PT91520A - Processo para a preparacao de proteinas por expressao de proteinas homologas e heterologas funcionais a partir da membrana exterior de e. coli e de outras bacterias gram-negativas - Google Patents

Description

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Descrição referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg, República Federal Alemã, (inventores: Prof. Dr. Gerd Ho-bom, Susanne Pistor e Norbert Arnold, residentes na Alemanha Ocidental), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS POR EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HOMÓLOGAS E HETERÓLOGAS FUNCIONAIS A PARTIR DA MEMBRANA EXTERIOR DE E. COLI E DE OUTRAS BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS".

Descrição A presente invenção refere-se a proteínas de fusão com a proteína A da membrana exterior (OmpA) de bactérias gram-nega-tivas e a processos para a expressão de proteínas homólogas e heterólogas na membrana exterior de E. coli e de outras bactérias gram-negativas. Deste modo as proteínas a expressar são inseridas sob a forma do seu ADNc na proteína A da membrana exterior (OmpA) no domínio dos codões de um dos quatro pontos de vértice exteriores desta proteína. Para além disso estas proteínas podem ser adicionalmente integradas numa haste formada a partir da extremidade aminoterminal e carboxiterminal da molécula de hemaglutinina do vírus da gripe e que é integrada por seu lado num ponto de vértice da OmpA. As proteínas de fusão são expressas nas bactérias de modo controlado.

Para um isolamento melhorado das proteínas de interesse podem ser integradas adicionalmente as respectivas sequências adjacentes sensíveis a proteases ou a colagenases. A OmpA pertence ao grupo de proteínas da membrana do invólucro de E. coli ou de outras bactérias gram-negativas como ANA * 1

a Shigella dysenteriae e serve - enquanto que até agora não é conhecida qualquer função - em alguns bacteriófagos e colicinas como estrutura receptora para a infecção ou para a intoxicação. A partir da sequência da proteína (R. Chen et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, TJ_, 4592 - 4596) e a partir da ocorrência de mutações para a resistência a fagos predominantemente em posições perto dos ácidos aminados (AA) 25, 70, 110 e 154 da OmpA de E. coli foi proposto um modelo segundo o qual a OmpA atravessa oito vezes a membrana celular e as posições o.g. dos quatro pontos de vértice apresentam a curva "para fora". Em seguida utiliza-se a numeração dos AA de acordo com MORONA et al. (R. Morona et al. (1985) J. Bacteriology 164, 539 - 543) que toma como base a proteína madura de E. coli sem peptídeo guia. FREUNDL et al. (R. Freundl et al. (1986) J. Mol. Biol. 188, 491 - 494) inseriram peptídeos curtos de cerca de 15 AA codificados por sequências de adaptadores e de ligantes nas posições 154 e 162 da OmpA de E. coli a fim de demonstrar que a inserção em 154 é sensível a proteinase K e portanto é acessível a partir do exterior, enquanto que a inserção em 162 - portanto na região transmembrana - não foi cindida. Neste trabalho é finalmente discutida a possibilidade de integrar por meio de inserções peptídeos curtos na superfície da célula, estando no entanto a aptidão destes peptídeos severamente limitada pelo comprimento e pela sequência de AA. A presente invenção mostra, pelo contrário que não só segmentos de proteínas mais pequenos, como por exemplo determinantes antigénicos (com cerca de 30 AA de comprimento) mas também proteínas inteiras, como por exemplo a hemaglutinina (HA) do vírus A da gripe, a toxina OL de Staphylococcus aureus, a en-donuclease de restrição EcoRI ou o produto do gene lacZ (p-ga-lactosidase) podem ser expressos na membrana de bactérias e podem ser feitos passar para o exterior por inserção na região de uma das posições anteriormente mencionadas, de preferência nas posições de vértice 3 ou 4 (AA 110 ou 154 da OmpA de E. coli ou de OmpA de Shigella dysenteriae, respectivamente). Numa forma preferida de concretização a inserção é adicionalmente efectua-da de modo que a "região de haste" da referida hemaglutinina. 2

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e sem dúvida a respectiva parte lateral ascendente de cerca de 1 até cerca de 50 AA e a respectiva estrutura de base C-termi-nal com cerca de 235 AA envolvem como uma"guarnição interior" a proteína estranha, enquanto que esta se encontra ela própria inserida na proteína OmpA. Por integração de uma sequência cindida de ambos os lados de protease ou de colagenase entre o suporte da OmpA ou de OmpA/HA e a proteína de fusão é possível separar e purificar em casos apropriados a inserção proteica. A inserção de proteínas homólogas ou heterólogas na OmpA pode para além disso ser efectuada em estirpes de E. coli OmpA+ ou OmpA” e ser transferida para outras bactérias gram-negativas como especialmente S. typhi ou S. typhimurium.

Uma vez que as proteínas inseridas são transportadas através da membrana para o exterior durante a tradução, podem ser sintetizadas também do modo anteriormente descrito proteínas de estrutura terciária complicada com a dobragem correcta. Para além disso, é também possível provocar a expressão de proteínas que numa expressão de acordo com técnicas de manipulação genética normais são prejudiciais no citoplasma do hospedeiro ou que não são compatíveis com a célula hospedeira. A expressão de proteínas de fusão decorre nas células hospedeiras de modo controlado com um indutor apropriado.

As células que expressam proteínas apropriadas (por exemplo hemaglutininas dos vírus da gripe ou a proteína VP1 do vírus da doença da boca e dos pés) do modo descrito para o exterior da membrana celular podem ser utilizadas como vacinas orais vivas. A presente invenção refere-se por conseguinte a: (a) Um processo para a preparação de proteínas de fusão com OmpA, de preferência sob a forma de uma inserção de uma proteína ou de um peptídeo de interesse numa região dos quatro pontos de vértice exteriores da OmpA, sendo por sua vez especialmente preferida a região do 32. ponto de vértice (posição do AA 110 na OmpA de E. coli ou do AA 115 na OmpA de S. dysenteriae, respectivamente); para a estabilização da estrutura sobre a superfície de E. coli ou de outras bactérias gram-negativas as inserções podem ser flan- 3 queadas por cerca de 1 a 50 AA da extremidade aminoterminal e por cerca de 235 AA dã região carboxiterminal da hemeglu-tinina do vírus da gripe. A fim de facilitar o isolamento pode ser integrada ainda uma "guarnição" de sequências sensíveis a protease ou a colagenase, e (b) Um processo para a preparação de vacinas vivas por utilização das bactérias gram-negativas produzidas com as proteínas de fusão com a OmpA sobre a sua superfície, quando a proteína componente que não é a OmpA é de interesse como imunogénio. A presente invenção é definida mais completamente nas reivindicações e é elucidada mais pormenorizadamente nos exemplos que se seguem.

Exemplos: 1. Síntese de hemaglutinina de vírus A da gripe como proteína de fusão no terceiro ponto de vértice (região das posições de AA 110 e 119) da OmpA de E. coli.

Em primeiro lugar isolou-se o gene da OmpA de E. coli de acordo com CHEN et al. (ver acima) e inseriu-se no vector de expressão pHK236 como se segue. O plasmídèo pHK236 é composto pelo domínio da "origem" do plasmídèo pBR328, por um segmento promotor-terminador-resistência a ampicilina do plas-mídeo pOB3 (E. Amann et al. (1983) Gene 22, 167 - 178) e por um fragmento do gene LacI^ do plasmídèo pJFH8u (J.P. Fíirst et al. (1986) Gene 48, 119 - 131); a construção do plasmídèo pHK236 é apresentada na Figura 1. Para a inserção do gene da OmpA este plasmídèo foi aberto na região de poliligante mpl2 nos locais Smal e Pst I por meio das respectivas endonu-cleases de restrição. O gene da OmpA pode ser integrado após corte com EcoRV (=corte na posição - 104 em pares de bases (pb) a montante relativamente ao codão de início ATG) e Pst I (= corte na posição + 99 a juzante em relação ao codão de terminação TAA) no vector de expressão pHK236 de acordo com métodos normais. No plasmídèo resultante pHS51 o gene da OmpA está separado do seu promotor original por um comprimento inserido de 1243 pb e em vez deste encontra-se fundido ao 4 promotor do vector forte Ptac (E. Amann et al. (1983) ver acima), o qual se encontra sob regulação de repressão do gene lacl, o qual se encontra igualmente no plasmídeo. Na Figura 2 apresentam-se as fases de síntese para o plasmídeo pHS51. 0 gene da OmpA de S. dysenteriae foi isolado de acordo com COLE et al. (S.P. Cole et al. (1980) J. Bacteriol. 149, 145 - 150), foi sequenciado e foi expresso em E. coli. O gene de Shigella é consideravelmente idêntico ao gene de E. coli mas contém, entre outros 19 AA hidrófilos na região do vértice 3 (aproximadamente na posição 110 da proteína de E. coli) em vez de 14 AA como no gene de E. coli. De modo correspondente como para o gene da OmpA de E. coli integrou-se o gene de S. dysenteriae em pHK 236 com o plasmídeo pHS53 como resultado (Fig. 2b); adicionalmente construiu-se um gene híbrido de OmpA no qual a sequência de AA de Shigella se estende das posições 46 a 233 e a proteína integral abrange 330 AA. A construção do conjunto encontra-se representada esquemáticamente na Figura 2c, dando como resultado o plasmídeo pHS56.

Por último integrou-se a seguir ao AA 119 no plasmídeo PHS56 após abertura com a endonuclease Hinfl a seguinte sequência poliadaptadora de 18 pb de comprimento após cisão com Hinfl e

Hinfl Ciai

A A T T TA

5 ' G G T G 3'C C A C C G A T A-g c|t A T- •Gly . Glu . Ser . Ile .

StuI Bell (Hinfl)

-G G -C C

C C T

G A T C A

G G A C T A G

A A TC T G A G TTTAGACTC 3'

Gly . Leu . Ile . Lys . Ser . Glu 5 5*

obteve-se o plasmídeo vector pHS64 (Fig. 2d).

Deste modo os plasmídeos pHS64 e pHS164 (com um domínio pro-motor-/operador melhorado, estando estes elementos trocados em relação aos do plasmídeo vector pHK509 que de resto é igual (Dusterhoft e Kroger; Trabalho de Licenciatura de A. Dusterhõft Universidade de GieJ&en 1987) são apropriados para alojar o gene da hemaglutinina do vírus da gripe. Foi descrita por VERHOEYEN et al. (M. Verhoeyen et al. (1980) Natu-re 286, 771 - 776) uma hemaglutinina híbrida humana do ADNc da gripE do serotipo H3. Depois de separação por corte sob a forma de um fragmento HaelII - BamHI (1542 pb) e de ligação no local de corte aberto correspondente Stul/Bcll na sequência de poliadaptador de 18 pb foi possível obter os referidos plasmídeos pinf4-6 e pinf4-39 (Fig. 3).

Transformaram-se diferentes estirpes de E. coli (por exemplo 490A, HB101) com o gene OmpA+ cromossómico por meio dos plasmídeos referidos anteriormente, e ao mesmo tempo para fins analíticos também a estirpe UH 210.3 (OrnpA-, S.T. Cole et al. (1982), J. Bacteriol. 149, 145 - 150) e a proteína "sandwich1 OmpA/HA/OmpA por indução com isopropiltiogalactósido (IPTG); outras bactérias gram-negativas podem no entanto ser igualmente transformadas e induzidas por meio de IPTG. Após indução foi possível detectar a proteína de fusão OmpA-HA nos géis de proteínas integrais de E. coli, fortamente concentrada como um componente principal das proteínas de membrana da bactéria. Em ambos os casos (transformação com pinf4-6 ou com pinf4-39, respectivamente) a reacção imune com um anticorpo de HA na reacção de mancha imunológica (Western blot) apresenta uma reacção cruzada com HA autêntica para a banda da fusão OmpA/HA.

Foi possível detectar a presença de HA correctamente formada no exterior das células transformadas e induzidas por marcação por iodo com lactoperoxidase, de preferência por cisão com tripsina nas células bacterianas intactas, bem como por um ensaio de imunofluorescência indirecto (IFT). Para esse fim numa primeira fase incubaram-se células induzidas com anti-soro contra HA e em seguida incubaram-se numa segunda 6

fase com anti-anticorpos marcados com fluoresceína. As células induzidas (quase 100% viáveis de acordo com o procedimento de IFT) mostraram uma fluorescência nítida, enquanto que as células não induzidas não foram coradas. 2. Expressão de um domínio de superfície do vírus da doença da boca e dos pés (DBP), serotipo C^K sob a forma de uma proteína de fusão com OmpA sobre a superfície de E. coli e de S. typhi. A sequência de ADN correspondente aos codões 140 a 162 da proteína da superfície virai VP1 (Cheung et al. (1983), J. Virol. 48, 451 - 459) foi sintetizada de novo e foi integrada por clonagem com extremidades Clal-StuI no composto de fusão de OmpA do correspondente vector pHS164 aberto. A sequência de Oligonucleótidos integrada em pHSl64 (pfmdv-1) era a seguinte:

Ciai (AT) (CG ATT GCT GTG CCC AAC TTG AGA GGT GAC CTT-TAA CGA CAC GGG TTG AAC TCT CCA CTG GAA- - CAG GTG TTG GCT CAA AAG GTG GCA CGG ACG CTG- - GTG CAC AAC CGA GTT TTC CAC CGT GCC TGC GAC-

StuI - CCT ACC TCA GG- - GGA TGG AGT CC- A expressão do domínio VPl foi detectada sobre a superfície das correspondentes células induzidas que contêm pfmdv-1 como no Exemplo 1 por meio de IFT. 3. Síntese da toxina ee de Staphylococcus aureus sob a forma de uma proteína de fusão no terceiro ponto de vértice (região das posições do AA 110 ou 119) da OmpA de E. coli. O gene para a toxina 0t de Staphylococcus aureus foi isolado e sequenciado por KEHOE et al. (M. Kehoe et al. (1983) Infect Immuno. 41, 1105 - 1111). Este gene foi incorporado por clonagem por Bhakdi e colaboradores numa forma portátil no plas-mídeo pUC19 sob a designação de pUC19-effox e foi obtido a 7

partir deste plasmídeo por cisão com Ciai e Hinfl em dois fragmentos parcelares, os quais em conjunto com uma ponte oligonucleótida N-terminal em relação a um e C-terminal em relação ao outro possibilitam a reconstrução gradual no quadro da fusão com o gene da OmpA no plasmídeo pHS64 dando origem ao plasmídeo pHS140. A toxina oc pôde, tal como a hemaglutinina, ser detectada no exterior de células de E. coli transformadas do modo habitual com pHS140 por meio de IFT e por marcação com iodo. 4. Aumento da expressão da toxina cC de S. aureus por incorporação adicional na "região haste" da hemaglutinina da gripe* A expressão à superfície da toxina eC de S. aureus pôde ser elevada consideravelmente (cerca de quatro vezes) por meio da incorporação adicional desta proteína na "região haste" do gene da hemaglutinina da gripe. Para este fim ligam-se os codões dos AA 1 a 48 e 279 a 514 da extremidade aminoter-minal ou do domínio carboxiterminal da hemaglutinina no plasmídeo pHS164 ou suprime-se o domínio da "cabeça" médio da HA de pinf4-39 (ver acima) do AA 46 ao 281 e reconstroi-se por meio de um oligonucleótido adaptador na fronteira referida. Para além disso produziu-se um domínio adaptador oligonucleo-tídico estruturalmente apropriado para esse fim na região atribuída da superfície proteica (codões 400 a 409) por permuta contra um segundo oligonucleótido (plasmídio pinf 4-49). Neste integrou-se de modo correspondente ao do Exemplo 2 o gene da toxina 0t sob a forma dum fragmento Nhel-Stul de 950 pb do plasmídeo pHS140. A expressão e a detecção da expressão foram levadas a efeito como no Exemplo 1.

Como exemplos dos chamados "plasmídeos padrão" ou esqueletos vectores apresentam-se na Figura 4 e na Figura 5 e nos Quadros 1 e 2 os plasmídeos pHS164 e pinf4-49. 0 plasmídeo pHS164 contém a guarnição da OmpA e o plasmídeo pinf4-49 contém ainda adicionalmente a guarnição da HA. Nos dois "plasmídeos padrão" encontra-se ainda integrado uma sequência adaptadora oligonucleotídica, a qual possibilita a inserção de genes estranhos. 8 » » Seq. pHS 164

Quadro 1

Sequência do pHS 164 (adaptador no 3Q domínio) 1 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 801 851 901 951 1001 1051 1101 1151 • 1201

-35 tac Promotor -10 AATGAGCTGT TGACAATTAA TCATCGGCTC GTATAATGTG II II II II II II II II II II II II II II

GTATTCGCAG GTGGTGTTGA ATGGGCCATC ACTCCTGAAA TCGCTACCCG TCTGGAATAC CAGTGGACCA ACAACATCGG TGACGCACAC ACCATCGGCA CTCGTCCGGA CAACGGCCTG CTGAGCTTGG GTGTTTCCTA CCGTTTCGGT CAGGGCGAAG CAGCTCCAGT AGTTGCTCCG GCTCCAGCTC CGGCACCGGA AGTACAGACC AAGCACTTCA CTCTGAAGTC TGACGTTCTG TTCAACTTCA ACAAAGCAAC CCTGAAACCG GAAGGTCAGG CTGCTCTGGA TCAGCTGTAC AGCCAGCTGA GCAACCTGGA TCCGAAAGAC GGTTCCGTAG TTGTTCTGGG TTACACCGAC CGCATCGGTT CTGACGCTTA CAACCAGGGT CTGTCCGAGC

AATATTCTGA

TGGAATTGTG

TTCCACATGT

TCCTCTGACC

TCTGACCAGC

CCGCTCACAA

ATATTGAGCA

GATATTCATG

ACAGCTATCG

GGCCGCTCCG

CCCAGTACCA

AACCAACTGG

TGGCTTTGAA

GCGTTGAAAA

CTGGGTTACC

TATGGTTTGG

CGATAGGCCT -Adaptador

AGCGGATAAC

GGAATTGTGA

AGCCAGAAAA

CAGAAAACGA

TTCCACATGT

GATCCCCCGG

GCGTATTTTG

CGATTACAGT

AAAGATAACA

TGACACTGGT

GCGCTGGTGC

ATGGGTTACG

CGGTGCATAC

CAATCACTGA

CGTGCAGACA

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AATTTCACAC

GCGGATAACA

CGATCTTCGT

TCTTCGTCCG

GGAATTCGAG

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GATGATAACG

GGCACTGGCT

CCTGGTACAC

TTCATCGACA

TTTTGGTGGT

ACTGGTTAGG

AAAGCTCAGG

CGACGTGGAC

CCAAAGCTCA

GAGAAAAACC

AGGAAACAGA CCATGCGGAA ATTTGTGGAA TTCTGGCGAA CCGAGAATTC TGGCGAATCC AGAATTCCAC AAATTGTTAT CTCGCCCATC GGTAGAGTTA AACCGTGTTA TCTCGTTGGA

Início ompA AGGCGCAAAA AATGAAAAAG GGTTTCGCTA CCGTAGCGCA TGGTGCTAAA CTGGGCTGGT ACAATGGCCC GACCCATGAA TACCAGGTTA ACCCGTATGT

TCGTATGCCG TACAAAGGCA GCGTTCAGTT GACCGCTAAA GTGTACACTC GTCTGGGTGG CAACAATGTG ACAGGTIgAAT ACGATACCGG CGTTTCTCCG 9

1251 GCCGTGCTCA GTCTGTTGTT GATTACCTGA TCTCCAAAGG TATCCCGGCA 1301 GACAAGATCT CCGCACGTGG TATGGGCGAA TCCAACCCGG TTACTGGCAA 1351 CACCTGTGAC AACGTGAAAC AGCGTGCTGC ACTGATCGAC TGCCTGGCTC 1401 CGGATCGTCG Fim CGTAGAGATC ompA GAAGTTAAAG GTATCAAAGA CGTTGTAACT 1451 CAGCCGCAGG CTTAAGTTCT *** CGTCTGGTAG AAAAACGCTG CTGCGGGTTT 1501 TTTTTTGCCT TTAGTAAATT GAACTGACTT TCGTCAGTTA TTCCTTACCC 1551 AGCAATGCCT GCAGCCCAAG CTTCTGTTTT GGCGGATGAG AGAAGATTTT 1601 CAGCCTGATA CAGATTAAAT CAGAACGCAG AAGCGGTCTG ATAAAACAGA 1651 ATTTGCCTGG CGGCAGTAGC GCGGTGGTCC CACCTGACCC CATGCCGAAC 1701 TCAGAAGTGA AACGCCGTAG CGCCGATGGT AGTGTGGGGT CTCCCCATGC 1751 GAGAGTAGGG AACTGCCAGG CATCAAATAA AACGAAAGGC TCAGTCGAAA 1801 GACTGGGCCT TTCGTTTTAT CTGTTGTTTG TCGGTGAACG CTCTCCTGAG 1851 TAGGACAAAT CCGCCGGGAG CGGATTTGAA CGTTGCGAAG CAACGGCCCG 1901 GAGGGTGGCG GGCAGGACGC CCGCCATAAA CTGCCAGGCA TCAAATTAAG 1951 CAGAAGGCCA TCCTGACGGA TGGCCTTTTT GCGTTTCTAC AAACTCTTTT 2001 GTTTATTTTT CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA 2051 CCCTGATAAA TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA 2101 ACATTTCCGT GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG 2151 TTTTTGCTCA CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG 2201 TTGGGTGCAC GAGTGGGTTA CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT 2251 CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG AAGAACGTTT TCCAATGATG AGCACTTTTA 2301 AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTGTTGACGC CGGGCAAGAG 2351 CAACTCGGTC GCCGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC 2401 ACCAGTCACA GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT 2451 GCAGTGCTGC CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG 2501 ACAACGATCG GAGGACCGAA GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG 2551 GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA ACCGGAGCTG AATGAAGCCA 2601 TACCAAACGA CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGCNGCAAT GGCAACAACG 2651 TTGCGCAAAC TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA 10

2701 ATTAATAGAC TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT 2751 CGGCCCTTCC GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG 2801 CGTGGGTCTC GCGGTATCAT TGCAGCACTG GGGCCAGÂTG GTAAGCCCTC 2851 CCGTATCGTA GTTATCTACA CGACGGGGAG TCAGGCAACT ATGGATGAAC 2901 GAAATAGACA GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA 2951 CTGTCAGACC AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA 3001 TTTTTAATTT AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA 3051 CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA 3101 GAAAAGATCA AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG 3151 CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG 3201 ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG 3251 CAGATACCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT 3301 CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC 3351 CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA 3401 AGACGATAGT TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC 3451 GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC 3501 TACAGCGTGA GCATTGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG 3551 GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA 3601 GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC 3651 ACCTCTGACT TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC 3701 CTATGGAAAA ACGCCAGCAA CGCGGCCCGA GATGCGCCGC GTGCGGCTGC 3751 TGGAGATGGC GGACGCGATG GATATGTTCT GCCAAGGGTT GGTTTGCGCA 3801 TTCACAGTTC TCCGCAAGAA TTGATTGGCT CCAATTCTTG GAGTGGTGAA 3851 TCCGTTAGCG AGGTGCCGCC GGCTTCCATT CAGGTCGAGG TGGCCCGGCT 3901 CCATGCACCG CGACGCAACG CGGGGAGGCA GACAAGGTAT AGGGCGGCGC 3951 CTACAATCCA TGCCAACCCG TTCCATGTGC TCGCCGAGGC GGCATAAATC 4001 GCCGTGACGA TCAGCGGTCC AGTGATCGAA GTTAGGCTGG TAAGAGCCGC 4051 GAGCGATCCT TGAAGCTGTC CCTGATGGTC GTCATCTACC TGCCTGGACA 11

4101 GCATGGCCTG CAACGCGGGC ATCCCGATGC CGCCGGAAGC GAGAAGAATC 4151 ATAATGGGGA AGGCCATCCA GCCTCGCGTC GCGAACGCCA GCAAGACGTA 4201 GCCCAGCGCG TCGGCCAGCT TGCAATTCGC GCTAACTTAC ATTAATTGCG 4251 TTGCGCTCAC TGCCCGCTTT CCAGTCGGGA AACCTGTCGT GCCAGCTGCA 4301 TTAATGAATC GGCCAACGCG CGGGGAGAGG CGGTTTGCGT ATTGGGCGCC 4351 AGGGTGGTTT TTCTTTTCAC CAGTGAGACG GGCAACAGCT GATTGCCCTT 4401 CACCGCCTGG CCCTGAGAGA GTTGCAGCAA GCGGTCCACG CTGGTTTGCC 4451 CCAGCAGGCG AAAATCCTGT TTGATGGTGG TTGACGGCGG GATATAACAT 4501 GAGCTGTCTT CGGTATCGTC GTATCCCACT ACCGAGATAT CCGCACCAAC 4551 GCGCAGCCCG GACTCGGTAA TGGCGCGCAT TGCGCCCAGC GCCATCTGAT 4601 CGTTGGCAAC CAGCATCGCA GTGGGAACGA TGCCCTCATT CAGCATTTGC 4651 ATGGTTTGTT GAAAACCGGA CATGGCACTC CAGTCGCCTT CCCGTTCCGC 4701 TATCGGCTGA ATTTGATTGC GAGTGAGATA TTTATGCCAG CCAGCCAGAC 4751 GCAGACGCGC CGAGACAGAA CTTAATGGGC CCGCTAACAG CGCGATTTGC 4801 TGGTGACCCA ATGCGACCAG ATGCTCCACG CCCAGTCGCG TACCGTCTTC 4851 ATGGGAGAAA ATAATACTGT TGATGGGTGT CTGGTCAGAG ACATCAAGAA 4901 ATAACGCCGG AACATTAGTG CAGGCAGCTT CCACAGCAAT GGCATCCTGG 4951 TCATCCAGCG GATAGTTAAT GATCAGCCCA CTGACGCGTT GCGCGAGAAG 5001 ATTGTGCACC GCCGCTTTAC AGGCTTCGAC GCCGCTTCGT TCTACCATCG 5051 ACACCACCAC GCTGGCACCC AGTTGATCGG CGCGAGATTT AATCGCCGCG 5101 ACAATTTGCG ACGGCGCGTG CAGGGCCAGA CTGGAGGTGG CAACGCCAAT 5151 CAGCAACGAC TGTTTGCCCG CCAGTTGTTG TGCCACGCGG TTGGGAATGT 5201 AATTCAGCTC CGCCATCGCC GCTTCCACTT TTTCCCGCGT TTTCGCAGAA 5251 ACGTGGCTGG CCTGGTTCAC CACGCGGGAA ACGGTCTGAT AAGAGACACC 5301 GGCATACTCT GCGACATCGT ATAACGTTAC TGGTTTCACA TTCACCACCC 5351 TGAATTGACT CTCTTCCGGG GGCTATCATG CCATACCGCG AAAGGTTTTG 5401 CACCATTCGT ATGGTGTCAA CGTAAATGCC CGTTGCCCTT CGCGCGCGAA . 5451 TTGCAAGCTG ATCGGAGCTT ATCGACTGCA CGGTGCACCA ATGCTTCTGG 12 5501 5551 5601

13

Seq. pHS 164

1 AATATTCTGA 51 TGGAATTGTG 101 TTCCACATGT 151 TCCTCTGACC 201 TCTGACCAGC 251 CCGCTCACAA 301 ATATTGAGCA 351 GATATTCATG 401 ACAGCTATCG 451 GGCCGCTCCG 501 CCCAGTACCA 551 AACCAACTGG 601 TGGCTTTGAA 651 GCGTTGAAAA 701 CTGGGTTACC 751 TATGGTTTGG 801 CGATAGGCCA 851 CTGGGACATC 901 TGATCAGATT 951 TACTCATATG -AdaptadorI— 1001 CAAAACGTAA 1051 AAACACCCTG 1101 CTAGAGGCCT 1151 GGAATGATAG 1201 AGGAC&AGCA

CTAGAG

Quadro 2

Sequência do pinf 4-49

-35 tac Promotor -10 AATGAGCTGT TGACAATTAA TCATCGGCTC GTATAATGTG

II II II II II II II M II II II

AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGAAACAGA CCATGCGGAA

GGAATTGTGA GCGGATAACA ATTTGTGGAA TTCTGGCGAA

AGCCAGAAAA CGATCTTCGT CCGAGAATTC TGGCGAATCC

CAGAAAACGA TCTTCGTCCG AGAATTCCAC AAATTGTTAT

TTCCACATGT GGAATTCGAG CTCGCCCATC GGTAGAGTTA

GATCCCCCGG TGAAGGATTT AACCGTGTTA TCTCGTTGGA

Início ompA

GCGTATTTTG GATGATAACG AGGCGCAAAA AATGAAAAAG ***

CGATTGCAGT GGCACTGGCT GGTTTCGCTA CCGTAGCGCA

AAAGATAACA CCTGGTACAC TGGTGCTAAA CTGGGCTGGT

TGATACTGGT TTCATCAACA ACAATGGCCC GACCCATGAA

GCGCTGGTGC TTTTGGTGGT TACCAGGTTA ACCCGTATGT

ATGGGTTACG ACTGGTTAGG TCGTATGCCG TACAAAGGCA

CGGTGCATAC AAAGCTCAGG GCGTTCAGTT GACCGCTAAA

CAATCACTGA CGACCTGGAC GTGTACACTC GTCTGGGTGG

Transição: ompA/HAV

CGTGCAGACA CCAAAGCTCA CAACAATGTG ACAGGTGAAT AGACCTTCCA GGAAATGACA ACAGCACAGC AACGCTGTGC ATGCGGTGCC AAACGGAACA CTAGTGAAAA CAATCACAGA

GAAGTGACTA ATGCTACTGA GCTAGTTCAG AGCT

CAjTCACTCCA AATGGAAGCA TTCCCAATGA CAAGCCCTTT ACAAGATCAC ATATGGAGCA TGCCCCAAGT ATGTTAAGCA AAGTTGGCAA CAGGGATGCG GAATGTACCA GAGAAACAAA ATTCGGCGCA ATAGCAGGTT TCATAGAAAA TGGTTGGGAG ACGGTTGGTA CGGTTTCAGG CATCAAAATT CTGAGGGCAC GCAGATCTTA AAAGCACTCA AGCAGCCATC GACCAAATCA 14

1251 ATGGGAAATT GAACAGGGTA ATCGAGAAGA CGAACGAGAA ATTCCATCAA 1301 ATCGAAAAGG aatttg|ctag CGACGTCGAC CCGGGCCAAG •Adaptador II---------- ATCjTCGAGAA 1351 ATACGTTGAA GACACTAAAA TAGATCTCTG GTCTTACAAT GCGGAGCTTC 1401 TTGTCGCTCT GGAGAATCAA CATACAATTG ACCTGACTGA CTCGGAAATG 1451 AACAAGCTGT TTGAAAAAAC AAGGAGGCAA CTGAGGGAAA ATGCTGAAGA 1501 GATGGGCAAT GGTTGCTTCA AAATATACCA CAAATGTGAC AACGCTTGCA 1551 TAGAGTCAAT CAGAAATGGT ACTTATGACC ATGATGTATA CAGAGACGAA 1601 GCATTAAACA ACCGGTTTCA GATCAAAGGT VSobreposição: HA/ompA GTTGAACTGA AGTCTGGATA 1651 CAAAGACTGG ATCAAATCTG AGAAAAACCA CGATACCGGC GTTTCTCCGG 1701 TATTCGCAGG TGGTGTTGAA TGGGCCATCA CTCCTGAAAT CGCTACCCGT 1751 CTGGAATACC AGTGGACCAA CAACATCGGT GACGCACACA CCATCGGCAC 1801 TCGTCCGGAC AACGGCGTGC TGAGCTTGGG TGTTTCCTAC CGTTTCGGTC 1851 AGGGCGAAGC AGCTCCAGTA GTTGCTCCGG CTCCAGCTCC GGCACCGGAA 1901 GTACAGACCA AGCACTTCAC TCTGAAGTCT GACGTTCTGT TCAACTTCAA 1951 CAAAGCAACC CTGAAACCGG AAGGTCAGGC TGCTCTGGAT CAGCTGTACA 2001 GCCAGCTGAG CAACCTGGAT CCGAAAGACG GTTCCGTAGT TGTTCTGGGT 2051 TACACCGACC GCATCGGTTC TGACGCTTAC AACCAGGGTC TGTCCGAGCG 2101 CCGTGCTCAG TCTGTTGTTG ATTACCTGAT CTCCAAAGGT ATCCCGGCAG 2151 ACAAGATCTC CGCACGTGGT ATGGGCGAAT CCAACCCGGT TACTGGCAAC 2201 ACCTGTGACA ACGTGAAACA GCGTGCTGCA CTGATCGACT GCCTGGCTCC 2251 GGATCGTCGC Fim GTAGAGATCG ompA AAGTTAAAGG TATCAAAGAC GTTGTAACTC 2301 AGCCGCAGGC TTAAGTTCTC *** GTCTGGTAGA AAAACGCTGC TGCGGGTTTT 2351 TTTTTGCCTT TAGTAAATTG AACTGACTTT CGTCAGTTAT TCCTTACCCA 2401 GCAATGCCTG CAGCCCAAGC TTCTGTTTTG GCGGATGAGA GAAGATTTTC 2451 AGCCTGATAC AGATTAAATC AGAACGCAGA AGCGGTCTGA TAAAACAGAA 2501 TTTGCCTGGC GGCAGTAGCG CGGTGGTCCC ACCTGACCCC ATGCCGAACT 2551 CAGAAGTGAA ACGCCGTAGC GCCGATGGTA GTGTGGGGTC TCCCCATGCG 2601 AGAGTAGGGA ACTGCCAGGC ATCAAATAAA ACGAAAGGCT CAGTCGAAAG 15

2651 ACTGGGCCTT TCGTTTTATC TGTTGTTTGT CGGTGAACGC TCTCCTGAGT 2701 AGGACAAATC CGCCGGGAGC GGATTTGAAC GTTGCGAAGC AACGGCCCGG 2751 AGGGTGGCGG GCAGGACGCC CGCCATAAAC TGCCAGGCAT CAAATTAAGC 2801 AGAAGGCCAT CCTGACGGAT GGCCTTTTTG CGTTTCTACA AACTCTTTTG 2851 TTTATTTTTC TAAATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC 2901 CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA GGAAGAGTAT GAGTATTCAA 2951 CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT GCCTTCCTGT 3001 TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 3051 TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC 3101 CTTGAGAGTT TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA 3151 AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG TATTATCCCG TGTTGACGCC GGGCAAGAGC 3201 AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA ATGACTTGGT TGAGTACTCA 3251 CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA GAGAATTATG 3301 CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 3351 CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG 3401 GATCATGTAA CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT 3451 ACCAAACGAC GAGCGTGACA CCACGATGCC TTCAGCAATG GCAACAACGT 3501 TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA CTCTAGCTTC CCGGCAACAA 3551 TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC TTCTGCGCTC 3601 GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 3651 GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC 3701 CGTATCGTAG TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG 3751 AAATAGACAG ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC 3801 TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT AGATTGATTT AAAACTTCAT 3851 TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCATGAC 3901 CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 3951 AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC 4001 TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA 16

4051 TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC 4101 AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC 4151 AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC 4201 AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 4251 GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG 4301 TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT 4351 ACAGCGTGAG CATTGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG 4401 ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG 4451 CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA 4501 CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 4551 TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCCGAG ATGCGCCGCG TGCGGCTGCT 4601 GGAGATGGCG GACGCGATGG ATATGTTCTG CCAAGGGTTG GTTTGCGCAT 4651 TCACAGTTCT CCGCAAGAAT TGATTGGCTC CAATTCTTGG AGTGGTGAAT 4701 CCGTTAGCGA GGTGCCGCCG GCTTCCATTC AGGTCGAGGT GGCCCGGCTC 4751 CATGCACCGC GACGCAACGC GGGGAGGCAG ACAAGGTATA GGGCGGCGCC 4801 TACAATCCAT GCCAACCCGT TCCATGTGCT CGCCGAGGCG GCATAAATCG 4851 CCGTGACGAT CAGCGGTCCA GTGATCGAAG TTAGGCTGGT AAGAGCCGCG 4901 AGCGATCCTT GAAGCTGTCC CTGATGGTCG TCATCTACCT GCCTGGACAG 4951 CATGGCCTGC AACGCGGGCA TCCCGATGCC GCCGGAAGCG AGAAGAATCA 5001 TAATGGGGAA GGCCATCCAG CCTCGCGTCG CGAACGCCAG CAAGACGTAG 5051 CCCAGCGCGT CGGCCAGCTT GCAATTCGCG CTAACTTACA TTAATTGCGT 5101 TGCGCTCACT GCCCGCTTTC CAGTCGGGAA ACCTGTCGTG CCAGCTGCAT 5151 TAATGAATCG GCCAACGCGC GGGGAGAGGC GGTTTGCGTA TTGGGCGCCA 5201 GGGTGGTTTT TCTTTTCACC AGTGAGACGG GCAACAGCTG ATTGCCCTTC 5251 ACCGCCTGGC CCTGAGAGAG TTGCAGCAAG CGGTCCACGC TGGTTTGCCC 5301 CAGCAGGCGA AAATCCTGTT TGATGGTGGT TAACGGCGGG ATATAACATG 5351 AGCTGTCTTC GGTATCGTCG TATCCCACTA CCGAGATATC CGCACCAACG 5401 CGCAGCCCGG ACTCGGTAAT GGCGCGCATT GGGCCCAGCG CCATCTGATC 17 4 *

5451 GTTGGCAACC AGCATCGCAG TGGGAACGAT GCCCTCATTC AGCATTTGCA 5501 TGGTTTGTTG AAAACCGGAC ATGGCACTCC AGTCGCCTTC CCGTTCCGCT 5551 ATCGGCTGAA TTTGATTGCG AGTGAGATAT TTATGCCAGC CAGCCAGACG 5601 CAGACGCGCC GAGACAGAAC TTAATGGGCC CGCTAACAGC GCGATTTGCT 5651 GGTGACCCAA TGCGACCAGA TGCTCCACGC CCAGTCGCGT ACCGTCTTCA 5701 TGGGAGAAAA TAATACTGTT GATGGGTGTC TGGTCAGAGA CATCAAGAAA 5751 TAACGCCGGA ACATTAGTGC AGGCAGCTTC CACAGCAATG GCATCCTGGT 5801 CATCCAGCGG ATAGTTAATG ATCAGCCCAC TGACGCGTTG CGCGAGAAGA 5851 TTGTGCACCG CCGCTTTACA GGCTTCGACG CCGCTTCGTT CTACCATCGA 5901 CACCACCACG CTGGCACCCA GTTGATCGGC GCGAGATTTA ATCGCCGCGA 5951 CAATTTGCGA CGGCGCGTGC AGGGCCAGAC TGGAGGTGGC AACGCCAATC 6001 AGCAACGACT GTTTGCCCGC CAGTTGTTGT GCCACGCGGT TGGGAATGTA 6051 ATTCAGCTCC GCCATCGCCG CTTCCACTTT TTCCCGCGTT TTCGCAGAAA 6101 CGTGGCTGGC CTGGTTCACC ACGCGGGAAA CGGTCTGATA AGAGACACCG 6151 GCATACTCTG CGACATCGTA TAACGTTACT GGTTTCACAT TCACCACCCT 6201 GAATTGACTC TCTTCCGGGC GCTATCATGC CATACCGCGA AAGGTTTTGC 6251 ACCATTCGTA TGGTGTCAAC GTAAATGCCC GTTGCCCTTC GCGCGCGAAT 6301 TGCAAGCTGA TCGGAGCTTA TCGACTGCAC GGTGCACCAA TGCTTCTGGC 6351 GTCAGGCAGC CATCGGAAGC TGTGGTATGG CTGTGCAGGT CGTAAATCAC 6401 6451 TGCATAATTC TGCGCCGACA GTGTCGCTCA TCATAACGGT AGGCGCACTC TCTGGCA CCGTTCTGGA TAATGTTTTT 18

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES - lã - Processo para a preparação de proteínas de fusão caracterizado por se ligar o ADN da proteína de membrana exterior A (OmpA) de bactérias gram-negativas com o ADNc de proteínas de dimensão superior a 20 ácidos aminados (AA) e se expressar em bactérias gram-negativas com auxílio de plasmídeos apropriados. - 2ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína OmpA ser originária de E. coli ou de S. dysenteriae ou ser constituída por um híbrido desta OmpA. - 3â - Processo para a preparação de proteínas de fusão caracterizado por se inserir o ADNc para uma proteína de dimensão superior a 20 AA no ADNc para a OmpA de bactérias gram--negativas numa das quatro regiões do vértice do exterior e se expressar em bactérias gram-negativas com auxílio de plasmídeos apropriados. - 4ã - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína OmpA ser originária de E. coli ou de S. dysenteriae ou ser constituída por um híbrido desta OmpA. - 5§ - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se incorporar adicionalmente uma haste corres-4 pondente ao ADNc para o domínio de dobragem tridimensional da * região aminoterminal ou carboxiterminal da hemaglutinina da gri- 19

   pe (a cerca dos AA 1 a 50 e dos AA 280 a 510) antes da extremidade aminoterminal ou depois da extremidade carboxiterminal, res pectivamente, da proteína inserida. - 6§ Processo de acordo com a reivindicação 5, ca-racterizado por se situar adicionalmente antes da inserção de ADNc que codifica para a extremidade aminoterminal ou depois da que codifica para a extremidade carboxiterminal, respectiva-mente, em cada um dos casos uma sequência de ADNc que codifica para uma sequência de ácidos aminados cindível por meio de uma protease. - 7a - Processo de acordo com a reivindicação 5, ca-racterizado por a sequência de ADNc incorporada codificar para uma sequência de ácidos aminados cindível por meio de colagena-se. - 8i - Processo para a preparação de uma vacina ca-racterizado por se misturar uma proteína de fusão preparada de acordo com uma das reivindicações, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 com adjuvantes habituais. - 9â - Processo para a preparação de uma vacina viva oral caracterizado por se estabilizarem de modo a que se conservem as condições de viabilidade as bactérias transformadas utilizadas na reivindicação 1. A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 24 de Agosto de 1988, sob o n3. P 20 38 28 666.1. Lisboa, 23 de Agosto de 1989 © £msm βήκα pstotsiwj

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