CN106755105A - 一质粒拯救系统用于流感病毒疫苗株的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一质粒拯救系统用于流感病毒疫苗株的制备及应用。本发明提供了一种制备流感病毒疫苗的系统，包括表达流感病毒内部基因和流感病毒表面基因的单一质粒；所述流感病毒内部基因为PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因。本发明利用一质粒拯救系统(流感病毒血凝素HA基因、流感病毒神经氨酸酶NA基因来源于当年流行的流感病毒株、流感病毒内部基因来源于流感冷适应减毒株，并将表面基因片段和内部基因片段构建在一个载体上)来重组流感病毒，效率较传统的8质粒系统更高，使得制备的疫苗具有很好的时效性，使得此新系统更适合于生产流感病毒疫苗。

Description

一质粒拯救系统用于流感病毒疫苗株的制备及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一质粒拯救系统用于流感病毒疫苗株的制备及应用。
背景技术
流感是一种由流感病毒引起的急性发热性呼吸道传染病，可引起严重的并发症。流感病毒的抗原不断发生变化，具有较强的传染性，经常造成大范围流行。在正常的流行季节，全球约10％的人口即6亿多人患流感，目前还未找到十分理想的防治药物，接种流感疫苗仍是当今预防流感的有效手段。给健康人群接种流感疫苗，70-80％的人会起到预防发病的效果(当传播的病毒毒株与疫苗采用毒株相同时)，更重要的是，给高危人群接种疫苗可以明显降低流感的发生，减少住院及死亡率，所以研制高效、安全的新一代流感疫苗对预防流感发生具有重要意义。目前投放市场的流感疫苗主要有流感灭活全病毒疫苗、流感裂解病毒疫苗、亚单位疫苗及流感减毒活疫苗。但流感灭活全病毒疫苗、流感裂解病毒疫苗、亚单位疫苗注射免疫不能诱发有效的粘膜免疫、细胞免疫，其效果远不及减毒疫苗的免疫保护效果。应用于临床的流感病毒冷适应性减毒活疫苗采用鼻通道免疫途径，其抗原的制备通过重配技术，将每年相应的甲乙型流感病毒流行株的HA、NA基因整合到减毒的冷适应性的宿主病毒中，这种制备方法重配率较低，导致突发流感病毒难以在有限的时间内重配。另外，减毒活疫苗存在毒力恢复的问题。发展起来的多质粒拯救系统针对流感病毒这一特点，利用反义遗传学的方法，可针对当年流行的病毒株快速制备有效的流感病毒减毒疫苗，制备快速、省力、相对安全，为新一代流感减毒活疫苗的研制提供新的思路和方法。
流感病毒属于正粘病毒科，其基因组为单股负义RNA，分为八个片段，胞质连接蛋白与脂膜相连。流感病毒的基因组主要有表面基因血凝素(HA)基因神经氨酸酶(NA)基因以及流感病毒内部6个基因有PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因。根据流感病毒结构蛋白核蛋白(Nucleocapsid protein，NP)和膜蛋白(Membrane protein,MP)抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)3型，其中甲型和乙型流感病毒基因组均含有8个RNA节段,分别编码PB1、PB2、PA、HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NS2共10种蛋白；而丙型流感病毒基因组只含有7个RNA节段，缺少编码NA的RNA节段。甲、乙、丙3型流感病毒均可感染人类，甲、乙型引起的病症较严重,其中尤以甲型更为严重。正因为流感病毒的基因组是负义RNA，因而不具有感染性，各个RNA片段必须与聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA，统称为P蛋白)及核蛋白(NP)结合在一起形成核糖核蛋白复合物即RNPs才有活性。流感病毒感染时，首先与宿主细胞表面的特异性HA受体结合，通过融膜进入细胞后释放出RNPs，RNPs进入细胞核才开始病毒基因组的复制和转录，每个RNA片段单独组成一个转录单位，转录出mRNA和互补RNA(cRNA)，mRNA翻译合成病毒蛋白，cRNA复制生成病毒负链子代RNA，进而在细胞浆中组装成完整的病毒粒子。
由于流感病毒的两个表面抗原：HA和NA经常发生抗原漂移和转换，流感病毒变异现象时有发生，使得每年需更换新的流行株的疫苗株，这也是现有疫苗无法应对所有流感爆发的主要原因。WHO在全世界建立了完整的监测网络，分离、鉴定世界各地的流感毒株，并每年2-3月份组织专家召开会议，推荐流感流行季节疫苗中应包括的毒株，以便生产厂家在疫苗制备过程中采用与流行株一致的毒株，使疫苗达到最佳保护效力。然而即使这样，生产流感病毒疫苗仍存在许多亟待解决的问题：
1、生产周期较长，生产的流感疫苗往往错过流感流行季节。等再一次流感流行时，或许生产的疫苗已经失效。目前，美国所有商品化的流感疫苗都是由鸡胚来培养的。虽然流感病毒在鸡胚中生长良好，但疫苗的产量仍有赖于鸡胚的可获得性及其质量。鸡胚的提供必须有组织性，疫苗的生产周期较长，因为鸡胚供应不及时而限制了该种疫苗的生产。
2、近几年来，用细胞培养的方法生产疫苗也得到了发展。选择好的宿主细胞可以永久传代，这就克服了由鸡胚培养所带来的不便。然而，并不是所有的流感病毒株在组织细胞中都能很好生长。例如，像一些适合制备疫苗的病毒株，如温度敏感株等，用现有的方法并不能在组织细胞中培养。
3、全病毒灭活疫苗、裂解流感疫苗和亚单位疫苗免疫保护效果远不及减毒疫苗，而利用传统方法制备的流感减毒疫苗又存在着毒力恢复等缺陷。
基于以上情况，为了克服现有流感病毒疫苗生产中的不足，基于反向遗传操作技术，利用多质粒拯救系统能够显著增加流感疫苗生产的灵活性，同时利用反义遗传学和基因定点突变的方法，既保存了流感病毒减毒疫苗的免疫原性，又提高了其安全性。
反向遗传操作技术(reverse genetics)是近几年快速发展的一项新的生物技术，应用于病毒研究又叫“病毒拯救(rescue of virus)”，病毒拯救技术是在了解病毒复制特点等基础上利用分子生物学技术而建立和完善起来的，是指通过人工操作基因，用病毒核酸的适当形式，在一定条件下转染细胞产生有感染性的病毒子。由于RNA不稳定，病毒拯救技术尤其是完全以质粒为基础的操作技术实现了在cDNA水平上对RNA病毒的操作和方便地人工制造病毒，这是20世纪90年代RNA病毒研究中的重大突破，成为至今生命科学研究热点。现在，病毒拯救指的就是使用以质粒为基础的系统，即从克隆的cDNA产生病毒的过程，在对病毒的生活周期、基因结构与功能、致病基础、新型疫苗构建、表达外源蛋白等方面的研究中显示了良好的应用前景。流感病毒的反向遗传操作技术的建立难度较大，因为要同时在细胞内形成多个功能性核糖核蛋白复合物(RNPs)，而且与大多数其它负义RNA病毒不同，流感病毒基因组在细胞核内复制，因此流感病毒拯救技术的发展落后于其它负义RNA病毒。经过20年的发展，终于在1999年Neumann等和Fodor等分别报道了完全以多质粒为基础的技术，这是流感病毒拯救技术发展史上的转折点。其优点是不再像早期的方法那样，需要为RNA合成提供功能蛋白的辅助病毒一起感染细胞，从而避免了大量的筛选工作。1999年,Fodor首次通过12质粒系统拯救出流感病毒；2005年Hoffmann等建立了使用双向转录表达载体的8质粒系统，在同一个模板(载体上)实现vRNA的转录和病毒蛋白的表达。Neumann创建了一套少于以PHW2000为载体的经典的8个质粒反基因系统，在此系统中减少了用于产生病毒的质粒。8个用于病毒合成的RNA聚合酶I转录盒与一个允许插入大片段外源基因的的PTM克隆载体结合。同样，两个编码HA和NA片段的载体盒和6个编码其他蛋白质的载体盒结合。另外,将用于表达聚合酶亚基的三个RNA聚合酶II载体盒和编码NP蛋白载体盒结合。通过分别组合这些载体盒,显著降低了病毒繁殖所需要的质粒数量，分别形成了3、4质粒的系统。
发明内容
本发明一个目的是提供一种制备流感病毒疫苗的系统。
本发明提供的系统，包括表达流感病毒内部基因和流感病毒表面基因的单一质粒；
所述流感病毒内部基因为PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因。
上述系统中，所述流感病毒的表面基因为血凝素基因HA和神经氨酸酶基因NA；
或，所述单一质粒从上游到下游依次包括PB2基因、PB1基因、NS基因、M基因、NP基因、PA基因、HA基因和NA基因。
上述系统中，所述单一质粒为将PB2基因或其表达盒、PB1基因或其表达盒、NS基因或其表达盒、M基因或其表达盒、NP基因或其表达盒、PA基因或其表达盒、HA基因或其表达盒和NA基因或其表达盒导入骨架载体得到的质粒。
上述系统中，所述骨架载体为杆状病毒表达载体；
或，所述杆状病毒表达载体为敲除plh启动子的pFastBac1载体或者其它杆状病毒表达载体；
或，所述系统还包括Sf9昆虫细胞或者能用于昆虫表达系统的其它细胞；
或，所述流感病毒为A型流感病毒或B型流感病毒。
上述系统中，所述单一质粒按照包括如下步骤的方法制备：
1)将PB2基因表达盒、PB1基因表达盒、PA基因表达盒、NP基因表达盒、M基因表达盒、NS基因表达盒和含有attRl和attR2位点的片段(按照实施例的方法制备)导入所述敲除plh启动子的pFastBac1载体中，得到供体质粒；
2)将HA基因表达盒和NA基因表达盒替换所述供体质粒中attRl和attR2位点之间的DNA片段，得到表达A型流感病毒内部6个基因、血凝素基因HA和神经氨酸酶基因NA的质粒。
上述系统中，所述PB2基因表达盒的核苷酸序列为序列2；
所述PB1基因表达盒的核苷酸序列为序列3；
所述PA基因表达盒的核苷酸序列为序列4；
所述NP基因表达盒的核苷酸序列为序列5；
所述M基因表达盒的核苷酸序列为序列6；
所述NS基因表达盒的核苷酸序列为序列7；
所述敲除plh启动子的pFastBac1载体的核苷酸序列为序列1；
所述HA基因表达盒的核苷酸序列为序列8；
所述NA基因表达盒的核苷酸序列为序列9。
上述系统在制备流感病毒疫苗中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种制备流感病毒疫苗的方法。
本发明提供的方法，为利用上述系统中的表达流感病毒内部6个基因、血凝素基因和神经氨酸酶基因的质粒转染细胞，包装得到流感病毒疫苗。
上述方法中，所述转染包括如下步骤：
1)将所述表达流感病毒内部6个基因、血凝素基因和神经氨酸酶基因的质粒转染Sf9昆虫细胞，包装得到重组杆状病毒；
2)再将所述重组杆状病毒转染目标细胞，包装得到流感病毒疫苗；
或所述目标细胞为293T细胞或cos1细胞或293T细胞和MDCK细胞的混合细胞或cos1细胞和MDCK细胞的混合细胞。
由上述方法制备的流感病毒疫苗也是本发明保护的范围。
含有attRl和attR2位点的片段(attRl-Tk-pIE-1(0)-attR2复制子)按照如下实施例中公开的方法制备：
本发明的实验证明，本发明利用一质粒拯救系统(流感病毒血凝素HA基因、流感病毒神经氨酸酶NA基因来源于当年流行的流感病毒株、流感病毒内部基因来源于流感冷适应减毒株，并将表面基因片段和内部基因片段构建在一个载体上)来重组流感病毒，该重组流感病毒可用细胞培养的方法来大量扩增，且不需任何处理可直接用于疫苗的制造。生产流感病毒的效率较传统的8质粒系统更高,此新系统能够显著增加流感疫苗生产的灵活性，同时能将组织细胞培养的方法更好地应用于该种疫苗的生产，使得制备的疫苗具有很好的时效性，使得此新系统更适合于生产流感病毒疫苗。
附图说明
图1为一质粒拯救流感病毒技术路线图。
图2为重组A型H1N1流感病毒电镜照片。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
图1为一质粒拯救流感病毒技术路线图。
实施例1、用单质粒拯救病毒获得流感病毒
(一)、表达流感病毒HA和NA的重组质粒的制备
一、供体质粒pΔFattP6TK的构建
1、重组质粒pΔFast-P3
pFastΔplh的核苷酸序列为序列1，具体为pFastBac1(Invitrogen公司)删去plh启动子，生成pFastΔplh。
重组质粒pΔFast-Pl为将序列2所示的PB2基因表达盒插入载体pFastΔplh上的BamHI和BssHII酶切位点之间。
序列2所示的PB2基因表达盒中，第173-582位为CMV启动子，第633-2973位为PB2基因，第3231-3455位为终止子BGHpolyA。
重组质粒pΔFast-P2为将序列3所示的PB1基因表达盒替换载体pΔFast-P1上的BssHII和SpeI酶切位点之间得到的载体，且PB1基因表达盒位于PB2表达盒下游。
序列3所示的PB1基因表达盒中，第173-582位为CMV启动子，第633-2973位为PB1基因，第3231-3455位为终止子BGHpolyA。
重组质粒pΔFast-P3为将序列4所示的PA基因表达盒替换载体pΔFast-P2上的SpeI和NotI酶切位点之间得到的载体，且PA基因表达盒位于PB1表达盒下游。
序列4所示的PA基因表达盒中，第173-582位为CMV启动子，第633-2865位为PA基因，第3123-3347位为终止子BGHpolyA。
2、重组质粒pΔFast-P6的获得
为了将NP，M和NS亚克隆到pΔFast-P3，进行如下实验：
将NP基因表达盒(序列5)、M基因表达盒(序列6)和NS基因表达盒(序列7)等量的加入连接反应中，再加入经过Notl/Kpnl酶切pFastΔplh供体载体，然后用Quick ligationkit，4C过夜连接，得到重组质粒pΔFast-NPMNS。
经过测序，重组质粒pΔFast-NPMNS为将NPMNS片段替换pFastΔplh载体的Notl和Kpnl酶切位点间的载体。
NPMNS片段由NP基因表达盒、M基因表达盒和NS基因表达盒组成，且NP表达盒的最后一个核苷酸残基与M基因表达盒的第一个核苷酸残基紧邻，且M基因表达盒的最后一个核苷酸残基与NA基因表达盒第一个核苷酸残基紧邻。
序列5中，第173-582位为NP基因表达盒中的启动子、第633-2198位为NP基因表达盒中的NP基因、第2456-2680位为NP基因表达盒中的终止子；
序列6中，第173-582位为M基因表达盒中的启动子、第633-1659位为M基因表达盒中的M基因、第1917-2141位为M基因表达盒中的终止子；
序列7中，第173-582位为NS基因表达盒中的启动子、第633-1522位为NS基因表达盒中的NS基因、第1780-2004位为NS基因表达盒中的终止子。
再将重组质粒pΔFast-NPMNS用Notl和Kpnl酶切，回收酶切产物NPMNS，再将酶切产物NPMNS与经过同样酶切的重组质粒pΔFast-P3通过长片段DNA连接试剂盒，16C过夜连接，得到重组质粒pΔFast-P6。
经过测序，重组质粒pΔFast-P6为将NPMNS片段替换重组载体pΔFast-P3的Notl和Kpnl酶切位点间的载体。
3、供体质粒pΔFattP6TK的制备
为了获得一个针对流感病毒各个亚型通用的重组杆状病毒载体，引入了attRl/attR2元件克隆到pΔFast-P6质粒上，具体方法如下：
首先，以BaculoDirectTM N-GST线性DNA(Thermo Fisher Scientific,货号#A10640)为模板，Spel-attRIF和SpeI-attR2R(核苷酸序列见表1)为引物，用BaculoDirectTMN-Term expression kit试剂盒(Thermo Fisher Scientific,货号#12562054)进行PCR扩增，得到5327bp的片段，命名为attRl-tk-pIE(O)-plO-lacZ-attR2；
以片段attRl-tk-pIE(O)-plO-lacZ-attR2为模板，引入两个内部重叠引物TklER和IEattR2F(核苷酸序列见表1)进行PCR扩增，用引物TklER和引物speI-attRIF，以
attRl-tk-pIE(O)-plO-lacZ-attR2为模板，得到产物1。用引物IEattR2F和引物speI-attR2R，attRl-tk-pIE(O)-plO-lacZ-attR2为模板，得到产物2.以产物1和产物2为模板，用引物speI-attRIF和speI-attR2R进行PCR扩增，得到2247bp的PCR扩增产物3，命名为attRl-Tk-pIE-1(0)-attR2复制子。
第二步，将attRl-Tk-pIE-1(0)-attR2复制子连接到上述2获得的pΔFast-P6质粒的speI单酶切位点处，得到重组质粒pΔFattP6TK。
用表1所示的引物对扩增上述重组质粒pΔFattP6TK，得到目的扩增片段为阳性质粒。
表1为引物对
二、gateway入门载体pENTR-HA-NA的构建
为了获得HA和NA表达元件并将其插入到上述一制备的供体质粒pΔFattP6TK中，基于Gateway克隆策略，将其克隆到pENTR-lA载体的attLl和attL2序列之间，来使HA和NA元件从疫苗候选株中转换出来，使其具有来自pAFattP6TK质粒的Thymidine kinase(TK)表达盒。
入门载体pENTR-HA-NA为先将HA表达盒(序列8)插入pENTR-1A载体(序列10)的BamHI和Notl酶切位点间，得到pENTR-HA，再将NA表达盒(序列9)插入到pENTR-HA的Notl和Xhol酶切位点之间得到gateway入门载体pENTR-HA-NA。
序列7中，第173-582位为HA基因表达盒中的启动子、第633-2334位为HA基因表达盒中的HA基因、第2591-2815位为HA基因表达盒中的终止子；
序列8中，第173-582位为NA基因表达盒中的启动子、第633-2034位为NA基因表达盒中的NA基因、第2291-2515位为NA基因表达盒中的终止子。
三、表达HA和NA的重组载体pΔFast-P8的构建
为了将HA和NA亚克隆到6个内部基因盒中，引入了Gateway LR克隆策略来获得流感病毒的全基因组，具体如下：
Gateway LR克隆反应体系：上述一制备的供体质粒pΔFattP6TK(100ng)，上述二制备的入门载体pENTR-HA-NA(1ug),ClonaseTM II Enzyme Mix(4(uL)(Invitrogen)，最后用TE buffer(pH 8.0)(Invitrogen)，调整体系终浓度为20uL。反应要在25℃维持18h。
终产物转化One shot ccdB SurvivalTM 2 T1R competent cells(Invitrogen)，涂布在1.2％LB平板上(氨苄浓度为100ug/mL)。比较不同克隆的大小，挑选小的克隆用表1中8对引物PCR扩增鉴定。挑出经表1中8对引物PCR扩增鉴定成功的阳性克隆后，提取阳性克隆的质粒为重组质粒，命名为pΔFast-P8。
(二)、重组杆粒pΔFastbac-P8拯救流感病毒
一、重组杆粒pΔFastbac-P8包装得到重组杆状病毒
上述(一)pΔFast-P8转化感受态MAX DH10BacTM Competent E.coli(Invitrogen)，在包含Bluo-gal,IPTG,庆大霉素,卡那霉素,盐酸四环素的1.2％LB平板上筛选阳性克隆，根据bac-to-bac杆状病毒表达系统，通过抗生素筛选3次，挑选出白色的克隆，获得杆粒pΔFastbac-P8，pΔFastbac-P8DNA的提取和鉴定通过8对引物通过PCR反应鉴定，具体如下：
1、重组杆状病毒的获得
将上述(一)得到的重组杆粒pΔFastbac-P8(M.O.I(multiplicity ofinfection)值为0.1)转染Sf9昆虫细胞(ATCC编号为CRL-1711TM)，培养4天后收集转染产物，得到重组杆状病毒，命名为rBacHlNl。
通过终点稀释法测定转染产物的滴度，结果为1×106TCID50/mL。
2、重组杆状病毒的纯化
将上述1收集的转染产物，4℃，3000g离心30min去除细胞碎片，收集上清；
再将上清通过超速离心(25,000rpm使用Sorvall SW42转子)4℃超速离心2.5h，收集沉淀；
再用无菌PBS(0.01mol/L，pH7.2)重悬沉淀，4℃保存，得到纯化后杆状病毒rBacHlNl。
通过终点稀释法检测纯化后杆状病毒rBacHlNl的病毒滴度,具体方法如下：
将SF9细胞悬液滴加在96孔细胞培养板中，每孔100ul，5*103cell/孔。27℃培养箱中培养24h，在离心管中用培养基将病毒稀释液连续作10倍梯度稀释，从10-1至10-11。将稀释好的病毒悬液100ul加到培养好的96孔板中，每个稀释度接种一列共8孔，留一列作为阴性对照孔。置于27℃培养箱中培养，5d后显微镜下观察细胞病变情况。用Reed-Muench法计算病毒滴度。结果纯化后杆状病毒rBacHlNl的病毒滴度为1×107TCID50/mL。
二、拯救流感病毒
1、本发明实验组
1)、细胞的培养
将293T细胞(ATCC编号为CRL-3216TM)与DMEM+10％FBS培养基(购自美国Sigma公司)混匀，得到293T细胞培养体系；将COS1细胞(ATCC编号为CRL-1650TM)与DMEM-F12+10％FBS培养基(购自美国Sigma公司)混匀，得到COS1细胞培养体系；将MDCK细胞(ATCC编号为CRL-2935TM)与1XDMEM+10％FBS培养基(购自美国Sigma公司)混匀，得到MDCK细胞培养体系。
将293T细胞培养体系与MDCK细胞培养体系按照体积比100：1的比例混匀，得到293T/MDCK细胞；(293T细胞数为3×105；MDCK细胞数为3×103)。
将COS1细胞培养体系与MDCK细胞培养体系按照体积比100：1的比例混匀，得到COS1/MDCK细胞(COS1细胞数为3×105；MDCK细胞数为3×103)。
将上述293T/MDCK细胞和COS1/MDCK细胞置于37℃，5％CO2孵箱培养，24h后观察细胞状态，待细胞长到80％-90％时进行下一代传代培养。
2)、转染
以转染293T/MDCK细胞为例，具体方法如下：
293T/MDCK细胞铺入六孔细胞板，培养过夜，当细胞长成单层，加入新鲜DMEM培养基清洗3次，再次加入新鲜DMEM培养基2mL/孔，然后感染上述一制备的纯化后杆状病毒rBacHlN，采用不同的MOI值感染(0.1MOI，0.5MOI,1MOI,3MOI,10MOI)，按照Effectene转染试剂(购自美国QIAGEN公司，目录号：301425)说明书共转染，并设阴性对照孔(不加杆状病毒，其余转染条件不变)。
转染后24h，用新鲜DMEM培养基2mL/孔换液，其中每mL培养基含有终浓度为1μg/μL的TPCK-trypsin(美国Sigma公司，货号：T1426)。换液后置于33℃孵箱中培养，得到转染rBacHlNl细胞293T/MDCK，48小时，收集上清液，得到重组A型H1N1亚型流感病毒。
3)、检测
转染72h后，在显微镜下观察细胞病变(CPE)，结果细胞产生变圆、死亡、小块脱落并以丝相连等特征性病变。
在10日龄鸡胚上盲传后再监测重组A型H1N1亚型流感病毒的拯救情况TCID50，具体方法：用MDCK细胞铺96孔板，每孔2×104～4×104个细胞，待长成单层后，病毒按101、102、103……稀释.每孔200μl，稀释液为DMEM培养基，3天后观察结果，用Reed-Muench法计算TCID50，结果为重组A型H1N1流感病毒的TCID50为7.5；病毒使用前要储存在-80℃冰箱。
采用同样的方法转染COS1/MDCK细胞，得到重组A型H1N1亚型流感病毒，结果与转染297T/MDCK细胞无显著差异。
2、对照组
以6+2反向遗传学系统为对照组：将PB2，PB1，PA,HA,NP,NA,M,NS质粒共转染293T/MDCK细胞，包装得到对照重组A型H1N1亚型流感病毒。具体转染方法如下：293T/MDCK细胞或C0S1/MDCK细胞分别铺入六孔细胞板，培养过夜，当细胞长成单层，加入新鲜DMEM培养基清洗3次，再次加入新鲜DMEM培养基2mL/孔，然后将PB2，PB1，PA,HA,NP,NA,M,NS质粒均稀释至250ng/μL，各质粒等量混合，按照Effectene转染试剂(购自美国QIAGEN公司，目录号：301425)说明书分别共转染到293T/MDCK细胞或C0S1/MDCK细胞中。
对照重组A型H1N1亚型流感病毒在显微镜下观察对照组细胞病变(CPE)，结果细胞产生变圆、死亡、小块脱落并以丝相连等特征性病变；
在10日龄鸡胚上盲传后再监测对照重组A型H1N1亚型流感病毒的拯救情况TCID50，结果为7.0logTCID50；
3、转染效率
上述实验组得到的重组A型H1N1亚型流感病毒和对照组得到的对照重组A型H1N1亚型流感病毒分别转染20个孔(铺入293T/MDCK细胞六孔细胞板)，实验组18孔能成功拯救出流感病毒，重组效率(转染效率＝实验组成功转染孔数/共转染孔数)约为90％，而对照组中用8质粒重组流感病毒的方法，转染20个孔，12孔能成功拯救出流感病毒，重组效率(转染效率)约为60％。由此本发明重组流感病毒的方法的重组效率(转染效率)显著提高。
三、重组流感病毒减毒株的验证
1、鸡胚传代流感减毒病毒的感染性
将上述二1制备的重组A型H1N1流感减毒，-20℃和20℃冻融2次，经尿囊腔接种于10日龄SPF鸡胚，每胚0.2mL，每个样品接种5个胚，置35℃培养至72h，收集尿囊液，参考0IE推荐的标准、用0.8％鸡红细胞进行HA试验，HA阳性者用H1、H3、B亚型阳性血淸(购于中国CDC国家流感中心)进行血凝抑制试验(HI)，并设阴性对照(不加重组病毒，其余条件均不变)。
结果表明：重组A型H1N1流感减毒病毒的HI效价在1:28以上，而对照组HI实验均阴性。检测的阳性尿囊液传代20次,HA效价均为1:210，阳性组的转染上清接种鸡胚在第一代(F1)尿囊液检测为阳性，检测阳性时的鸡胚平均HA效价范围为1:27-1:211，经上述传代后重组A型H1N1流感减毒病毒的HA效价没有改变，说明重组H1N1流感减毒病毒具有很高的滴度和很好的稳定性。
2、重组流感减毒病毒全基因序列分析
分别提取鸡胚传代的第2代阳性尿囊液的上述二1制备的重组A型HIN1流感减毒病毒的RNA，用表2所示的通用引物进行RT-PCR扩增，分别得到PB1、PB2、NS、M、NP、PA、HA、NA的8个基因片段，并对其进行测序，未经反转录的RNA作为对照，以排除尿囊液中转染质粒DNA的存在。
表2、扩增重组A型H1N1亚型流感病毒的8个基因片段的引物
结果表明：重组A型H1N1亚型流感病毒转染293T/MDCK细胞或C0S1/MDCK细胞的转染上清得到的尿囊液经RT-PCR均能扩增出PB1、PB2、NS、M、NP、PA、HA、NA的8基因片段，经测序与设计的相符；而未经反转录的RNA均不能扩增出8个基因片段，说明尿囊液中无质粒DNA的存在；A型流感病毒阴性对照组转染的293T/MDCK细胞或C0S1/MDCK细胞的转染上清得到的尿囊液经RT-PCR不能扩增出8基因片段，未经反转录的RNA也不能扩增出8基因片段；说明尿囊液中无拯救病毒的存在。
3、重组流感减毒病毒感染MDCK细胞的稳定性
将鸡胚传代的第2代阳性尿囊液的上述二1制备的重组A型HIN1亚型流感减毒病毒在不加胰酶的情况下感染MDCK细胞(具体方法：收集l mL阳性尿囊液，5000rpm离心5min，再取离心后的上清，倍比稀释每孔100μL加入12孔板中培养的MDCK细胞中(1-2×105个细胞)；上清与细胞共培养l h后去掉上清，代之以无血清的1×DMEM，观察96h内的病变。然后进行血凝试验。具体步骤如下：
(1)取一次性96孔U型板,在板的边缘标记好所要测定的样品名称。
(2)U型板第一孔对病毒做1:2稀释,加入100μL稀释的病毒混合液,从第二
孔开始一律加入50μL病毒稀释液。
(3)用200μL移液器反复吹打第一孔,使病毒混合液充分混匀,吸出50μL混合液加入U型板的第二孔,以相同方式一直稀释至倒数第二孔。倒数第二孔混匀后,弃掉50μL病毒混合液,保留最后一排孔做阴性对照孔。
(4)向每个孔中均加入50μL的1％鸡红细胞悬液,混匀后室温静置30min。
(5)观察结果:以++++,+++,++,+表示,一层红细胞均匀铺于孔上者为++++,基本同上,边缘不整齐,面积稍小者为+++,红细胞形成一个环状,边缘不光滑,四周有小凝块记为++,红细胞孔底形成一个小团,边缘光滑并有立体感,将板倾斜片刻,就可见红细胞滑动像人的眼泪样都为—。
(6)血凝效价的计算：结果以++为终点,即为一个凝集单位。最高稀释度病毒能引起++的为红细胞凝集终点,此稀释度的倒数为红细胞凝集效价简称血凝效价。
结果表明：重组A型HIN1亚型流感减毒病毒感染72h后均使MDCK产生变圆、死亡、小块脱落并以丝相连等特征性病变。
进一步用SPF鸡胚(或细胞)传代20代，A/California/7/2009毒株(2013-2014野毒株NIBSC code：12/174)做对照。HA试验检测每批次鸡胚(或细胞)的血凝效价，对每代次取平均值。
HA试验结果如表3所示：重组A型HIN1亚型流感减毒病毒的鸡胚平均HA效价范围为1:210-1:211，对照毒株A/California/7/2009的鸡胚平均HA效价范围为1:210-1:211。说明重组A型HIN1亚型流感减毒病毒对鸡胚(或细胞)有很好的感染性。
表3、重组A型HIN1流感减毒病毒和A/California/7/2009用鸡胚传平均HA效价
注：F1-代表第2代、F2-代表第6代、F3-代表第12代、F4-代表第20代，AH1-表示重
组A型H1N1亚型流感减毒病毒，NC代表A/California/7/2009。
同时对重组A型HIN1亚型流感减毒病毒的EID50(重组A型HIN1亚型流感减毒病毒每一代尿囊液作10倍递进稀释，经尿囊腔接种于10日龄非免疫鸡胚，每个稀释度接种4个胚，每胚0.2mL、35C培养，取出24h后的死胚和培养至84h的胚，血凝效价在1:16以上的判定为鸡胚感染阳性，用Reed-Muench法计算EID50。)和序列进行分析。
结果表明：传20代后重组A型HIN1亚型流感减毒病毒的EID50分别为10-11/0.2ml，且序列分析结果显示重组A型HIN1亚型流感减毒病毒均无基因突变。
上述结果均表明重组A型HIN1亚型流感减毒病毒具有很好的稳定性。
4、鸡胚半数感染剂量(EID50)的测定
将共转染产生的上述二1制备的重组A型HIN1亚型流感减毒病毒和野生型病毒A/California/7/2009(购自NIBSC)的第1代尿囊液作10倍递进稀释，经尿囊腔接种于10日龄非免疫鸡胚，每个稀释度接种4个胚，每胚0.2mL、25-33℃培养，取出24h后的死胚和培养至84h的胚，血凝效价在1:16以上的判定为鸡胚感染阳性，用Reed-Muench法计算EID50。
结果表明：共转染产生的重组A型HIN1亚型流感减毒病毒的EID50为10-7/0.2mL。鸡胚感染和死亡情况见表4。说明获得重组A型HIN1亚型流感减毒病毒较野生病毒株相比，EID50较低，具有良好的安全性。
表4、EID50测定中鸡胚感染和死亡数(n/4)
注：AH1表示重组A型H1N1亚型流感减毒病毒，NC代表A/California/7/2009。
5、电镜观察重组流感减毒病毒形态
用上述二的1制备的重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、感染MDCK细胞，72小时后分别用负染法。具体步骤：将病毒悬液滴于支持膜的铜网上，静止20min，用镊子将铜网移至载玻片另一端，自然半干时，滴加2％磷钨酸染液染2-3min，用滤纸吸取多余染液，透射电镜下观察。结果见图2。
结果表明：重组A型HIN1亚型流感减毒病毒的形态与野生型病毒无任何差异，符合流感病毒典型特征，具有包膜，直径在80-120nm之间。
6、重组流感减毒病毒的安全性
按照2005年版《中国生物制品规程》要求，对不同代次重组A型HIN1亚型流感减毒病毒进行安全性实验(无菌实验、毒力实验、外源致热原)。
结果表明：无菌实验、毒力实验、外源致热原的检测结果均为阴性，说明重组A型HIN1亚型流感减毒病毒作为疫苗株具有很好的安全性。
7、重组流感减毒病毒的敏感及冷适应性
在不同的温度培养条件下测定上述二的1制备的重组A型HIN1亚型流感减毒病毒的TCID50滴度。在不同的温度条件下，在96孔板内用重组流感减毒病毒感染细胞的CPE来决定TCID50滴度，具体步骤如下：
用含有5％的FCS(HYCLONE)的MEM(SIGMA)(每95mLMEM培养基中加入5mLFCS)悬浮PCK(primary chicken kidney)细胞(ATCC编号：CRL-12203TM)，并将其种植于96孔板，48h后单克隆细胞数需达到90％以上，用含有1mM L-谷氨酰胺的非必需氨基酸的无血清的MEM来洗细胞l h。然后种植96孔板，稀释10倍的病毒样品(重组A型HIN1亚型流感减毒病毒)来感染96孔板中的细胞，设6个孔。以未加病毒的细胞做阴性对照，也设6个孔；以冷适应病毒及温度敏感毒株A/AnnArbor/6/60为阳性对照。为了决定重组减毒病毒的温度敏感性，加入病毒的板子分别在33℃、37℃的温度条件的CO2孵箱内培养6天，测定其冷适应性需要在25C培养10天。病毒滴度用Karber方法计算，用log10平均值(n＝4)TCID50Titer/ml土SD来表示。此值在33-37C之间的不同代表温度敏感现象，在25-33℃之间的差异代表冷适应性。结果如表5：重组A型HIN1亚型流感减毒病毒既有温度敏感现象，又有冷适应性。25-33℃之间病毒滴度的差异在0.3-0.4log10，说明了其具有冷适应性。37℃病毒生长滴度小于33℃病毒滴度21og10，33-37℃之间病毒滴度的差异在原病毒和重组病毒之间的差异是3.4-3.71og10。说明重组A型HIN1亚型流感病毒在人体温下不会大量繁殖，可以直接用于流感减毒疫苗的生产。
表5、重组流感减毒病毒株温度敏感及冷适应型结果
注：Ca-ts代表冷适应性和温度敏感性，NC代表A/California/7/2009
总之，证明本发明用单质粒拯救流感病毒转染效率高，具有很高的滴度和很好的稳定性；无菌实验、毒力实验、外源致热原的检测结果均为阴性，说明重组A型HIN1亚型流感减毒病毒作为疫苗株具有很好的安全性；重组流感减毒病毒株温度敏感及冷适应型结果也表明在人体温下不会大量繁殖，可以直接用于流感减毒疫苗的生产。
因此，也可以用本发明的方法制备其他流感病毒，包括甲型和乙型流感病毒。根据实施例一，利用流感病毒野毒株A/Teaxs/50/2012(H3N2)、B/Massachusetts/2/2012-like和B/Brisbane/60/2008(编号分别为X223、NYMCBX-51B或NIB/58)分别制备了上述三株流感病毒疫苗株。
实施例2、重组流感四价减毒活疫苗病毒的制备
本实施例中的重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒、重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒均是按照实施例1方法转染C0S1/MDCK细胞得到的重组病毒。
其中重组A型H3N2亚型流感减毒病毒，利用A/Teaxs/50/2012(编号为X223)毒株的HA/NA基因和A/AnnArbor/6/60冷适应株的骨架基因按照实施例1方法构建一质粒系统拯救得到的重组A型H3N2亚型流感减毒病毒。
其中重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒，利用B/Massachusetts/2/2012-like和B/Brisbane/60/2008(编号分别为NYMCBX-51B或NIB/58)毒株的HA/NA基因和B/AnnArbor/1/66冷适应株的骨架基因按照实施例1方法构建一质粒系统拯救得到的重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒。
其中流感病毒冷适应株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66均购自中国华兰生物工程股份有限公司。A/California/7/2009(H1N1)、A/Teaxs/50/2012(H3N2)、B/Massachusetts/2/2012-like和B/Brisbane/60/2008均购自NIBSC
一、重组流感四价减毒活疫苗病毒的制备
1、病毒接种液的制备
用PBS溶液(0.01mol/L，pH7.2)分别将上述实施例1中的重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒进行1:104稀释，分别得到各病毒接种液。
2、接种
分别用步骤1得到的各病毒接种液接种9-11日龄鸡的鸡胚。每个鸡胚接种0.2mL的病毒接种液，接种好病毒的鸡胚在33℃下孵育48-96小时，在结束时，把鸡胚放在2-8℃冰箱12-60小时使鸡胚冻死。
3、流感病毒的收获
从冻死的鸡胚中收获尿囊液，通常一个鸡胚可以收获8-10mL。收获的鸡胚尿囊液4000-14000g离心。
4、纯化
将尿囊液离心后用超滤包(MW为20KD)浓缩全病毒液，蔗糖梯度超速离心或柱层析进行纯化，分别得到纯化后的重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒。
5、对纯化的重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒进行病毒滴度、HA含量、外源因子、纯度等理化性质检测。检测结果如表6所示，检测合格用于流感四价减毒活疫苗的制备。
表6、重组流感减毒病毒的理化性质检测结果
二、细胞培养生产流感四价减毒活疫苗病毒
1、微载体大规模培养MDCK细胞生产重组流感减毒病毒株
分别将上述实施例1中的重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒按照接毒剂量为MOI＝0.001-0.008接种到生长在24孔板上的含有TPCK-胰酶(TPCK-胰酶终浓度为1ug/ml)的MDCK细胞培养液(MDCK细胞培养液为实施例1中的MDCK细胞培养体系，该培养液pH值为7.4)中进行增殖培养，分别得到培养后的流感病毒，并检测接毒后不同时间的病毒血凝素滴度(HA)。
结果表明：重组流感减毒病毒株适应在用微载体大规模培养的MDCK细胞内大量增殖，病毒的最高血凝效价可达到1:512。
2、流感减毒活病毒的纯化
将细胞培养后的流感病毒用超滤包、蔗糖梯度超速离心或柱层析，进行浓缩和纯化，得到纯化后的重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒，以用于疫苗流感病毒的制备。
实施例3、重组流感四价减毒活疫苗的制备与效果评价
1、重组流感四价减毒活疫苗
将实施例2的步骤一获得的纯化后的重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒、重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victorialineage系流感减毒病毒以HA含量1:1:1:1的质量比混合，得到重组流感四价减毒活疫苗；向重组流感四价减毒活疫苗中加入保护剂(质量分数为0.1-0.5％海藻糖或壳聚糖，质量分数为0.1-0.3％明胶，质量分数为0.2-0.8％蔗糖，质量分数为0.1-0.3％乳胶蛋白和质量分数为0.1-0.8％白蛋白)，制备得到重组流感四价减毒活疫苗的滴鼻剂，或不加佐剂制备成注射剂型，或加入10-20％CTB制备成透皮剂型。
重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒、重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒分别制成重组A型H1N1亚型流感减毒活疫苗(重组H1N1流感病毒减毒活疫苗)、重组A型H3N2亚型流感减毒活疫苗(重组H3N2流感病毒减毒活疫苗)或重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒活疫苗的滴鼻剂、注射剂或透皮剂。
2、疫苗的免疫原性评价
将上述步骤1制备的重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1亚型流感减毒活疫苗、重组A型H3N2亚型流感减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒活疫苗分别进行喷鼻粘膜免疫，同时以A/AnnArbor/6/60作为重组A型H1N1亚型流感病毒减毒活疫苗和重组A型H3N2亚型流感病毒减毒活疫苗的阳性对照，B/AnnArbor/1/66作为重组B型流感病毒减毒活疫苗的阳性对照，流感三价灭活疫苗(购自中国天坛药业)作为重组流感四价减毒活疫苗的阳性对照，以未接种病毒的鸡胚尿囊液为阴性对照。免疫方案如表7。具体步骤如下：
表7、小鼠免疫方案
注：5×106EID50相当于50μg HA。
分别于0d、28d喷鼻免疫Balb/c小鼠二次，于第42天取动物的唾液、肺脏及血清标本，测定每份标本的抗体效价，用0.5mL PBS注入小鼠口腔，收集唾液测定其IgA含量，肺组织裂解标本的制备：处死小鼠，打开喉部，取出肺脏并用PBS清洗，研磨肺组织并离心匀浆去处细胞组织，收集上清液并储存于-20℃，用于IgA效价测定。IgG和IgA效价测定使用商品化甲型或乙型流感病毒ELISA检测试剂盒(Genzyme Virotech)。37℃孵育2小时后加入羊抗鼠IgG或IgA抗体(Pharmigen)及底物液和显色液检测特异性IgG和IgA抗体效价。HAI效价测定：取小鼠血液，按照Palmer et al指定方法测定甲型和乙型流感病毒HAI(红细胞凝集抑制实验)效价。
唾液、血清及肺组织裂解物中IgA抗体效价和血清中IgG与HAI效价测定结果如表8所示。结果表明：重组流感四价减毒活疫苗免疫原性好于重组A型H1N1亚型流感减毒活疫苗、重组A型H3N2亚型流感减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗的效果，且重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1亚型流感减毒活疫苗、重组A型H3N2亚型流感减毒活疫苗和重组B型流感病毒活疫苗都好于流感三价灭活疫苗的效果。
表8、鼻粘膜免疫后抗体滴度的检测
3、疫苗免疫保护效果评价
将上述步骤1制备的重组流感四价减毒活疫苗、重组流感三价减毒活疫苗(专利授权公告号为CN1810961)、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗分别喷鼻免疫动物二次后14d，用50LD50甲、乙型流感病毒野生株A/California/7/2009(编号：12/174，购自NIBSC)、B/Massachusetts/2/2012(编号：13/134，购自NIBSC)气溶胶攻击，检测其免疫保护效果。以流感三价灭活疫苗(购自中国天坛药业)为对照。
免疫保护效果如表9所示：重组流感四价减毒疫苗的保护率高于重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗、重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗和重组流感三价减毒活疫苗(专利授权公告号为CN1810961)，且重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗的保护率均高于流感三价灭活疫苗。
表9、重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1、H3N2和重组B型流感病毒减毒活疫苗和流感三价灭活疫苗的免疫保护效果
4、疫苗的稳定性评价
在不同温度下检测上述步骤1制备的重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗、重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗的稳定性(病毒形态、HA特异性含量与最初的量、病毒滴度)。
通过电镜观察病毒形态、HA特异性含量与最初的量、病毒滴度可知，重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗、重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗放-70℃可保存二年，-20℃可保存一年，4℃可保存三个月，表明重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗和重组B型流感病毒减毒活疫苗具有很好的稳定性。
5、疫苗的安全性评价
将上述步骤1制备的重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗、重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗通过喷鼻或腹腔分别免疫Balb/c小鼠、SD大鼠、豚鼠和雪貂。免疫剂量是0.5-1.0mL，共三次。
免疫结果表明：免疫后的动物均没有出现异常毒性和过敏反应，表明重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗、重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗均具有很好的安全性。
序列表
<110>长春海基亚生物技术股份有限公司 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
<120>一质粒拯救系统用于流感病毒疫苗株的制备及应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 60
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 120
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 180
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 240
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 300
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 360
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 420
aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat 480
gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 540
agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 600
catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 660
ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 720
atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 780
ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 840
gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 900
ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 960
ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 1020
gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1080
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 1140
gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 1200
ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1260
gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 1320
gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 1380
caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 1440
cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 1500
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1560
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 1620
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 1680
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 1740
agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 1800
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 1860
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 1920
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 1980
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2040
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2100
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2160
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2220
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2280
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2340
cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg 2400
cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct 2460
ggcaaaatcg gttacggttg agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga 2520
caataaagtc ttaaactgaa caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag 2580
acagaatagt tgtaaactga aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt 2640
tgttatggct aaagcaaact cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga 2700
ggggcgtggc caagggcatg gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac 2760
aactccgcgg ccgggaagcc gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg 2820
tcgatatcaa agtgcatcac ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg 2880
ggatcgtcac cgtaatctgc ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca 2940
tgcttgagga gattgatgag cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact 3000
gcgagatcat agatatagat ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc 3060
gcgagagcgc caacaaccgc ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta 3120
cggagcaagt tcccgaggta atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct 3180
ccgaactcac gaccgaaaag atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg 3240
agcctacatg tgcgaatgat gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg 3300
ccctgctgcg taacatcgtt gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca 3360
tcgacccacg gcgtaacgcg cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa 3420
acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa 3480
ggttctggac cagttgcgtg agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca 3540
ggcttatgtc aactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac 3600
cttgggcagc agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc 3660
ggtctccacg catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg 3720
cacggatctg ccctggcttc aggagatcgg aagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt 3780
ggtgctgacc ccggatgaag tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt 3840
gttcgcccag gactctagct atagttctag tggttggcta cgtatactcc ggaatattaa 3900
tagggatccc ggtccgaagc gcgcggaatt caaaggccta cgtcgacgag ctcactagtc 3960
gcggccgctt tcgaatctag agcctgcagt ctcgaggcat gcggtaccaa gcttgtcgag 4020
aagtactaga ggatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa 4080
aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac 4140
ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 4200
aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 4260
catgtctgga tctgatcact gcttgagcct aggagatccg aaccagataa gtgaaatcta 4320
gttccaaact attttgtcat ttttaatttt cgtattagct tacgacgcta cacccagttc 4380
ccatctattt tgtcactctt ccctaaataa tccttaaaaa ctccatttcc acccctccca 4440
gttcccaact attttgtccg cccacagcgg ggcatttttc ttcctgttat gtttttaatc 4500
aaacatcctg ccaactccat gtgacaaacc gtcatcttcg gctacttttt ctctgtcaca 4560
gaatgaaaat ttttctgtca tctcttcgtt attaatgttt gtaattgact gaatatcaac 4620
gcttatttgc agcctgaatg gcgaatgg 4648
<210> 2
<211> 3500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 60
aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 120
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tcgatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480
acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca ctgcttactg 540
gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctgttaacg ctagcagtta 600
accggagtac tggtcgacct ccgaagttgg gggggagcga aagcaggtca attatattca 660
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taacaaaaac cacagtggac catatggcca taattaagaa gtacacatca gggaggcagg 780
aaaagaaccc gtcacttagg atgaaatgga tgatggcaat gaaatatccg attacagccg 840
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atagaaatgg accaatgaca agtacggttc attatccaaa aatctacaaa acttattttg 1020
agaaagtcga aaggttaaaa catggaacct ttggccctgt ccattttaga aaccaagtca 1080
aaatacgccg aagagttgac ataaatcctg gtcatgcaga cctcagtgcc aaggaggcac 1140
aggatgtaat catggaagtt gttttcccta acgaagtggg ggccaggata ctaacgtcgg 1200
aatcgcaatt aacaataacc aaagagaaaa aagaagaact ccaggattgc aaaatttcac 1260
ctttgatggt tgcgtacatg ttagagagag aacttgtccg aaaaacgaga tttctcccag 1320
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gattgattca gctgattgtg agtggaagag acgaacagtc gatagctgaa gcaataattg 1860
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tcgttaatag ggcaaatcag cgattgaatc ccatgcatca acttttaaga cattttcaga 1980
aggatgcgaa agtgcttttt caaaattggg gaattgaaca tatcgacaat gtgatgggaa 2040
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cctttgcagc cgccccacca aagcaaagta gaatgcagtt ctcttcactg actgtgaatg 2580
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cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag 3300
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<210> 3
<211> 3500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400>3
gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 60
aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 120
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tcgatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480
acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca ctgcttactg 540
gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctgttaacg ctagcagtta 600
accggagtac tggtcgacct ccgaagttgg gggggagcga aagcaggcaa accatttgaa 660
tggatgtcaa tccgacctta cttttcttga aagttccagc gcaaaatgcc ataagtacta 720
cattccctta tactggagat cctccataca gccatgggac aggaacagga tacaccatgg 780
acacagtcaa cagaacacat caatattcaa aaaaggggaa gtggacaaca aacacggaaa 840
ctggagcgca ccaacttaac ccaattgatg gaccactacc tgaggacaat gaaccaagtg 900
gatatgcaca aacagactgc gtcctggaag caatggcttt ccttgaagaa tcccacccag 960
gaatctttga aaactcgtgt cttgaaacga tggaagttat tcaacaaaca agagtggaca 1020
aactgaccca aggtcgtcag acctatgatt ggacattgaa cagaaatcag ccggctgcaa 1080
ctgcgctagc caacactata gaggtcttca gatcgaatgg tctgacagct aatgaatcgg 1140
gaaggctaat agatttcctc aaggatgtgg tagaatcaat ggataaagag gagatggaaa 1200
tcacaacaca cttccaaaga aaaagaagag taagagacaa catgaccaag aaaatggtca 1260
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ctataatgtt ctcaaataaa atggcaagac tagggaaagg atacatgttc aaaagcaaga 1740
gcatgaagct ccgaacacaa ataccagcag aaatgctagc aagtattgac ctgaaatact 1800
ttaatgaatc aacaagaaag aaaatcgagg aaataaggcc tctcctaata gatggcacag 1860
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aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 120
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tcgatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480
acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca ctgcttactg 540
gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctgttaacg ctagcagtta 600
accggagtac tggtcgacct ccgaagttgg gggggatgaa tccaaaccaa aagataataa 660
ccattggttc ggtctgtatg acaattggaa tggctaactt aatattacaa attggaaaca 720
taatctcaat atggattagc cactcaattc aacttgggaa tcaaaatcag attgaaacat 780
gcaatcaaag cgtcattact tatgaaaaca acacttgggt aaatcagaca tatgttaaca 840
tcagcaacac caactttgct gctggacagt cagtggtttc cgtgaaatta gcgggcaatt 900
cctctctctg ccctgttagt ggatgggcta tatacagtaa agacaacagt gtaagaatcg 960
gttccaaggg ggatgtgttt gtcataaggg aaccattcat atcatgctcc cccttggaat 1020
gcagaacctt cttcttgact caaggggcct tgctaaatga caaacattcc aatggaacca 1080
ttaaagacag gagcccatat cgaaccctaa tgagctgtcc tattggtgaa gttccctctc 1140
catacaactc aagatttgag tcagtcgctt ggtcagcaag tgcttgtcat gatggcatca 1200
attggctaac aattggaatt tctggcccag acaatggggc agtggctgtg ttaaagtaca 1260
acggcataat aacagacact atcaagagtt ggagaaacaa tatattgaga acacaagagt 1320
ctgaatgtgc atgtgtaaat ggttcttgct ttactgtaat gaccgatgga ccaagtaatg 1380
gacaggcctc atacaagatc ttcagaatag aaaagggaaa gatagtcaaa tcagtcgaaa 1440
tgaatgcccc taattatcac tatgaggaat gctcctgtta tcctgattct agtgaaatca 1500
catgtgtgtg cagggataac tggcatggct cgaatcgacc gtgggtgtct ttcaaccaga 1560
atctggaata tcagatagga tacatatgca gtgggatttt cggagacaat ccacgcccta 1620
atgataagac aggcagttgt ggtccagtat cgtctaatgg agcaaatgga gtaaaagggt 1680
tttcatacaa atatggcaat ggtgtttgga tagggagaac taaaagcatt agttcaagaa 1740
acggttttga gatgatttgg gatccgaacg gatggactgg gacagacaat aacttctcaa 1800
taaagcaaga tatcgtagga ataaatgagt ggtcaggata tagcgggagt tttgttcagc 1860
atccagaact aacagggctg gattgtataa gaccttgctt ctgggttgaa ctaatcagag 1920
ggcgacccaa agagaacaca atctggacta gcgggagcag catatccttt tgtggtgtaa 1980
acagtgacac tgtgggttgg tcttggccag acggtgctga gttgccattt accattgaca 2040
agtaaataac ccggcggccc aaaatgccga ctcggagcga aagatatacc tcccccgggg 2100
ccgggaggtc gcgtcaccga ccacgccgcc ggcccaggcg acgcgcgaca cggacacctg 2160
tccccaaaaa cgccaccatc gcagccacac acggagcgcc cggggccctc tggtcaaccc 2220
caggacacac gcgggagcag cgccgggccg gggacgccct cccggcggtc acctaaatgc 2280
tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 2340
ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 2400
tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 2460
gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg 2520
ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctgcattaat gaatcggcc 2569

Claims (10)

1.一种制备流感病毒疫苗的系统，包括表达流感病毒内部基因和流感病毒表面基因的单一质粒；
所述流感病毒内部基因为PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：
所述流感病毒的表面基因为血凝素基因HA和神经氨酸酶基因NA；
或，所述单一质粒从上游到下游依次包括PB2基因、PB1基因、NS基因、M基因、NP基因、PA基因、HA基因和NA基因。
3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于：
所述单一质粒为将PB2基因或其表达盒、PB1基因或其表达盒、NS基因或其表达盒、M基因或其表达盒、NP基因或其表达盒、PA基因或其表达盒、HA基因或其表达盒和NA基因或其表达盒导入骨架载体得到的质粒。
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于：
所述骨架载体为杆状病毒表达载体；
或，所述杆状病毒表达载体为敲除plh启动子的pFastBac1载体或者其它杆状病毒表达载体；
或，所述系统还包括Sf9昆虫细胞或者能组装杆状病毒的其它细胞；
或，所述流感病毒为A型流感病毒或B型流感病毒。
5.根据权利要求1-4中任一所述的系统，其特征在于：
所述单一质粒按照包括如下步骤的方法制备：
1)将PB2基因表达盒、PB1基因表达盒、PA基因表达盒、NP基因表达盒、M基因表达盒、NS基因表达盒和含有attRl和attR2位点的片段导入所述敲除plh启动子的pFastBac1载体中，得到供体质粒；
2)再将HA基因表达盒和NA基因表达盒替换所述供体质粒中attRl和attR2位点之间的DNA片段，得到表达A型流感病毒内部6个基因、血凝素基因HA和神经氨酸酶基因NA的质粒。
6.根据权利要求1-5中任一所述的系统，其特征在于：
所述PB2基因表达盒的核苷酸序列为序列2；
所述PB1基因表达盒的核苷酸序列为序列3；
所述PA基因表达盒的核苷酸序列为序列4；
所述NP基因表达盒的核苷酸序列为序列5；
所述M基因表达盒的核苷酸序列为序列6；
所述NS基因表达盒的核苷酸序列为序列7；
所述敲除plh启动子的pFastBac1载体的核苷酸序列为序列1；
所述HA基因表达盒的核苷酸序列为序列8；
所述NA基因表达盒的核苷酸序列为序列9。
7.权利要求1-6中任一所述系统在制备流感病毒疫苗中的应用。
8.一种制备流感病毒疫苗的方法，为利用权利要求1-6中任一所述系统中的表达流感病毒内部6个基因、血凝素基因和神经氨酸酶基因的质粒转染细胞，包装得到流感病毒疫苗。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述转染包括如下步骤：
1)将所述表达流感病毒内部6个基因、血凝素基因和神经氨酸酶基因的质粒转染Sf9昆虫细胞，包装得到重组杆状病毒；
2)再将所述重组杆状病毒转染目标细胞，包装得到流感病毒疫苗；
或所述目标细胞为293T细胞或cos1细胞或293T细胞和MDCK细胞的混合细胞或cos1细胞和MDCK细胞的混合细胞或者其它可用于转染的细胞。
10.由权利要求8或9制备的流感病毒减毒株，制备单价或多价疫苗，用于人或动物或禽类流感的免疫预防。
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