CN114836391A - 一种重组t4噬菌体及其在制备流感病毒鼻内递送vlp疫苗中的应用 - Google Patents

一种重组t4噬菌体及其在制备流感病毒鼻内递送vlp疫苗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组T4噬菌体，通过CRISPR基因编辑技术对T4噬菌体基因组进行改造，构建一种在体内组装病毒样颗粒(Virus‑like particle,VLP)的疫苗载体，将目的抗原基因插入到T4噬菌体基因组中Soc基因的3’端，利用衣壳蛋白Soc的自组装功能，在体内将抗原蛋白展示到T4噬菌体衣壳表面，形成T4‑VLP。该T4‑VLP疫苗以滴鼻的方式进行免疫接种，实现抗原的鼻内递送，高效地诱导系统性及黏膜免疫反应，能用于广谱性流感疫苗的研发，对动物提供更高效的免疫保护。

Description

一种重组T4噬菌体及其在制备流感病毒鼻内递送VLP疫苗中 的应用
技术领域
本发明属于生物领域，涉及一种重组T4噬菌体，本发明还涉及该重组T4噬菌体在制备流感病毒鼻内递送VLP疫苗中的应用。
背景技术
呼吸道黏膜是呼吸道病原的主要入侵位点，在局部黏膜诱导强大的先天性及适应性免疫，有利于在呼吸道病原感染时将其清除。然而，大多数商业疫苗都是通过非黏膜途径给药，主要诱导系统免疫反应，难以触发黏膜免疫系统。鼻内、口服、直肠、阴道给药均能诱导黏膜免疫反应，其中鼻内给药由于较大的吸收表面积及温和的局部条件，是极具吸引力的给药途径。因此，开发鼻内递送疫苗对抵御呼吸道病原感染具有重大意义。然而，开发呼吸道黏膜疫苗也面临巨大的挑战。黏膜表面黏液层的清除作用，降低了疫苗在黏膜的驻留时间，限制了抗原的识别与摄取。因此，需要使用合适的佐剂及递送载体来延长抗原存在时间及靶向APCs，从而增强黏膜免疫反应。目前缺乏可用的黏膜佐剂，常规佐剂通过黏膜免疫通常带来较高的安全隐患。纳米颗粒载体具有局部贮存效应及促进抗原摄取的能力，在呼吸道黏膜能引起长期有效的免疫保护，被认为是极具前景的呼吸道疫苗递送载体。
T4噬菌体是一种新型纳米颗粒疫苗载体，抗原蛋白和T4噬菌体的衣壳蛋白Soc融合表达，得到的重组蛋白在体外能自行组装到T4噬菌体的衣壳表面，形成VLP疫苗。T4-VLP具有与病原体相似的病原相关分子模式，能有效激活机体的先天免疫系统，因而具有内源性佐剂活性，在无需额外佐剂的情况下就可以高效地诱导针对抗原蛋白的免疫反应；最近研究也表明，T4噬菌体可以通过与粘蛋白结合，富集在黏膜表面的黏液层，增加了与宿主相互作用的机会。因此，T4噬菌体作为一种纳米颗粒材料，有作为黏膜疫苗载体的潜力。通过实验室近期开发的噬菌体基因组编辑技术(Liu Yuepeng等.Journal of Virology,2020.94:e01630-20；Junhua Dong等.ACS Synth.Biol.2021,10,2639-2648)，对T4噬菌体基因组进行基因改造，用于开发鼻内递送黏膜VLP疫苗。
发明内容
本发明的目的是利用T4噬菌体开发一种流感病毒鼻内黏膜VLP疫苗。
为了实现这一目的，本发明以构建流感病毒鼻内递送VLP疫苗为例，通过体内重组方式将流感病毒M2e蛋白展示到T4噬菌体衣壳表面，制备流感病毒VLP疫苗，通过滴鼻方式免疫动物，最终进行免疫评估。具体如下：
1.重组T4噬菌体的构建
1)将流感病毒M2e蛋白目的片段融合到T4噬菌体Soc蛋白C端，得到供体质粒；
2)将pLbCas12a-ModB和步骤1)得到的供体质粒共转化至宿主菌，得到同时含有pLbCas12a-ModB质粒和供体质粒的重组工程菌；
3)敲除T4噬菌体衣壳表面非必需蛋白Hoc及Soc的编码基因，制备Hoc-Soc-T4噬菌体；
4)用Hoc-Soc-T4噬菌体感染步骤2)得到的工程菌，获得衣壳表面展示流感病毒M2e蛋白的重组T4噬菌体。
其中，所述流感病毒M2e蛋白为人流感病毒M2e蛋白(HumanM2e，HuM2e)、猪流感病毒M2e蛋白(SwineM2e，SwM2e)、禽流感病毒M2e蛋白(AvianM2e，AvM2e)或者将三者串联得到的3M2e蛋白。以上四种蛋白目的片段的制备可按本领域常规方法，其中单一蛋白片段是以pUCSoc-gfp为模板，PCR获得ModB基因，同时通过多轮PCR将M2e片段加至ModB的C端。而3M2e是合成以“GGSSGGSS”linker连接的三种M2e串联核苷酸序列。
所得到的四种M2e蛋白目的片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1-4所示。
其中，利用CRISPR基因编辑技术对T4噬菌体基因组进行改造，在即将目的抗原基因插入到T4噬菌体基因组中Soc基因的3’端，利用衣壳蛋白Soc的自组装功能，在体内将抗原蛋白展示到T4噬菌体衣壳表面。
所述T4噬菌体Soc蛋白的编码核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
所述供体质粒的载体是pUC质粒。
所述宿主菌是大肠杆菌。
2.T4-VLP作为鼻内递送载体的特性评估
1)粒径、zeta电位及稳定性分析。
2)运用生物素链霉亲和素荧光标记系统对T4噬菌体进行标记，鼻内免疫小鼠后，通过小动物活体成像系统分析T4噬菌体在体内驻留情况。
3)将荧光标记的T4噬菌体鼻内免疫小鼠，用荧光抗体对不同亚型APCs进行标记，通过流式细胞术分析抗原递呈细胞对T4噬菌体的捕获。
3.鼻内免疫3M2e-T4 VLP疫苗的免疫保护效力评估
1)通过对鼻内免疫3M2e-T4 VLP的小鼠进行同源与异源流感病毒攻毒，评估鼻内递送3M2e-T4 VLP疫苗的免疫保护效力。
2)通过对血清抗体水平及脾脏CD4+T细胞水平的分析，评估鼻内递送3M2e-T4VLP疫苗诱导系统性免疫反应的能力。
3)通过分析肺黏膜抗原特异性抗体及CD4+T细胞水平来评估鼻内递送3M2e-T4VLP疫苗诱导黏膜免疫反应的能力。
结果表明：所构建的重组T4噬菌体能应用于制备流感病毒鼻内递送VLP疫苗。本发明实现了抗原的鼻内递送，高效地诱导系统性及黏膜免疫反应。T4-VLP黏膜疫苗通过鼻内免疫后能够在黏膜表面长期驻留，增强了抗原蛋白被抗原呈递细胞(Antigen-presentingcells,APCs)摄取的效率，通过诱导系统性及局部黏膜免疫反应，对动物提供更高效的免疫保护。
附图说明
图1：HuM2e-T4、SwM2e-T4、AvM2e-T4、3M2e-T4重组噬菌体的鉴定。
图2：M2e-T4纳米颗粒的粒径与zeta电位分布。
图3：4℃储存10个月后T4-VLP的稳定性。
图4：鼻内免疫的T4-VLP在体内的驻留。
图5：鼻内免疫的T4-VLP被肺APCs的加工呈递。
图6：鼻内免疫的T4-VLP被MLNs中APCs的加工呈递。
图7：肌肉注射3M2e-T4 VLP对同源流感病毒攻毒的免疫保护效力。
图8：肌肉注射3M2e-T4 VLP对异源流感病毒攻毒的免疫保护效力。
图9：鼻内免疫3M2e-T4 VLP对同源流感病毒攻毒的免疫保护效力。
图10：鼻内免疫3M2e-T4 VLP对异源流感病毒攻毒的免疫保护效力。
图11：鼻内免疫途径诱导的血清抗体水平。
图12：鼻内免疫3M2e-T4 VLP诱导的系统性CD4+T细胞水平。
图13：鼻内免疫3M2e-T4 VLP诱导的呼吸道黏膜抗体水平。
图14：鼻内免疫3M2e-T4 VLP诱导的肺抗原特异性CD4+T细胞水平。
图中*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：流感病毒T4-VLP疫苗的制备
关键试验材料及其说明：
质粒pUCSoc-gfp：是以pUC19为载体，能将Soc-gfp展示于噬菌体表面所需的供体质粒，其中Soc-gfp基因两端分别含有来自T4噬菌体Soc基因两端同源臂56及ModB基因，在ModB基因上及Soc基因3’端分别含有Spe Ⅰ及Xho Ⅰ两个酶切位点。质粒的构建及详细信息参见Junhua Dong等.ACS Synth.Biol.2021,10,2639-2648。
pLbCas12a-ModB质粒：是靶向T4噬菌体ModB基因的LbCas12a编辑载体。其中spacer序列能在大肠杆菌J23100启动子控制下编码产生相应的crRNA，质粒的构建及详细信息参见Junhua Dong等.ACS Synth.Biol.2021,10,2639-2648。基因序列见SEQ IDNo.10。
Hoc-Soc- T4噬菌体：是野生型T4噬菌体Hoc、Soc缺失型突变体，用于表面展示抗原重组噬菌体的构建。其中Soc- T4噬菌体的制备及详细信息参见Junhua Dong等.ACSSynth.Biol.2021,10,2639-2648。Hoc-Soc- T4噬菌体是在Soc- T4基础上对Hoc基因进行敲除制备而成。
1.构建将3M2e或单个M2e融合于Soc蛋白C端的供体质粒
1)PCR方法获得目的片段HuM2e3、SwM2e3、AvM2e3及ModB
以质粒pUCSoc-gfp(Junhua Dong等.ACS Synth.Biol.2021,10,2639-2648)为模板，分别用下表中的引物HuM2e FW1/ModB、SwM2e FW1/ModB、AvM2e FW1/ModB和ModB FW/ModB进行PCR扩增以获取片段HuM2e1、SwM2e1、AvM2e1和ModB。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。胶回收具体步骤参考Omega公司
Figure BDA0003666471110000041
Gel Extraction试剂盒说明书。以上述获取目的片段HuM2e1、SwM2e1、AvM2e1为模板，分别用引物HuM2e FW2/ModB、SwM2e FW2/ModB、AvM2e FW2/ModB进行PCR扩增与胶回收得到目的片段HuM2e2、SwM2e2、AvM2e2。最后用HuM2e2、SwM2e2、AvM2e2为模板，分别用引物HuM2eFW3/ModB、SwM2e FW3/ModB、AvM2e FW3/ModB进行PCR扩增与胶回收得到目的片段HuM2e3、SwM2e3、AvM2e3。引物序列如下：
Figure BDA0003666471110000051
所得产物ModB、HuM2e3、SwM2e3、AvM2e3的核苷酸序列见SEQ ID No.6-9，其中HuM2e3、SwM2e3、AvM2e3各自所包含的HuM2e、SwM2e、AvM2e核苷酸序列参见SEQ ID No.1-3。
2)酶切连接的方法获得pUCSoc-HuM2e、pUCSoc-SwM2e、pUCSoc-AvM2e、pUCSoc供体质粒。
将以上获得HuM2e3、SwM2e3、AvM2e3、ModB目的片段和pUCSoc-gfp质粒进行QuickCutTMSpe I和QuickCutTMXho I(Takara)双酶切，酶切反应体系如下：
Figure BDA0003666471110000061
酶切反应体系置于37℃水浴锅孵育1h，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。
随后用T4连接酶(Thermo ScientificTM T4 DNA)，16℃连接过夜，将目的片段的酶切产物与pUCSoc-gfp酶切产物连接，得到供体质粒pUCSoc-HuM2e、pUCSoc-SwM2e、pUCSoc-AvM2e、pUCSoc。其中，pUCSoc质粒中Soc C端含有Xho Ⅰ酶切位点。反应体系如下：
Figure BDA0003666471110000062
3)酶切连接的方法获得pUCSoc-3M2e供体质粒
设计并合成来自于人、猪和禽流感病毒的M2e串联核苷酸序列，序列信息如SEQ IDNo.4所示。将其克隆至pUC57载体质粒上，命名为pUC57-3M2e。
利用QuickCutTMSal I/QuickCutTMXho I(Takara)将pUC57-3M2e质粒进行双酶切反应，获得3M2e目的片段。利用QuickCutTMXho I对2)中获得pUCSoc进行单酶切获得线性化载体，随后用T4连接酶16℃连接过夜，得到pUCSoc-3M2e供体质粒，酶切及连接体系见上述pUCSoc-HuM2e、pUCSoc-SwM2e、pUCSoc-AvM2e、pUCSoc供体质粒构建方法。
2.制备用于构建M2e-T4、3M2e-T4重组噬菌体的重组工程菌。
将上述得到的pUCSoc-HuM2e、pUCSoc-SwM2e、pUCSoc-AvM2e和pUCSoc-3M2e供体质粒分别与pLbCas12a-ModB质粒共转化至大肠杆菌B834细胞中，接种于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的LB固体培养基中，37℃培养过夜，筛选双阳性克隆得到同时含有pLbCas12a-ModB质粒和供体质粒的重组工程菌。同时，将pLbCas12a-ModB质粒单独转化到大肠杆菌B834中，得到只含有pLbCas12a-ModB的大肠杆菌作为对照。其中pLbCas12a-ModB质粒，核苷酸序列信息参见SEQ ID No.10。
3.构建用于基因编辑所需Hoc-Soc-T4噬菌体
Hoc和Soc蛋白是T4噬菌体表面的非必需蛋白，它们的敲除不会影响T4噬菌体的增殖活性而有利于噬菌体的改造，从而能将Soc融合蛋白高拷贝地展示在噬菌体衣壳表面。因此，我们利用CRISPR技术对野生型T4噬菌体进行改造，分别敲除Soc及Hoc基因构建Hoc-Soc-T4噬菌体。其中Soc- T4噬菌体的具体构建方法及详细信息参见Junhua Dong等.ACSSynth.Biol.2021,10,2639-2648。Hoc-Soc- T4噬菌体是在Soc- T4噬菌体基础上敲除Hoc基因获得。
1)构建缺失Hoc所需供体质粒pUC-ΔHoc
以质粒pUCHoc-gfp(Junhua Dong等.ACS Synth.Biol.2021,10,2639-2648)为模板，用下表中的引物inhZT FW及inhZT BW扩增获得片段R，片段R含pUC19载体骨架及T4噬菌体Hoc蛋白C端同源臂。其中pUCHoc-gfp是以pUC19为载体，能将Hoc-gfp展示于噬菌体表面所需的供体质粒，其中Hoc-gfp基因两端分别含有来自T4噬菌体Hoc两端同源臂。质粒的构建及详细信息参见Junhua Dong等.ACS Synth.Biol.2021,10,2639-2648。
以T4噬菌体为模板，用inh FW及inh BW引物扩增获得片段inh，inh为T4噬菌体Hoc蛋白N端基因片段，可作为构建Hoc缺失突变体所需N端同源臂。
PCR扩增产物经胶回收得到目的片段R及inh。引物序列如下：
Figure BDA0003666471110000071
所得产物R及inh的核苷酸序列见SEQ ID No.11-12。
采用南京诺唯赞公司一步克隆法试剂盒(货号C112)，在37℃条件下反应1h使片段R与片段inh经体外重组拼接在一起，得到供体质粒pUC-ΔHoc。体外重组反应体系如下：
Figure BDA0003666471110000081
2)制备用于构建Hoc缺失型突变体的重组工程菌
将上述得到的pUC-ΔHoc供体质粒与pLbCas12a-Hoc质粒共转化至大肠杆菌B834细胞中，接种于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的LB固体培养基中，37℃培养过夜，筛选双阳性克隆得到同时含有pLbCas12a-Hoc质粒和pUC-ΔHoc供体质粒的重组工程菌。其中pLbCas12a-Hoc质粒是靶向T4噬菌体Hoc基因的LbCas12a编辑载体，质粒的构建及详细信息参见Junhua Dong等.ACS Synth.Biol.2021,10,2639-2648。基因序列见SEQ IDNo.13。
3)制备Hoc-Soc- T4重组噬菌体
分别将100μL的Soc- T4噬菌体不同梯度的稀释液与300μL(108CFU/mL)同时含有pLbCas12a-Hoc质粒与pUC-ΔHoc供体质粒的重组工程菌在10mL EP管中混匀，置于37℃培养箱孵育7min。加入7mL含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的半固体培养基，混合均匀，倾倒至含有LB琼脂层的预制平板上，37℃过夜培养。获得含重组噬菌体的双层平板，用10μL规格小枪头挑取单斑，在含宿主菌的双层平板上进行传代，当传至第三代时，对单斑进行PCR鉴定及测序。得到的阳性单斑即为Hoc-Soc- T4重组噬菌体。将单斑置于1mL Pi-Mg缓冲液(26mM Na2HPO4、68mM NaCl，22mM KH2PO4、1mM MgSO4，pH 7.5)中，4℃保存备用。
4.将外源抗原M2e展示于T4噬菌体衣壳表面，制备T4-VLP疫苗载体
将100μL的Hoc-Soc- T4噬菌体梯度稀释液与300μL(108CFU/mL)同时含有pLbCas12a-ModB质粒与pUCSoc-M2e或pUCSoc-3M2e供体质粒的重组工程菌在10mL EP管中混匀，置于37℃培养箱孵育7min。加入7mL含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的半固体培养基，混合均匀，倾倒至含有LB琼脂层的预制平板上，37℃过夜培养，获得含重组噬菌体的双层平板。用10μL规格小枪头挑取单斑，在含宿主菌的双层平板上进行传代，当传至第三代时，对单斑进行PCR鉴定及测序。得到的阳性单斑即为M2e-T4(HuM2e-T4、SwM2e-T4、AvM2e-T4)或3M2e-T4重组噬菌体，将单斑置于1mL Pi-Mg缓冲液中，4℃保存备用。
3)重组噬菌体的增殖
取300μL含重组噬菌体的Pi-Mg缓冲液与300μL P301大肠杆菌(1.5-2×108cells/mL)混合。加入3mL半固体培养基，倾倒至含LB琼脂层的预制平板上，制成含重组噬菌体的双层平板，将其置于37℃温箱内过夜培养。第二天，用灭菌载玻片刮取上述双层平板的上层噬菌体培养物，转至1L含2×108CFU/mL P301的锥形瓶中，置于摇床，37℃180rpm培养3-4h左右，随后通过30,000g离心30min收获细菌和噬菌体混合培养物。用含有氯仿和DNaseⅠ(公司：Solarbio，产品货号：D8071-100mg)的Pi-Mg缓冲液重悬噬菌体培养物。37℃震荡培养20min。通过4,300g离心20min去除细菌碎片，将上清转移到新的30mL离心管。随后30,000g离心30min收获噬菌体，用适量的Pi-Mg缓冲液重悬获取的噬菌体，并置于4℃保存。
4)重组噬菌体的纯化
用CsCl溶液(8mM CsCl、100mM Tris-HCl、85mM NaCl、20mM NH4Cl)制备CsCl梯度，具体梯度如下：
No. Stock CsCl(mL) H<sub>2</sub>O(mL) Total Volume(mL)
1 1 4 5
2 1.5 3.5 5
3 2 3 5
4 2.5 2.5 5
5 3 2 5
6 3.5 1.5 5
取Beckman离心管，从下往上沿管壁依次缓慢叠加等体积6号，5号，4号，3号，2号，1号不同梯度的CsCl分离液。将上述增殖得到的噬菌体悬液置于梯度的最上层，在Beckman超高速冷冻离心机中，通过转子SW41 Ti在4℃，180,000g离心1h。离心结束后，可观察明显的噬菌体层，用长针头插入噬菌体界面，将噬菌体层吸出并转移到新的离心管。将噬菌体样品置于透析袋中，首先在透析缓冲液Ⅰ(10mM Tris-HCl、200mM NaCl、5mM MgCl2，pH 7.5)中4℃透析5h，然后在透析缓冲液Ⅱ(10mM Tris-HCl、50mM NaCl、5mM MgCl2，pH 7.5)中4℃透析过夜。最后收集透析好的噬菌体样品并保存在4℃。
5)验证外源抗原成功展示在噬菌体表面
经SDS-PAGE分析CsCl纯化后的重组噬菌体，结果如图1A所示，HuM2e-T4、SwM2e-T4、AvM2e-T4重组噬菌体在的10kDa至15kDa范围内出现明显的目的条带，3M2e-T4重组噬菌体在15kDa至25kDa间出现明显的目的条带。通过Western Blot分析(图1B)进一步证明HuM2e、SwM2e、AvM2e与3M2e均成功组装到T4噬菌体的衣壳表面，其中Western blot实验所用一抗为1：200稀释的M2e免疫血清；二抗为1：8000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(公司：Abbkine货号：A21010)；显色液为ECL化学发光底物试剂盒(公司：Biosharp货号：BL520A)。
实施例2：T4纳米颗粒作为鼻内递送载体的特性评估
1.粒径与电位分析
通过Zetasizer Nano ZS系统对获得T4-VLP疫苗载体的粒径与zeta电位进行检测，结果如图2A所示，组装3M2e及单个M2e的T4噬菌体平均粒径均大于未组装外源抗原的Hoc-Soc- T4噬菌体，三种噬菌体的zeta电位分布相似，带有相似水平的负电荷(图2B)。
2.稳定性分析
将T4-VLP在4℃条件下储存8个月，通过SDS-PAGE分析检测其表面抗原的稳定性，结果如图3所示，仍具有明显的目的条带，证明了T4-VLP在4℃保存条件下具有很好的稳定性。
3.体内驻留情况分析
为了评估T4-VLP载体经鼻内免疫后在小鼠体内的驻留情况，我们用生物素标记T4-VLP，然后将生物素化的T4-VLP与Alexa Fluor 647标记的链霉亲和素(公司：YEASEN，货号：35104ES60)共孵育以获得荧光标记的T4-VLP。将荧光标记的T4-VLP(T4647)与未标记的T4-VLP(Control)分别滴鼻免疫小鼠，通过小动物活体成像系统(IVIS Spectrum)对T4-VLP在小鼠体内的驻留进行定期监测。结果显示，滴鼻免疫T4647后，在小鼠鼻腔内可立即观察到明显的荧光信号，在滴鼻免疫后40min，鼻腔内荧光信号消失，而在对照组小鼠中未检测到荧光信号(图4A)。随后对鼻内免疫后1.5h、1d、10d、15d、26d、46d的小鼠肺组织中荧光信号进行观察，结果显示，随着时间推移，肺部荧光信号逐渐降低，在第46天达到不可检测的水平，而对照组均未检测到荧光信号(图4B、4C)，在所有小鼠的脾脏均未观察到明显的荧光信号(图4B、4C)。以上结果说明T4-VLP作为鼻内免疫载体，具有驻留效应，能够在肺部长时间驻留。
4.鼻内递送T4-VLP疫苗能被APCs识别
上述结果显示，鼻内免疫T4-VLP能够在呼吸道长期驻留，但这种长期驻留能否延长其被呼吸道及纵膈淋巴结APCs的加工递呈。
1)T4-VLP能更有效被呼吸道APCs加工识别
小鼠肺的APCs主要包括经典CD103+树突状细胞(CD103+cDCs)(F4/80loCD103+CD11blo)，经典CD11b+树突状细胞(CD11b+cDCs)(F4/80-CD103loCD11bhi)，肺泡巨噬细胞(Alveolar Macrophage,AMs)(CD11bloF4/80+),和单核细胞来源DCs(Mononuclear-derivedDendritic Cells,moDCs)(CD11bhiF4/80hi)。
我们给小鼠分别鼻内免疫展示AF488链霉亲和素的T4-VLP(SA-T4)、AF488标记的链霉亲和素(SA)(公司：YEASEN，货号：35103ES60)和PBS，在免疫后的第1天和第14天，分离小鼠肺CD11c+细胞，通过流式细胞术分析肺中不同亚型的APCs对T4-VLP的加工呈递。
具体方法如下：
①分离小鼠肺白细胞
对小鼠进行脱颈处死后，取出肺脏，置于1mL组织消化液(1mg/mL胶原酶D、20U/mLDNAseⅠ、RPMI+10％FBS+1/100双抗)中，用无菌剪刀剪碎肺组织，置于37℃摇床中避光孵育1h；将消化后的组织用10mL注射器内芯轻轻研磨使其通过70μm细胞网筛；用大约7mL组织匀浆冲洗液冲洗细胞网筛，并收集冲洗液；将冲洗液于450g离心10min，用样品稀释液重悬细胞，并小心将细胞悬液加至含6mL小鼠白细胞分离液的15mL离心管中；将细胞分离液于室温300g离心30min后收集白细胞层；将收集到的白细胞用40mL PBS洗涤后，转移至流式管中，加1mL红细胞裂解液，4℃裂解5min；300g，4℃，离心10min后加入2mL流式细胞染色液洗涤两遍；300g，4℃，离心10min，弃掉上清以获取肺白细胞。
②分离小鼠肺CD11c+细胞
用4mL 1×MojosortTM缓冲液(PBS,2.5％BSA,10mM EDTA)重悬上述得到的白细胞并转移到流式管，250g，4℃，离心10min，随后用100μL MojosortTM缓冲液重悬细胞，加入10μL抗小鼠CD16/32(公司：Biolegend，货号：S17011E)混匀，室温封闭10min；加入10μL抗CD11c磁珠(公司：BioLegend)，混匀后立即置于冰上孵育15min；加入4mL的Mojosort Buffer洗涤细胞，4℃，300g离心15min；弃掉上清，加入2.5mL的Mojosort Buffer；把试管放入磁铁中孵育5min，弃去未标记的细胞，重复3次后，将剩余被标记的细胞用2.5mL Mojosort Buffer重悬，250g，4℃，离心10min，加入流式细胞染色液洗涤，并用适量流式细胞染色液重悬细胞以备后续染色。
③对不同亚群APCs进行细胞染色
将上述收集到CD11c+细胞按照100μL/管的体积(≤1×106个/管)分至流式管中，用荧光标记的抗体进行染色，4℃避光孵育20min；加入流式细胞染色缓冲液重悬细胞，250g，4℃，离心10min，重复3次；加入适量的流式细胞染色缓冲液重悬细胞；通过流式细胞仪进行分析。流式细胞分析的荧光抗体均购自Biolegend和BD Biosciences公司，信息如下：
Figure BDA0003666471110000121
如图所示，在免疫后第1天，与对照组相比，在SA-T4免疫组中能观察到显著更多的Streptavidin488+肺细胞(图5A)，对肺APCs进一步分析发现，鼻内免疫后T4-VLP载体主要被AMs摄取，在SA-T4免疫组中也能观察到显著更多的Streptavidin488+CD11b+DCs和Streptavidin488+moDCs(图5B、5C)。同时，对抗原递呈细胞活化标志物CD86分析时，我们发现，与对照组相比，SA-T4组能够观察到更高水平的CD86+AMs和CD86+moDCs细胞(图5D、5E)，这提示T4-VLP载体能更有效被APCs细胞摄取并有效激活APCs细胞活性。而对免疫后第14天小鼠肺APCs细胞进行分析时发现，与对照组相比，在SA-T4免疫组小鼠中观察到显著更高水平的Streptavidin488+AMs和Streptavidin488+moDCs细胞(图5F、5G)以及激活性CD86+CD103+DCs、CD86+AMs和CD86+moDCs(图5H、5I)。综合以上结果，我们发现T4-VLP能有效被肺局部APCs摄取并同时激活其活性。
2)鼻内免疫T4-VLP能顺利将抗原迁移到引流淋巴结并被APCs摄取
纵膈淋巴结(Mediastinal lymph nodes,MLN)是肺的引流淋巴结，迁移至MLN的抗原能够有效启动适应性免疫，为了检测MLN中APCs对T4-VLP的加工呈递，我们在免疫后的第1天和第14天，对4-1中免疫小鼠的MLN进行酶消化以获取单细胞悬液，通过流式细胞术分析MLN中不同亚型APCs对T4-VLP的加工呈递。
具体流程如下：断颈处死小鼠后，分离纵膈淋巴结并置于70μm细胞网筛中。加入1mL肺组织消化液(1mg/mL胶原酶D、20U/mL DNAse Ⅰ、RPMI+10％FBS+1/100双抗)，用10mL注射器内芯轻轻研磨使其通过70μm细胞网筛。收集细胞悬液置于流式细胞管中，洗涤离心后，进行红细胞裂解，离心并用流式细胞染色缓冲液洗涤以进行后续的细胞染色。用100μL细胞染色缓冲液重悬上述淋巴结单细胞悬液并置于流式管中，加入FCR，在4℃封闭15min后，对细胞进行荧光标记，其中荧光标记步骤如4-1-3。使用的荧光标记的抗体如下表。随后通过流式细胞术分析MLN中Streptavidin488+APCs细胞。
Figure BDA0003666471110000131
结果如图6所示，在免疫后第1天，在鼻内免疫SA-T4组与可溶性SA蛋白组的小鼠纵膈淋巴结中检测到相当水平的Streptavidin488+总DCs(图6A)、Streptavidin488+CD11b+DCs和Streptavidin488+CD103+DCs(图6B)。当进一步分析CD86+APCs细胞时，我们发现在鼻内免疫SA-T4组与SA蛋白组的小鼠纵膈淋巴结中CD86+CD103+DCs和CD86+CD11b+DCs也显示相似的水平(图6C)。而在免疫后第14天，检测到相当水平的Streptavidin488+总DCs(图6D)，与SA可溶性蛋白组相比，在SA-T4组中具有更高水平的Streptavidin488+CD11b+DCs(图6E)。以上结果说明SA-T4比SA可溶性蛋白更能有效地被小鼠MLN中DCs加工呈递。此外，与对照组相比，SA-T4组有更高水平的Streptavidin488+CD86+CD11b+DCs(图6F)。综上结果，我们发现将T4-VLP进行鼻内递送，能延长其被纵膈淋巴结APCs加工呈递，并更有效被APCs捕获和激活其活性。
实施例3：T4-VLP的免疫保护效力评估
为了验证T4-VLP疫苗的免疫效力，我们开展动物实验，通过攻毒后产生的免疫保护，诱导产生系统性及局部黏膜免疫反应水平，评估T4-VLP作为鼻内免疫载体的保护效力。实验选择6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自华中农业大学实验动物中心)，根据免疫方式分为鼻内免疫组及肌肉注射组，根据疫苗组分分为PBS组、3M2e可溶性蛋白组、T4组、M2e-T4mixture组(HuM2e-T4，SwM2e-T4与AvM2e-T4混合组)与3M2e-T4组，分别在第0、2和4周进行免疫(M2e：15μg/只)。详细实验分组如下：
No. 免疫方式 免疫组分
1 i.m. T4
2 i.m. 3M2e
3 i.m. M2e-T4 mixture
4 i.m. 3M2e-T4
5 i.n. PBS
6 i.n. T4
7 i.n. 3M2e
8 i.n. 3M2e-T4
1.肌肉注射3M2e-T4 VLP能对同源流感病毒提供完全保护及对异源流感病毒提供部分保护
在第3次免疫后2周，肌肉注射组小鼠每组分别取6只小鼠麻醉后经滴鼻方式感染5LD50同源流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)及3LD50异源流感病毒A/duck/Shandong/03/2019(H3N2)。每天监测小鼠体重变化和死亡，持续14天(体重减轻大于30％被视为死亡，并立即进行安乐死)。结果显示，可溶性3M2e免疫组小鼠仅有一只存活，其他实验组小鼠在10天内全部死亡，而肌肉注射3M2e-T4的小鼠对同源流感病毒H1N1提供完全保护(图7)。异源流感病毒攻毒后，肌肉注射T4噬菌体组小鼠在攻毒7天内均死亡，而其它实验组小鼠均仅有一只存活(图8)。因此，肌肉注射3M2e-T4 VLP能对同源流感病毒攻毒提供完全保护，而对异源流感病毒仅提供部分保护。
2.鼻内免疫3M2e-T4 VLP对流感病毒提供完全的免疫保护
在第3次免疫后2周，滴鼻免疫组小鼠每组分别取6只小鼠麻醉后经滴鼻感染5LD50同源流感病毒H1N1，及3LD50异源流感病毒H3N2。每天监测小鼠体重变化和死亡情况。同源流感攻毒后，结果如图9所示，鼻内免疫3M2e-T4组能够提供完全的免疫保护，且在攻毒后7天内仅出现轻微的体重下降，随后体重迅速回升。而所有对照组小鼠体重持续减轻并在10天内均全部死亡。而对异源流感攻毒结果进行分析，我们发现滴鼻免疫3M2e-T4组能够对异源性流感病毒提供完全的保护，且未观察到明显的体重变化，而对照PBS组和可溶性3M2e组小鼠体重持续减轻并在7天内全部死亡(图10)。因此鼻内免疫3M2e-T4 VLP能对异源流感病毒提供交叉免疫保护。
4.T4-VLP作为鼻内疫苗递送载体能诱导系统性免疫反应
1)滴鼻与肌肉免疫3M2e-T4 VLP能够诱导相当水平的系统性体液免疫反应
在第三次免疫后第10天进行采血，分离血清。酶标板用包被液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH:9.6)包被200ng/孔的等量HumanM2e、SwineM2e、AvianM2e混合肽，4℃过夜包被。包被后，弃去液体，用PBST(PBS+0.05％Tween 20)洗涤5次后，加入200μL/孔封闭液(3％BSA)于37℃封闭1小时。用PBST洗涤5次后，用血清稀释液(1％BSA)对小鼠血清进行连续稀释，每孔100μL，于37℃孵育1小时。用PBST洗涤5次后，每孔分别加入100μL的1：8000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG、1：3000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG1(公司：ABclonal，货号：AS066)、IgG2a(公司：ABclonal，货号：AS065)与IgA(公司：Thermo Scientific货号：62-6720)，37℃孵育45分钟。用PBST洗涤5次后，每孔加入100μL的TMB显色液(公司：碧云天货号：P0209)，孵育20分钟后每孔加入50μL的2M H2SO4终止反应，最后通过酶标仪测定OD450处的吸光度。
对鼻内免疫组小鼠血清进行ELISA分析，结果如图11所示，与滴鼻免疫的对照组(PBS、T4、3M2e)相比，3M2e-T4组能诱导显著更高水平的M2e特异性IgG(图11A)、IgG1(图11B)、IgG2a(图11C)及IgA抗体(图11D)。鼻内免疫3M2e-T4能诱导均衡的IgG1、IgG2a抗体水平，产生了均衡的Th1/Th2型免疫应答。当对两种不同免疫途径的小鼠血清进行ELISA分析，结果发现，滴鼻与肌肉注射T4-VLP诱导的系统性免疫抗体水平相似。
3)滴鼻与肌肉注射3M2e-T4 VLP诱导相似水平的系统性细胞免疫反应
为了评估T4-VLP经不同免疫途径诱导的系统性细胞免疫反应，我们分离免疫后小鼠脾的淋巴细胞，在M2e混合肽刺激后，通过检测T细胞受体依赖性激活诱导标记(AIM)(CD134+CD25+)来评估小鼠脾脏中M2e特异性CD4+T细胞水平。
具体方法如下：
①分离脾淋巴细胞：在第三次免疫结束后第10天，对鼻内免疫组小鼠及肌肉注射3M2e-T4、T4组小鼠进行脱颈处死，取出脾脏，将脾脏置于含4mL小鼠淋巴细胞分离液的6孔板中，用10mL注射器内芯轻轻研磨，使脾细胞通过70μm细胞网筛；研磨充分后，将单细胞悬液转移到15mL离心管中，在细胞悬液顶层轻轻覆盖0.5mL无血清RPMI 1640培养基。用水平离心机，室温，800g离心30min。小心吸出淋巴细胞层并置于15mL细胞离心管中，加入10mL无血清培养基RPMI 1640培养基，轻轻颠倒清洗细胞；250g，4℃离心10min，弃掉上清，收集得到脾淋巴细胞。
②M2e肽刺激脾淋巴细胞：将分离得到的脾淋巴细胞用0.4％的台盼蓝染色后用细胞计数板进行活细胞计数，将分离得到的脾和肺淋巴细胞以1×106个/孔接种到24孔板中，以10μg/mL的终浓度将M2e混合多肽加入孔中，在CO2培养箱中刺激44h-46h；刺激结束后，回收细胞，用适量PBS重悬，250g离心10min，洗涤细胞2次后用细胞计数板进行活细胞计数，调整细胞密度。
③淋巴细胞染色：将刺激后淋巴细胞按照100μL/管的体积(≤1×106cells/100μL)分至流式管中，加入FCR，在4℃封闭15min后，用荧光标记的抗体进行染色，4℃避光孵育20min；加入流式细胞染色缓冲液重悬细胞，250g，4℃，离心10min，重复3次；加入适量的流式细胞染色缓冲液重悬细胞；通过流式细胞仪进行分析。所用荧光标记单抗的信息如下：
Figure BDA0003666471110000161
结果显示，与鼻内免疫对照组(PBS、T4、3M2e)相比，鼻内免疫3M2e-T4 VLP能有效地诱导M2e特异CD4+T细胞免疫反应(图12A)。另外，肌肉注射3M2e-T4也诱导了高水平的M2e特异性CD4+T细胞免疫反应，其与鼻内免疫3M2e-T4 VLP诱导的M2e特异性CD4+T细胞水平相当(图12B)。这说明T4-VLP经过两种不同免疫途径诱导相似水平的系统性细胞免疫反应。
5.T4-VLP作为鼻内递送载体诱导肺黏膜免疫反应
1)鼻内免疫3M2e-T4诱导产生黏膜抗体水平
对免疫后第10天的小鼠进行安乐死，收集支气管肺泡灌注液，通过ELISA的方法监测抗原特异性IgG与IgA抗体水平，其中，黏膜分泌型IgA(SIgA)被证明在局部黏膜免疫反应中发挥重要作用。结果发现与鼻内免疫对照组(PBS、T4及3M2e)相比，鼻内免疫3M2e-T4 VLP能够诱导高水平的M2e特异性IgA与IgG抗体(图13A、13B)。与肌肉注射3M2e-T4 VLP组小鼠相比，两种不同免疫方式诱导相似水平的M2e特异性黏膜局部IgG抗体(图13C),但肌肉注射诱导产生黏膜IgA抗体能力不足(图13D)。综上所述，与肌肉注射相比，T4-VLP作为鼻内递送载体能诱导产生高水平的局部黏膜抗体。
2)鼻内免疫3M2e-T4诱导肺细胞免疫反应
呼吸道黏膜是呼吸道病毒的主要入侵位点，黏膜表面具有丰富的免疫细胞，发生在呼吸道黏膜的抗原特异性免疫记忆能够对感染做出准确快速的反应，从而有利于呼吸道病毒的早期清除，这种免疫记忆的产生对提供长久的保护至关重要。
因此，我们利用AIM法测定肺局部M2e特异性CD4+T细胞水平。在第3次免疫后第10天，断颈处死小鼠后，打开胸腔取出肺脏，置于含1mg/mL胶原酶D和20U/mL DNAseⅠ的1mL完全RPMI培养基，并用无菌剪刀剪碎，37℃培养箱中孵育2h后将消化后组织用10mL注射器内芯轻轻研磨，使其通过70μm的细胞网筛，将获得的单细胞悬液置于Percoll细胞密度梯度分离液(下层为7mL 80％Percoll细胞分离液，上层为6mL 40％Percoll细胞分离液)的最上层，室温，1000g，离心20min后，收集分离层中的淋巴细胞，用10mL无血清RPMI 1640洗涤两次后，250g离心10分钟。用1mL RPMI完全培养基(RPMI+10％FBS+1/100双抗)重悬，最后用细胞计数板进行活细胞计数，肺淋巴细胞的刺激与染色参考上述4-3，流式细胞分析使用的荧光标记抗体信息同：
AIM法分析抗原特异性CD4+T细胞水平结果显示，与鼻内免疫PBS、T4和3M2e可溶性抗原相比，鼻内免疫3M2e-T4的小鼠肺中含有显著更高水平的抗原特异性CD4+T细胞(图14A)。与肌肉注射3M2e-T4组小鼠相比，鼻内免疫的小鼠肺中也含有显著更高水平的抗原特异性CD4+T细胞(图14B)。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种重组T4噬菌体及其在制备流感病毒鼻内递送VLP疫苗中的应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人流感病毒(influenza virus)
<400> 1
atgagcctgc tgaccgaagt ggaaaccccg attcgtaacg aatggggctg ccgttgcaac 60
gatagcagcg at 72
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> 猪流感病毒(Swine influenza virus)
<400> 2
atgagcctgc tgaccgaagt ggaaaccccg acccgtagcg aatgggaatg ccgttgcagc 60
gatagcagcg at 72
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 禽流感病毒(avian influenza virus)
<400> 3
atgagcctgc tgaccgaagt ggaaaccccg acccgtaacg aatgggaatg ccgttgcagc 60
gatagcagcg at 72
<210> 4
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcggcagca gcggcggcag cagcatgagc ctgctgaccg aagtggaaac cccgattcgt 60
aacgaatggg gctgccgttg caacgatagc agcgatggcg gcagcagcgg cggcagcagc 120
atgagcctgc tgaccgaagt ggaaaccccg acccgtagcg aatgggaatg ccgttgcagc 180
gatagcagcg atggcggcag cagcggcggc agcagcatga gcctgctgac cgaagtggaa 240
accccgaccc gtaacgaatg ggaatgccgt tgcagcgata gcagcgat 288
<210> 5
<211> 240
<212> DNA
<213> T4噬菌体(T4 Phage)
<400> 5
atggctagta ctcgcggtta tgttaatatc aaaacatttg agcagaaatt agatggaaat 60
aagaaaattg aaggaaagga aatttctgta gctttccctc tttattctga cgttcacaaa 120
atttctggcg ctcattacca gacattccct tcagaaaaag cagcatattc tacagtatat 180
gaagaaaatc aacgtactga atggattgct gcaaatgaag atttgtggaa agtaactggt 240
<210> 6
<211> 274
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgctcgagt aataactcaa ggactccttc gggagtcctt ttttcattta aaatgattat 60
taatcttgca gatgttgaac agttatctat aaaagctgaa agcgttgatt ttcaatatga 120
tatgtataaa aaggtctgtg aaaaatttac tgactttgag cagtctgttc tttggcaatg 180
tatggaagcc aaaaagaatg aagctcttca taagcattta aatgaaatca ttaaaaagca 240
tttaactaaa tcgccttatc aattatatcg tggtatatca aaatcgacaa aagaactcat 300
taaagattta caagttggag aagtgttttc aacgaacagg gtagattcat ttactactag 360
tttgcataca gcgtgttctt tttcttatgc tgaatatttc actgaaacaa tacttcgttt 420
aaaaactgat aaagctttta attattctga ccatatcagc gatattatac tttc 474
<210> 7
<211> 561
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgctcgagg gcggtggcgg tagcatgagc ctgctgaccg aagtggaaac cccgattcgt 60
aacgaatggg gctgccgttg caacgatagc agcgattaat aactcaagga ctccttcggg 120
agtccttttt tcatttaaaa tgattattaa tcttgcagat gttgaacagt tatctataaa 180
agctgaaagc gttgattttc aatatgatat gtataaaaag gtctgtgaaa aatttactga 240
ctttgagcag tctgttcttt ggcaatgtat ggaagccaaa aagaatgaag ctcttcataa 300
gcatttaaat gaaatcatta aaaagcattt aactaaatcg ccttatcaat tatatcgtgg 360
tatatcaaaa tcgacaaaag aactcattaa agatttacaa gttggagaag tgttttcaac 420
gaacagggta gattcattta ctactagttt gcatacagcg tgttcttttt cttatgctga 480
atatttcact gaaacaatac ttcgtttaaa aactgataaa gcttttaatt attctgacca 540
tatcagcgat attatacttt c 561
<210> 8
<211> 561
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgctcgagg gcggtggcgg tagcatgagc ctgctgaccg aagtggaaac cccgacccgt 60
agcgaatggg aatgccgttg cagcgatagc agcgattaat aactcaagga ctccttcggg 120
agtccttttt tcatttaaaa tgattattaa tcttgcagat gttgaacagt tatctataaa 180
agctgaaagc gttgattttc aatatgatat gtataaaaag gtctgtgaaa aatttactga 240
ctttgagcag tctgttcttt ggcaatgtat ggaagccaaa aagaatgaag ctcttcataa 300
gcatttaaat gaaatcatta aaaagcattt aactaaatcg ccttatcaat tatatcgtgg 360
tatatcaaaa tcgacaaaag aactcattaa agatttacaa gttggagaag tgttttcaac 420
gaacagggta gattcattta ctactagttt gcatacagcg tgttcttttt cttatgctga 480
atatttcact gaaacaatac ttcgtttaaa aactgataaa gcttttaatt attctgacca 540
tatcagcgat attatacttt c 561
<210> 9
<211> 561
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgctcgagg gcggtggcgg tagcatgagc ctgctgaccg aagtggaaac cccgacccgt 60
aacgaatggg aatgccgttg cagcgatagc agcgattaat aactcaagga ctccttcggg 120
agtccttttt tcatttaaaa tgattattaa tcttgcagat gttgaacagt tatctataaa 180
agctgaaagc gttgattttc aatatgatat gtataaaaag gtctgtgaaa aatttactga 240
ctttgagcag tctgttcttt ggcaatgtat ggaagccaaa aagaatgaag ctcttcataa 300
gcatttaaat gaaatcatta aaaagcattt aactaaatcg ccttatcaat tatatcgtgg 360
tatatcaaaa tcgacaaaag aactcattaa agatttacaa gttggagaag tgttttcaac 420
gaacagggta gattcattta ctactagttt gcatacagcg tgttcttttt cttatgctga 480
atatttcact gaaacaatac ttcgtttaaa aactgataaa gcttttaatt attctgacca 540
tatcagcgat attatacttt c 561
<210> 10
<211> 6325
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgagcaaac tggaaaaatt tacgaattgt tatagcctgt ccaagaccct gcgtttcaaa 60
gccatccccg ttggcaaaac ccaggagaat attgataata aacgtctgct ggttgaggat 120
gaaaaaagag cagaagacta taagggagtc aaaaaactgc tggatcggta ctacctgagc 180
tttataaatg acgtgctgca tagcattaaa ctgaaaaatc tgaataacta tattagtctg 240
ttccgcaaga aaacccgaac agagaaagaa aataaagagc tggaaaacct ggagatcaat 300
ctgcgtaaag agatcgcaaa agcttttaaa ggaaatgaag gttataaaag cctgttcaaa 360
aaagacatta ttgaaaccat cctgccggaa tttctggatg ataaagacga gatagcgctc 420
gtgaacagct tcaacgggtt cacgaccgcc ttcacgggct ttttcgataa cagggaaaat 480
atgttttcag aggaagccaa aagcacctcg atagcgttcc gttgcattaa tgaaaatttg 540
acaagatata tcagcaacat ggatattttc gagaaagttg atgcgatctt tgacaaacat 600
gaagtgcagg agattaagga aaaaattctg aacagcgatt atgatgttga ggattttttc 660
gagggggaat tttttaactt tgtactgaca caggaaggta tagatgtgta taatgctatt 720
atcggcgggt tcgttaccga atccggcgag aaaattaagg gtctgaatga gtacatcaat 780
ctgtataacc aaaagaccaa acagaaactg ccaaaattca aaccgctgta caagcaagtc 840
ctgagcgatc gggaaagctt gagcttttac ggtgaaggtt ataccagcga cgaggaggta 900
ctggaggtct ttcgcaatac cctgaacaag aacagcgaaa ttttcagctc cattaaaaag 960
ctggagaaac tgtttaagaa ttttgacgag tacagcagcg caggtatttt tgtgaagaac 1020
ggacctgcca taagcaccat tagcaaggat atttttggag agtggaatgt tatccgtgat 1080
aaatggaacg cggaatatga tgacatacac ctgaaaaaga aggctgtggt aactgagaaa 1140
tatgaagacg atcgccgcaa aagctttaaa aaaatcggca gctttagcct ggagcagctg 1200
caggaatatg cggacgccga cctgagcgtg gtcgagaaac tgaaggaaat tattatccaa 1260
aaagtggatg agatttacaa ggtatatggt agcagcgaaa aactgtttga tgcggacttc 1320
gttctggaaa aaagcctgaa aaaaaatgat gctgttgttg cgatcatgaa agacctgctc 1380
gatagcgtta agagctttga aaattacatt aaagcattct ttggcgaggg caaagaaaca 1440
aacagagacg aaagctttta tggcgacttc gtcctggctt atgacatcct gttgaaggta 1500
gatcatatat atgatgcaat tcgtaattac gtaacccaaa agccgtacag caaagataag 1560
ttcaaactgt atttccagaa cccgcagttt atgggtggct gggacaaaga caaggagaca 1620
gactatcgcg ccactattct gcgttacggc agcaagtact atctcgccat catggacaaa 1680
aaatatgcaa agtgtctgca gaaaatcgat aaagacgacg tgaacggaaa ttacgaaaag 1740
attaattata agctgctgcc agggcccaac aagatgttac cgaaagtatt tttttccaaa 1800
aaatggatgg catactataa cccgagcgag gatatacaga agatttacaa aaatgggacc 1860
ttcaaaaagg gggatatgtt caatctgaat gactgccaca aactgatcga tttttttaaa 1920
gatagcatca gccgttatcc taaatggtca aacgcgtatg attttaattt ctccgaaacg 1980
gagaaatata aagacattgc tggtttctat cgcgaagtcg aagaacaggg ttataaagtt 2040
agctttgaat cggccagcaa gaaagaggtt gataaactgg tggaggaggg taagctgtat 2100
atgtttcaga tttataacaa agactttagc gacaaaagcc acggtactcc taatctgcat 2160
acgatgtact ttaaactgct gtttgatgag aataaccacg gccaaatccg tctctccggt 2220
ggagcagaac tttttatgcg gcgtgcgagc ctaaaaaagg aagaactggt ggtgcatccc 2280
gccaacagcc cgattgctaa caaaaatcca gataatccta agaagaccac cacactgtcg 2340
tacgatgtct ataaggataa acgtttctcg gaagaccagt atgaattgca tataccgata 2400
gcaattaata aatgcccaaa aaacattttc aaaatcaaca ctgaagttcg tgtgctgctg 2460
aaacatgatg ataatccgta tgtgatcgga attgaccgtg gggagagaaa tctgctgtat 2520
attgtagtcg ttgatggcaa gggcaacatc gttgagcagt atagcctgaa tgaaataatt 2580
aataatttta acggtatacg tattaaaacc gactatcata gcctgctgga taaaaaggag 2640
aaagagcgtt ttgaggcacg ccaaaattgg acgagcatcg aaaacatcaa ggaactgaag 2700
gcaggatata tcagccaagt agtccataaa atctgtgaac tggtggagaa gtacgacgct 2760
gtcattgccc tggaagacct caatagcggc tttaaaaaca gccgggtgaa ggtggagaaa 2820
caggtatacc aaaagtttga aaagatgctc attgataagc tgaactatat ggttgataaa 2880
aagagcaacc cgtgcgccac tggcggtgca ctgaaagggt accaaattac caataaattt 2940
gaaagcttta aaagcatgag cacgcagaat gggtttattt tttatatacc agcatggctg 3000
acgagcaaga ttgaccccag cactggtttt gtcaatctgc tgaaaaccaa atacacaagc 3060
attgcggata gcaaaaaatt tatttcgagc ttcgaccgta ttatgtatgt tccggaggaa 3120
gatctgtttg aatttgccct ggattataaa aacttcagcc gcaccgatgc agattatatc 3180
aaaaaatgga agctgtacag ttatggtaat cgtatacgta tcttccgtaa tccgaagaaa 3240
aacaatgtgt tcgattggga agaggtctgt ctgaccagcg cgtataaaga actgttcaac 3300
aagtacggaa taaattatca gcaaggtgac attcgcgcac tgctgtgtga acagtcagat 3360
aaagcatttt atagcagctt tatggcgctg atgagcctga tgctccagat gcgcaacagc 3420
ataaccggtc gcacagatgt tgactttctg atcagccctg tgaagaatag cgacggcatc 3480
ttctacgatt ccaggaacta tgaagcacag gaaaacgcta ttctgcctaa aaatgccgat 3540
gccaacggcg cctataatat tgcacggaag gttctgtggg cgattggaca gttcaagaaa 3600
gcggaagatg agaagctgga taaggtaaaa attgctatta gcaataagga atggctggag 3660
tacgcacaga catcggttaa acactgagat acttctattc tactctgact gcaaaccaaa 3720
aaaacaagcg ctttcaaaac gcttgtttta tcatttttag ggaaattaat ctcttaatcc 3780
ttttatcatt ctacatttag gcgctgccat cttgggacaa tgaaaacgtt agtcatggcg 3840
cgccttgacg gctagctcag tcctaggtac agtgctagct taatctcgag gtttcaaaga 3900
ttaaataatt tctactaagt gtagattaac gatgatatga tagcttctgg tttcaaagat 3960
taaataattt ctactaagtg tagatagatg ttagaagata atcattctga attctgtaag 4020
ctttgagacc caagcccggc cggcctaagg cgatgccccc tcgacctcga tcagggaggc 4080
gttcaggacg actcacaaag aaagccgggc aatgcccggc tttttccacg cctcctgggc 4140
tgacttcagg tgctacattt gaagagataa attgcactga aatctagagc ggttcagtag 4200
aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatcttt tgccctgtaa 4260
acgaaaaaac cacctgggga ggtggtttga tcgaaggtta agtcagttgg ggaactgctt 4320
aaccgtggta actggctttc gcagagcaca gcaaccaaat ctgtccttcc agtgtagccg 4380
gactttggcg cacacttcaa gagcaaccgc gtgtttagct aaacaaatcc tctgcgaact 4440
cccagttacc aatggctgct gccagtggcg ttttaccgtg cttttccggg ttggactcaa 4500
gtgaacagtt accggataag gcgcagcagt cgggctgaac ggggagttct tgcttacagc 4560
ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgagc cgagatacca gtgtgtgagc tatgagaaag 4620
cgccacactt cccgtaaggg agaaaggcgg aacaggtatc cggtaaacgg cagggtcgga 4680
acaggagagc gcaagaggga gcgacccgcc ggaaacggtg gggatcttta agtcctgtcg 4740
ggtttcgccc gtactgtcag attcatggtt gagcctcacg gctcccacag atgcaccgga 4800
aaagcgtctg tttatgtgaa ctctggcagg agggcggagc ctatggaaaa acgccaccgg 4860
cgcggccctg ctgttttgcc tcacatgtta gtcccctgct tatccacgga atctgtgggt 4920
aactttgtat gtgtccgcag cgcccgccgc agtctcacgc ccggagcgta gcgaccgagt 4980
gagctagcta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 5040
taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgaggga agcggtgatc 5100
gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg 5160
acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt 5220
gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg 5280
atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta 5340
gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa 5400
ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga gccagccacg 5460
atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta 5520
ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta 5580
aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta 5640
gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat 5700
gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa 5760
gctagacagg cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg 5820
gaagaatttg tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataatgtcta 5880
acaattcgtt caagccgagg ggccgcaaga tccggccacg atgacccggt cgtcggttca 5940
gggcagggta ccaggcacgc ctaaccgtca gtgagattgg atgagtgaac gatattgatc 6000
gagaagagcc ctgcgcagcc gctgccgtgc ctgcaggaag caacggcccg gagggtggcg 6060
ggcaggacgc ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga 6120
tggccttttt gcgtttctac aaactctgct agcttctaga gcacagctaa caccacgtcg 6180
tccctatctg ctgccctagg tctatgagtg gttgctggat aactttacgg gcatgcataa 6240
ggctcgtatg atatattcag gctgaccaca acggtttccc tctacaaata attttgttta 6300
acttttacta gaggaggagg caaaa 6325
<210> 11
<211> 2216
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcataagggg cttcggcccc tttcttcatt ttgaaagcac acaaaacaca atcagaaaat 60
gatgtatata atggcaccaa ctcgataaca tgagattgat tatgagaact gaggttgtgg 120
tggttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 180
atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 240
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 300
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 360
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 420
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 480
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 540
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 600
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 660
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 720
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 780
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 840
agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 900
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 960
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 1020
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 1080
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 1140
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 1200
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 1260
cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 1320
gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 1380
gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 1440
tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 1500
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 1560
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 1620
aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 1680
atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 1740
tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 1800
catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 1860
aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 1920
tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 1980
gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 2040
tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 2100
tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 2160
taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcc 2216
<210> 12
<211> 516
<212> DNA
<213> T4噬菌体(T4 Phage)
<400> 12
aataggcgta tcacgaggcc tgatgctgct gatgccgcag agggattaaa atatgacgat 60
gaagaagtca atccagaagc agcacttctg attgattctc cgattaaatc tgacattaaa 120
attgaagtag tagaaacgga taaaattcct gaaaataccg atgttttgat tgaagatact 180
ccttttgttg aagaaaaatt cgaacaggct gtagctgaga ttattgaatc tgaaaagccg 240
tctgtattta ctcttccgga aaactttagt ccgaatcttc aactgattgg aaaaaatcta 300
ggattctgta ctgttccttg gtggatttat caatggattg ctgaaactcc tgattggaaa 360
tctcacccaa ctagttttga acatgcgtca gcacaccaaa ctttatttag cttaatttat 420
tacattaatc gcgatggatc agttttaatt cgtgaaacac gcaactcttc tttcgtaaca 480
ttaaaataag gataactttc ataaggggct tcggcc 516
<210> 13
<211> 6325
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgagcaaac tggaaaaatt tacgaattgt tatagcctgt ccaagaccct gcgtttcaaa 60
gccatccccg ttggcaaaac ccaggagaat attgataata aacgtctgct ggttgaggat 120
gaaaaaagag cagaagacta taagggagtc aaaaaactgc tggatcggta ctacctgagc 180
tttataaatg acgtgctgca tagcattaaa ctgaaaaatc tgaataacta tattagtctg 240
ttccgcaaga aaacccgaac agagaaagaa aataaagagc tggaaaacct ggagatcaat 300
ctgcgtaaag agatcgcaaa agcttttaaa ggaaatgaag gttataaaag cctgttcaaa 360
aaagacatta ttgaaaccat cctgccggaa tttctggatg ataaagacga gatagcgctc 420
gtgaacagct tcaacgggtt cacgaccgcc ttcacgggct ttttcgataa cagggaaaat 480
atgttttcag aggaagccaa aagcacctcg atagcgttcc gttgcattaa tgaaaatttg 540
acaagatata tcagcaacat ggatattttc gagaaagttg atgcgatctt tgacaaacat 600
gaagtgcagg agattaagga aaaaattctg aacagcgatt atgatgttga ggattttttc 660
gagggggaat tttttaactt tgtactgaca caggaaggta tagatgtgta taatgctatt 720
atcggcgggt tcgttaccga atccggcgag aaaattaagg gtctgaatga gtacatcaat 780
ctgtataacc aaaagaccaa acagaaactg ccaaaattca aaccgctgta caagcaagtc 840
ctgagcgatc gggaaagctt gagcttttac ggtgaaggtt ataccagcga cgaggaggta 900
ctggaggtct ttcgcaatac cctgaacaag aacagcgaaa ttttcagctc cattaaaaag 960
ctggagaaac tgtttaagaa ttttgacgag tacagcagcg caggtatttt tgtgaagaac 1020
ggacctgcca taagcaccat tagcaaggat atttttggag agtggaatgt tatccgtgat 1080
aaatggaacg cggaatatga tgacatacac ctgaaaaaga aggctgtggt aactgagaaa 1140
tatgaagacg atcgccgcaa aagctttaaa aaaatcggca gctttagcct ggagcagctg 1200
caggaatatg cggacgccga cctgagcgtg gtcgagaaac tgaaggaaat tattatccaa 1260
aaagtggatg agatttacaa ggtatatggt agcagcgaaa aactgtttga tgcggacttc 1320
gttctggaaa aaagcctgaa aaaaaatgat gctgttgttg cgatcatgaa agacctgctc 1380
gatagcgtta agagctttga aaattacatt aaagcattct ttggcgaggg caaagaaaca 1440
aacagagacg aaagctttta tggcgacttc gtcctggctt atgacatcct gttgaaggta 1500
gatcatatat atgatgcaat tcgtaattac gtaacccaaa agccgtacag caaagataag 1560
ttcaaactgt atttccagaa cccgcagttt atgggtggct gggacaaaga caaggagaca 1620
gactatcgcg ccactattct gcgttacggc agcaagtact atctcgccat catggacaaa 1680
aaatatgcaa agtgtctgca gaaaatcgat aaagacgacg tgaacggaaa ttacgaaaag 1740
attaattata agctgctgcc agggcccaac aagatgttac cgaaagtatt tttttccaaa 1800
aaatggatgg catactataa cccgagcgag gatatacaga agatttacaa aaatgggacc 1860
ttcaaaaagg gggatatgtt caatctgaat gactgccaca aactgatcga tttttttaaa 1920
gatagcatca gccgttatcc taaatggtca aacgcgtatg attttaattt ctccgaaacg 1980
gagaaatata aagacattgc tggtttctat cgcgaagtcg aagaacaggg ttataaagtt 2040
agctttgaat cggccagcaa gaaagaggtt gataaactgg tggaggaggg taagctgtat 2100
atgtttcaga tttataacaa agactttagc gacaaaagcc acggtactcc taatctgcat 2160
acgatgtact ttaaactgct gtttgatgag aataaccacg gccaaatccg tctctccggt 2220
ggagcagaac tttttatgcg gcgtgcgagc ctaaaaaagg aagaactggt ggtgcatccc 2280
gccaacagcc cgattgctaa caaaaatcca gataatccta agaagaccac cacactgtcg 2340
tacgatgtct ataaggataa acgtttctcg gaagaccagt atgaattgca tataccgata 2400
gcaattaata aatgcccaaa aaacattttc aaaatcaaca ctgaagttcg tgtgctgctg 2460
aaacatgatg ataatccgta tgtgatcgga attgaccgtg gggagagaaa tctgctgtat 2520
attgtagtcg ttgatggcaa gggcaacatc gttgagcagt atagcctgaa tgaaataatt 2580
aataatttta acggtatacg tattaaaacc gactatcata gcctgctgga taaaaaggag 2640
aaagagcgtt ttgaggcacg ccaaaattgg acgagcatcg aaaacatcaa ggaactgaag 2700
gcaggatata tcagccaagt agtccataaa atctgtgaac tggtggagaa gtacgacgct 2760
gtcattgccc tggaagacct caatagcggc tttaaaaaca gccgggtgaa ggtggagaaa 2820
caggtatacc aaaagtttga aaagatgctc attgataagc tgaactatat ggttgataaa 2880
aagagcaacc cgtgcgccac tggcggtgca ctgaaagggt accaaattac caataaattt 2940
gaaagcttta aaagcatgag cacgcagaat gggtttattt tttatatacc agcatggctg 3000
acgagcaaga ttgaccccag cactggtttt gtcaatctgc tgaaaaccaa atacacaagc 3060
attgcggata gcaaaaaatt tatttcgagc ttcgaccgta ttatgtatgt tccggaggaa 3120
gatctgtttg aatttgccct ggattataaa aacttcagcc gcaccgatgc agattatatc 3180
aaaaaatgga agctgtacag ttatggtaat cgtatacgta tcttccgtaa tccgaagaaa 3240
aacaatgtgt tcgattggga agaggtctgt ctgaccagcg cgtataaaga actgttcaac 3300
aagtacggaa taaattatca gcaaggtgac attcgcgcac tgctgtgtga acagtcagat 3360
aaagcatttt atagcagctt tatggcgctg atgagcctga tgctccagat gcgcaacagc 3420
ataaccggtc gcacagatgt tgactttctg atcagccctg tgaagaatag cgacggcatc 3480
ttctacgatt ccaggaacta tgaagcacag gaaaacgcta ttctgcctaa aaatgccgat 3540
gccaacggcg cctataatat tgcacggaag gttctgtggg cgattggaca gttcaagaaa 3600
gcggaagatg agaagctgga taaggtaaaa attgctatta gcaataagga atggctggag 3660
tacgcacaga catcggttaa acactgagat acttctattc tactctgact gcaaaccaaa 3720
aaaacaagcg ctttcaaaac gcttgtttta tcatttttag ggaaattaat ctcttaatcc 3780
ttttatcatt ctacatttag gcgctgccat cttgggacaa tgaaaacgtt agtcatggcg 3840
cgccttgacg gctagctcag tcctaggtac agtgctagct taatctcgag gtttcaaaga 3900
ttaaataatt tctactaagt gtagatggag ttatatcaac tgtaaaagtg tttcaaagat 3960
taaataattt ctactaagtg tagatctgct acacccagtg gtcaaactga attctgtaag 4020
ctttgagacc caagcccggc cggcctaagg cgatgccccc tcgacctcga tcagggaggc 4080
gttcaggacg actcacaaag aaagccgggc aatgcccggc tttttccacg cctcctgggc 4140
tgacttcagg tgctacattt gaagagataa attgcactga aatctagagc ggttcagtag 4200
aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatcttt tgccctgtaa 4260
acgaaaaaac cacctgggga ggtggtttga tcgaaggtta agtcagttgg ggaactgctt 4320
aaccgtggta actggctttc gcagagcaca gcaaccaaat ctgtccttcc agtgtagccg 4380
gactttggcg cacacttcaa gagcaaccgc gtgtttagct aaacaaatcc tctgcgaact 4440
cccagttacc aatggctgct gccagtggcg ttttaccgtg cttttccggg ttggactcaa 4500
gtgaacagtt accggataag gcgcagcagt cgggctgaac ggggagttct tgcttacagc 4560
ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgagc cgagatacca gtgtgtgagc tatgagaaag 4620
cgccacactt cccgtaaggg agaaaggcgg aacaggtatc cggtaaacgg cagggtcgga 4680
acaggagagc gcaagaggga gcgacccgcc ggaaacggtg gggatcttta agtcctgtcg 4740
ggtttcgccc gtactgtcag attcatggtt gagcctcacg gctcccacag atgcaccgga 4800
aaagcgtctg tttatgtgaa ctctggcagg agggcggagc ctatggaaaa acgccaccgg 4860
cgcggccctg ctgttttgcc tcacatgtta gtcccctgct tatccacgga atctgtgggt 4920
aactttgtat gtgtccgcag cgcccgccgc agtctcacgc ccggagcgta gcgaccgagt 4980
gagctagcta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 5040
taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgaggga agcggtgatc 5100
gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg 5160
acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt 5220
gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg 5280
atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta 5340
gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa 5400
ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga gccagccacg 5460
atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta 5520
ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta 5580
aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta 5640
gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat 5700
gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa 5760
gctagacagg cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg 5820
gaagaatttg tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataatgtcta 5880
acaattcgtt caagccgagg ggccgcaaga tccggccacg atgacccggt cgtcggttca 5940
gggcagggta ccaggcacgc ctaaccgtca gtgagattgg atgagtgaac gatattgatc 6000
gagaagagcc ctgcgcagcc gctgccgtgc ctgcaggaag caacggcccg gagggtggcg 6060
ggcaggacgc ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga 6120
tggccttttt gcgtttctac aaactctgct agcttctaga gcacagctaa caccacgtcg 6180
tccctatctg ctgccctagg tctatgagtg gttgctggat aactttacgg gcatgcataa 6240
ggctcgtatg atatattcag gctgaccaca acggtttccc tctacaaata attttgttta 6300
acttttacta gaggaggagg caaaa 6325

Claims (7)

1.一种重组T4噬菌体，其特征在于构建方法如下：
1)将流感病毒M2e蛋白目的片段融合到T4噬菌体Soc蛋白C端，得到供体质粒；
2)将靶向T4噬菌体ModB基因的LbCas12a编辑载体和步骤1)得到的供体质粒共转化至宿主菌，得到同时含有CRISPR质粒和供体质粒的重组工程菌；
3)用野生型T4噬菌体Hoc、Soc基因缺失突变体感染上述重组工程菌，得到衣壳表面展示流感病毒M2e蛋白的重组T4噬菌体。
2.如权利要求1所述的重组T4噬菌体，其特征在于：所述流感病毒为人流感病毒、猪流感病毒、禽流感病毒。
3.如权利要求2所述的重组T4噬菌体，其特征在于：所述M2e蛋白目的片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1-4所示，分别为人流感病毒M2e蛋白目的片段、猪流感病毒M2e蛋白目的片段、禽流感病毒M2e蛋白目的片段以及以上三种流感病毒M2e蛋白的串联片段。
4.如权利要求1所述的重组T4噬菌体，其特征在于：所述T4噬菌体Soc基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
5.如权利要求1所述的重组T4噬菌体，其特征在于：所述供体质粒的载体是pUC质粒。
6.如权利要求1所述的重组T4噬菌体，其特征在于：所述宿主菌是大肠杆菌。
7.权利要求1-6任一项所述的重组T4噬菌体在制备流感病毒鼻内递送VLP疫苗中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101015691A (zh) * 2006-11-14 2007-08-15 中国医学科学院医学生物学研究所 重组噬菌体流感疫苗
CN111926030A (zh) * 2020-07-13 2020-11-13 华中农业大学 一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体及其应用
CN113061620A (zh) * 2021-03-16 2021-07-02 华中农业大学 一种t4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统及其构建方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101015691A (zh) * 2006-11-14 2007-08-15 中国医学科学院医学生物学研究所 重组噬菌体流感疫苗
CN111926030A (zh) * 2020-07-13 2020-11-13 华中农业大学 一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体及其应用
CN113061620A (zh) * 2021-03-16 2021-07-02 华中农业大学 一种t4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONG， JUNHUA等: "Engineering T4 bacteriophage for in vivo display by type V CRISPR-cas genome editing", 《ACS SYNTHETIC BIOLOGY》, vol. 10, no. 10 *
MENGLING LI等: ""Bacteriophage T4 vaccine platform for next-generation influenza vaccine development"", 《FRONTIERS IN IMMUNOLOGY》, vol. 12, pages 2 - 4 *

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