述的包装系统将目标蛋白包装在T4噬菌体衣壳内腔的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将所述用于将IPIII基因替换成目标蛋白基因的供体质粒转化到所述含有CRISPR-LbCas12a基因编辑载体的宿主菌，得到含有供体质粒和CRISPR-LbCas12a基因编辑载体的宿主菌；

2)用缺失IPI和IPII基因T4突变噬菌体感染上述含有两种质粒的宿主菌，得到衣壳内腔包装有目标蛋白的重组T4突变噬菌体。

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