KR20200108514A - 신경 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

신경 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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케네쓰 피. 그린버그
네이더니엘 데이비드
미첼 에이치. 파이너
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코다 바이오테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 일반적으로 통증을 관리하는 것을 포함하여 신경 장애를 치료하기위한 벡터, 조성물 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 상기 조성물 및 방법은 통증, 간질 및 포만감 장애를 포함하는 신경 징후를 치료하기 위한 G 단백질-결합 수용체 및 리간드-개폐 이온 채널의 사용을 포함한다. 상기 조성물 및 방법은 신경 질환의 치료에서 G 단백질-결합 수용체 및 리간드-개폐 이온 채널을 활성화시키는 합성 리간드의 사용을 추가로 포함한다.

Description

신경 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법
본 발명은 일반적으로 수용체를 암호화하는 바이러스 벡터, 조성물, 및 통증을 조절하는 것을 포함하여 신경 장애를 치료하기 위한 관련 사용 방법에 관한 것이다.
전세계적으로 수억명의 사람들이 신경 장애에 의해 영향을 받는다. 현재 사람들에게 영향을 미치는 600개 이상의 상이한 신경 장애가 있는 것으로 추정된다. 약 620만명이 매년 뇌졸중으로 사망하며 저소득 및 중산층 국가에서 사망자의 80% 이상을 차지한다. 5천만명 이상의 사람들이 전세계적으로 간질을 앓고 있다. 전 세계적으로 3,560만명의 치매 환자가 있으며 매년 770만의 새로운 케이스가 발생하는 것으로 추정된다. 알츠하이머 병은 치매의 가장 흔한 원인이며 케이스의 60-70%의 원인이 될 것이다. 편두통의 유행은 전 세계적으로 10% 이상이다. 1억천만명 이상의 미국인이 만성 통증을 앓고 있다. 신경 장애의 재정적 부담은 상당하다. 미국에서만, 신경 장애 치료 비용은 연간 8천억 달러가 넘는 것으로 추정된다. 신경 장애 치료에 대한 전세계적인 비용은 2030년까지 6조 달러를 초과하는 것으로 추정된다.
만성 통증은 신경 장애의 한 유형이다. 완화되지 않는 만성 통증은 미국과 전세계에서 치명적인 건강 문제이다. 의학 연구소(Institute of Medicine)의 보고서에 따르면 1억1600만명의 미국인이 수주 내지 수년 동안 동안 계속되는 고통을 앓고 있고 최종 연간 비용은 5억6000만 달러를 넘는다. 만성 통증 환자에게는 적절한 장기 치료법이 없기 때문에 사회와 개인 모두에게 상당한 비용이 발생한다. 통증은 종종 장애를 초래하고 장애를 초래하지 않더라도 삶의 질에 지대한 영향을 미친다. 세심한 잘 훈련된 의사; 마취제에 대한 재빠른 접근; 보조 진통제의 사용; 환자 제어 진통제의 이용성; 및 신경 차단 및 IT 펌프와 같은 절차의 증거 기반 사용과 같은 진료 전달 상황이 최적일 때조차 통증 치료는 자주 실패한다.
만성 통증에 대해 가장 일반적으로 사용되는 치료법은 아편 유사 진통제 및 비 스테로이드성 소염제의 적용이지만, 이들 약물은 중독을 유발할 수 있고, 약물 의존성, 내성, 호흡 억제, 진정 작용, 인지 장애, 환각 및 다른 전신 부작용과 같은 부작용을 유발할 수 있다. 의약품의 폭넓은 사용에도 불구하고, 통증 완화에 대한 효과는 놀랍도록 성공률이 낮다. 다양한 약물을 사용하는 대규모 무작위 연구는 2 또는 3명 중 1명만이 적어도 50% 통증 완화를 달성하였다(Finnerup et al., 2005). 가장 많이 개발된 약리학적 치료법을 사용한 추적 조사 결과는 동일한 결과를 발견하였으며 통증 치료제의 효능에 개선이 없음을 나타내었다(Finnerup et al., Pain, 150(3): 573-81, 2010).
통증의 치료를 위한 보다 침습적인 옵션은 신경 차단 및 전기 자극을 포함한다. 신경 차단은 일반적으로 뇌에 대한 통증 신호를 방해하는 척수의 국소 마취 주사이며, 그 효과는 수 주에서 수개월까지 지속된다. 신경 차단은 대부분의 경우 권장되는 치료 옵션이 아니다(Mailis and Taenzer, Pain Res Manag. 17(3): 150-158, 2012). 전기 자극은 통증 신호를 차단하기 위해 전류를 공급하는 것을 포함한다. 이 효과는 신경 차단보다 오래 지속될 수 있지만 전기 리드 자체로 인해 문제가 발생한다: 전위, 오염, 파손 또는 배터리 소멸. 한 가지 리뷰는 신경병증에 대해 전기 자극을 받은 환자의 40%가 이 기기에 대해 이러한 문제 중 하나 이상을 경험하였다(Wolter, 2014).
통증을 관리하기 위한 가장 침습적이며 바람직하지 않은 방법은 통증을 유발하는 신경 또는 그 부분의 왼전한 외과적 제거이다. 이 옵션은 환자가 이전 및 덜 침습적인 치료법을 모두 소진하고 효과가 없다고 판단한 경우에만 권장된다. 고주파 신경 절제는 열을 사용하여 문제가되는 신경을 파괴하고 신경 차단보다 긴 통증 완화를 제공한다. 그러나 한 연구는 만성적인 요추 관절 통증에 대한 DRG의 부분적인 고주파 열응고술에서 대조군과 치료군 사이에 차이가 없다고 보고하였다(Geurts et al., 2003). 통증 신경을 외과적으로 제거하기 위한 다른 수술 방법은 유사한 단점이 있으며 감각이나 운동 장애를 포함하는 장기간의 심각한 부작용이 있거나 다른 곳에서 통증을 유발한다.
신경 장애의 치료 방법은 안전하고 효율적이며 비용면에서 효율적이어야 한다. 유전자 요법은 통증 관리를 포함하는 다양한 신경 질환에 대한 비 침습적 치료 옵션을 제공할 수 있다. 그러나, 현재까지, 유전자 치료법은 신경 질환의 치료에 널리 사용되지 않았다. 유전자 치료에 대한 핵심은 특정 세포 유형에서 관련 표적을 과발현하거나 억제하기 위한 치료 유전자를 전달할 수 있는 안전하고 효율적인 유전자 전달 시스템을 선택하는 것이다.
그러나, 안전하고 효율적인 것으로 입증된 전달 시스템은 극히 드물다; 따라서, 통증 관리를 포함하는 신경 장애를 치료하기 위한 유전자 요법의 가능성은 아직 실현되지 않았다.
본 발명은 신경 장애 및 질환의 유전자 치료에 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 관련 조성물을 제공한다. 한 실시태양에서, 신경 장애는 통증(예를 들어, 만성 또는 급성 통증)이다.
한 양태에서, 신경 질환을 앓는 대상에게 생물학적으로 비활성인 제제 또는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시태양에서, 신경 질환은 간질이 아니다. 일부 경우에, 대상은 G 단백질-결합 수용체 또는 리간드-개폐 이온 채널(LGIC)을 이종성으로 발현한다. 일부 경우에, 대상은 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 상동성으로 발현한다. 일부 경우에, 대상은 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 전위성으로 발현한다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체는 디자이너 드럭(Designer Drug)에 의해 독점적으로 활성화되는 디자이너 수용체(Designer Receptor)(DREADD)이다. 일부 예에서, DREADD는 hM4Di, hM3Dq, AlstR 또는 KOR-DREADD이다. 일부 경우에, LGIC는 GlyR-M, GluCl, PSAM-5HT3HC, PSAM-GlyR, PSAM-nAChR, TRPV1 또는 GABAA이다. 일부 경우에, 생물학적으로 불활성인 제제는 클로자핀-N-옥사이드(CNO), 날프라핀(C28H32N2O5), 살비노린 B, 알라토스타틴, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀이다. 일부 경우에, 약물은 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에피리노멕틴, 아바멕틴, 목시덱틴, PSEM22S, PSEM89S, PSEM9S, 캡사이신 또는 졸피뎀이다. 일부 실시태양에서, 상기 신경 질환을 앓고 있는 대상에게 클로자핀-N-옥사이드인 생물학적으로 불활성인 제제를 투여하는 단계를 포함하는 간질이 아닌 신경 질환의 치료 방법이 제공되며, 상기 대상은 hM4Di를 발현한다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 생물학적으로 비활성인 제제 또는 약물에 의해 활성화된다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 스위치 수용체이다. 일부 경우에, 상기 방법은, 상기 투여 전에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 핵산 분자는 바이러스 벡터에서 대상에게 전달된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터이다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9로부터 유도된다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV6(Y705+731F+T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 대상에게 전달된다. 일부 예에서, 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사이다. 일부 경우에, 신경 질환은 통증이다. 일부 경우에, 신경 질환은 포만감 장애이다. 일부 경우에, 포만감 장애는 비만증, 신경성 식욕 부진증 또는 신경성 대식증이다. 일부 경우에, 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암이다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체는 Gi- 또는 Gq-결합된다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 흥분성 세포에서 선택적으로 발현된다. 일부 경우에, 흥분성 세포는 뉴런 또는 근육 세포이다. 일부 경우에, 뉴런은 후근 신경절 또는 감각 뉴런이다. 일부 경우에, 투여는 경구, 척수강내 또는 국소 투여를 포함한다. 일부 경우에, 전달은 척수강내, 신경절내, 두개내, 피하, 척추내, 대수조 또는 신경내 전달을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적으로 비활성인 제제 또는 약물은 상기 전달의 적어도 일주일 후에 투여된다. 일부 경우에, 생물학적으로 비활성인 제제 또는 약물은 0.001㎍/㎏ 내지 10mg/㎏의 투여량으로 투여된다. 일부 경우에, 핵산 분자는 시냅신, TRPV1, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, CamKII, NSE 또는 Advillin 프로모터를 포함한다. 일부 경우에, 대상은 사람이다. 일부 경우에, 대상은 가축 동물이다.
또 다른 양태에서, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법이 제공되며, 여기서 약물은 생물학적으로 비활성인 제제 또는 합성 리간드이다. 일부 양태에서, 신경 질환은 간질이 아니다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체는 DREADD이다. 일부 경우에, DREADD는 hM4Di, hM3Dq, AlstR 또는 KOR-DREADD이다. 일부 경우에, LGIC는 GlyR-M, GluCl, PSAM-5HT3HC, PSAM-GlyR, PSAM-nAChR, TRPV1 또는 GABAA이다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 스위치 수용체이다. 일부 경우에, 생물학적으로 불활성인 제제는 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀(C28H32N2O5), 살비노린 B, 알라토스타틴, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀이다. 일부 경우에, 약물은 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴틴, 에마멕틴, 에피리노멕틴, 아바멕틴, 목시덱틴, PSEM22S, PSEM89S, PSEM9S, 캡사이신 또는 졸피뎀이다. 일부 경우에, 투여는 경구, 척수강내 또는 국소 투여를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 투여 전에 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 핵산 분자는 바이러스 벡터에서 대상에게 전달된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터이다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9로부터 유도된다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV6(Y705+731F+T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 대상에게 전달된다. 일부 예에서, 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사이다. 일부 경우에, 신경 질환은 통증이다. 일부 경우에, 신경 질환은 포만감 장애이다. 일부 예에서, 포만감 장애는 비만증, 신경성 식욕 부진증 또는 신경성 대식증이다. 다른 경우에, 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암이다. 일부 경우에, 핵산 분자는 시냅신, TRPV1, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, CamKII, NSE 또는 Advillin 프로모터를 포함한다.
또 다른 양태에서, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법이 제공되며, 여기서 약물은 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC에 대한 내인성 리간드가 아니다. 일부 경우에서, 신경 질환은 간질이 아니다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체는 hM4Di, hM3Dq, AlstR 또는 KOR-DREADD이다. 일부 경우에, LGIC는 GlyR-M, GluCl, PSAM-5HT3HC, PSAM-GlyR, PSAM-nAChR, TRPV1 또는 GABAA이다. 일부 경우에, 약물은 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀(C28H32N2O5), 살비노린 B, 알라토스타틴, 클로자핀, 올란자핀, 퍼라핀, 플루퍼라핀, 알로세트론, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀이다. 일부 경우에, 약물은 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에피리노멕틴, 아바멕틴, 목시덱틴, PSEM22S, PSEM89S, PSEM9S, 캡사이신 또는 졸피뎀이다. 일부 경우에, 상기 방법은, 투여 전에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 흥분성 세포에서 선택적으로 발현된다. 일부 경우에, 흥분성 세포는 뉴런 또는 근육 세포를 포함한다. 일부 경우에, 뉴런은 감각 신경, 후근 신경절 또는 삼차 신경절을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 전달된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터이다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9로부터 유도된다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV6(Y705+731F+T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8이다. 일부 경우에, 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 대상에게 전달된다. 일부 경우에서, 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사이다. 일부 경우에, 약물은 합성 리간드이다. 일부 경우에, 약물은 0.001㎍/㎏ 내지 10mg/㎏의 투여량으로 투여된다. 일부 경우에, 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 통증, 비만증, 식욕 부진, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암이다.
또 다른 양태에서, 다음 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법이 제공된다: G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계, 여기서 대상은 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 이종성으로 발현한다, 및 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 활성화하는 약물을 대상에게 투여하여, 대상에서 신경 질환을 치료하는 단계, 여기서 약물은 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자의 전달의 적어도 1주 후 대상에게 투여된다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 대상에게 전달된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터이다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9이다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV6(Y705 + 731F + T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8이다. 일부 경우에, 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 대상에게 전달된다. 일부 경우에서, 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사이다. 일부 경우에, 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 통증, 간질, 비만증, 식욕 부진, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암이다. 일부 경우에, 약물은 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀(C28H32N2O5), 살비노린 B, 알라토스타틴, 클로자핀, 올란자핀, 퍼라핀, 플루퍼라핀, 알로세트론, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀이다. 일부 경우에, 약물은 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에피리노멕틴, 아바멕틴, 목시덱틴, PSEM22S, PSEM89S, PSEM9S, 캡사이신 또는 졸피뎀이다. 일부 경우에, 약물은 0.001㎍/㎏ 내지 10mg/㎏의 투여량으로 투여된다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 흥분성 세포에서 선택적으로 발현된다. 일부 경우에, 흥분성 세포는 뉴런 또는 근육 세포이다. 일부 경우에, 뉴런은 감각 신경, 후근 신경절 또는 삼차 신경절이다. 일부 경우, 상기 방법은 적어도 3일 연속으로 매일 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 다음 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법이 제공된다: G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 활성화시키는 약물을 투여하는 단계, 여기서 약물은 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC에 대한 내인성 리간드가 아니다. 일부 실시태양에서, 약물은 카파-오피오이드 수용체-(KOR) 결합 약물이 아니다. 일부 경우에, 신경 질환이 간질이 아니다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체는 카파-오피오이드 수용체(KOR) 이외의 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 예에서, 이종 G 단백질-결합 수용체는 DREADD이다. 일부 경우에, DREADD는 hM4Di, hM3Dq, AlstR 또는 KOR-DREADD이다. 일부 경우에, LGIC는 GlyR-M, GluCl, PSAM-5HT3HC, PSAM-GlyR, PSAM-nAChR, TRPV1 또는 GABAA이다. 일부 경우에, 약물은 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀(C28H32N2O5), 살비노린 B, 알라토스타틴, 클로자핀, 올란자핀, 퍼라핀, 플루퍼라핀, 알로세트론, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀이다. 일부 경우에, 약물은 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에피리노멕틴, 아바멕틴, 목시덱틴, PSEM22S, PSEM89S, PSEM9S, 캡사이신 또는 졸피뎀이다. 일부 경우에, 상기 방법은, 투여 전에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 바이러스 벡터에 의해 전달된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9이다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV6(Y705+731F+T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8이다. 일부 경우에, 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 대상에게 전달된다. 일부 경우에서, 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사이다. 일부 경우에, 신경 질환은 통증이다. 다른 경우에, 신경 질환은 포만감 장애이다. 일부 예에서, 포만감 장애는 비만증, 신경성 식욕 부진증 또는 신경성 대식증이다. 다른 경우에, 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 통증, 간질, 비만증, 식욕 부진, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암이다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 흥분성 세포에서 선택적으로 발현된다. 일부 예에서, 흥분성 세포는 뉴런 또는 근육 세포이다. 일부 경우에, 뉴런은 감각 신경, 후근 신경절 또는 삼차 신경절이다. 일부 경우에, 투여는 경구, 척수강내 또는 국소 투여를 포함한다.
또 다른 양태에서, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법이 제공되며, 여기서 약물은 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC에 대한 내인성 리간드가 아니며, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 감각 뉴런, 후근 신경절, 삼차 신경절, 미주 신경, 뇌 또는 근육 세포에서 선택적으로 발현된다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체는 DREADD이다. 일부 예에서, DREADD는 hM4Di, hM3Dq, 또는 AlstR이다. 일부 경우에, LGIC는 GlyR-M, GluCl, PSAM-5HT3HC, PSAM-GlyR, PSAM-nAChR, TRPV1 또는 GABAA이다. 6일부 경우에, 약물은 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀(C28H32N2O5), 살비노린 B, 알라토스타틴, 클로자핀, 올란자핀, 퍼라핀, 플루퍼라핀, 알로세트론, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀이다. 일부 경우에, 약물은 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에피리노멕틴, 아바멕틴, 목시덱틴, PSEM22S, PSEM89S, PSEM9S, 캡사이신 또는 졸피뎀이다. 일부 경우에, 상기 방법은, 상기 투여 전에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 핵산 분자는 바이러스 벡터에서 대상에게 전달된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터이다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9로부터 유도된다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV6(Y705+731F+T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8이다. 일부 경우에, 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 대상에게 전달된다. 일부 경우에서, 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사이다. 일부 경우에, 신경 질환은 통증이다. 다른 경우에, 신경 질환은 통증이다. 일부 경우에, 신경 질환은 간질이다. 또 다른 경우에, 신경 질환은 포만감 장애이다. 일부 예에서, 포만감 장애는 비만증, 신경성 식욕 부진증 또는 신경성 대식증이다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체는 Gi- 또는 Gq-결합된다. 일부 경우에, 투여는 경구, 척수강내 또는 국소 투여를 포함한다. 일부 경우에, 전달은 척수강내, 신경절내, 두개내, 피하, 척추내, 대수조 또는 신경내 전달을 포함한다. 일부 경우에, 약물은 전달의 적어도 일주일 후에 투여된다. 일부 경우에, 약물은 0.001㎍/㎏ 내지 10mg/㎏의 투여량으로 투여된다. 일부 경우에, 핵산 분자는 시냅신, TRPV1, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, CamKII, NSE 또는 Advillin 프로모터를 포함한다. 일부 경우에, 대상은 사람이다.
또 다른 양태에서, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계, 및 대상에게 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 신경 질환을 치료하는 방법이 제공된다, 여기서 약물은 FDA 승인을 받았지만 신경 질환의 치료를 위해 FDA 승인을 받지 못했다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 대상에서 발현된다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 대상에서 이종성으로 발현된다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 대상에서 상동성으로 발현된다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC는 대상에서 전위성으로 발현된다. 일부 경우에, G 단백질-결합 수용체는 DREADD이다. 일부 예에서, DREADD는 hM4Di, hM3Dq, AlstR 또는 KOR-DREADD이다. 일부 경우에, LGIC는 GlyR-M, GluCl, PSAM-5HT3HC, PSAM-GlyR, PSAM-nAChR, TRPV1 또는 GABAA이다.
또 다른 양태에서, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법이 제공되며, 여기서 약물은 0.001㎍/㎏ 내지 10mg/㎏의 투여량으로 투여된다. 일부 경우에, 약물은 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀(C28H32N2O5), 살비노린 B, 알라토스타틴, 클로자핀, 올란자핀, 퍼라핀, 플루퍼라핀, 알로세트론, 클로자핀, 올란자핀, 퍼라핀, 플루퍼라핀, 알로세트론, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀이다. 일부 경우에, 약물은 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에피리노멕틴, 아바멕틴, 목시덱틴, PSEM22S, PSEM89S, PSEM9S, 캡사이신 또는 졸피뎀이다.
또 다른 양태에서, G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계 및 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 활성화시키는 약물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법이 제공되며, 여기서 약물은 전달 후 적어도 3일 연속으로 대상에게 투여된다. 일부 경우에, 약물은 전달 적어도 일주일 후에 대상에게 투여된다.
또 다른 양태에서, 리간드-개폐 이온 채널을 이종성으로 발현하는 대상에게 리간드-개폐 이온 채널을 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법이 제공된다. 일부 경우에, 약물은 글리신, 베타-알라닌 또는 타우린이 아니다. 일부 양태에서, 리간드-개폐 이온 채널은 본래 별개의 폴리펩타이드로 암호화된 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열의 융합에 의해 생성된 이온 전도 기공 도메인 및 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 cys 루프 수용체 유전자 패밀리의 2개 이상의 구성원을 포함한다. 한 실시태양에서, 이온 전도 기공 도메인은 음이온을 전도한다. 다른 실시태양에서, 이온 전도 기공 도메인은 양이온을 전도한다. 일부 경우에, 리간드 결합 도메인은 클로자핀-N-옥사이드, 클로자핀, 퍼라핀, 올란자핀, 알로세트론, 플루퍼라핀 또는 N4'-알킬 치환된 CNO 유사체의 결합에 의해 활성화된다. 특정 양태에서, 리간드 결합 도메인은 니코틴, 바레니클린 또는 갈란타민의 결합에 의해 활성화된다.
일부 경우에, 리간드-개폐 이온 채널은 GlyR-M, GluCl, PSAM-5HT3HC, PSAM-GlyR, PSAM-nAChR, TRPV1 또는 GABAA이다. 일부 경우에, 약물은 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에피리노멕틴, 아바멕틴, 목시덱틴, PSEM22S, PSEM89S, PSEM9S, 캡사이신 또는 졸피뎀이다. 일부 경우, 상기 방법은 투여 전에, 리간드-개폐 이온 채널을 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 핵산 분자는 바이러스 벡터에서 대상에게 전달된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터이다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9로부터 유도된다. 일부 예에서, AAV 벡터는 AAV6(Y705 + 731F + T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 대상에게 전달된다. 일부 예에서, 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사이다. 일부 경우에, 신경 질환은 통증이다. 다른 경우에, 신경 질환은 간질이다. 다른 경우에, 신경 질환은 포만감 장애이다. 일부 경우에, 포만감 장애는 비만증, 신경성 식욕 부진증 또는 신경성 대식증이다. 일부 다른 경우에, 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암이다. 일부 경우에, 리간드-개폐 이온 채널은 흥분성 세포에서 선택적으로 발현된다. 일부 경우에, 흥분성 세포는 뉴런 또는 근육 세포이다. 일부 경우에, 뉴런은 감각 신경, 후근 신경절 또는 삼차 신경절이다. 일부 경우에, 투여는 경구, 척수강내 또는 국소 투여를 포함한다. 다른 경우에, 전달은 척수강내, 신경절내, 두개내, 피하, 척추내, 대수조 또는 신경내 전달을 포함한다. 일부 경우에,약물은 전달의 적어도 일주일 후에 투여된다. 일부 경우에, 핵산 분자는 시냅신, TRPV1, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, CamKII, NSE 또는 Advillin 프로모터를 포함한다. 일부 경우에, 대상은 사람이다. 일부 경우에, 대상은 가축 동물이다.
다른 양태에서, 리간드-개폐 이온 채널을 이종성으로 발현하는 대상에게 리간드-개폐 이온 채널을 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법이 제공되며, 여기서 약물은 약물은 0.001㎍/㎏ 내지 10mg/㎏의 투여량으로 투여된다. 일부 경우에, 리간드-개폐 이온 채널은 GlyR-M, GluCl, PSAM-5HT3HC, PSAM-GlyR, PSAM-nAChR, TRPV1 또는 GABAA이다. 일부 경우에, 약물은 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에피리노멕틴, 아바멕틴, 목시덱틴, PSEM22S, PSEM89S, PSEM9S, 캡사이신 또는 졸피뎀이다. 일부 경우에, 신경 질환은 통증이다. 일부 경우에, 통증은 완화된다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 부분적으로, 신경 세포에서 작동 가능한 프로모터를 포함하는 AAV 벡터를 고려하며, 여기서 프로모터는 스위치 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된다.
특정 실시태양에서, 프로모터는 뉴런 특이적 프로모터이다.
일부 실시태양에서, 뉴런 특이적 프로모터는 삼차 신경절(TGG) 뉴런 또는 후부 신경절(DRG) 뉴런에서 작동 가능한 프로모터이다.
또 다른 실시태양에서, 뉴런 특이적 프로모터는 hSYN1 프로모터, 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II 프로모터, 튜불린 알파 I 프로모터, 뉴런-특이적 엔올라아제 프로모터, 혈소판-유도 성장 인자 베타 사슬 프로모터, TRPV1 프로모터, Nav1.7 프로모터, Nav1.8 프로모터, Nav1.9 프로모터, 또는 Advillin 프로모터이다.
특정 실시태양에서, 뉴런 특이적 프로모터는 hSYN1 프로모터이다.
추가 실시태양에서, 프로모터는 구조성 프로모터이다.
특정 실시태양에서, 구조성 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터, 바이러스 유사 바이러스 40(SV40), 모로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)(티미딘 키나아제) 프로모터, 천연두 바이러스로부터의 H5, P7.5 또는 P11 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세롤알데하이드 3-인산 탈수소효소(GAPDH), 진핵 세포 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열충격 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 충격 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/치킨 β-액틴(CAG) 프로모터, 또는 β-액틴 프로모터이다.
일부 실시태양에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다.
추가 실시태양에서, 유도성 프로모터는 테트라사이클린 반응 프로모터, 엑디손 반응 프로모터, 쿠메이트 반응 프로모터, 글루코코르티코이드 반응 프로모터, 에스트로겐 반응 프로모터, PPAR-γ 프로모터 또는 RU-486 반응 프로모터이다.
추가 실시태양에서, 스위치 수용체는 리간드-개폐 이온 채널 또는 G-결합 단백질 수용체를 포함한다.
특정 실시태양에서, 스위치 수용체의 활성은 세포외 리간드에 의해 조절된다.
특정 실시태양에서, 리간드는 비-천연적으로 발생되거나 합성된다.
추가 실시태양에서, 스위치 수용체를 발현하는 세포의 활성은 세포외 리간드가 스위치 수용체에 결합할 때 증가되며, 선택적으로 활성은 전기생리학적 활성이다.
특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 hM3Dq, GsD, PSAM-5HT3HC, PSAM-nAChR 또는 TRPV1로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 리간드는 PSEM22S, PSEM9S, 캡사이신, 클로자핀, 퍼라핀, 알로세트론, 플루퍼라핀, 날프라핀(C28H32N2O5), 올란자핀, 클로자핀-N-옥사이드, 클로자핀-N-옥사이드 유사체: 3-클로로-6-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4] 벤조다이아제핀, 4-(8-클로로-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀-11-일)-1,1-다이메틸피페라진-1-움 요오드화물, 3-클로로-6-(피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀, 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 및 11-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시태양에서, 스위치 수용체를 발현하는 세포의 활성은 세포외 리간드가 스위치 수용체에 결합할 때 감소되고, 선택적으로 활성은 전기생리학적 활성이다.
추가 실시태양에서, 스위치 수용체는 AlstR, hM4Di, KORD, GluCl, PSAM-GlyR, GlyR-M 및 GABA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 글리신 수용체(GlyR) 폴리펩타이드의 하나 이상의 서브 유닛을 포함한다.
일부 실시태양에서, 스위치 수용체는 글리신 수용체 α1 서브 유닛(GlyRα1) 폴리펩타이드를 포함한다.
추가의 실시태양에서, GlyRα1 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
특정 실시태양에서, GlyRα1 폴리펩타이드는 아미노산 치환 F207A 및 A288G를 포함한다. 일부 실시태양에서, 스위치 수용체는 다음 아미노산 치환의 하나 이상을 포함하는 GlyRα1 서브 유닛을 포함한다: A-1'E, P-2'Δ, T13'V, R19'E, F207A 및 A228G(Islam et al., ACS Chem. Neurosci., DOI: 10.1021/acschemneuro.6b00168 (2016) 참조). 한 실시태양에서, 스위치 수용체는 아미노산 치환체 A-1'E, F207A 및 A228G를 포함하는 GlyRα1 서브 유닛를 포함하고 리간드 이버멕틴에 특이적으로 결합한다. 다른 실시태양에서, 스위치 수용체는 아미노산 치환체 A-1'E, P-2'Δ, T13'V, F207A 및 A228G를 포함하는 GlyRα1 서브 유니트를 포함하고 리간드 이버멕틴에 특이적으로 결합한다.
특정 실시태양에서, 리간드는 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에프리노멕틴, 아바멕틴 및 목시덱틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시태양에서, 리간드는 이버멕틴이다.
스위치 수용체는 GluClα 또는 GluClβ 폴리펩타이드를 포함한다.
추가 실시태양에서, GluClα 또는 GluClβ 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
추가 실시태양에서, 리간드는 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에프리노멕틴, 아바멕틴 및 목시덱틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 PSAM-5HT3HC 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 실시태양에서, PSAM-5HT3HC 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
일부 실시태양에서, 리간드는 PSEM22S이다.
특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 PSAM-GlyR 폴리펩타이드를 포함한다.
추가의 실시태양에서, PSAM-GlyR 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
특정 실시태양에서, 리간드는 PSEM89S이다.
일부 실시태양에서, 스위치 수용체는 PSAM-nAChR 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 실시태양에서, PSAM-nAChR 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
특정 실시태양에서, 리간드는 PSEM9S이다.
특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 TRPV1 폴리펩타이드를 포함한다.
추가 실시태양에서, TRPV1 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
추가 실시태양에서, 리간드는 캡사이신이다.
추가의 실시태양에서, 스위치 수용체는 GABAA 폴리펩타이드를 포함한다.
추가의 실시태양에서, GABAA 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
특정 실시태양에서, 리간드는 졸피뎀이다.
추가 실시태양에서, 스위치 수용체는 AlstR 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시태양에서, AlstR 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
추가 실시태양에서, 리간드는 알라토스타틴이다.
특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 hM4Di 폴리펩타이드를 포함한다.
추가 실시태양에서, hM4Di 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
특정 실시태양에서, 리간드는 CNO, 클로자핀, 퍼라핀, 올란자핀, 알로세트론, 플루퍼라핀, 날프라핀(C28H32N2O5) 및 N4'-알킬 치환된 CNO 유사체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시태양에서, N4'-알킬 치환된 CNO 유사체는 3-클로로-6-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4] 벤조다이아제핀, 4-(8-클로로-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀-11-일)-1,1-다이메틸피페라진-1-움 요오드화물, 3-클로로-6-(피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀, 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 및 11-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 스위치 수용체는 KORD 폴리펩타이드를 포함한다.
추가 실시태양에서, KORD 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
일부 실시태양에서, 리간드는 살비노린 B이다.
특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 hM3Dq 폴리펩타이드를 포함한다.
추가 실시태양에서, hM3Dq 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
특정 실시태양에서, 리간드는 CNO, 클로자핀, 퍼라핀, 올란자핀, 알로세트론, 플루퍼라핀, 날프라핀(C28H32N2O5) 및 N4'-알킬 치환된 CNO 유사체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시태양에서, N4'-알킬 치환된 CNO 유사체는 3-클로로-6-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4] 벤조다이아제핀, 4-(8-클로로-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀-11-일)-1,1-다이메틸피페라진-1-움 요오드화물, 3-클로로-6-(피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀, 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 및 11-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 GsD 폴리펩타이드를 포함한다.
추가 실시태양에서, GsD 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
특정 실시태양에서, 리간드는 CNO, 클로자핀, 퍼라핀, 올란자핀, 알로세트론, 플루퍼라핀, 날프라핀(C28H32N2O5) 및 N4'-알킬 치환된 CNO 유사체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시태양에서, N4'-알킬 치환된 CNO 유사체는 3-클로로-6-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4] 벤조다이아제핀, 4-(8-클로로-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀-11-일)-1,1-다이메틸피페라진-1-움 요오드화물, 3-클로로-6-(피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀, 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 및 11-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시태양에서, 벡터는 에피토프 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
추가 실시태양에서, 에피토프 태그는 말토스 결합 단백질("MBP"), 글루타티온 S 전이효소(GST), HIS6, MYC, FLAG, V5, VSV-G 및 HA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시태양에서, 벡터는 폴리(A)서열을 추가로 포함한다.
추가 실시태양에서, 폴리(A)서열은 SV40 폴리(A)서열, 소 성장 호르몬 폴리(A)서열(bGHpA) 또는 토끼 β-글로빈 폴리(A)서열(rβgpA)이다.
특정 실시태양에서, 폴리(A)서열은 bGHpA이다.
특정 실시태양에서, AAV 벡터는 하나 이상의 AAV2 역전된 말단 반복(ITR)을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV1(Y705+731F+T492V), AAV2(Y444+500+730F+T491V), AAV3(Y705+731F), AAV5, AAV5(Y436+693+719F), AAV6, AAV6(VP3 변이체 Y705F/Y731F/T492V), AAV-7m8, AAV8, AAV8(Y733F), AAV9, AAV9(VP3 변이체 Y731F), AAV10(Y733F), 및 AAV(Y733F)-ShH10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 혈청형을 포함한다.
추가 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV5, AAV6, AAV6(Y705F/Y731F/T492V), AAV8, AAV9 및 AAV9(Y731F)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 혈청형을 포함한다.
특정 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV6, AAV6(Y705F/Y731F/T492V), AAV9 및 AAV9(Y731F)로 이루어진 그룹에서 선택된 혈청형을 포함한다.
추가 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV6 또는 AAV6(Y705F/Y731F/T492V) 혈청형을 포함한다.
특정 실시태양에서, 프로모터는 DRG 뉴런 또는 TGG 뉴런에서 작동 가능하고, 스위치 수용체는 GlyRα1 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시태양에서, 프로모터는 hSYN-1 프로모터이고, 스위치 수용체는 아미노산 치환 F207A 및 A288G를 추가로 포함하는 GlyRα1 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 실시태양에서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV1(Y705+731F+T492V), AAV2(Y444+500+730F+T491V), AAV3(Y705+731F), AAV5, AAV5(Y436+693+719F), AAV6, AAV6(VP3 변이체 Y705F/Y731F/T492V), AAV-7m8, AAV8, AAV8(Y733F), AAV9, AAV9(VP3 변이체 Y731F), AAV10(Y733F) 또는 AAV-ShH10이고, 프로모터는 hSYN-1 프로모터이고, 스위치 수용체는 아미노산 치환 F207A 및 A288G를 추가로 포함하는 GlyRα1 폴리펩타이드를 포함한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 부분적으로 하나 이상의 AAV2 ITR, AAV6 혈청형, hSYN-1 프로모터, 및 아미노산 치환체 F207A 및 A288G를 추가로 포함하는 GlyRα1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV 벡터를 고려한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 부분적으로 하나 이상의 AAV2 ITR, AAV6(Y705F/Y731F/T492V) 혈청형, hSYN-1 프로모터 및 아미노산 치환체 F207A 및 A288G를 추가로 포함하는 GlyRα1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV 벡터를 고려한다. 일부 양태에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 bGHpA를 추가로 포함한다.
특정 실시태양에서, AAV 벡터는 FLAG 에피토프 태그를 추가로 포함한다.
특정 실시태양에서, AAV 벡터는 자기-상보적 AAV(scAAV)벡터이다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 부분적으로는 본 발명에 기술된 하나 이상의 벡터를 포함하는 조성물을 고려한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 부분적으로 본 발명에 기술된 AAV 벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상에서 통증을 관리, 예방 또는 치료하는 방법을 고려한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 부분적으로 본 발명에 기술된 AAV 벡터를 대상에게 투여하는 것을 포함하여, 통증을 갖는 대상에게 진통을 제공하는 방법을 고려한다.
추가 실시태양에서, 통증은 급성 통증 또는 만성 통증이다.
일부 실시태양에서, 통증은 만성 통증이다.
특정 실시태양에서, 통증은 급성 통증, 만성 통증, 신경병증성 통증, 통각 장애 통증, 이질통, 염증성 통증, 염증성 통각 과민증, 신경병증, 신경통, 당뇨병성 신경병증, 인간 면역결핍 바이러스-관련 신경병증, 신경 손상, 류마티스성 관절염 통증, 골관절염 통증, 화상, 허리 통증, 눈 통증, 내장 통증, 암 통증(예를 들어, 골암 통증), 치통, 두통, 편두통, 손목 터널 증후군, 섬유 근육통, 신경염, 좌골 신경통, 골반 과민증, 골반 통증, 대상포진 후 신경통, 수술 후 통증, 뇌졸중 후 통증 또는 생리통이다.
추가 실시태양에서, 통증은 통각성 통증이다.
특정 실시태양에서, 통증은 중추 신경계 외상, 좌상/염좌, 화상, 심근 경색 및 급성 췌장염, 수술 후 통증(임의 유형의 외과 수술 후 통증), 외상 후 통증, 신장 산통, 암 통증 및 허리 통증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 통각성 통증이다.
일부 실시태양에서, 통증은 신경병증성 통증이다.
추가 실시태양에서, 신경병증성 통증의 원인은 말초 신경병증, 당뇨병성 신경병증, 대상포진 후 신경통, 삼차 신경통, 허리 통증, 암 신경병증, HIV 신경병증, 환상 사지 통증, 손목 터널 증후군, 뇌졸중 후 중추 통증 및 만성 알코올 중독, 갑상선 기능 저하증, 요독증, 다발성 경화증, 척수 손상, 파킨슨병, 간질 및 비타민 결핍과 관련된 통증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경병증성 통증이다.
특정 실시태양에서, 신경병증성 통증은 관절염, 이질통증, 전형적인 삼차 신경통, 삼차 신경통, 신체형 장애, 감각 저하, 통각과민, 신경통, 신경염, 신경원성 통증, 진통, 무감각 통증, 작열통, 좌골 신경통 장애, 퇴행성 관절 장애, 섬유근통, 내장 질환, 만성 통증 장애, 편두통/두통, 만성 피로 증후군, 복합 부위 통증 증후군, 신경장애, 족저근막 염증 또는 암 관련 통증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 통증 장애에 관한 것이다.
추가 실시태양에서, 통증은 염증성 통증이다.
특정 실시태양에서, 통증은 근골격계 장애, 근육통, 섬유 근육통, 척추염, 혈청-음성(비-류마티스성) 관절증, 비-관절 류마티스, 이상영양장애, 글리코겐 분해, 다발성근염 및 근염; 심장 및 혈관 통증, 협심증, 심근 경색, 승모판 협착증, 심낭염, 레이노 현상, 다발성 경화증 및 골격근 허혈에 의한 통증; 두통, 편두통, 군발 두통, 긴장형 두통 혼합 두통 및 혈관 장애와 관련된 두통; 안면 통증, 치통, 귀 통증, 구강 건조 증후군 및 저작근 근막통과 관련된다.
특정 실시태양에서, 방법은 본 발명에서 고려되는 AAV 벡터 또는 조성물의 척수강내 투여를 포함한다.
특정 실시태양에서, 방법은 본 발명에서 고려되는 AAV 벡터 또는 조성물의 신경절내 투여를 포함한다.
특정 실시태양에서, 방법은 본 발명에서 고려되는 AAV 벡터 또는 조성물의 신경내 투여를 포함한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명에 개시된 바와 같은 조성물을 이용하는 본 발명의 방법을 도시한다. 도 1은 바이러스 벡터를 통한 손상된 말초 신경과 연관된 후근 신경절 속에 본 발명의 치료적 '스위치' 수용체(예를 들어, G 단백질 결합된 수용체 또는 리간드-개폐 이온 채널)의 유전자 삽입 및 중추 신경계와의 신경 전달을 침묵시켜서, 효과적으로 진통을 제공하고 고통스런 감각을 차단하기 위한 생물학적으로 비활성인 화합물에 의한 '스위치'의 활성화를 도시한다.
도 2a-2c는 (도 2a) hM4Di의 발현을 유도하는 인간 시냅신(hSYN) 프로모터, (도 2b) hSYN-hM3Dq 및 (도 2c) hSYN-hGlyR(F207A/A288G)을 포함하는 본 발명의 스위치 수용체의 전달을 위한 AAV 전달 벡터 아키텍처의 비-제한적인 예를 도시한다.
도 3은 본 발명에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 신경 질환을 치료하기 위해 재의도될 수 있는 FDA 승인된 약물의 비-제한적인 예를 도시한다.
도 4는 본 발명에서 고려된 예시적인 유전자 치료 벡터의 도면을 도시한다.
도 5는 hSYN1-GlyRα1 F207A/A288G 유전자 치료 벡터의 도면을 도시한다.
도 6은 척수 및 피부와 심부 조직의 통증 뉴런 및 경로의 도면을 도시한다. 도 6은 또한 생쥐에서 주사 3주후에 척수강내, 신경절내 및 뇌척수내 경로의 투여 이후 후각 및 후근 신경절 뉴런에서 hSYN-hGlyRM(F207A/A288G)을 발현하는 AAV6(Y705 + 731F + T492V) 벡터의 발현의 면역조직화학 분석의 결과를 도시한다.
도 7은 생쥐에서 예비 신경 손상(SNI) 모델의 도면을 도시한다. 도 7은 손상되지 않은 대측성 대조군과 비교된 SWB001(hSYN-hGlyRM(F207A/A288G)를 발현하는 AAV6 벡터)을 주사한 생쥐 SNI 모델에서 기계적 과민성 분석법(Von Frey)의 결과를 나타내는 그래프를 도시한다. 이버멕틴(15mg/kg)의 1회 투여량을 IP 주사하여 신경 손상 후 7-10일 동안 진통을 제공하였다.
도 8은 손상되지 않은 대측성 대조군과 비교된 SWB001(hSYN-hGlyRM(F207A/A288G)를 발현하는 AAV6 벡터)을 주사한 생쥐 SNI 모델에서 기계적 과민성 분석법(Von Frey)의 결과를 나타내는 그래프를 도시한다. 도 7에 기술된 실험에서 이버멕틴의 세척 이후 통증 역치가 기준 수준으로 회복된 후, 이버멕틴(10mg/kg)의 반복 투여량을 IP 주사하여 신경 손상 후 14일째 진통을 제공하였다.
도 9는 실시예 22에 기술된 열 회수 대기 시간 분석의 개별 대상 결과를 도시하는 그래프를 도시한다. 각 대상에 대하여, 이전-이버멕틴 치료 결과는 좌측에 도시되고, 이후-이버멕틴 치료 결과는 우측에 도시된다.
도 10은 실시예 22에 기술된 열 회수 대기 시간 분석의 개별 대상 결과를 도시하는 그래프를 도시한다. 이전-이버멕틴 치료 결과는 좌측에 도시되고, 이후-이버멕틴 치료 결과는 우측에 도시된다.
A. 개관
본 발명은 신경 질환 및 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 조성물은 일반적으로 본 발명에서 "스위치 수용체"로 의미되는 치료용 수용체를 포함한다. 일부 실시예에서, 스위치 수용체는 G 단백질-결합 수용체(GPCR) 또는 리간드-개폐 이온 채널(LGIC)이다. 본 발명의 조성물 및 방법은, 예를 들어, 신경 질환의 치료를 위한 유전자 요법으로서의 특정 용도를 발견할 수 있다. 일부 경우에, 상기 방법은 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 제공한다. 필요로 하는 대상은 신경 질환을 앓고있는 대상일 수 있다. 일부 경우에, 스위치 수용체는 신경 질환을 앓고 있는 대상에서 발현된다. 상기 방법은 또한 발현된 스위치 수용체를 활성화시키는 리간드로 대상을 치료하는 단계를 제공한다. 리간드에 의한 치료는 스위치 수용체를 발현하는 흥분성 세포(예를 들어, 뉴런, 근육 세포)의 전기 생리학적 활성을 변화시켜서 신경 질환을 치료할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 일반적으로 통증 관리를 위한 유전자 치료법에 관한 것이다. 본 발명에서 고려되는 유전자 치료 조성물 및 방법은 통증 경로에 관련된 신경 세포에 대해 정확한 시공간 조절을 제공하며, 따라서 기존의 치료법에 비해 많은 이점도 제공한다. 특정 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 신경 세포를 표적으로 하는 유전자 요법을 제공하면 장기간 통증 완화를 중재하고, 부작용을 감소시키며, 외부 펌프 및 위험한 절차로부터 환자를 자유롭게 함으로써 삶의 질을 향상시킬 수 있다. 또한, 유전자 요법은 통상적인 약물 등가물과 비교하여 여러 페이로드(payload) 이점을 제공하는데, 예를 들어, 특정의 큰 단백질은 재조합 의약품 또는 소분자 유사체로서 이용 가능하지 않을 수 있으나, 벡터에 치료적 유전자로서 암호화되고 전달될 수 있다.
다양한 실시태양에서, 스위치 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 신경 세포에서 전사물을 발현할 수 있는 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 바이러스 벡터가 제공된다. 본 발명은 외인성으로 공급된 및/또는 자연적으로 발생하지 않는 리간드와 결합하는 스위치 수용체가 바이러스 벡터를 사용하여 신경 세포에 전달될 수 있고 신경 세포의 활성, 예를 들어 전기생리 학적 활성을 안전하게 조절하고 대상에서 통증을 효율적으로 관리하는데 사용될 수 있음을 고려한다.
특정 실시태양에서, 리간드-개폐 이온 채널, g-단백질 결합 수용체(GPCR), 또는 이의 서브유닛 및/또는 뮤테인을 포함하는 스위치 수용체에 작동 가능하게 연결된 신경 세포에서 활성인 발현 조절 요소를 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는 파보바이러스 벡터가 제공된다.
본 발명에서 고려되는 벡터 및 조성물은 대상에서 통증의 감각을 약화시키는데 사용된다. 다양한 실시태양에서, 통증은 급성 통증 또는 만성 통증이다. 만성 통증은 통각 통각성 통증 또는 신경병증성 통증일 수 있다. 한 실시태양에서, 통증은 신경병증성 통증이다. 통증은 또한 고립된 통증일 수 있거나 통증이 특정 질환과 관련될 수 있다.
따라서, 본 발명은 통증 관리에서 유전자 치료의 안전성 및 효능을 향상시키기 위한 충족되지 않은 임상적 요구를 다룬다.
본 발명의 실시는 당업자의 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법을 반대로 명시하지 않는 한, 당해 기술의 많은 부분은 설명의 목적으로 이하에서 기술된다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); NucleicAcid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture(R. Freshney, ed., 1986); A Practical Guideto Molecular Cloning (B. Perbal, ed., 1984); Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)) 참조.
본 발명에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 이의 전체가 본 발명에 참조로 포함된다.
B. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어가 아래에 정의된다.
관사 "a", "an" 및 "the"는 본 발명에서 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)을 언급하는데 사용된다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 모두 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "및/또는"은 대안의 하나 또는 둘 모두를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이에 대한 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 만큼 변화하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다. 한 실시태양에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8% , ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%인 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함한다(comprise)", "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"이라는 단어는 명시된 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 그룹을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 그룹을 제외하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 특정 실시태양에서, 용어 "포함한다(include)", "갖는다(has)", "포함한다(contains)" 및 "포함하다(comprise)"는 동의어로 사용된다.
"이루어진다"는 문구 "이루어진다" 다음에 오는 것을 포함하되 이에 제한되는 것을 의미한다. 따라서, "이루어진다"는 문구는 열거된 요소가 요구되거나 필수적이며 다른 요소가 없을 수 있음을 나타낸다.
"본질적으로 이루어진"은 문구 다음에 열거된 모든 요소를 포함하며, 열거 된 요소에 대해 본 발명에서 특정된 활동 또는 작용을 간섭하지 않거나 기여하지 않는 다른 요소로 제한되는 것을 의미한다. 따라서, "본질적으로 이루어진"이라는 문구는 열거된 요소가 요구되거나 필수적임을 나타내지만 다른 요소는 선택 사항이 아니며 열거된 요소의 활동이나 동작에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다.
본 명세서 전반에서 "일 실시태양", "한 실시태양", "특정 실시태양", "관련 실시태양", "어떤 실시태양", "다른 실시태양"또는 "추가 실시태양" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 그 실시태양과 관련하여 기술된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시태양에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 곳에서의 전술한 문구의 출현은 모두 반드시 동일한 실시태양를 의미하는 것은 아니다. 또한, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시태양에서 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "분리된"은 자연 상태에서 통상 동반되는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는 물질을 의미한다. 특정 실시태양에서, 용어 "수득된"또는 "유도된"은 분리된 것과 동의어로 사용된다.
용어 "대상", "환자" 및 "개인"은 척추 동물, 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 인간을 의미하기 위해 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 포유 동물은 쥐, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완 동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 생체내에서 수득되거나 시험관내에서 배양된 생물학적 실체의 조직, 세포 및 이들의 자손 또한 포함된다. 본 발명에 사용된 "대상", "환자" 또는 "개인"은 본 발명에서 고려된 벡터, 조성물 및 방법으로 치료할 수 있는 통증을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상(예를 들어, 환자)은 실험실 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니 피그), 농장 동물 및 가축 또는 애완 동물(예를 들어, 고양이 또는 개)을 포함한다. 비인간 영장류 및 바람직하게는 인간 환자가 포함된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 통증의 감소와 관련된 임의의 유익한 또는 바람직한 효과를 포함하며 통증의 최소 감소도 포함할 수 있다. 치료는 선택적으로 통증의 감소 또는 완화, 또는 통증의 진행 지연을 포함할 수 있다. "치료"는 반드시 질환 또는 상태 또는 이의 관련 증상의 완전한 박멸 또는 치료를 나타내지는 않는다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "예방하다" 및 "예방된", "예방하는" 등과 같은 유사한 단어는 통증의 발생 또는 재발의 가능성을 예방, 억제 또는 감소시키기 위한 접근법을 나타낸다. 이는 또한 질환 또는 상태의 발병이나 재발을 지연시키거나 통증 증상의 발생이나 재발을 지연시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용된 "예방" 및 유사한 단어는 발병 또는 재발 전에 통증의 강도, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "관리" 또는 "통증 조절"은 통증을 앓고 있는 대상에게 진통을 제공하여 개인의 삶의 질을 향상시키기 위해 본 발명에서 고려되는 조성물 또는 방법의 사용을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "양"은 임상 결과를 포함하는 유익한 또는 원하는 예방적 또는 치료적 결과를 달성하기 위한 바이러스의 "효과적인 양" 또는 "유효량"을 의미한다.
"예방적 유효량"은 목적하는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 바이러스의 양을 의미한다. 필수적은 아니지만 통상적으로, 예방적 투여량은 질환 이전 단계 또는 질환의 초기 단계에서 대상에게 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량 미만이다.
바이러스의 "치료학적 유효량"은 개인의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자 및 개인에서 원하는 반응을 유도하는 줄기 세포 및 전구 세포의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 바이러스의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료학적으로 유익한 효과가 더 뛰어난 양이다. 용어 "치료적 유효량"은 대상(예를 들어, 환자)를 "치료"하는데 효과적인 양을 포함한다.
생리학적 반응, 예를 들어, 전기생리활성 또는 세포 활성의 "증가된" 또는 "강화된" 양은 통상적으로 "통계적으로 유의한" 양이고, 치료되지 않은 세포에서 활성의 수준의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000배)(1 사이 및 이상의 모든 정수 및 소수점을 포함, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1, , 1.7, 1.8, 등)인 증가를 포함할 수 있다.
생리학적 반응, 예를 들어, 전기생리학적 활성 또는 세포 활성의 "감소" 또는 "감소된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의한" 양이고, 치료되지 않은 세포에서 활성의 수준의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000배)(1 사이 및 이상의 모든 정수 및 소수점을 포함, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1, , 1.7, 1.8, 등)인 감소를 포함할 수 있다.
"유지하다", "보존하다" 또는 "유지" 또는 "변화 없음"또는 "실질적 변화 없음" 또는 "실질적인 감소 없음"은 일반적으로 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 의해 유발된 반응과 비교 가능한 생리적 반응을 일반적으로 의미한다. 비교 가능한 반응은 기준 반응과 현저하게 다르지 않거나 측정할 수 없는 반응이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "흥분성 세포"는 개폐 이온 채널의 결과로서 그의 막 전위에서 변동을 경험하는 세포를 의미한다. 본 발명에서 고려되는 흥분성 세포의 예는 근육 세포, 신경 세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 신경 세포는 감각 뉴런이다. 감각 뉴런의 예시적 예는 후근 신경절(DRG) 뉴런 및 삼차 신경절(TGG) 뉴런을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, 신경 세포는 말초 감각 뉴런이다. 한 실시태양에서, 신경 세포는 억제성 개재뉴런이다.
"G 단백질-결합 수용체" 또는 "GPCR"은 천연 펩타이드 또는 비 펩타이드 리간드의 결합 및 수용체의 활성화시, 생리학적, 세포 반응(예를 들어, 세포 증식 또는 분비)을 초래하는 G 단백질-매개 신호(들)를 전달하는 수용체를 의미한다. G 단백질-결합 수용체는 진화적으로 관련된 단백질의 큰 패밀리를 형성한다. G 단백질-결합 수용체 패밀리의 구성원인 단백질은 일반적으로 7개의 추정 막투과 도메인으로 구성된다. G 단백질-결합 수용체는 당업계에서 "7개의 막투과 단편(7TM) 수용체" 및 "칠중나선 수용체"로도 알려져 있다.
"리간드-개폐 이온 채널"은 특정 화학물질에 의한 활성화시 이온의 통과를 허용하는 고유 막투과 단백질의 큰 그룹을 의미한다. 대부분의 내인성 리간드는 이온 전도 기공과 구별되는 부위에 결합하고 결합은 채널의 개폐를 직접 일으킨다. 내인성 리간드는 세포외적으로, 예를 들어, 글루타메이트, ACh 및 GABA와, 또는 세포내적으로, 예를 들어, Ca2+-활성화 칼륨 채널 상의 Ca2+ 결합할 수 있다. 리간드 자체가 막을 통해 수송되지 않는다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 리간드 결합은 채널의 특정 이온 또는 이온에 대한 투과율의 급격한 변화를 일으킨다; 이온이 불활성일 때 효과적으로 이온이 채널을 통과할 수 없지만 리간드 결합시 초당 107 이온이 허용될 수 있다.
"수용체-리간드 결합", "리간드 결합" 및 "결합"은 수용체(예를 들어, G 단백질-결합 수용체) 및 리간드(예를 들어, 천연 리간드, (예를 들어, 펩타이드 리간드) 또는 합성 리간드(예를 들어, 합성 소분자 리간드)) 사이의 물리적 상호작용을 의미하는데 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 리간드 결합은 당업계에 공지 된 다양한 방법(예를 들어, 방사성 표지된 리간드와의 결합의 검출)에 의해 측정될 수 있다.
"결합 친화성"은 일반적으로 수용체의 단일 결합 부위와 리간드 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본 발명에 사용된 바와 같이, "결합 친화력"은 결합 쌍(예를 들어, 수용체 및 리간드)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화력을 의미한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화력은 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화력은 본 발명에 기술된 방법을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합 친화력" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합된" 또는 "특이적 결합"은 명세서 및 청구 범위에서 상호 교환적으로 사용되고, 분자의 쌍을 이룬 종들, 예를 들어, 수용체 및 리간드 사이에서 일어나는 결합을 의미한다. 두 종의 상호작용이 비공유 결합된 복합체를 생성할 때, 발생하는 결합은 통상적으로 정전기, 수소-결합 또는 친유성 상호작용의 결과이다. 다양한 실시태양에서, 하나 이상의 종 사이의 특이적 결합은 직접적이다. 한 실시태양에서, 특이적 결합의 친화력은 배경 결합(비특이적 결합)보다 약 2배, 배경 결합보다 약 5배, 배경 결합보다 약 10배, 배경 결합보다 약 20배, 배경 결합보다 약 50배, 배경 결합보다 약 100배, 배경 결합보다 약 1000배 이상이다.
"시그널링"은 리간드 결합의 결과로서(예를 들어, 스위치 수용체에 결합하는 리간드의 결과로서) 생화학적 또는 생리학적 반응의 발생을 의미한다.
용어 "유발하는"은 보다 높은 이온 농도의 영역으로부터 저농도의 영역으로 이온이 수용체를 통해 수동적으로 통과하게 하는 물리적 또는 화학적 자극 이후 수용체의 개방을 의미한다.
일반적으로, "서열 동일성" 또는 "서열 상동성"은 각각 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 서열의 정확한 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 아미노산-대-아미노산 대응을 의미한다. 전형적으로, 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계 및/또는 이에 의해 암호화된 아미노산 서열을 결정하는 단계, 및 이들 서열을 제 2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 2개 이상의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 이들의 "퍼센트 동일성"을 측정함으로써 비교될 수 있다. 2개 서열의 퍼센트 동일성은 핵산 또는 아미노산 서열에 상관없이 2개의 정렬 된 서열간의 정확한 일치를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 수이다. 백분율 동일성은, 예를 들어, 국립 보건원으로부터 입수 가능한 버전 2.2.9를 포함하는 진보된 BLAST 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수있다. BLAST 프로그램은 Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2264-2268 (1990) 및 Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215 : 403-410 (1990); Karlin And Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 5873-5877 (1993); and Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402 (1997)의 정렬 방법을 기초로 한다. 간단히 말하면, BLAST 프로그램은 2개 서열의 더 짧은 것에서 기호의 총 수로 나눈 동일한 정렬된 기호(일반적으로 뉴클레오타이드 또는 아미노산)의 수로서 동일성을 정의한다. 프로그램은 비교되는 단백질의 전체 길이에 걸쳐 퍼센트 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, blastp 프로그램에서 짧은 쿼리 시퀀스로 검색을 최적화하기 위해 기본 매개 변수가 제공된다. 이 프로그램은 또한 Wootton and Federhen, Computers and Chemistry 17:149-163(1993)의 SEG 프로그램에 의해 결정된 쿼리 시퀀스의 세그먼트를 마스크-오프하는 SEG 필터의 사용을 허용한다. 원하는 정도의 서열 동일성의 범위는 약 80% 내지 100%이고 그 사이의 정수 값이다. 통상적으로, 개시된 서열과 청구된 서열 간의 동일성은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%이다.
본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "생물약제"는 의약 또는 치료제로서 이용될 수 있는 생물학적 또는 생물학적 의학 제품을 포함하는 임의의 조성물을 의미한다. 생물학적 제제는 치료제로서 사용될 수 있는 임의의 생물학적 제제일 수 있다. 생물학적 제제는 생물학적 원료에서 제조, 추출 또는 반합성된 약제일 수 있다. 생물학적 제제는 단백질, 핵산 분자, 세포, 조직, 백신, 혈액 또는 혈액 성분, 알레르기제, 유전자 요법, 재조합 단백질 및 재조합 핵산 분자를 제한없이 포함할 수 있다. 생물약제는 추가적인 요법(생물학적 또는 합성 화학적 제제), 부형제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 추가의 제제를 포함할 수 있다.
용어 "외인성"은 생물체 외부에서 기원하는 핵산, 단백질 또는 펩타이드, 소형 분자 화합물 등을 포함하는 임의의 분자를 의미하기 위해 본 발명에서 사용된다. 대조적으로, 용어 "내인성"은 유기체 내부로부터 기원하는 (즉, 유기체에 의해 자연적으로 생성된) 임의의 분자를 의미한다.
용어 "이종성 발현" 및 "이종적으로 발현된"은 본 발명에서 단백질을 통상적으로 발현하지 않는 대상에서의 단백질 발현을 의미한다. 또한, 이종성 발현은 대상에서 단백질의 발현을 의미할 수 있으며 여기서 단백질은 발현되는 대상 이외의 종으로부터 유래된다. 이종성 발현은 바이러스 벡터 전달, 전기천공, 감염, 형질감염 등을 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 외인성 핵산 분자를 대상으로 전달하는 것을 포함할 수 있다.
용어 "상동성 발현" 및 "상동성으로 발현된"은 본 발명에서 단백질을 통상적으로 발현하는 대상에서 단백질의 과다 발현을 의미하기 위해 본 발명에서 사용된다. 상동성 발현은 단백질의 동종 발현을 의미하기 위해 본 발명에서 사용되는 이소성 발현"을 포함할 수 있으며, 여기서 단백질은 단백질을 통상적으로 발현하지 않는 대상의 숙주 세포에서 발현되다(예를 들어, 대상의 심근 세포에서만 발견된 단백질은 대상의 뇌 세포에서 발현된다).
용어 "야생형"은 분자, 통상적으로 자연에서 발견되는 단백질과 동일하거나 실질적으로 동일한 단백질을 의미하기 위해 본 발명에서 사용된다. 단백질의 동일성은 일반적으로 자연에서 일반적으로 발견되는 단백질에 대한 서열 동일성 또는 상동성의 백분율로 측정된다. 따라서, 야생형 단백질은 자연에서 통상적으로 발견되는 단백질과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100%의 서열 상동성을 공유하는 단백질로 생각될 수있다.
C. 조성물
일부 양태에서, 본 발명은 신경 질환 또는 신경 장애의 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에서 생각되는 조성물은 일반적으로 신경 질환의 치료에 사용될 수있는 치료제를 포함한다. 본 발명의 치료제는 대상에게 전달되는 임의의 분자(예를 들어, 단백질, RNA, DNA)일 수 있다. 경우에 따라 환자는 신경 질환 또는 상태로 고통받는 대상이다. 치료제는 신경 질환을 치료하는데 사용될 수 있거나 신경 질환의 증상을 경감시키는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 대상은 건강하며 치료제는 신경 질환의 발병을 예방하기 위한 예방적 치료로서 사용된다. 일반적으로, 치료제는 대상에서 치료 반응을 유도하기 위해 대상에게 전달된다. 일부 실시태양에서, 조성물은 통증을 치료하기 위해 사용된다.
D. 스위치 수용체
다양한 예시적인 실시태양에서, 본 발명은 부분적으로 스위치 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 벡터 및 신경 세포의 활성을 조절하기 위한 이들 조성물의 용도를 고려한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "스위치 수용체"는 G 단백질-결합 수용체(GPCR), 합성 리간드에 의해서만 활성화된 수용체(RASSLs), 디자이너 약물에 의해 독점적으로 활성화되는 디자이너 수용체(DREADD) 및/또는 리간드-개폐 이온 채널(LGIC) 및/또는 이의 뮤테인을 의미한다. 일부 양태에서, 스위치 수용체의 하나 이상의 서브유닛이 이종성 리간드, 외인성 리간드 및/또는 합성 리간드에 특이적으로 결합하도록 조작되었다. 특정 실시태양에서, "스위치 수용체"는 이종성, 외인성 및/또는 합성 리간드에 특이적으로 결합하도록 조작된 GPCR, RASSL, DREADD 또는 LGIC 또는 이의 뮤테인의 하나 이상의 서브유닛을 의미한다. 본 발명에서 고려되는 스위치 수용체는 신경 세포를 활성화, 억제, 탈분극 및/또는 과분극화하도록 설계된다.
특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 자연 발생 수용체에 검출 가능하게 결합하지 않는 이종성, 외인성 및/또는 합성 리간드에 특이적으로 결합하도록 설계된다. 특정 실시태양에서, 이종성, 외인성 및/또는 합성 리간드는 스위치 수용체와 특이적으로 결합하여 스위치 수용체를 발현하는 흥분성 세포의 활성을 조절하고 자연 발생 수용체를 검출 가능하게 결합하지만 자연 발생 수용체와 결합할 때 생리학적으로 측정가능한 변화를 유도하지는 않는다.
특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 본 발명에서 고려되는 벡터를 사용하여 신경 세포 내로 주입된다. 특정 실시태양에, 스위치 수용체를 암호화하는 핵산 분자는 스위치 수용체가 적어도 하나의 숙주 세포에서 발현되도록 대상에게 전달된다. 일부 경우에, 스위치 수용체는 대상에 직접 전달된다(즉, 단백질로서). 스위치 수용체는 신경 세포와 동일한 종 또는 다른 종으로부터 유래될 수 있다. 스위치 수용체는 대상에서 이종성으로 발현되거나 상동성으로 발현될 수 있다. 특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 이종성 및/또는 합성 리간드에 의해 스위치 수용체가 유발되게 하고 내인성 리간드에 대한 민감성을 감소시키고, 줄이고 또는 폐지하도록 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 다양한 실시태양에서, 사용하기 위해 선택된 스위치 수용체는 (i) 적절한 극성의 전류 및/또는 이온 조성물을 운반하고 (ii) (iii) 신경계에서 신경 전달물질로서 사용되지 않는 리간드에 의해 직접 개폐된다(특히 활성화될 세포가 신경 세포인 경우).
한 실시태양에서, 스위치 수용체는 자연 발생 수용체에 검출 가능하게 결합하지 않는 이종성, 외인성 및/또는 합성 리간드에 특이적으로 결합하도록 조작된다. 스위치 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인의 원자 구조는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정되거나 예측될 수 있다. 고해상도 구조는 내인성 리간드에 대한 민감성을 폐지하는 수용체의 리간드-결합 도메인에서의 돌연변이의 "합리적인 디자인"을 유도하는데 사용될 수 있다. 수용체에서 이러한 돌연변이를 보완하고 기능적(그러나 완전히 비자연적) 수용체-리간드 쌍을 회복하기 위해 내인성 리간드에 대해 "2차-위치" 치환을 할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 도킹 알고리즘은 돌연변이된 수용체의 리간드 결합 도메인에 대한 합성 리간드의 결합을 모델화하는데 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 덜 표적화되거나 무작위 돌연변이가 또한 천연 효현제에 대한 친화력이 없는 스위치 수용체의 돌연변이 종을 생성하는데 사용될 수 있다. 잠재적인 효현제 화합물의 라이브러리는 공지된 "직접 진화" 방법을 사용하여 유용한 비-천연 효현제를 동정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
유사한 화학적 유전 접근법은 또한 이온 선택성과 같은 스위치 수용체의 전도 특성을 변경시키는데 유용하다. 화학적 유전 접근법은 스위치 수용체의 리간드 결합, 물리적 활성화 특성 또는 전도 특성을 변경시키는데 사용될 수 있다. 하나의 비 제한적인 예에서, 스위치 수용체는 나트륨 또는 칼슘 이온의 유입을 증가시키는 대신 칼륨 이온의 유출을 증가시키거나 염화물 이온과 같은 음이온의 유입을 증가 시키도록 조작될 수 있다. 이런 스위치 수용체가 신경 세포에서 발현되고 리간드 결합에 의해 유발될 때, 조작된 수용체는 과분극을 형성하고 신경 세포를 불활성화시킬 것이다.
"이종성" 리간드는 스위치 수용체를 발현하는 세포의 종과 상이한 종으로부터 유래된 폴리펩타이드 또는 소분자를 의미한다. 이종성 리간드는 천연 공급원으로부터 단리되거나, 재조합적으로 생산되거나, 또는 합성될 수 있다.
"자연 발생 리간드"는 자연계에서 발견될 수 있는 생체 분자를 의미하며, 생체 분자는 천연 GPCR 또는 리간드-개폐 이온 채널에 결합한다.
"합성 리간드"는 자연계에서 발생하지 않으며 천연 또는 화학적 수단에 의해 합성되는 폴리펩타이드 또는 소분자를 의미한다. 합성 리간드는 독특하거나 알려져있을 수 있다.
"소분자"는 약 5kD 미만, 약 4kD 미만, 약 3kD 미만, 약 2kD 미만, 약 1kD 미만 또는 약 .5kD 미만의 분자량을 갖는 화합물을 의미한다. 소분자는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 펩티도미메틱, 펩토이드, 탄수화물, 지질 또는 다른 유기 또는 무기 분자일 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 스위치 수용체는 또한 개시 및 오프셋 동역학을 변화시킴으로써 (밀리초, 초, 분 또는 시간과 같은) 가변적 시간 제어를 제공하고 상이한 바이러스 벡터를 사용하거나 및/또는 전달 방법 및/또는 전달 위치를 변경함으로써 가변적인 공간 해상도를 제공하도록 설계될 수 있다.
1. G 단백질-결합 수용체(GPCR)
G 단백질-결합 수용체(GPCR)는 외부 자극에 대한 세포 반응을 매개하는 단백질 수용체의 다양한 패밀리이다. 특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 GPCR 또는 이의 뮤테인, RASSL 또는 DREADD이다. 일부 양태에서, GPCR 또는 이의 뮤테인, RASSL 또는 DREADD의 하나 이상의 서브유닛이 이종성 리간드, 외인성 리간드 및/또는 합성 리간드에 특이적으로 결합하도록 조작되었다. 특정 실시태양에서 사용하기에 적합한 리간드, RASSL 및 DREADD에 특이적으로 결합하는 GPCR의 예시적 예 및 이를 동정하고 제조하기 위한 방법은 Conklin et al., 2008; Pei et al., 2008; Nichols and Roth, 2009; 및 Dong et al., 2010a에 기술되어 있으며, Rogan and Roth, 2011에서 검토되고, 이의 각각은 전체가 본 발명에 참조로 포함된다.
본 발명의 조성물은 GPCR을 암호화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에, GPCR은 대상에서 이종적으로 발현된다. 다른 경우에, GPCR은 대상에서 상 동성으로 발현된다. 특정 경우에, GPCR은 (예를 들어, 뉴런에서) 전위성으로 발현된다. GPCR은 야생형 GPCR 또는 돌연변이 GPCR을 포함할 수 있다. GPCR은 필수적으로 인간, 마우스, 랫트를 포함하는 포유류; 노랑초파리(Drosophila melanogaster)를 포함하는 곤충; 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)를 포함하는 선충류 및 효모를 포함하나 이에 제한되지 않는 GPCR이 정상적으로 발현되는 모든 유기체로부터 유래될 수 있다. GPCR은 본 발명에 기술된 방법을 사용하여 신경 질환을 치료하기 위해 대상에서 발현될 수 있다. 일부 예에서, 대상에서 발현된 GPCR은 대상의 종 이외의 종에서 유래된다. 예를 들어, 마우스에서 통상적으로 발현되는 GPCR은 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 인간에서 발현될 수 있다. 조성물에서 사용되는 GPCR은 야생형 GPCR과 실질적으로 상동성일 것이며(즉, 서열 동일성을 공유한다), 예를 들어, 야생형 GPCR과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100% 동일할 것이다.
GPCR은 이들이 상호작용하는 시그널링 단백질에 따라 분류될 수 있다. 이론에 구속되기를 바라지 않고, GPCR은 세포 외 신호를 전달하기 위해 하류 신호 분자 (예를 들어, G 단백질)에 결합한다. G 단백질은 흥분성(예를 들어, Gs, Gq/11, G12/13) 또는 억제성(예를 들어, Gi/o)일 수 있다. 일부 경우에, 하류 G 단백질에 결합된 GPCR의 활성화는 흥분성 세포(예를 들어, 근육 세포, 뉴런)의 전기생리학적 활성을 변화시킬 수 있다. GPCR은 이들이 결합하는 G 단백질의 종류에 기초하여 선택될 수있다. GPCR은 원하는 하류 시그널링 경로에 기초한 본 발명의 방법을 수행하기 위해 선택될 것이라는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 하나의 특정 예에서, 억제성 GPCR(즉, Gi/o에 결합됨)이 통증을 치료하기 위해 선택될 수 있다.
일부 경우에, GPCR은 구조적으로 활성(즉, 세포에서 연속적으로 활성)일 수 있다. 이 예에서, GPCR은 리간드에 의한 활성화를 필요로하지 않을 수 있다. 보다 특별한 경우, GPCR은 리간드에 의해 활성화된다. 리간드는 내인성 또는 외인성 리간드 일 수있다. 일부 예에서, GPCR은 내인성 리간드 (즉, 대상에 의해 자연적으로 생성되는 리간드)에 의해 활성화된다. 다른 예에서, GPCR은 외인성 리간드(즉, 주사에 의해 대상에게 전달되는 리간드)에 의해 활성화된다. 리간드는 단백질, 지질, 합성 분자, 핵산 등을 포함하는 GPCR을 활성화시키는 임의의 분자일 수 있다. 특정 경우에, 리간드는 신경 질환을 치료하기 위해 이종성으로 GPCR을 발현하는 대상에게 전달된다. 한 예에서, GPCR은 노랑초파리로부터 유래된 알라토스타틴 수용체(AlstR)이고, 리간드는 알라토스타틴이다.
본 발명에 기술된 바와 같이 사용하기에 적합한 GPCR의 비 제한적인 예는 다음을 포함한다: CHRM1; GNRHR; GPR73; GPR45; PTHR1; CHRM2; GNRHR2; GPR73; GPR63; PTHR2; CHRM3; HRH1; GPR10; GPR83; SCTR; CHRM4; HRH2; F2R; PGR15; ADCYAP1R1; CHRM5; HRH3; F2RL1; PGR15L; VIPR1; ADORA1; HRH4; F2RL2; GPR103; VIPR2; ADORA2A; FSHR 93; F2RL3; GPR103L; BAI1; ADORA2B; LHCGR; P2RY1; GRCA; BAI2; ADORA3; TSHR; P2RY2; PGR1; BAI3; P2RY12; GPR54; P2RY4; HGPCR11; CD97; GPR105; LTB4R; P2RY6; SALPR; EMR1; GPR86; LTB4R2; P2RY11; MAS1; EMR2; GPR87; MRGX1; LGR7; GPR90; EMR3; ADRA1A; MRGX2; LGR8; P2Y5; PGR16; ADRA1B; MRGX3; RGR; GPR23; LEC1; ADRA1D; MRGX4; HTR1A; P2Y10 275; LEC2; ADRA2A ; MRGD; HTR1B; FKSG79; LEC3; ADRA2B; MrgA1; HTR1D; PGR2; CELSR1; ADRA2C; MrgA2; HTR1E; PGR3; CELSR2; ADRB1; MrgA3; HTR1F; AGR9; CELSR3; ADRB2 21; MrgA4; HTR2A; CMKLR1; GPR64; ADRB3; MrgA5; HTR2B; EBI2; PGR17; ADMR; MrgA6; HTR2C; GPCR150; DJ287G14; C3AR1; MrgA7; HTR4; GPR1; KIAA0758; C5R1; MrgA8; HTR5A; GPR15; PGR18; GPR77; MrgA9; HTR5B; GPR17; PGR19; AGTR1; MrgA10; HTR6; GPR18; PGR20; AGTR2; MrgA11; HTR7; GPR19; TEM5; AGTRL1; MrgA12; SSTR1; GPR20; KIAA1828; BRS3; MrgA13; SSTR2; GPR22; PGR21; GRPR 31; MrgA14; SSTR3; GPR25; ETL; NMBR; MrgA15; SSTR4; GPR30; FLJ14454; BDKRB1; MrgA16; SSTR5; GPR31; GPR56; BDKRB2; MrgA19; G2A; GPR32; OA1; CNR1; MrgB1; GPR4; GPR33; PGR22;CNR2; MrgB2; GPR65; GPR34; PGR23; CCR1; MrgB3; GPR68; GPR35; PGR24; CCR2; MrgB4; EDG1; GPR39; PGR25; CCR3; MrgB5; EDG2; GPR40; PGR26; CCR4; MrgB6; EDG3; GPR44; PGR27; CCR5 41; MrgB8; EDG4; GPR55; VLGR1; CCR6; MrgB10; EDG5; GPR61; CCR7 43; MrgB11; EDG6; GPR62; CCR8; MrgB13; EDG7; GPR75; CCR9; GPR24; EDG8; GPR80; GPR2; SLT; TACR1; GPR82; CASR; CCRL1; MC1R; TACR2; GPR84; GABBR1; CCRL2; MC2R; TACR3; GPR88; GPR51; CCBP2; MC3R; TRHR; GPR91; GPRC5B; CMKBR1L1; MC4R; TRHR2; GPR92; GPRC5C; CMKBR1L2; MC5R; GPR57; GPR101; GPRC5D; CCXCR1; MTNR1A; GPR58; H963; RAI3; CX3CR1; MTNR1B; PNR; HGPCR2; GRM1; IL8RA; GPR50; TAR1; HGPCR19; GRM2; IL8RB; GPR66; TAR2; HUMNPIIY20; GRM3; GPR9; NMU2R; TAR3; MRG; GRM4; CXCR4; NPFF1R; TAR4; MRGE; GRM5; BLR1; GPR74; GPR102; MRGF; GRM6; CXCR6; GPR7; TA7; MRGG; GRM7; CCKAR; GPR8; TA8; OPN3; GRM8; CCKBR; NPY1R; TA10; OPN4; GPRC6A; CYSLT1; NPY2R; TA11; PGR4; PGR28; CYSLT2; PPYR1; TA12; PGR5; DRD1; NPY5R; TA14; PGR6; DRD2; NPY6R; TA15; PGR7; DRD3; NTSR1; GPR14; PGR8; DRD4; NTSR2; AVPR1A; PGR10; FZD1; DRD5; OPRD1; AVPR1B; PGR11; FZD2; FY; OPRK1; AVPR2; PGR12; FZD3; TG1019; OPRM1; OXTR; PGR13; FZD4; HM74; OPRL1; GPR48; PGR14; FZD5; GPR81; OPN1LW; GPR49; RDC1; FZD6; EDNRA; OPN1MW; LGR6; RE2; FZD7; EDNRB; OPN1SW; GPR27; RRH; FZD8; FPR1; RHO; GPR85; FZD9; FPRL1; HCRTR1; SREB3; FZD10; FPRL2; HCRTR2; GPR3; SMOH; FPR-RS1; PTAFR; GPR6; CALCR; FPR-RS2; PTGDR; GPR12; CALCRL; FPR-RS3; PTGER1; GPR21; CRHR1; FPR-RS4; PTGER2; GPR52; CRHR2; GALR1; PTGER3; GPR26; GIPR; TM7SF1; GALR2; PTGER4; GPR78; GCGR; TM7SF1L1; GALR3; PTGFR; GPR37; GLP1R; TM7SF1L2; GHSR; PTGIR; GPR37L1; GLP2R; TM7SF3; GPR38; TBXA2R; GPR41; GHRHR; TPRA40; 및 GPR43.
일부 경우에, 스위치 수용체는 합성 리간드(RASSL)에 의해서만 활성화된 수용체이다. RASSL은 합성 소분자 리간드에만 반응하도록 디자인된 GPCR일 수 있다. RASSL은 임의의 GPCR 백본으로 구성될 수 있으며, 이의 예가 제공되어있다. 일부 경우에, RASSL은 합성 리간드에 의해 활성화되도록 디자인된다. 이 경우에, RASSL은 내인성 리간드에 대해 반응성하지 않거나 실질적으로 덜 반응할 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, 이 방법은 RASSL이 합성 리간드의 존재하에서만 활성화되도록 RASSL의 시간적 제어를 제공할 수 있다. RASSL은 내인성 리간드에 대해 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 86% 미만, 87% 미만, 88% 미만, 89% 미만, 90% 미만, 91% 미만, 92% 미만, 93% 미만, 94% 미만, 95% 미만, 96% 미만, 97% 미만, 98% 미만, 99% 미만 또는 100% 미만으로 반응할 수 있다. 일부 경우에, RASSL은 원래 별도의 단백질을 암호화한 두 개 이상의 유전자(또는 유전자의 일부)의 결합으로부터 생성된 융합 단백질이다. 일부 경우에, RASSL은 야생형 GPCR과 적어도 부분적으로 상동이다. 일부 경우, RASSL은 야생형 GPCR에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9%의 아미노산 상동성을 공유한다.
일부 양태에서, 본 발명의 스위치 수용체는 디자이너 드럭(DREADD)에 의해 독점적으로 활성화되는 디자이너 수용체이다. 일부 경우에, DREADD는 RASSL이다. DREADD는 생물학적으로 비활성인 리간드에 의해 활성화되는 임의의 GPCR일 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이 용어 "생물학적으로 비활성"은 야생형 수용체에 대해 낮은 친화력을 가져서, 낮은 응답성을 갖는 리간드-수용체 상호작용을 일으키나 스위치 수용체(예를 들어, DREADD)에 대해 높은 친화성을 가질 수 있는 임의의 리간드(예를 들어, 단백질, 소분자, 지질 등)를 의미한다. 생물학적으로 불활성인 임의의 리간드는 일반적으로 투여량이 통상적으로 전달되는 경우, 스위치 수용체의 부재하에 유기체에 생리학적 효과를 거의 또는 전혀 갖지 않을 것이다. 그러나, 스위치 수용체의 존재하에, 생물학적으로 비활성인 리간드는 유기체에 유의한 생리학적 효과(예를 들어, 진통 완화)를 가질 수 있다. 생물학적으로 비활성인 소분자의 사용은 예를 들어, 부작용 및 오프-타겟 효과의 위험이 낮기 때문에 본 발명에 개시된 방법에 의해 신경 질환을 치료하기에 적합할 수 있다. DREADD는 다른 경우에 대상에게 효과를 갖지 않는 생물학적으로 불활성인 분자에 의해 일시적으로 제어될 수 있기 때문에 DREADD는 본 발명에 기술된 방법을 수행하는 특별한 유용성을 발견 할 수 있다. DREADD는 상술된 임의의 GPCR 백본(예를 들어, 직접 진화 또는 합리적인 설계를 통해)을 사용하여 디자인될 수 있다. 일부 경우에, DREADD는 내인성 리간드에 대해 반응하지 않거나 실질적으로 덜 반응하므로, 합성 리간드에 의해 주로 활성화된다. DREADD의 예는 Armbruster et al., PNAS, 2007에 기술된 바와 같이 무스카린성 아세틸콜린 수용체(예를 들어, hM1Dq, hM2Di, hM3Dq, hM4Di 및 hM5Dq)에 대해 디자인된 것들 및 Vardy et al., Neuron, 2015에 기술된 바와 같이 카파 오피오이드 수용체에 대해 디자인된 것들을 제한 없이 포함하며, 이의 참고문헌은 참조로 본 발명에 포함된다. 일부 경우에, DREADD는 클로자핀-N-옥사이드(예를 들어, hM1Dq, hM2Di, hM3Dq, hM4Di 및 hM5Dq 수용체)에 의해 활성화된다. 일부 경우에, 생물학적으로 비활성인 화합물은 화합물 4b(3-클로로-6-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀); 화합물 6(4-(8-클로로-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀-11-일)-1,1-다이메틸피페라진-1-움 요도드화물; 화합물 11(3-클로로-6-(피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀); 화합물 13(8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀); 및 화합물 21(11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀; 11-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀)을 포함하는 Chen et al., ACS Chem. Neurosci., 2015에 개시된 임의의 화합물과 같은 N4'-알킬 치환된 CNO 유사체이다. 다른 경우에, DREADD는 살비노린 B(예를 들어, KOR-DREADD)에 의해 활성화된다. 임의의 GPCR은 DREADD로서 디자인될 수 있고 본 발명은 개시된 DREADD에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 합성 리간드는 본질적으로 생물학적으로 비활성인 임의의 분자일 수 있다.
DREADD는 특정 G 단백질 및 특정 시그널링 경로를 활성화시키는 DREADD의 능력에 기초하여 본 발명에 기술된 방법을 수행하기 위한 스위치 수용체로서 선택될 수 있다. 시그널링 경로는 관심 신경 질환을 특이적으로 치료하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 억제성 G 단백질, Gi에 결합하는 DREADD의 사용은, 예를 들어, 통증을 치료하기에 적합할 수 있다. Gi에 결합하는 DREADD의 한 비-제한적인 예는 hM4Di이다. 일부 경우에, hM4Di는 클로자핀-N-옥사이드에 의해 활성화된다. hM4Di를 활성화시킬 수있는 리간드의 다른 비-제한적인 예는 클로자핀, 퍼라핀 및 올란자핀을 포함한다. 다른 예에서, 흥분성 G 단백질, Gq에 결합되는 DREADD는, 예를 들어, 통증을 치료하기에 적합할 수 있다. Gq에 결합하는 DREADD의 한 비-제한적인 예는 hM3Dq이다. 일부 경우에, hM3Dq는 클로자핀-N-옥사이드, 클로자핀, 퍼라핀 또는 올란자핀에 의해 활성화된다.
리간드, RASSL 및 DREADD와 특이적으로 결합하는 GPCR의 예시적 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 GPCR로부터 유래될 수 있다: 5-하이드록시트립타민 수용체, 아세틸콜린 수용체(무스카린성), 아데노신 수용체, 접착성 클래스 GPCR, 아드레날린 수용체, 안지오텐신 수용체, 아펠린 수용체, 담즙산 수용체, 봄베신 수용체, 브라디키닌 수용체, 칼시토닌 수용체, 칼슘-감지 수용체, 칸나비노이드 수용체, 케메린 수용체, 케모카인 수용체, 콜레시스토키닌 수용체, 클래스 프리질리드 GPCRs, 보체 펩타이드 수용체, 부신피질자극호르몬-방출 인자 수용체, 도파민 수용체, 엔도텔린 수용체, 에스트로겐(G 단백질 결합) 수용체, 포밀펩타이드 수용체, 유리 지방산 수용체, GABAB 수용체, 갈라닌 수용체, 그렐린 수용체, 글루카곤 수용체 패밀리, 글리코프로테인 호르몬 수용체, 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체, GPR18, GPR55 및 GPR119, 히스타민 수용체, 하이드록시카복실산 수용체, 키스펩틴 수용체, 류코트리엔 수용체, 리소포스폴리드(LPA) 수용체, 리소포스폴리드(S1P) 수용체, 멜라닌-농축 호르몬 수용체, 멜라노코르티닌 수용체, 멜라노틴 수용체, 메타보트로픽 글루타메이트 수용체, 모틸린 수용체, 뉴로메딘 U 수용체, 신경펩타이트 FF/신경펩타이트 AF 수용체, 신경펩타이트 S 수용체, 신경펩타이트 W/신경펩타이트 B 수용체, 신경 펩타이드 Y 수용체, 뉴로텐신 수용체, 오피오이드 수용체, 오렉신 수용체, 옥시글루타레이트 수용체, P2Y 수용체, 부갑상선 호르몬 수용체, 펩타이드 P518 수용체, 혈소판-활성화 인자 수용체, 프로키네틴 수용체, 프로락틴-방출 펩타이드 수용체, 프로스타노이드 수용체 , 프로테아제 활성화 수용체, 릴렉신 패밀리 펩타이드 수용체, 소마토스타틴 수용체, 숙시네이트 수용체, 타치키닌 수용체, 갑상선호르몬-수용체, 트레이스 아민 수용체, 우로텐신 수용체, 바소프레신 및 옥시토신 수용체, VIP 및 PACAP 수용체.
본 발명에서 고려되는 신경 질환을 치료하는 특정 실시태양에서의 사용에 적합한 GPCR-리간드 쌍의 예시적인 예가 표 1에 제시되어 있다.
신경 질환의 치료를 위한 GPCR-리간드 조합의 비-제한적인 예
종류 수용체 리간드 효과 메커니즘
GPCR AlstR (Drosophila) 알라토스타틴 억제 Gi-결합; GIRK K+ 채널을 활성화한다
GPCR DREADD hM4Di (human) CNO, 클로자핀, 퍼라핀, 올란자핀, 알로세트론, 플루퍼라핀, N4'-알킬 치환 CNO 유사체* 억제 Gi-결합; GIRK K+ 채널을 활성화한다; Ca++ 채널을 억제한다; cAMP를 억제한다
GPCR DREADD KORD (human) 살비노린 B 억제 Gi-결합; GIRK K+ 채널을 활성화한다; CA++ 채널을 억제한다; cAMP를 억제한다
GPCR DREADD hM3Dq (human) CNO, 클로자핀, 퍼라핀, 올란자핀, 알로세트론, 플루퍼라핀, N4'-알킬 치환 CNO 유사체* 자극 Gq-결합; KCNQ K+ 채널을 억제한다
GPCR DREADDGsD CNO, 클로자핀, 퍼라핀, 올란자핀, 알로세트론, 플루퍼라핀, N4'-알킬 치환 CNO 유사체* 활동일 주기를 조절하고 인슐린 분비를 제어한다; 자극 Gs-결합; cAMP 조절
다음을 포함하는 Chen et al., ACS Chem. Neurosci. 2015, PMID 25587888에 기술된 *N4'-알킬 치환 클로자핀-N-옥사이드(CNO) 유사체: 3-클로로-6-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀, 4-(8-클로로-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀-11-일)-1,1-다이메틸피페라진-1-움 요도드화물, 3-클로로-6-(피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀, 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀, 또는 11-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀.
2. 리간드-개폐 이온 채널
특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 리간드-개폐 이온 채널(LGIC) 또는 이의 뮤테인이다. LGIC는 리간드의 결합에 반응하여 세포막을 가로 질러 이온(예를 들어, Na+, K+, Ca++, Cl-)의 유입을 제어하는 임의의 막 투과성 단백질일 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, LGIC의 활성화는 흥분성 세포의 전기생리학적 활성(즉, 탈분극, 과분극)을 변화시킬 수 있다. LGIC는 양이온, 음이온 또는 이들의 조합을 막을 통해 제어할 수 있다. LGIC는 채널의 이온 선택성에 따라 선택될 수 있다. 일부 경우, LGIC는 막을 가로질러 염소 이온(Cl-)의 유입을 제어하고, 예를 들어 통증을 치료하는데 적합할 수 있다. 일부 양태에서, LGIC 또는 이의 뮤테인의 하나 이상의 서브유닛은 이종성 리간드, 외인성 리간드 및/또는 합성 리간드에 특이적으로 결합하도록 조작되었다. 특정 실시태양에서 사용하기에 적합한 LGIC의 예시적인 예는 5-HT3 수용체, 산-감지(양성자-개폐) 이온 채널(ASIC), 상피 나트륨 채널(ENaC), GABAA 수용체, 글리신 수용체, 이온성 글루타메이트 수용체, IP3 수용체, 니코틴성 아세틸콜린 수용체, P2X 수용체, 리아노딘 수용체 및 아연 활성화 채널(ZAC)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 양태에서, 리간드-개폐 이온 채널은 본래 별개의 폴리펩타이드에 대해 암호화된 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열의 융합에 의해 생성된 이온 전도 기공 도메인 및 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 cys 루프 수용체 유전자 패밀리의 2개 이상의 구성원을 포함한다. 한 실시태양에서, 이온 전도 기공 도메인은 음이온을 전도한다. 다른 실시태양에서, 이온 전도 기공 도메인은 양이온을 전도한다.
일부 경우에, LGIC는 합성 리간드에 의해 활성화될 수 있도록 조작되거나 변형된다. 본 발명에 기술된 방법을 수행하기에 적합한 LGIC의 비-제한적인 예는 합성 리간드, 이버멕틴에 반응하도록 조작된 글루타메이트-개폐 클로라이드 채널(Frazier et al., Journal of Biological Chemistry, 2012); 합성 리간드 PSEM22S에 의해 활성화된 PSAM-5HT3HC, 합성 리간드 PSEM89S에 의해 활성화된 PSAM-GlyR 및 PSAM9S에 의해 활성화된 PSAM-nAChR(Magnus et al., Science, 2011); 캡사이신에 의해 활성화된 TRPV1; 합성 리간드 이버멕틴에 의해 활성화된 GlyR-M(Lynagh and Lynch, Journal of Biological Chemistry, 2010); 및 합성 리간드 졸 피뎀에 의해 활성화된 GABA-A를 포함한다.
본 발명에 기술된 방법과 함께 사용하기에 적합한 LGIC의 다른 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: HTR3A; HTR3B; HTR3C; HTR3D; HTR3E; ASIC1; ASIC2; ASIC3; SCNN1A; SCNN1B; SCNN1D; SCNN1G; GABRA1; GABRA2; GABRA3; GABRA4; GABRA5; GABRA6; GABRB1; GABRB2; GABRB3; GABRG1; GABRG2; GABRG3; GABRD; GABRE; GABRQ; GABRP; GABRR1; GABRR2; GABRR3; GLRA1; GLRA2; GLRA3; GLRA4; GLRB; GRIA1; GRIA2; GRIA3; GRIA4; GRID1; GRID2; GRIK1; GRIK2; GRIK3; GRIK4; GRIK5; GRIN1; GRIN2A; GRIN2B; GRIN2C; GRIN2D; GRIN3A; GRIN3B; ITPR1; ITPR2; ITPR3; CHRNA1; CHRNA2; CHRNA3; CHRNA4; CHRNA5; CHRNA6; CHRNA7; CHRNA9; CHRNA10; CHRNB1; CHRNB2; CHRNB3; CHRNB4; CHRNG; CHRND; CHRNE; P2RX1; P2RX2; P2RX3; P2RX4; P2RX5; P2RX6; P2RX7; RYR1; RYR2; RYR3; 및 ZACN.
TRPV1, TRPM8 및 P2X2는 게이팅 원리뿐만 아니라 구조적 특징을 공유하는 대형 LGIC 패밀리의 구성원이다. 예를 들어, TRPV1과 유사한 TRPV4는 또한 열에 의해 유발되지만 캡사이신에 의해 유발되지는 않는다; P2X3는 ATP에 의해 유발되지만 P2X2보다 더 빠르게 감도가 감소한다. 따라서, TRPV1, TRPM8 및 P2X2는 특정 실시태양에서의 사용에 적합한 LGIC의 비 제한적인 예이다.
한 실시태양에서, 스위치 수용체는 TRPV1 또는 TRPM8 수용체 또는 이의 뮤 테인이다. TRPV1 및 TRPM8은 말초 신경계의 침해 수용성 뉴런에 의해 발현되는 바닐로이드 및 멘톨 수용체이다. 두 채널은 비 선택적, 나트륨 및 칼슘 투과성 호모 테트라머로 기능한다고 생각된다. 또한, 두 채널 및 이의 주요 효현제-캡사이신 및 멘톨과 같은 냉각 화합물은 중추 신경계에 실질적으로 존재하지 않는다. 캡사이신 및 멘톨과 이실린을 포함하는 냉각 화합물은 광불안정 차단 그룹에 대한 잠재적인 수용체 위치를 함유한다. 이런 수용체와 광 불안정 차단 그룹의 결합은 광이 활성 리간드를 방출함으로써 간접적인 유발체로 작용하는 리간드-개폐 이온 채널을 초래할 것이다.
한 실시태양에서, 스위치 수용체는 P2X2 수용체 또는 이의 뮤테인이다. P2X2는 감도 저하 속도가 느린 ATP-개폐 비 선택적 양이온 채널이다. P2X2는 선택적으로 접근 가능한 탈극성 전류원으로 사용될 수 있으며 자연적 효현제가 완전히 결여된 조작된 채널- 리간드 조합의 생성을 위한 플랫폼을 제공한다.
본 발명에서 고려되는 신경 질환을 치료하는 특정 실시태양에서의 사용에 적합한 LGIC-리간드 쌍의 예시적인 예가 표 2에 제시되어있다.
신경 질환 치료를 위한 LGIC-리간드 조합의 비 제한적인 예
종류 수용체 리간드 효과 메커니즘
LGIC GluCl α 및 β(초파리) 이버멕틴
셀라멕틴
도라멕틴
에마멕틴
에프리노멕틴
아바멕틴
목시덱틴		 억제 Cl-채널
LGIC PSAM-5HT3HC (인간-마우스) PSEM22S 자극 양이온 채널
LGIC PSAM-GlyR PSEM89S 억제 Cl-채널
LGIC PSAM-nAChR PSEM9S 도시되지 않음 Ca++ 채널
LGIC TRPV1 (랫트) 캡사이신 자극 양이온 채널
LGIC GlyR-M (인간) 이버멕틴
셀라멕틴
도라멕틴
에마멕틴
에프리노멕틴
아바멕틴
목시덱틴		 억제 Cl-채널
LGIC GABAA (마우스) 졸피뎀 억제 Cl-채널
3. 글리신 수용체
특정 실시태양에서, 스위치 수용체는 글리신 수용체(GlyR) 또는 이의 뮤테인이다. 일부 양태에서, GlyR 또는 이의 뮤테인의 하나 이상의 서브유닛은 이종성 리간드, 외인성 리간드 및/또는 합성 리간드에 특이적으로 결합하도록 조작되었다. GlyR은 중추 신경계(CNS)에서 빠른 신경전달을 매개하는 리간드-개폐 이온성 수용체의 니코틴계 수퍼패밀리의 구성원이다. 그러나 인간 α1 서브유닛의 이종성 발현은 천연 채널과 본질적으로 동일한 약리학적 성질을 가진 활성 글리신-개폐 채널을 재구성하는데 충분하다. 따라서, 다양한 예시적인 실시태양에서, 스위치 수용체는 GlyR의 서브유닛(예를 들어, α1, α2, α3, α4 또는 β)를 포함하고 바람직하게는 포유 동물 기원의 서브유닛 또는 이런 서브유닛의 뮤테인을 포함한다. 특정 실시태양에서 사용하기에 적합한 GlyR의 예시적 예는 미국 특허 제8,957,036호에 기술되어 있으며, 이는 본 발명에서 그 전체가 참고로 포함된다.
변형된 활성을 갖는 GlyR 서브유닛의 돌연변이 형태(뮤테인)가 또한 공지되어 있고, 특정 실시태양에서 사용될 수 있다. 예를 들어, GlyR 단백질의 특정 뮤 테인은 양이온 이온 채널을 초래하는 것과 같은 변화된 이온-채널 특성을 초래한다(예를 들어, Δ250A251E; Keramidas et al., J. Gen. Physiol., 119, 393(2002)). 다른 GlyR 뮤테인은 아연 강화 또는 아연 억제(예를 들어, Hirzel et al., Neuron, 52, 679-90 (2006)), 알로스테릭 조절제에 대한 친화력(예를 들어, 마취 증강(Hemmings et al., Trends Pharmacol. Sci., 26, 503-10(2005)) 또는 리간드에 대한 친화력(Rajendra et al., Neuron, 14, 169-175 (1995); Schrnieden et al., Science, 262, 256-258(1993))을 위한 위치가 없다. GlyR 서브유닛의 돌연변이는 또한 이온 투과(예를 들어, 음이온 또는 양이온 선택 채널)를 선택적으로 변경할 수 있으며 리셉터 서브유닛의 리간드 결합 포켓을 이종성 또는 합성 리간드를 인식하도록 재디자인할 수 있다. 예를 들어, 특정 리간드에 대한 GlyR 단백질의 민감성과 선택성을 변경하기 위해서, 점 돌연변이는 용량 반응 곡선을 왼쪽 또는 오른쪽으로 이동시킬 것으로 예상되는 GlyRα1 서브유닛에서 이루어질 수 있다(즉, 글리신에 대해 덜 또는 더 특이적이다). 다른 돌연변이는 특정 마취제(예를 들어, 에탄올)에 대한 GlyR 단백질의 민감성을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 위치 287에서 메티오닌(M)이 류신(L)(M297L)으로 변화되는 마우스 글리신 α1 수용체 서브유닛의 돌연변이는 휘발성 마취제 엔플루란에 대한 민감성을 크게 향상시킨다. 이러한 GlyR 뮤테인은 특정 실시태양에서 GlyR 단백질로서 사용될 수 있다.
특히 바람직한 실시태양에서, 스위치 수용체는 이의의 천연 리간드에 대한 GlyR 결합을 폐지하고 이종성 또는 합성 리간드에 대한 GlyR 뮤테인의 특이적 결합을 부여하는 하나 이상의 아미노산 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는 GlyRα1 서브유닛을 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 스위치 수용체는 F207 및/또는 A228에서 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 GlyRα1 서브유닛을 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 스위치 수용체는 아미노산 치환 F207A 및/또는 A228G를 포함하는 GlyRα1 서브유닛을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 스위치 수용체는 아미노산 치환 F207A 및 A228G를 포함하는 GlyRα1 서브유닛을 포함하고 리간드 이버멕틴에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 스위치 수용체는 아미노산 치환 F207A 및 A228G를 포함하는 GlyRα1 서브유닛을 포함하고, 목시덱틴(밀베마이신) 및 이의 유사체 이외에 이버멕틴 유사체 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에피리노멕틴 및 아바멕틴을 포함하는 이버멕틴(넓은 종류로서)에 특이적으로 결합한다.
일부 실시태양에서, 스위치 수용체는 다음 아미노산 치환: A-1'E, P-2'Δ, T13'V, R19'E, F207A 및 A228G의 하나 이상을 포함하는 GlyRα1 서브유닛을 포함한다(Islam et al., ACS Chem. Neurosci., DOI: 10.1021/acschemneuro.6b00168 (2016) 참조). 한 실시태양에서, 스위치 수용체는 아미노산 치환 A-1'E, F207A 및 A228G를 포함하는 GlyRα1 서브유닛을 포함하고 리간드 이버멕틴에 특이적으로 결합한다. 다른 실시태양에서, 스위치 수용체는 아미노산 치환 A-1'E, P-2'Δ, T13'V, F207A 및 A228G를 포함하는 GlyRα1 서브유닛을 포함하고 리간드 이버멕틴에 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 고려되는 특정 실시 양태에서의 사용에 적합한 아버멕틴 유사체의 예시는 PubChem 화합물 데이터베이스(www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)의 기존 유사체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
E. 리간드
신경 질환(예컨대, 통증)을 치료하기에 적합한 리간드는 본 발명에 기재된 바와 같은 스위치 수용체를 활성화시킬 수 있는 임의의 분자를 포함할 수 있다. 리간드는 핵산, 소분자 화합물, 단백질 또는 펩타이드, 지질, 광자 등일 수 있다. 본 발명의 GPCR-유도된 스위치 수용체를 활성화시키는데 적합한 리간드의 비 제한적인 예는 알라토스타틴; 날푸라핀(C28H32N2O5), 클로자핀-N-산화물(CNO); 클로자핀; 올란자핀; 퍼라핀; 살비노린 B; 알로세트론; 플루퍼라핀; 및 화합물 4b(3-클로로-6-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀); 화합물 6(4-(8-클로로-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀-11-일)-1,1-다이메틸피페라진-1-움 요도드화물; 화합물 11(3-클로로-6-(피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀); 화합물 13(8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀); 및 화합물 21(11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀; 11-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀)을 포함하는 Chen et al., ACS Chem. Neurosci., 2015에 개시된 임의의 화합물과 같은 N4'-알킬 치환된 CNO 유사체를 포함한다. 본 발명의 LGIC 유래의 스위치 수용체를 활성화시키는데 적합한 리간드의 비 제한적인 예는 다음을 포함한다: 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라메틴, 에마멕틴, 에프리노멕틴 및 아바멕틴을 포함하는 아버멕틴 패밀리의 구성원; 밀베멕틴, 목시덱틴 및 네마덱틴을 포함하는 밀베바이신 패밀리의 구성원; 졸피뎀, 알피뎀, 사리피뎀, 네오피뎀, 파시플론 및 DS-1을 포함하는 이미다조피리딘; 캡사이신, 다이하이드로캡사이신, 노르다이하이드로캡사이신, 호모다이하이드로캡사이신, 호모캡사이신 및 노니브아마이드를 포함하는 캡사이시노이드; PSEM22S, PSEM89S 및 PSEM9S를 포함하는 약리학적 선택적 이펙터 분자(PSEM); 및 ATP. 일부 경우에, 리간드 결합 도메인은 클로자핀-N-산화물(CNO), 클로자핀, 퍼라핀, 올란자핀; 알로세트론, 플루퍼라핀, 날푸라핀(C28H32N2O5) 또는 N4'-알킬 치환된 CNO 유사체의 결합에 의해 활성화된다. 특정 양태에서, 리간드 결합 도메인은 니코틴, 바레니클린 또는 갈란트아민의 결합에 의해 활성화된다. 일부 경우에, 리간드는 글리신, 베타-알라닌 또는 타우린이 아니다.
일부 경우에, 리간드는 본 발명에서 고려된 신경 질환 또는 장애를 포함하지 않는 하나 이상의 징후에 대해 FDA 승인된 약물이다. 달리 말하자면, 신경 장애를 앓고 있는 대상은 신경 장애를 치료하도록 FDA-승인되지 않은(즉, "오프-레이블" 표시) FDA-승인 약물로 치료될 수 있다. 도 3은 약물이 FDA-승인되지 않은 신경 장애를 치료하기 위해 용도가 변경될 수 있는 FDA-승인 약물의 비-제한적인 예를 제공한다. 예를 들어, 클로자핀은, 출원 시에, 정신 분열병 치료를 위해 FDA 승인을 받았으며 불안 장애 치료에 "오프 레이블(off-label)"로 사용된다. 클로자핀은, 예를 들어, 본 발명에 기술된 조성물 및 방법을 사용하여, 위식도 역류 질환(GERD)을 치료하기 위해 용도가 변경될 수 있다고 생각된다. 또 다른 비 제한적인 예에서, 퍼라핀은 최면술로서 비만증 치료를 위해 용도가 변경될 수 있는 최면제이다. 또 다른 비 제한적인 예에서, 이버멕틴은 만성 통증의 치료를 위해 용도가 변경될 수 있는 항기생충이다.
F. 폴리뉴클레오타이드
다양한 예시적인 실시태양에서, 본 발명은 부분적으로 폴리뉴클레오타이드, GPCR, RASSL, DREADD, LGIC 및 이의 서브유닛 및 뮤테인을 포함하나 이에 제한되지 않는 스위치 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 융합 폴리펩타이드, 바이러스 벡터 폴리뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1(표 4) 및 도 2a-2c를 참조한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드 서열"또는 "핵산"은 상호 교환적으로 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이의 유사체인 임의의 길이의 폴리머 형태의 뉴클레오타이드를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지된 또는 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비 제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 암호화 또는 비 암호화 영역, 결합 분석에 의해 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 가지형 폴리 뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리 된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를. 폴리 뉴클레오타이드는 메틸화 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체와 같은 하나 이상의 변형 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리머의 조립 전 또는 후에 부여될 수있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비 뉴클레오타이드 성분에 의해 차단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합 후, 예를 들어, 표지 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 또는 DNA/RNA 하이브리드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 프리-메신저 RNA(프리-mRNA), 메신저 RNA(mRNA), RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 리보자임, 합성 RNA, 게놈 RNA(g RNA), 플러스 가닥 RNA(RNA(+)), 마이너스 가닥 RNA(RNA(-)), 합성 RNA, 게놈 DNA(gDNA), PCR 증폭 DNA, 상보적 DNA(cDNA), 합성 DNA, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 또는 각 유형의 뉴클레오타이드의 변형 형태의 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 5000, 적어도 10000 또는 적어도 15000 뿐만 아니라 모든 중간 길이의 폴리머 형태의 뉴클레오타이드를 의미한다. 이 문맥에서 "중간 길이"는 6, 7, 8, 9 등, 101, 102, 103 등; 151, 152, 153 등; 201, 202, 203 등과 같이 인용된 값 사이의 임의의 길이를 의미함을 쉽게 이해할 수 있다. 특정 실시태양에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 변이체는 본 발명에 기술된 또는 당업계에 공지된 참조 서열에 대해 적어도 또는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진다.
본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "유전자"는 인핸서, 프로모터, 인트론, 엑손 등을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미할 수 있다. 특정 실시태양에서, 용어 "유전자"는 폴리뉴클레오타이드 서열이 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 서열과 동일한지 여부에 관계없이, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
"의 전사를 조절하는 게놈 서열" 또는 "전사를 조절하는 게놈 서열"은 유전자의 전사와 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 한 실시태양에서, 게놈 서열은 전사를 억제 또는 감소시키는 폴리펩타이드 또는 전사 억제에 기여하는 전사 인자 결합 부위와 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 결합 부위이기 때문에 전사를 조절한다.
"의 전사를 조절하는 시스-작용 서열" 또는 "전사를 조절하는 시스-작용 뉴클레오타이드 서열" 또는 이의 등가물은 유전자의 전사와 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 한 실시태양에서, 시스-작용 서열은 전사를 억제 또는 감소시키는 폴리펩타이드 또는 전사 억제에 기여하는 전사 인자 결합 부위와 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 결합 부위이기 때문에 전사를 조절한다.
"조절 요소" 또는 "시스-작용 서열" 또는 이의 등가물은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사 또는 발현과 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 제어 서열을 의미한다.
"유도성 발현 조절 요소"는 발현되는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 인핸서 또는 기능적 단편인 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 유도성 발현 조절 요소는 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 증가(턴-온) 또는 감소(턴-오프)시키기 위해 요소와 결합하는 분자의 존재 또는 부존재에 반응한다. 유도성 발현을 위한 예시적인 조절 요소는 테트라사이클린 반응 프로모터, 엑디존 반응 프로모터, 쿠메이트 반응 프로모터, 글루코코르티코이드 반응 프로모터, 에스트로겐 반응 프로모터, RU-486 반응 프로모터, PPAR-γ 프로모터 및 퍼옥사이드 유도성 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"일과성(transient) 발현 조절 요소"는 폴리뉴클레오타이드 뉴클레오타이드 서열을 잠깐 또는 일시적으로 발현하는데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 특정 실시태양에서, 일시적 발현을 위한 하나 이상의 조절 요소는 폴리뉴클레오타이드의 지속 시간을 제한하는데 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 폴리뉴클레오타이드 발현의 바람직한 지속 시간은 분, 시간 또는 수일 정도이다. 일과성 발현에 대한 예시적인 조절 요소는 핵산 분해효소 표적 부위, 재조합 효소 인식 부위 및 억제 RNA 표적 부위를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 어느 정도까지는, 특정 실시태양에서, 유도성 발현을 위한 조절 요소는 또한 폴리뉴클레오타이드 발현의 지속 기간을 조절하는데 기여할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드 변이체" 및 "변이체" 등은 참조 폴리뉴클레오타이드 서열과 실질적인 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드 또는 이후에 정의되는 엄격한 조건 하에서 참조 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 이들 용어는 또한 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 첨가, 결실, 치환 또는 변형에 의해 기준 폴리뉴클레오타이드와 구별되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체"는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 추가 또는 결실되거나 변형되거나 상이한 뉴클레오타이드로 치환된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 관련하여, 변경된 폴리뉴클레오타이드가 기준 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 기준 폴리뉴클레오타이드에 돌연변이, 첨가, 결실 및 치환을 포함하는 특정 변경이 이루어질 수 있음은 당업계에서 잘 알려져 있다.
한 실시태양에서, 폴리뉴클레오타이드는 엄격한 조건 하에서 표적 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. "엄격한 조건"하에서 혼성화하는 것은 서로 적어도 60% 동일한 뉴클레오타이드 서열이 혼성화된 것으로 존재하는 혼성화 프로토콜을 기술한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮은 것으로 선택된다. Tm은 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열과 혼성화하는 온도(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서)이다. 표적 서열은 일반적으로 Tm에서 과잉으로 존재하기 때문에, 프로브의 50%가 평형 상태에서 사용된다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "서열 동일성" 또는 예를 들어, "50% 동일한 서열"을 포함하는 인용은 서열이 비교 윈도우에 대해 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 기준 또는 아미노산-대-아미노산 기준에 대해 동일하다는 정도를 의미한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에 대해 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)이 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 비교 윈도우에서 위치의 총 수(즉, 윈도우 크기)로 일치된 위치의 수를 나누고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 사이의 서열 관계를 기술하는데 사용되는 용어는 "참조 서열", "비교 윈도우", "서열 동일성", "서열 동일성 백분율" 및 "실질적인 동일성"을 포함한다. "참조 서열"은 적어도 12개이지만 주로 15 내지 18개이고 종종 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기를 포함하는 길이가 적어도 25개 모노머 유닛이다. 2개의 폴리뉴클레오타이드는 각각 (1) 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이에서 유사한 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부만) 및 (2) 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이에서 발현되는 서열을 포함할 수 있기 때문에, 2개(또는 그 이상)의 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 비교는 서열 유사성의 국소 부위를 동정하고 비교하기 위해 "비교 윈도우"에 대해 2개의 폴리뉴클레오타이드의 서열을 비교함으로써 통상적으로 수행된다. "비교 윈도우"는 적어도 약 6개의 인접한 위치, 일반적으로 약 50 내지 약 100, 보다 통상적으로는 약 100 내지 약 150의 개념적 세그먼트를 의미하며 여기서 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 인접한 위치의 동일한 수의 기준 서열과 비교된다. 비교 윈도우는 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 약 20% 이하의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 윈도우의 정렬을 위한 서열의 최적 정렬은 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지 릴리스 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA) 또는 검색 및 선택된 다양한 방법의 임의의 것에 의해 생성된 최상의 정렬(즉, 비교 윈도우에 비해 가장 높은 상동성 비율을 나타냄)에 의해 실행될 수 있다. 또한, 예를 들어 Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389에 의해 개시된 프로그램의 BLAST 패밀리를 참조할 수 있다. 서열 분석의 상세한 논의는 Unit 19.3 of Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15에서 발견될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 자연 발생 상태에서 측면에 인접한 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 단편에 정상적으로 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 의미한다. 특정 실시태양에서, "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 천연 상에 존재하지 않고 인간의 손에 의해 만들어진 상보적인 DNA(cDNA), 재조합 DNA 또는 다른 폴리뉴클레오타이드를 말한다.
폴리뉴클레오타이드의 배향을 기술하는 용어는 5'(일반적으로 유리 인산기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 말단) 및 3'(일반적으로 유리 하이드록실(OH)기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 말단)을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 주석을 달 수 있다. DNA와 mRNA의 경우, [DNA에서 티민(T) 대신에, RNA에서 우라실(U) 제외] 5'에서 3' 가닥은 프리-메신저(premRNA)의 서열과 동일하기 대문에 "센스", "플러스" 또는 "암호화" 가닥으로 지정된다. DNA와 mRNA의 경우, RNA 중합효소에 의해 전사되는 가닥인 상보적인 3'에서 5' 가닥은 "주형", "안티센스", "마이너스"또는 "비 암호화"가닥으로 지정된다. 본 발명에 사용된 용어 "역방향 배향"은 3'에서 5' 방향으로 쓰여진 5'에서 3' 서열 또는 5'에서 3' 방향으로 쓰여진 3'에서 5' 서열을 의미한다.
용어 "측면에 인접한"은 상류 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 하류 폴리뉴클레오타이드 서열, 즉 서열에 대해 5' 및/또는 3' 사이에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 예를 들어, 두 개의 다른 요소에 의해 "측면에 인접한" 서열은 하나의 요소가 서열의 5'에 위치하고 다른 하나가 서열의 3'에 위치함을 나타내나, 그 사이에 개재 서열이 있을 수 있다.
용어 "상보적인" 및 "상보성"은 염기쌍화 규칙에 의해 관련된 폴리뉴클레오타이드(즉, 뉴클레오타이드의 서열)를 의미한다. 예를 들어, DNA 서열 5' A G T C A T G 3'의 상보적 가닥은 3' T C A G T A C 5'이다. 후자의 서열은 종종 왼쪽의 5' 말단과 오른쪽의 3' 말단인 5' C A T G A C T 3'을 갖는 역상으로 쓰여진다. 역상과 동일한 서열은 회문염색 서열(palindromic sequence)이라고 한다. 상보성은 핵산 염기의 일부만이 염기쌍화 규칙에 따라 매칭되는 "부분"일 수 있다. 또는 핵산 사이에 "완전" 또는 "전체" 상보성이 있을 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이 용어 "핵산 카세트"또는 "발현 카세트"는 폴리뉴클레오타이드로부터 하나 이상의 RNA를 발현시키기에 충분한 벡터와 같은 더 큰 폴리뉴클레오타이드 내의 폴리 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 발현된 RNA는 단백질로 번역될 수 있고, 절단 및/또는 분해를 위한 다른 폴리 뉴클레오타이드 서열을 표적화하기 위한 안내 RNA 또는 억제 RNA로서 작용할 수 있다. 한 실시태양에서, 핵산 카세트는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오타이드(들)를 함유한다. 또 다른 실시태양에서, 핵산 카세트는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오타이드(들)에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열을 함유한다. 폴리뉴클레오타이드는 관심 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이 용어 "관심 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 본 발명에서 고려한 바와 같이, 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 억제성 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, GPCR, RASSL, DREADD, LGIC, 및 이의 서브유닛 및 뮤테인의 전사를 위한 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 특정 실시태양에서, 관심 폴리뉴클레오타이드는 핵산분해효소 활성 및/또는 염색질 재구성 또는 후성적 변형 활성과 같은 하나 이상의 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화한다.
벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상의 핵산 카세트를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 핵산 카세트는 스위치 수용체, 예를 들어 GPCR, RASSL, DREADD, LGIC 또는 이의 서브유닛 또는 뮤테인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열(예를 들어, 신경 세포에서 작동 가능한 프로모터 또는 인핸서)을 포함한다. 카세트는 단일 유닛으로서, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 다른 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 제거되거나 속에 삽입될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 이상의 핵산 카세트를 포함하며 이의 임의의 수 또는 조합은 동일하거나 반대 방향일 수 있다.
또한, 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서, 본 발명에서 고려되는 바와 같이, 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 단편을 암호화할 수 있는 많은 뉴클레오타이드 서열이 존재한다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드의 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 인간 및/또는 영장류의 코돈 선택을 위해 최적화된 폴리뉴클레오타이드와 같이, 코돈 사용의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 의해 구체적으로 고려된다. 한 실시태양에서, 특정 대립 형질 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 대립 유전자는 뉴클레오타이드의 결실, 부가 및/또는 치환과 같은 하나 이상의 돌연변이의 결과로서 변형되는 내인성 폴리 뉴클레오타이드 서열이다.
한 특정 실시태양에서, 관심 폴리뉴클레오타이드는 siRNA, miRNA, shRNA, 리보자임 또는 다른 억제성 RNA, 또는 RNA를 억제하는 시스템, 예를 들어 CRISPR/CAS9 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는 억제성 폴리뉴클레오타이드를 암호화한다. 특정 실시태양에서, 관심 폴리뉴클레오타이드는 통증에 대한 증가된 민감성과 관련된 분자, 예를 들어, TNFα, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPC, TRPP, ACCN1, ACCN2, TRPM8, TRPA1, P2XR3, P2RY, BDKRB1, BDKRB2, Htr3A, ACCNs, KCNQ, HCN2, HCN4, CSF-1, CACNA1A-S, CACNA2D1, IL1, IL6, IL12, IL18, COX-2, NTRK1, NGF, GDNF, LIF, CCL2, CNR2, TLR2, TLR4, P2RX4, P2RX7, CCL2, CX3CR1, 및 BDNF를 표적으로 하는 억제성 RNA이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이 용어 "siRNA" 또는 "짧은 간섭 RNA"는 동물에서 서열 특이적 사후 전사 유전자 사일런싱, 번역 억제, 전사 억제 또는 후성 RNAi의 과정을 매개하는 짧은 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다(Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951; Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13, 139-141; and Strauss, 1999, Science, 286, 886). 특정 실시태양에서, siRNA는 동일한 뉴클레오타이드 수를 갖는 제 1 가닥 및 제 2 가닥을 포함하고; 그러나, 제 1 및 제 2 가닥은 상쇄되어 제 1 및 제 2 가닥 상의 2개의 말단 뉴클레오사이드는 상보적 가닥 상의 잔기와 쌍을 이루지 않는다. 특정 경우에, 쌍을 이루지 않는 2개의 뉴클레오사이드는 티미딘 잔기이다. siRNA는 표적 유전자에 대해 충분한 상동성을 갖는 영역을 포함해야 하며 siRNA 또는 이의 단편이 표적 유전자의 조절을 매개할 수 있도록 뉴클레오타이드 측면에서 충분한 길이를 가져야 한다. 따라서, siRNA는 표적 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 영역을 포함한다. siRNA와 표적 사이에 완벽한 상보성이 있을 필요는 없지만, siRNA 또는 이의 절단 산물이 표적 RNA의 RNAi 절단과 같은 서열 특이적인 사일런싱을 유도할 수 있도록 충분해야 한다. 상보성, 또는 표적 가닥과의 상동성 정도는 안티센스 가닥에서 가장 중요하다. 특히 안티센스 가닥에서, 완벽한 상보성이 종종 요구되는 반면, 일부 실시태양은 표적 RNA에 대해 하나 이상의, 그러나 바람직하게는 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 이하의 미스매치를 포함한다. 미스매치는 말단 영역에서 가장 용납되고, 존재한다면 바람직하게는 말단 영역 또는 말단 영역들, 예를 들어, 5' 및/또는 3' 말단의 6개, 5개, 4개 또는 3개 뉴클레오타이드 내에 존재한다. 센스 가닥은 분자의 전반적인 이중 가닥 특성을 유지하기 위해 안티센스 가닥과 충분히 상보적일 필요가 있다. siRNA의 각 가닥은 길이가 30, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20개 뉴클레오타이드 이하일 수 있다. 가닥은 길이가 적어도 19 뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 예를 들어, 각각의 가닥은 21 내지 25개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 바람직한 siRNA는 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오타이드 쌍의 이중 영역, 및 2-3개 뉴클레오타이드의 하나 이상의 오버행, 바람직하게는 2-3개 뉴클레오타이드의 1개 또는 2개의 3' 오버행을 가진다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "miRNA" 또는 "마이크로 RNA"는 전형적으로 pre-miRNA로 알려진 ~ 70 뉴클레오타이드 폴드백 RNA 전구체 구조로부터 절제 된 20-22개 뉴클레오타이드의 작은 비 암호화 RNA를 의미한다. miRNA는 miRNA와 표적 사이의 상보성의 정도에 따라 두 가지 방법 중 하나로 표적을 음성적으로 조절한다. 첫째, 단백질 암호화 mRNA 서열에 완벽하거나 거의 완벽한 상보성으로 결합하는 miRNA는 RNA 매개 간섭(RNAi) 경로를 유도한다. mRNA 표적의 3' 비번역 영역(UTR) 내의 불완전한 상보적인 부위에 결합하여 조절 효과를 발휘하는 miRNA는 RNAi 경로에 사용되는 것과 동일하거나 가능하면 동일한 RISC 복합체를 통해, 번역의 수준에서 명백하게, 표적 유전자 발현을 전사 후에 억제한다. 번역 제어와 일관되게, 이 메커니즘을 사용하는 miRNA는 표적 유전자의 단백질 수준을 낮추지만 이러한 유전자의 mRNA 수준은 최소한으로 영향을 받는다. miRNA는 자연적으로 발생하는 miRNA뿐만 아니라 모든 mRNA 서열을 특이적으로 표적화할 수 있는 인공적으로 디자인된 miRNA를 모두 포함한다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 당업자는 인간 miRNA(예컨대, miR-30 또는 miR-21) 일차 전사체 또는 "mishRNA"로 발현되는 짧은 헤어핀 RNA 구조체를 디자인할 수 있다. 이 디자인은 드로샤 처리 위치를 헤어핀 구조체에 첨가하고, 크게 녹다운 효율을 증가시키는 것으로 나타났다(Pusch et al., 2004). 헤어핀 줄기는 22nt의 dsRNA(예를 들어, 안티센스는 원하는 표적과 완벽한 상보성을 가짐) 및 인간 miR로부터의 15-19 nt 루프로 구성된다. 헤어핀의 양쪽 또는 양쪽에 miR 루프 및 miR30 플랭킹 서열을 추가하면 마이크로RNA가 없는 통상적인 shRNA 디자인과 비교하여 발현된 헤어핀의 드로샤 및 다이서 처리에 10배 초과 증가를 초래한다. 증가된 드로샤 및 다이서 처리는 더 큰 siRNA/miRNA 생산 및 발현된 헤어핀에 대한 더 큰 효능으로 전환시킨다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "shRNA"또는 "짧은 헤어핀 RNA"는 단일 자기-상보적 RNA 가닥에 의해 형성된 이중 가닥 구조를 의미한다. 표적 유전자의 암호화 또는 비 암호화 서열 중 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 shRNA 구조체가 억제에 바람직하다. 표적 서열에 대해 삽입, 결실 및 단일점 돌연변이를 갖는 RNA 서열 또한 억제에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 억제 RNA와 표적 유전자의 부분 사이의 90% 초과의 서열 동일성 또는 심지어 100%의 서열 동일성이 바람직하다. 특정 바람직한 실시태양에서, shRNA의 이중-형성 부분의 길이는 적어도 20, 21 또는 22개 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 다이서-의존성 절단에 의해 생성된 RNA 생성물의 크기와 상응한다. 특정 실시태양에서, shRNA 구조체는 길이가 적어도 25, 50, 100, 200, 300 또는 400개 염기이다. 특정 실시태양에서, shRNA 구조체는 400-800개 염기 길이이다. shRNA 구조체는 루프 서열 및 루프 크기의 변화에 매우 관대하다.
본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "리보자임"은 표적 mRNA의 위치-특이적 절단이 가능한 촉매적으로 활성인 RNA 분자를 의미한다. 해머헤드 및 헤어핀 리보자임과 같은 몇몇 아형이 기술되었다. 리보자임 촉매 활성 및 안정성은 비 촉매 염기에서 리보뉴클레오티드를 데옥시리보뉴클레오티드로 대체함으로써 개선될 수 있다. 위치-특이적 인식 서열에서 mRNA를 절단하는 리보자임이 특정 mRNA를 파괴하는데 사용될 수 있지만, 해머헤드 리보자임의 사용이 바람직하다. 해머헤드 리보자임은 표적 mRNA와 상보적인 염기쌍을 형성하는 플랭킹 부위에 의해 지시된 위치에서 mRNA를 절단한다. 유일한 필요조건은 표적 mRNA가 2개 염기의 다음 서열을 갖는 것이다: 5'-UG-3'. 해머헤드 리보자임의 제조 및 생산은 당업계에 잘 알려져 있다.
암호화 서열 자체의 길이와 무관하게, 본 발명에서 고려된 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 다른 곳에서 개시되거나 당업계에 공지된 발현 제어 서열과 같은 다른 DNA 서열, 조절 요소, 프로모터 및/또는 인핸서, 비번역 영역(UTR), 코작(Kozak) 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가 제한효소 위치, 다중 암화화 위치, 내부 리보솜 출입 위치(IRES), 재조합 효소 인식 위치(예를 들어, LoxP, FRT 및 Att 위치), 유도 RNA 표적 위치, 종결 코돈, 전사 종결 신호 및 자가-절단 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 에피토프 태그와 결합할 수 있어서, 이들의 전체 길이는 상당히 변할 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이 사용될 수 있으며, 전체 길이는 바람직하게는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조 및 사용의 용이성에 의해 제한되는 것으로 고려된다.
폴리뉴클레오타이드는 당해 분야에 공지되고 이용 가능한 다양한 잘 확립된 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조, 조작 및/또는 발현될 수 있다. 원하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 바이러스 벡터와 같은 적절한 벡터 속에 삽입될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다.
발현 벡터에 존재하는 "발현 제어 서열", "제어 요소" 또는 "조절 서열"은 벡터의 복제되지 않은 부위-복제 기원, 선택 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(Shine Dalgarno 서열 또는 Kozak 서열) 인트론, 폴리아데닐화 서열, 숙주 세포 단백질과 상호 작용하여 전사 및 번역을 수행하는 5' 및 3' 비 번역 영역이다. 이러한 요소는 강도와 특이성이 다를 수 있다. 사용된 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 유비쿼터스 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함하는 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는 벡터이며, 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 외인성, 내인성 또는 이종성 제어 서열을 포함한다. "내인성" 제어 서열은 게놈에서 주어진 유전자와 자연적으로 연결된 서열이다. "외인성" 제어 서열은 유전자 조작(즉, 분자 생물학적 기술)에 의해 유전자와 병렬 배치되어, 그 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 하는 서열이다. "이종성" 제어 서열은 유전적으로 조작되는 세포와 다른 종으로부터 유래된 외인성 서열이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이 용어 "프로모터"는 RNA 중합 효소가 결합하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)의 인식 위치를 의미한다. RNA 중합 효소는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 개시하고 전사한다. 특정 실시태양에서, 포유 동물 세포에서 작동하는 프로모터는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25 내지 30개 염기 상류에 위치된 AT-풍부 영역 및/또는 전사 개시로부터 70 내지 80 염기 상류에서 발견된 서열, N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 영역을 포함한다. 특정 실시태양에서, 벡터는 하나 이상의 RNA polII 및/또는 RNA polIII 프로모터를 포함한다.
특정 실시태양에서의 사용에 적합한 RNA pol II 프로모터의 예시적인 예는 뉴런 특이적 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
용어 "인핸서"는 강화된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하고 일부 경우에는 다른 제어 서열에 비하여 이들의 배향과는 독립적으로 기능할 수 있는 서열을 함유하는 DNA 단편을 의미한다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 함께 또는 부가적으로 기능할 수 있다. 용어 "프로모터/인핸서"는 프로모터 및 인핸서 기능을 둘 다 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA 단편을 의미한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 기술된 성분이 의도된 방식으로 기능할 수 있는 관계에 있는 병치를 의미한다. 한 실시태양에서, 용어는 핵산 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서) 또는 조절 요소와 제 2 폴리 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 관심 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적 연결을 의미하며, 발현 제어 서열 또는 조절 요소는 제 2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "구조성 발현 제어 서열"은 작동 가능하게 연결된 서열의 전사를 연속적으로 또는 연속적으로 허용하는 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서를 의미한다. 구조성 발현 제어 서열은 매우 다양한 세포 및 조직 유형에서 발현을 허용하는 "유비쿼터스" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서 또는 각각 제한된 다양한 세포 및 조직 유형에서 발현을 허용하는 "세포 특이적", "세포 유형 특이적", "세포 계통 특이적" 또는 "조직 특이적" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서일 수 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서의 사용에 적합한 예시적인 유비쿼터스 발현 제어 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV) 직접 초기 프로모터, 바이러스 시미안 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 조기 또는 후기), 모로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나아제)프로모터, 우두 바이러스로부터의 H5, P7.5, 및 P11 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세롤알데하이드 3-인산 탈수소 효소(GAPDH), 진핵 세포 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열 충격 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 충격 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 유전자좌((Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 인핸서/치킨 β-액틴(CAG) 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 기술된 조성물 및 방법은 세포 또는 조직에서 스위치 수용체의 선택적인 발현을 위해 사용될 수 있다. 용어 "선택적 발현" 및 "표적 특이적 발현"은 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있고 특이적 세포 또는 조직 유형에서 단백질 또는 핵산의 발현을 의미할 수 있다. 선택적 표현은 하나 이상의 프로모터의 사용을 포함할 수 있다. 스위치 수용체를 암호화하는 핵산 분자는 특정 세포 또는 조직 유형에 대한 스위치 수용체의 발현을 지시하는 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, 원하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 세포 유형 특이적, 계통 특이적 또는 조직 특이적 발현을 달성하기 위해 조직 특이적인 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시태양에 따라, 세포 유형 특이적 프로모터는 뇌에서 발견되는 세포 유형(예를 들어, 뉴런, 신경 교세포)에 특이적이다. 조직 특이적인 프로모터의 예시적인 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 신경 교세포 섬유성 산성 단백질(GFAP) 프로모터(성상교세포 발현), 시냅신 프로모터(뉴런 발현) 및 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II(뉴런 발현), 튜불린 알파 I(뉴런 발현), 뉴런-특이적 에놀라제(뉴런 발현), 혈소판-유래 성장 인자 베타 사슬(뉴런 발현), TRPV1 프로모터(뉴런 발현), Nav1.7 프로모터(뉴런 발현), Nav1.8 프로모터(뉴런 발현), Nav1.9 프로모터(뉴런 발현) 또는 아드빌린 프로모터(뉴론 발현).
일부 경우에, 스위치 수용체는 하나 이상의 뉴런 또는 뉴런의 그룹에서 선택적으로 발현된다. 하나 이상의 뉴런에서 선택적인 발현은 하나 이상의 뉴런-특이적 프로모터의 사용을 포함할 수 있다. 뉴런-특이적 프로모터의 비-제한적 예는 인간 시냅신-1(SYN-1) 프로모터, 칼슘-칼모듈린 의존성 단백질 키나아제 IIA(CaMKIIA) 프로모터, 튜불린 알파 1 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, 혈소판-유래 성장 인자 베타 사슬 프로모터(PDGFB), TRPV1 프로모터, Nav1.7 프로모터, Nav1.8 프로모터, Nav1.9 프로모터, 아드빌린 프로모터, 드로소필라 싱글-마인디드 유사체 1(SIM1) 프로모터, 옥시토신(OXT) 프로모터, 아고우티-관련 펩타이드(AgRP) 프로모터, 단백질 키나아제 C-델타(PKC-델타) 프로모터 또는 그렐린 프로모터를 포함한다. 일부 경우에, 스위치 수용체는 감각 뉴런에서 선택적으로 발현된다. 일부 경우에, 스위치 수용체는 후근 신경절, 삼차 신경절, A-베타 섬유, A-델타 섬유, C-섬유, TRPV1 + 뉴런, Nav1.7 + 뉴런, Nav1.8 + 뉴런, 또는 Nav1.9 + 뉴런에서 선택적으로 발현된다. 다른 예시적인 예는 미주 신경, 프로오피멜라노 코르틴(POMC) 뉴런, 시상 하부의 방실핵(PVH), 시상 하부의 아치형 핵, 편도 중심 핵의 측면 세분, C6 성상 신경절, 하부 식도 괄약근 미주 신경, 신경 장총, 시상밑핵(STN) 등을 제한 없이 포함한다. 스위치 수용체는 하나 이상의 신경 세포, 흥분성 뉴런 또는 억제성 뉴런에서 발현될 수 있다. 일부 예에서, 스위치 수용체, 특히 LGIC-유래 스위치 수용체는 하나 이상의 흥분성 세포 또는 흥분성 세포 그룹에서 발현될 수 있다. 흥분성 세포는 세포막을 가로 지르는 이온 유입의 결과로서 막 전위의 변동을 겪는 임의의 세포이다. 흥분성 세포는 신경 세포, 근육 세포 등을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 스위치 수용체는 구조적으로 발현된다(즉, 연속적으로 발현된다; 비특이적 발현). 이러한 예에서, 스위치 수용체의 발현은 특이적 세포 또는 조직 유형에 대한 벡터의 선택적 전달 또는 직접적 벡터의 투여에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 구조적 프로모터의 조절하에 스위치 수용체를 암호화하는 벡터는 후근 신경절 또는 삼차 뉴런에 직접 전달될 수 있다. 일부 경우에, 스위치 수용체의 광범위한 발현은, 예를 들어, 구조적 프로모터의 조절하에 스위치 수용체를 암호화하는 벡터의 전신 투여에 의해 달성될 수 있다. 적절한 구조적 프로모터의 비 제한적인 예는 사이토 메갈로 바이러스(CMV) 초기 초기 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, 모로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나아제 프로모터, 우두 바이러스로부터의 H5, 우두 바이러스로부터의 P7.5, 우두 바이러스로부터의 P11 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1) 프로모터, 페리틴 H(FerH) 프로모터, 페리틴 L(FerL) 프로모터, 글리세롤알데하이드 3-인산 탈수소 효소(GAPDH), 진핵 세포 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1) 프로모터, 열충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열 충격 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1) 프로모터, 열 충격 단백질 70kDa(HSP70) 프로모터, β-키네신(β-KIN) 프로모터, 인간 ROSA 26 프로모터, 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/치킨 β-액틴(CAG) 프로모터 및 β-액틴 프로모터를 포함한다.
일부 경우에, 스위치 수용체의 발현은 유도성일 수 있다(즉, 유도제의 존재에 의해 제어될 수 있다). 사용하기 적합한 유도성 프로모터의 비 제한적인 예는 테트라사이클린 반응 프로모터, 엑디손 반응 프로모터, 쿠메이트 반응 프로모터, 글루코코르티코이드 반응 프로모터, 에스트로겐 반응 프로모터 또는 RU-486 반응 프로모터를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "조건부 발현"은 유도성 발현; 억제성 발현; 특정 생리학적, 생물학적 또는 질환 상태를 갖는 세포 또는 조직에서의 발현 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 조건적 발현을 의미할 수 있다. 이 정의는 세포 유형 또는 조직 특이적 발현을 배제하려는 것은 아니다. 본 발명의 특정 실시태양은 관심 폴리뉴클레오타이드의 조건적 발현을 제공하는데, 예를 들어, 발현은 폴리뉴클레오타이드를 발현시키거나 관심 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화딘 폴리뉴클레오타이드의 발현을 증가 또는 감소시키는 치료 또는 조건을 세포 또는 조직, 유기체 등에 적용함으로써 제어될 수 있다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적인 예는 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체(상응하는 호르몬에 의한 치료로 유도 가능)를 암호화하는 유전자에 대한 프로모터와 같은 스테로이드-유도성 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속에 의한 치료로 유도 가능), MX-1 프로모터(인터페론으로 유도 가능), "GeneSwitch" 미페프리스톤-조절 가능한 시스템(Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), 쿠메이트 유도 성 유전자 스위치(WO 2002/088346), 테트라사이클린-의존성 제어 시스템 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서의 사용에 적합한 프로모터의 예시적인 예는 뉴런 특이적 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드는 뉴런 특이적 프로모터 또는 신경 세포에서 작동하는 프로모터를 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드는 삼차 신경절(TGG) 뉴런 또는 후근 신경절(DRG) 뉴런에서 작동 가능한 뉴런 특이적 프로모터를 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드는 칼슘/칼 모듈린-의존성 단백질 키나아제 II 프로모터, 튜불린 알파 I 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제 프로모터, 혈소판 유래 성장 인자 β 사슬 프로모터, hSYN1 프로모터, TRPV1 프로모터, Nav1.7 프로모터, Nav1.8 프로모터, Nav1.9 프로모터 및 Advillin 프로모터를 포함한다.
한 실시태양에서, 스위치 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 뉴런 특이적 프로모터는 인간 시냅신(SYN1) 프로모터이다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드는 위치 특이적 재조합 효소에 의해 매개되는 재조합을 위한 적어도 하나의 (전형적으로 2개의) 위치(들)를 포함한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이 용어 "재조합 효소" 또는 "위치 특이적 재조합 효소"는 하나 이상의 재조합 위치(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상)를 포함하는 재조합 반응에 관련된 절제 또는 통합 단백질, 효소, 보조 인자 또는 관련 단백질을 포함하며, 이는 야생형 단백질(Landy, Current Opinion in Biotechnology 3 : 699-707 (1993) 참조), 이의 돌연변이체, 유도체(예를 들어, 재조합 단백질 재조합 단백질 서열 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질), 단편 및 변이체일 수 있다. 본 발명의 특정 실시 양태에서 사용하기에 적합한 재조합 효소의 예시적인 예는 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 resolvase, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1, 및 ParA를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
폴리뉴클레오타이드는 임의의 다양한 위치 특이적 재조합 효소에 대한 하나 이상의 재조합 위치를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "재조합 서열", "재조합 위치"또는 "위치 특이적 재조합 위치"는 재조합 효소가 인식하고 결합하는 특정 핵산 서열을 의미한다.
예를 들어, Cre 재조합 효소에 대한 하나의 재조합 위치는 8개 염기쌍 코어 서열의 측면에 인접한 2개의 13개 염기쌍 역반복체(재조합 효소 결합 위치로서 작용)를 포함하는 34개 염기쌍 서열인 loxP이다(Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)의 도 1 참조). 다른 예시적인 loxP 위치는 lox511 (Hoess et al., 1996; Bethke and Sauer, 1997), lox5171 (Lee and Saito, 1998), lox2272 (Lee and Saito, 1998), m2 (Langer et al., 2002), lox71 (Albert et al., 1995), 및 lox66 (Albert et al., 1995)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
FLP 재조합 효소에 대한 적합한 인식 위치는 FRT (McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3 (Schlake and Bode, 1994), F4, F5 (Schlake and Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff et al., 1988), FRT(RE) (Senecoff et al., 1988)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
인식 서열의 다른 예는 재조합 효소 λ 인테그레아제, 예를 들어, φ-c31에 의해 인식되는 attB, attP, attL 및 attR 서열이다. φC31 SSR은 attB (34bp 길이)와 attP (39bp 길이) 사이의 재조합만을 매개한다(Groth et al., 2000). 각각 박테리아 및 파지 게놈 상의 파지 인테그라아제에 대한 부착 위치로 명명된 attB 및 attP는 모두 φC31 동종이량체에 의해 결합될 수 있는 불완전한 역반복체를 포함한다(Groth et al., 2000). 생성물 위치, attL 및 attR은 φC31-매개 재조합에 효과적으로 불활성이어서(Belteki et al., 2003), 반응을 비가역적으로 만든다. 삽입을 촉매 작용하기 위해, attB 함유 DNA는 게놈 attB 위치 속 attP 위치보다 더욱 쉽게 게놈 attP 위치에 삽입되는 것이 발견되었다(Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). 따라서, 전형적인 전략은 상 동성 재조합에 의해 attP 보유 "도킹 부위"를 정의 된 궤적으로 위치시키고, 삽입을 위해 attB 함유 도입 서열과 파트너가된다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시태양에서, 복수의 폴리펩타이드 각각의 효율적인 번역을 달성하기 위해, 폴리뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 IRES 서열 또는 자가 절단 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리될 수 있다.
본 발명에 사용된 "내부 리보솜 출입 위치" 또는 "IRES"는 시스트론(단백질 암호화 영역)의 ATG와 같은 개시 코돈으로의 직접적인 내부 리보솜 출입을 촉진하여, 유전자의 캡-독립적(cap-independent) 번역을 유도하는 요소를 의미한다. 예를 들어, Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) 및 Jackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000 참조. 당업자에 의해 일반적으로 사용되는 IRES의 예는 미국 특허 제6,692,736호에 기술된 것들을 포함한다. 당업계에 공지 된 "IRES"의 추가 예는 피코르나바이러스(Jackson et al, 1990)로부터 얻을 수 있는 IRES 및 바이러스 또는 세포 mRNA 공급원, 예를 들어, 면역 글로불린 중쇄 결합 단백질(BiP), 혈관 내피 성장 인자(VEGF)(Huez et al. 1998. Mol. Cell. Biol. 18(11):6178-6190), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF-2) 및 인슐린 유사 성장 인자(IGFII), 번역 개시 인자 eIF4G 및 효모 전사 인자 TFIID 및 노바겐으로부터 구입할 수 있는 뇌 세포막 염증 바이러스(EMCV), HAP4(Duke et al., 1992. J. Virol 66(3):1602-9) 및 VEGF IRES(Huez et al., 1998. Mol Cell Biol 18(11):6178-90)로부터 얻을 수 있는 IRES를 포함하나 이에 제한되지 않는다. IRES는 또한 피코나비리대(Picornaviridae), 디시스트로비리대(Dicistroviridae) 및 플라비비리대(Flaviviridae) 종 및 HCV, 프리엔드 뮤린 백혈병 바이러스(FrMLV) 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV)의 바이러스 게놈에서 보고되었다.
한 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드에 사용된 IRES는 EMCV IRES이다.
특정 실시태양에서, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 컨센서스 코작(Kozak) 서열을 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "코작 서열"은 mRNA가 리보솜의 작은 서브유닛에 초기 결합하는 것을 매우 촉진하고 번역을 증가시키는 짧은 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 컨센서스 코작 서열은 R이 퓨린(A 또는 G)인(GCC)RCCATGG(SEQ ID NO: 2)이다(Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92, and Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48).
특정 실시태양에서, 폴리뉴클레오타이드는 발현될 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 폴리아데닐화 서열 3'을 포함한다. 폴리아데닐화 서열은 암호화 서열의 3' 말단에 폴리A 꼬리를 첨가함으로써 mRNA 안정성을 촉진시킬 수 있으며, 따라서 증가된 번역 효율에 기여한다. 절단 및 폴리아데닐화는 RNA에서 폴리(A)서열에 의해 지시된다. 포유류 pre-mRNA에 대한 코어 폴리(A) 서열은 절단-폴리아데닐화 위치의 측면에 인접한 2개의 인식 요소를 갖는다. 전형적으로, 거의 변하지 않는 AAUAAA 헥사머는 U 또는 GU 잔기가 풍부한 보다 가변적인 요소의 20-50 뉴클레오타이드 상류에 놓인다. 초기 전사물의 절단은 이 두 요소 사이에서 일어나며 5' 절단 생성물에 최대 250개의 아데노신을 첨가하는 것과 연결된다. 특정 실시태양에서, 코어 폴리(A) 서열은 이상적인 폴리A 서열(예컨대, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA)이다. 특정 실시태양에서, 폴리(A) 서열은 SV40 폴리A 서열, 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA) 또는 당업계에 공지 된 다른 적합한 이종성 또는 내인성 폴리A 서열이다.
G. 폴리펩타이드
본 발명은 GPCR, RASSL, DREADD 및 LGIC 폴리펩타이드 및 이의 서브유닛 및 뮤테인을 포함하나 이에 제한되지 않는 스위치 수용체 폴리펩타이드, 폴리펩타이드, 융합 폴리펩타이드, 및 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 벡터를 포함하는 조성물을 부분적으로 고려한다 .
"폴리펩타이드", "폴리펩타이드 단편", "펩타이드"및 "단백질"은 달리 명시되지 않는 한 및 통상적인 의미에 따라, 즉, 임의의 길이의 아미노산 서열 또는 폴리머로서 상호 교환적으로 사용된다. 한 실시태양에서, "폴리펩타이드"는 융합 폴리펩타이드 및 다른 변이체를 포함한다. 폴리펩타이드는 다양한 잘 알려진 재조합 및/또는 합성 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조될 수 있다. 폴리펩타이드는 특정 길이로 제한되지 않으며, 예를 들어, 전장 단백질 서열, 전장 단백질의 단편 또는 융합 단백질을 포함할 수 있으며, 폴리펩티드의 번역 후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등뿐만 아니라 당업계에 공지된 천연 발생 및 비 자연 발생하는 다른 변형을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 임의의 단백질, 펩타이드, 단백질 단편 또는 이의 성분일 수 있다. 폴리펩타이드는 본질적으로 자연적으로 발생하는 단백질 또는 자연에서 통상 발견되지 않는 단백질일 수 있다. 폴리펩타이드는 대체로 표준 20개 단백질을 구성하는 아미노산으로 구성될 수 있거나 비표준 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있다. 폴리펩타이드는 인산화, 아세틸화, 아실화, 포르밀화, 알킬화, 메틸화, 지질 첨가(예를 들어, 팔미토일화, 미리스토일화, 프렌일화 등) 및 탄수화물 첨가(예를 들어, N-연결 및 O-연결 글리코실화 등)를 포함하는 임의의 수의 생화학적 작용기를 첨가함으로써 숙주 세포에 의해 전형적으로 변형될 수 있다. 폴리펩타이드는 다이설파이드 브릿지의 형성 또는 단백질 분해성 절단과 같은 숙주 세포의 구조적 변화를 겪을 수 있다.
본 발명에 사용된 "분리된 펩타이드"또는 "분리된 폴리펩타이드" 등은 세포 환경으로부터 또는 세포의 다른 구성요소와의 결합으로부터 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자의 시험관내 분리, 정제, 재조합 생산 또는 합성을 의미하는데, 즉, 생체내 물질과 현저하게 결합되지 않는다.
폴리펩타이드는 생물학적으로 활성인 "폴리펩타이드 단편"을 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "생물학적 활성 단편" 또는 "최소 생물학적 활성 단편"은 천연 발생 폴리펩타이드 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20%, 적어도 10% 또는 적어도 5%를 보유하는 폴리펩타이드 단편을 의미한다. 폴리펩타이드 단편은 천연-발생 또는 재조합적으로-생산된 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산의 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실, 및/또는 내부 결실 또는 치환을 갖는 모노머 또는 멀티머일 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 특정 실시태양에서, 폴리펩타이드 단편은 적어도 5 내지 약 1700개의 아미노산 길이의 아미노산 사슬을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700개 또는 그 이상의 아미노산 길이인 것으로 생각될 것이다.
폴리펩타이드는 "폴리펩티드 변이체"를 포함한다. 폴리펩타이드 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입에서 천연 발생 폴리펩타이드와 상이할 수 있다. 이러한 변이체는 자연 발생적이거나, 예를 들어, 스위치 수용체 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 합성적으로 생성(조작)될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시태양에서, 스위치 수용체 폴리펩타이드의 생물학적 성질 또는 폴리펩타이드 속에 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 유도함으로써 이종성 리간드 및/또는 합성 리간드에 대한 스위치 수용체의 결합 특이성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩타이드 변이체는 본 발명에서 고려되는 스위치 수용체 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서 고려되는 폴리펩타이드는 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 포함하는 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 특정 실시태양에서, 스위치 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산은 스위치 수용체에 독특한 리간드 결합 특성을 부여하도록 변형된다. 이러한 조작 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어있다. 예를 들어, 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 DNA에서의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이 유발 및 뉴클레오타이드 서열 변경을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), U.S. Pat. No. 4,873,192, Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987) 및 본 발명에서 인용된 참조문헌을 참조한다. 관심 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)의 모델에서 찾을 수 있다.
특정 실시태양에서, 변이체는 하나 이상의 보존성 치환을 함유할 것이다. "보존성 치환"은 한 아미노산이 유사한 성질을 갖는 다른 아미노산으로 치환되어 펩타이드 화학 분야의 당업자가 폴리펩타이드의 2차 구조 및 소수성 성질이 실질적으로 변하지 않을 것으로 기대할 수 있을 것이다. 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조에서 이루어질 수 있고 여전히 바람직한 특성을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드를 암호화하는 기능성 분자를 여전히 얻을 수 있다. 본 발명의 균등하거나 개선된 변이체 폴리펩타이드를 생성하기 위해 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경하고자 하는 경우, 당업자는, 예를 들어, 표 3에 따라 암호화 DNA 서열의 하나 이상의 코돈을 변화시킬 수 있다.
아미노산 코돈
아미노산 한 글자 기호 세 글자 기호 코돈
알라닌 A Ala GCA GCC GCG GCU
시스테인 C Cys UGC UGU
아스파르트산 D Asp GAC GAU
글루탐산 E Glu GAA GAG
페닐알라닌 F Phe UUC UUU
글리신 G Gly GGA GGC GGG GGU
히스티딘 H His CAC CAU
아이소류신 I Iso AUA AUC AUU
리신 K Lys AAA AAG
류신 L Leu UUA UUG CUA CUC CUG CUU
메티오닌 M Met AUG
아스파라긴 N Asn AAC AAU
프롤린 P Pro CCA CCC CCG CCU
글루타민 Q Gln CAA CAG
아르기닌 R Arg AGA AGG CGA CGC CGG CGU
세린 S Ser AGC AGU UCA UCC UCG UCU
트레오닌 T Thr ACA ACC ACG ACU
발린 V Val GUA GUC GUG GUU
트립토판 W Trp UGG
티로신 Y Tyr UAC UAU
생물학적 활성을 없애지 않고 어떤 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실 될 수 있는지를 결정하는 지침은 DNASTARTM 소프트웨어와 같은 당업계에 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 발견될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 개시된 단백질 변이체의 아미노산 변화는 보존성 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전되거나 되지 않은 아미노산의 치환이다. 보존성 아미노산 변화는 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 중 하나의 치환을 포함한다. 자연 발생 아미노산은 일반적으로 4개 패밀리로 나뉜다: 산성(아스파르트산, 글루탐산), 염기성(리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 (알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비하전 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 펩타이드 또는 단백질에서, 아미노산의 적절한 보존성 치환은 당업자에게 공지되어 있고, 일반적으로 생성된 분자의 생물학적 활성을 변화시키지 않고 이루어질 수 있다. 당업자는 일반적으로 폴리펩타이드의 비 필수적 영역에서의 단일 아미노산 치환은 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않는다는 것을 인식한다(예를 들어, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224) 참조).
이러한 변화를 일으키는데 있어서, 아미노산의 소수성 지수가 고려될 수 있다. 단백질에 대한 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는데 있어 소수성 아미노산 지수의 중요성은 당해 기술분야에서 일반적으로 이해된다(본 발명에 참조로 포함된 Kyte 뭉 Doolittle, 1982). 각 아미노산은 소수성 및 전하 특성에 기초하여 소수성 지수를 부여받았다(Kyte and Doolittle, 1982). 이런 값은 다음과 같다: 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스테인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루탐산(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르트산(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
특정 아미노산이 유사한 소수성 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질, 즉 여전히 생물학적 기능적으로 동등한 단백질을 얻는 것이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 변화를 일으키는데 있어서, 소수성 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 내의 아미노산의 치환이 특히 바람직하고, ±0.5 내의 아미노산의 치환이 더욱 특히 바람직하다. 유사한 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있다는 것도 당업계에서 이해된다.
미국 특허 제4,554,101호에 상세히 기술된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 아미노산 잔기에 부여되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르트산(+3.0±1); 글루탐산(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 다른 것에 대해 치환될 수 있고 생물학적으로 동등한, 특히 면역학적으로 동등한 단백질을 여전히 얻을 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 내의 아미노산의 치환이 특히 바람직하고, ±0.5 내의 아미노산의 치환이 더욱 특히 바람직하다.
약술한 바와 같이, 아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어 이의 소수성, 친수성, 전하 및 크기 등에 기초할 수 있다.
폴리펩티드 변이체는 또한 글리코실화 형태, 다른 분자와의 응집 결합체, 및 비 관련 화학적 모이어티와의 공유 결합체(예를 들어, peg화 분자)를 추가로 포함한다. 공유결합 변이체는 당업계에 공지 된 바와 같이, 아미노산 사슬 또는 N- 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 그룹에 작용기를 연결시킴으로써 제조될 수 있다. 변이체는 또한 대립유전자 변이체, 종 변이체 및 뮤테인을 포함한다. 단백질의 기능적 활성에 영향을 미치지 않는 영역의 절단 또는 결실 또한 변이체이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시태양에서, 융합 폴리펩타이드 및 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 융합 폴리펩타이드 및 융합 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 폴리펩타이드 분절을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다.
융합 폴리펩타이드는 세포 투과성 펩타이드 도메인(CPP), Zn-핑거 DNA 결합 도메인, 뉴클레아제 도메인, 크로마틴 리모델링 도메인, 히스톤 변형 도메인 및 후성 유전 변형 도메인, 에피토프 태그(예를 들어, 말토오스 결합 단백질("MBP"), 글루타티온 S 전이효소(GST), HIS6, MYC, FLAG, V5, VSV-G 및 HA, 폴리펩타이드 링커 및 폴리펩타이드 절단 신호를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 폴리펩타이드 도메인 또는 분절을 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드는 C-말단 대 C-말단, N-말단 대 N-말단 또는 N-말단 대 C-말단 연결될 수 있지만, 전형적으로 C-말단 대 N-말단 연결된다. 융합 단백질의 폴리펩타이드는 임의의 순서로 존재할 수 있다. 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 융합 폴리펩타이드의 바람직한 전사 활성이 보존되는 한 보존적으로 변형된 변이체, 다형성 변이체, 대립 형질, 돌연변이체, 하부서열 및 종간 동종체를 포함할 수 있다. 융합 폴리펩티드는 화학적 합성 방법 또는 두 모이어티 사이의 화학적 결합에 의해 생성될 수 있거나 일반적으로 다른 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 포함하는 결합된 DNA 서열은 본 발명의 다른 곳에서 논의된 바와 같이 적합한 전사 또는 번역 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다.
융합 폴리펩타이드는 하나 이상의 폴리펩타이드를 연결시키는데 사용될 수 있는 링커를 선택적으로 포함할 수 있다. 펩타이드 링커 서열은 폴리펩타이드 도메인이 원하는 기능을 발휘할 수 있도록 각 폴리펩타이드가 적절한 2차 및 3차 구조로 접히는 것을 보장하기에 충분한 거리만큼 임의의 2개 이상의 폴리펩타이드 구성요소를 분리하는데 사용될 수 있다. 이러한 펩타이드 링커 서열은 당업계의 표준 기술을 사용하여 융합 폴리펩타이드 속에 혼입된다. 적합한 펩타이드 링커 서열은다음 요인에 기초하여 선택될 수 있다: (1) 유연한 확장된 형태를 채택할 수 있는 능력; (2) 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 상의 기능적 에피토프와 상호 작용할 수 있는 2차 구조를 채택할 수 없는 불능; (3) 폴리펩타이드 기능적 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 하전된 잔기의 부족. 바람직한 펩타이드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. Thr 및 Ala와 같은 다른 가까운 중성 아미노산은 또한 링커 서열에서 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986;; 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호에 개시된 것을 포함한다. 링커 서열은 특정 융합 폴리펩타이드 분절이 기능적 도메인을 분리하고 입체 장애를 방지하는데 사용될 수 있는 비 필수 N-말단 아미노산 영역을 포함할 때 필요하지 않다. 바람직한 링커는 전형적으로 재조합 융합 단백질의 일부로서 합성되는 가요성 아미노산 서열이다. 링커 폴리펩타이드는 1 내지 200개의 아미노산 길이, 1 내지 100개의 아미노산 길이, 또는 1 내지 50개의 아미노산 길이일 수 있으며, 이 사이의 모든 정수 값을 포함한다.
예시적 링커는 다음 아미노산 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다: DGGGS (SEQ ID NO: 3); TGEKP (SEQ ID NO: 4) (see, e.g., Liu et al., PNAS 5525-5530 (1997)); GGRR (SEQ ID NO: 5) (Pomerantz et al. 1995, supra); (GGGGS)n (SEQ ID NO: 6) (Kim et al., PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: 7) (Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 8) (Bird et al., 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (SEQ ID NO: 9); LRQRDGERP (SEQ ID NO: 10); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: 11); LRQKd(GGGS)2ERP (SEQ ID NO: 12). 대안적으로, 가요성 링커는 DNA 결합 위치 및 펩타이드 자체를 모델링할 수있는 컴퓨터 프로그램을 사용(Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994) 또는 파지 디스플레이 방법에 의해 합리적으로 디자인될 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 본 발명에 기술된 각각의 폴리펩타이드 도메인 사이의 폴리펩타이드 절단 신호를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 위치는 임의의 링커 펩타이드 서열에 삽입될 수 있다. 예시적인 폴리펩티드 절단 신호는 단백질 분해 효소 절단 위치, 뉴클레아제 절단 위치(예를 들어, 희소한 제한 효소 인식 위치, 자가 절단 리보자임 인식 위치) 및 자가 절단 바이러스 올리고펩타이드와 같은 폴리펩티드 절단 인식 위치를 포함한다(deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26) 참조).
적합한 프로테아제 절단 위치 및 자가 절단 펩타이드는 당업자에게 공지되어있다(예를 들어, Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594 참조). 예시적인 프로테아제 절단 위치는 포티바이러스(potyvirus) NIa 프로테아제(예를 들어, 담배 식각 바이러스 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1(P35) 프로테아제, 바이오바이러스 NIa 프로테아제, 바이오바이러스 RNA-2-암호화 프로테아제, 아프토바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 2A 프로테아제, 피코나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV(쌀 툰그로 구형 바이러스) 3C 유사 프로테아제, PYVF(파스닙 황색 반점 바이러스) 3C 유사 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이의 높은 절단 엄격성으로 인해, TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 위치는 한 실시태양에서 바람직하며, 예를 들어, EXXYXQ(G/S)(SEQ ID NO: 13), 예를 들어, ENLYFQG(SEQ ID NO: 14) 및 ENLYFQS(SEQ ID NO: 15), 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타낸다(TEV에 의한 절단은 Q 및 G 또는 Q 및 S 사이에서 일어난다).
특정 실시태양에서, 자가 절단 폴리펩티드 위치는 2A 또는 2A-유사 위치, 서열 또는 도메인을 포함한다(Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041). 특정 실시태양에서, 바이러스 2A 펩타이드는 아프토바이러스 2A 펩타이드, 포티바이러스 2A 펩타이드 또는 카디오 바이러스 2A 펩티드이다. 한 실시태양에서, 바이러스 2A 펩타이드는 구제역 바이러스(FMDV) 2A 펩타이드, 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A 펩티드, 토시아 이시그나 바이러스(TaV) 2A 펩타이드, 돼지 테스코바이러스-1(PTV-1) 2A 펩타이드, 테일로바이러스 2A 펩타이드 및 뇌신경초염 바이러스 2A 펩타이드를 포함한다.
H. 바이러스 벡터
일부 양태에서, 스위치 수용체를 암호화하는 핵산 분자가 대상에게 전달된다. 일부 경우에, 스위치 수용체를 암호화하는 핵산 분자는 벡터에 의해 대상에게 전달된다. 다양한 실시태양에서, 벡터는 본 발명에서 고려되는 하나 이상의 폴리 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 "벡터"는 본 발명에서 다른 핵산 분자를 전달하거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하기 위해 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에, 예를 들어, 삽입되어 연결된다. 벡터는 세포에서 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나 숙주 세포 DNA로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 표적 핵산을 유기체, 세포 또는 세포 구성요소에 전달될 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 발현 벡터이다. 본 발명에 사용된 "발현 벡터"는 발현을 촉진할 수 있는 벡터, 예를 들어 플라스미드 및 그 안에 혼입 된 핵산의 복제를 의미한다. 전형적으로, 발현되는 핵산은 프로모터 및/또는 인핸서에 "작동 가능하게 연결"되고, 프로모터 및/또는 인핸서에 의한 전사 조절 제어를 받는다. 특정 경우에, 벡터는 본 발명의 스위치 수용체를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하도록 사용된다.
특정 실시태양에서, 발현 카세트 또는 스위치 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 신경 세포 내로 주입시키기에 적합한 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예시적인 예는, 예를 들어, 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 및 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 벡터는 원형 핵산, 예를 들어, 플라스미드, BAC, PAC, YAC, 코스미드, 포스미드 등이다. 일부 경우에, 환형 핵산 분자는 스위치 수용체를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 스위치 수용체를 암호화하는 플라스미드 DNA 분자는 대상의 세포 내로 주입될 수 있고, 이로써 스위치 수용체를 암호화하는 DNA 서열은 mRNA 내로 전사되고 mRNA "메시지"는 단백질 생성물로 번역된다. 환형 핵산 벡터는 일반적으로 표적 단백질의 발현을 조절하는 조절 요소를 포함할 것이다. 예를 들어, 원형 핵산 벡터는 임의의 수의 프로모터, 인핸서, 터미네이터, 스플라이스 신호, 복제 기원, 개시 신호 등을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 벡터는 레플리콘을 포함할 수 있다. 레플리콘은 자가 복제할 수 있는 임의의 핵산 분자일 수 있다. 일부 경우에, 레플리콘은 바이러스로부터 유래된 RNA 레플리콘이다. 알파바이러스, 피코르나바이러스, 플라비바이러스, 코로나 바이러스, 페스티바이러스, 루비바이러스, 칼시바이러스 및 헤파시바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 적합한 바이러스(예를 들어, RNA 바이러스)가 이용 가능하다.
한 실시태양에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 경우, 바이러스 벡터는 복제-결핍 바이러스에서 유래된다. 본 발명의 핵산 분자를 대상에게 전달하기에 적합한 바이러스 벡터의 비 제한적인 예는 아데노바이러스, 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스), 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 단순 포진 바이러스-1(HSV-1)로부터 유래된 벡터를 포함한다. 적합한 바이러스 벡터의 예시적인 예는 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터), 포진 바이러스 기반 벡터 및 파보바이러스 기반 벡터(예를 들어, 아데노 관련 바이러스(AAV) 기반 벡터, AAV-아데노바이러스 키메라 벡터, 및 아데노 바이러스-기반 벡터)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "파보바이러스"는 자발적으로 복제하는 파보바이러스 및 의존 바이러스를 포함하는 모든 파보바이러스를 포함한다. 자율 파보 바이러스는 파보 바이러스(Parvovirus), 에리스로바이러스(Erythrovirus), 덴소 바이러스(Densovirus), 아이테라바이러스(Iteravirus) 및 콘트라바이러스(Contravirus)의 구성원을 포함한다. 예시적인 자발적인 파보바이러스는 마우스 미세 바이러스, 소 파보바이러스, 개 파보바이러스, 닭 파보바이러스, 고양이 범 백혈구 감소 바이러스, 고양이 파보바이러스, 거위 파보바이러스 및 B19 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 자율 파보바이러스는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Fields et al., 1996 Virology, volume 2, chapter 69(3d ed., Lippincott-Raven Publishers) 참조.
디펜도바이러스 속은 AAV 1 형, AAV 2 형, AAV 3 형, AAV 형 4, AAV 5 형, AAV 6 형, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV 및 양 AAV을 포함하나 이에 제한되지 않는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 함유한다.
한 바람직한 실시태양에서, 벡터는 AAV 벡터이다. 특정 경우에, 바이러스 벡터는 AAV-6 또는 AAV9 벡터이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함한다.
모든 공지된 AAV 혈청형의 게놈 조직은 유사하다. AAV의 게놈은 길이가 약 5,000 뉴클레오타이드(nt) 미만인 선형의 단일 가닥 DNA 분자이다. 역전된 말단 반복체(ITRs)는 비 구조적 복제(Rep) 단백질 및 구조적(VP) 단백질의 독특한 암호화 뉴클레오타이드 서열의 측면에 인접한다. VP 단백질(VP1, -2 및 -3)은 캡시드를 형성하고 바이러스의 방향성에 기여한다. 말단의 145nt ITR은 자기-보완적이며, T-형 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자 내 이합체가 형성될 수 있도록 구성된다. 이러한 헤어핀 구조는 바이러스 DNA 복제에 대한 기점으로 기능하여, 세포 DNA 중합효소 복합체의 프라이머로서 역할을 한다. 포유류 세포에서 야생형(wt) AAV 감염 후, Rep 유전자는 바이러스 게놈의 복제에서 발현되고 기능한다.
일부 경우에, 바이러스 벡터의 외부 단백질 "캡시드", 예를 들어, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10은 자연계에서 발생한다. 특정 경우에, 캡시드는 변형된 방향성, 증가된 형질도입 효율 또는 면역 회피와 같은 본질적으로 존재하지 않는 특정의 특성을 보유하도록 (예를 들어, 직접 진화 또는 합리적인 디자인을 통해) 합성적으로 조작된다. 합리적으로 디자인된 캡시드의 예는 VP3 바이러스 캡시드 단백질 상의 하나 이상의 표면 노출된 티로신(Y), 세린(S), 트레오닌(T) 및 라이신(K) 잔기의 돌연변이이다. VP3 캡시드 단백질이 합성적으로 조작되고 본 발명에 제공된 조성물 및 방법과 함께 사용하기 쉬운 바이러스 벡터의 비 제한적인 예는 AAV1(Y705+731F+T492V), AAV2(Y444+500+730F+T491V), AAV3(Y705+731F), AAV5(Y436+693+719F), AAV6(Y705+731F+T492V), AAV8(Y733F), AAV9(Y731F), 및 AAV10(Y733F)을 포함한다. 직접 진화를 통해 조작되었으며 본 발명에서 제공된 조성물 및 방법과 함께 사용하기 쉬운 바이러스 벡터의 비 제한적인 예는 AAV-7m8 및 AAV-ShH10을 포함한다.
본 발명에서 "재조합 파보바이러스 또는 AAV 벡터"(또는 "rAAV 벡터")는 하나 이상의 AAV ITR이 측면에 인접하는 본 발명에서 고려되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 의미한다. 이러한 rAAV 벡터는 AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 곤충 숙주 세포에 존재할 때 감염성 바이러스 입자 내로 복제되고 포장될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 핵산 구조체(예를 들어, 염색체 또는 복제 또는 형질감염에 사용되는 플라스미드 또는 바큘로바이러스와 같은 다른 벡터)에 혼입되면, rAAV 벡터는 전형적으로 "프로-벡터" 이는 AAV 패키징 기능과 필요한 헬퍼 기능의 존재하에서 복제 및 캡슐화에 의해 "지켜질 수 있는" "프로-벡터(pro-vector)"로 불린다.
특정 실시태양에서, 임의의 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16로부터의 ITR을 포함하는 AAV 벡터에서 사용될 수 있다. 한 바람직한 실시 양태에서, 본 발명에서 고려되는 AAV 벡터는 하나 이상의 AAV2 ITR을 포함한다.
2개의 ITR을 포함하는 rAAV 벡터는 약 4.4 kB의 페이로드 용량을 갖는다. 자기-보완적인 rAAV 벡터는 제 3의 ITR을 함유하고 본 발명에서 고려된 폴리뉴클레오타이드에 대해 단지 약 2.1 kB를 남기고 벡터의 재조합 부분의 2개 가닥을 포장한다. 한 실시태양에서, AAV 벡터는 scAAV 벡터이다.
rAAV(약 9kB)의 패키징 용량의 대략 두 배인 확장된 패키징 용량은 이중 rAAV 벡터 전략을 사용하여 달성되었다. 본 발명에서 고려되는 rAAV를 생산하는데 유용한 이중 벡터 전략은 스플라이싱(트랜스-스플라이싱), 상동성 재조합(오버랩핑) 또는 둘의 조합(하이브리드)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이중 AAV 트랜스-스플라이싱 전략에서, 스플라이스 도너(SD)는 5'-절반 벡터의 3' 말단에 위치되고 스플라이스 억셉터(SA) 신호는 3'-절반 벡터의 5' 말단에 위치된다. 이중 AAV 벡터에 의한 동일한 세포의 동시 감염 및 두 반쪽의 역전된 말단 반복체(ITR)-매개 헤드-투-테일 체내 이식시, 트랜스-스플라이싱은 성숙한 mRNA 및 풀-사이즈 단백질의 생산을 초래한다(Yan et al., 2000). 트랜스-스플라이싱은 근육과 망막에서 큰 유전자를 발현하는데 성공적으로 사용되어왔다(Reich et al., 2003; Lai et al., 2005). 대안적으로, 이중 AAV 벡터에 함유된 큰 형질전환 유전자 발현 카세트의 2개 절반은 상동성 중첩 서열(5'-절반 벡터의 3' 말단 및 3'-절반 벡터의 5' 말단, 이중 AAV 중첩)을 함유할 수 있으며, 이는 상동성 재조합에 의한 단일 큰 게놈의 재구성을 매개할 것이다(Duan et al., 2001). 이 전략은 형질전환 유전자 중첩 서열의 재조합 성질에 의존한다(Ghosh et al., 2006). 세 번째 이중 AAV 전략 (하이브리드)은 트랜스-스플라이싱 벡터에 대한 외인성 유전자(즉, 알칼라인 포스파타제; Ghosh et al., 2008, Ghosh et al., 2011)로부터의 고도로 재조합성 영역을 첨가하는 것에 기초한다. 추가된 영역은 이중 AAV 사이의 재조합을 증가시키기 위해 5'-절반 벡터에서 SD 신호의 하류 및 3'-절반 벡터에 SA 신호의 상류에 위치한다.
"하이브리드 AAV" 또는 "하이브리드 rAAV"는 상이한 AAV 혈청형(및 바람직하게는, 하나 이상의 AAV ITR과 상이한 혈청형)의 캡시드와 함께 포장된 rAAV 게놈을 의미하며, 슈도타입화(pseudotyped) rAAV로 달리 불릴 수 있다. 예를 들어, AAV 캡시드 및 게놈(및 바람직하게는 하나 이상의 AAV ITR)이 상이한 혈청형이면, rAAV 유형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 게놈은 AAV 유형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 캡시드 또는 이의 변이체 내에 캡슐화될 수 있다. 특정 실시태양에서, 슈도타입화 rAAV 입자는 유형 "x/y"로 불릴 수 있는데, 여기서 "x"는 ITR의 공급원을 나타내고 "y"는 캡시드의 혈청형을 표시하는데, 예를 들어 2/5 rAAV 입자는 AAV2로부터의 ITR과 AAV6로부터의 캡시드를 가진다.
하나의 예시적인 실시태양에서, AAV 벡터는 하나 이상의 AAV ITR 및 AAV1, AAV1(Y705+731F+T492V), AAV2(Y444+500+730F+T491V), AAV3(Y705+731F), AAV5, AAV5(Y436+693+719F), AAV6, AAV6(VP3 변이체 Y705F/Y731F/T492V), AAV-7m8, AAV8, AAV8(Y733F), AAV9, AAV9(VP3 변이체 Y731F), AAV10(Y733F), 및 AAV-ShH10로 이루어진 그룹으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함한다.
하나의 예시적인 실시태양에서, AAV 벡터는 하나 이상의 AAV2 ITR 및 AAV1, AAV1(Y705+731F+T492V), AAV2(Y444+500+730F+T491V), AAV3(Y705+731F), AAV5, AAV5(Y436+693+719F), AAV6, AAV6(VP3 변이체 Y705F/Y731F/T492V), AAV-7m8, AAV8, AAV8(Y733F), AAV9, AAV9(VP3 변이체 Y731F), AAV10(Y733F), 및 AAV-ShH10로 이루어진 그룹으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함한다.
하나의 예시적인 실시태양에서, AAV 벡터는 하나 이상의 AAV2 ITR 및 AAV1, AAV5, AAV6, AAV6(VP3 변이체 Y705F/Y731F/T492V), AAV8, AAV9, 및 AAV9 (VP3 변이체 Y731F)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함한다.
다른 예시적인 실시태양에서, AAV 벡터는 하나 이상의 AAV2 ITR 및 AAV6, AAV6(VP3 변이체 Y705F/Y731F/T492V), AAV9, 및 AAV9(VP3 변이체 Y731F)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함한다.
한 예시적인 실시태양에서, AAV 벡터는 하나 이상의 AAV2 ITR 및 AAV9, 및 AAV9(VP3 변이체 Y731F)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함한다.
한 예시적인 실시태양에서, AAV 벡터는 하나 이상의 AAV2 ITR 및 AAV6 및 AAV6(VP3 변이체 Y705F/Y731F/T492V)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함한다.
한 예시적인 실시태양에서, AAV 벡터는 하나 이상의 AAV2 ITR 및 AAV6 혈청형으로부터의 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함한다.
한 예시적인 실시태양에서, AAV 벡터는 하나 이상의 AAV2 ITR 및 AAV6(VP3 변이체 Y705F/Y731F/T492V) 혈청형으로부터의 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함한다.
"숙주 세포"는 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드로 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 형질감염, 감염 또는 형질도입된 세포를 포함한다. 숙주 세포는 바이러스 생성 세포 및 바이러스 벡터에 감염된 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 생체내 숙주 세포는 본 발명에서 고려되는 바이러스 벡터로 감염된다. 특정 실시태양에서, 용어 "표적 세포"는 숙주 세포와 상화 교환적으로 사용되며 원하는 세포 유형의 감염된 세포를 의미한다.
고 역가 AAV 제제는, 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,658,776; 6,566,118; 6,989,264; and 6,995,006; U.S. 2006/0188484; WO98/22607; WO2005/072364; and WO/1999/011764; and Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003; Samulski et al.,(1989) J. Virology 63, 3822; Xiao et al., (1998) J. Virology 72, 2224 ; lnoue et al.,(1998) J. Virol. 72, 7024에 기술된 당업계에 공지된 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 생체내 투여시 면역원성을 감소시키기 위한 슈도타입화 AAV 벡터를 생산하는 방법(예를 들어, WO00/28004) 뿐만 아니라 AAV 벡터의 다양한 변형 또는 제제(예를 들어, WO01/23001; WO00/73316; WO04/1 12727; WO05/005610; WO99/06562 참조)가 또한 보고되었다.
I. 구성요소 및 제형
본 발명은 또한 본 발명에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 다양한 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 이러한 약학적 조성물은 신경 질환 또는 장애(예를 들어, 통증)를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 약학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지를 포함하는 생리적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 용도는 당업계에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 배지 또는 제제가 본 발명에서 고려되는 벡터와 양립 불가능한 경우를 제외하고는, 본 발명의 약학적 조성물에서 이의 용도가 또한 고려된다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 요법과 조합하여, 세포 또는 동물에게 투여하기 위한 약학적으로 허용 가능한 또는 생리학적으로 허용 가능한 용액으로 제제화된, 본 발명에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 이 둘, 감염된 세포 등을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 원한다면, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 항염증성 사이토카인과 같은 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 소분자 또는 다양한 약학적 활성제과 같은 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있음이 또한 이해될 것이다. 추가적인 제제가 의도된 유전자 요법을 전달하기 위한 조성물의 능력에 악영향을 미치지 않는다면, 조성물에 포함될 수 있는 다른 구성요소에 실질적으로 제한이 없다.
일부 경우에, 스위치 수용체를 암호화하는 핵산은 비 바이러스 또는 벡터 수단에 의해 대상에게 전달된다. 당업자에게 공지된 임의의 방법이 본 발명의 핵산 분자를 대상에게 전달하는데 사용될 수 있다. 이런 방법은 리포펙션, 나노 입자 전달, 입자 폭격, 전기 천공, 초음파 및 미세주사를 제한 없이 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은, 예를 들어, 본 발명의 스위치 수용체를 활성화시키기 위한 리간드를 포함한다. 일부 양태에서, 고체 제제는 스위치 수용체(예를 들어, GPCR 또는 LGIC)를 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, 벡터)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상에게 경구 투여에 특히 유용한 고체 제제이다. 일부 경우에, 벡터 또는 리간드는, 예를 들어, 약 0.1㎍, 0.2㎍, 0.3㎍, 0.4㎍, 0.5㎍, 0.6㎍, 0.7㎍, 0.8㎍, 0.9㎍, 1㎍, 약 2㎍, 약 3㎍, 약 4㎍, 약 5㎍, 약 6㎍, 약 7㎍, 약 8㎍, 약 9㎍, 약 10㎍, 약 20㎍, 약 30㎍, 약 40㎍, 약 50㎍, 약 60㎍, 약 70㎍, 약 80㎍, 약 90㎍, 약 100㎍, 약 120㎍, 약 140㎍, 약 160㎍, 약 180㎍, 약 200㎍, 약 220㎍, 약 240㎍, 약 260㎍, 약 280㎍, 약 300㎍, 약 320㎍, 약 340㎍, 약 360㎍, 약 380㎍, 약 400㎍, 약 420㎍, 약 440㎍, 약 460㎍, 약 480㎍, 약 500㎍, 약 520㎍, 약 540㎍, 약 560㎍, 약 580㎍, 약 600㎍, 약 620㎍, 약 640㎍, 약 660㎍, 약 680㎍, 약 700㎍, 약 720㎍, 약 740㎍, 약 760㎍, 약 780㎍, 약 800㎍, 약 820㎍, 약 840㎍, 약 860㎍, 약 880㎍, 약 900㎍, 약 920㎍, 약 940㎍, 약 960㎍, 약 980㎍, 약 1mg, 약 2mg, 약 3mg, 약 4mg, 약 5mg, 약 6mg, 약 7mg, 약 8mg, 약 9mg, 약 10mg, 약 20mg, 약 30mg, 약 40mg, 약 50mg, 약 60mg, 약 70mg, 약 80mg, 약 90mg, 약 100mg, 약 120mg, 약 140mg, 약 160mg, 약 180mg, 약 200mg, 약 220mg, 약 240mg, 약 260mg, 약 280mg, 약 300mg, 약 320mg, 약 340mg, 약 360mg, 약 380mg, 약 400mg, 약 420mg, 약 440mg, 약 460mg, 약 480mg, 약 500mg, 약 520mg, 약 540mg, 약 560mg, 약 580mg, 약 600mg, 약 620mg, 약 640mg, 약 660mg, 약 680mg, 약 700mg, 약 720mg, 약 740mg, 약 760mg, 약 780mg, 약 800mg, 약 820mg, 약 840mg, 약 860mg, 약 880mg, 약 900mg, 약 920mg, 약 940mg, 약 960mg, 약 980mg, 약 1000mg 또는 1000mg 초과의 양으로 조성물에 존재할 수 있다.
본 발명에 기재된 조성물은 액체 제제, 고체 제제 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 제제의 비 제한적인 예는 정제, 캡슐, 겔, 페이스트, 액체 용액, 패치, 롤리팝, 크림 또는 에어로졸(즉, 스프레이)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 치료제 또는 약물은 결정 형태일 수 있다. 고형 제제는 조성물을 필요로 하는 대상에게 조성물의 경구 투여에 적합할 수 있다. 일부의 경우에, 경구 투여용 서방형 제제는 위장관에서 체액과 접촉하여 활성제의 제어된 방출을 달성하고, 혈장에서 활성 성분의 실질적으로 일정하고 효과적인 수준을 제공하기 위해 제조될 수 있다. 결정 형태는 생분해성 폴리머, 수용성 폴리머 또는 이들의 혼합물 및 선택적으로 적합한 계면활성제의 폴리머 기질에 이런 목적을 위해 삽입될 수 있다. 삽입은 이런 맥락에서 폴리머 기질에 미세 입자의 혼입을 의미할 수 있다. 제어 방출 제제는 또한 공지된 분산 또는 에멀젼 코팅 기술을 통해 분산된 미세 입자 또는 에멀젼화된 미세 방울의 캡슐화를 통해 얻어진다.
본 발명의 조성물은 임의의 수의 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 부형제는 임의의 및 모든 용제, 코팅제, 향료, 착색제, 윤활제, 붕해제, 방부제, 감미료, 결합제, 희석제 및 비히클(또는 담체)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 부형제는 본 발명의 치료 조성물과 양립 가능하다.
본 발명에서 고려되는 약학적 조성물에서, 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체 용액의 제제는, 예를 들어, 비경구, 정맥내, 비강내, 근육내, 척수강내, 신경내, 신경절내 및 뇌실내 투여 및 제제를 포함하는 다양한 치료 요법에서 본 발명에 기술된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 마찬가지로 당업자에게 주지되어 있다.
특정 상황에서, 본 발명에 개시된 조성물을 비경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 척수강내, 신경내, 신경절 또는 뇌실내를 전달하는 것이 바람직할 것이다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용 가능한 염인 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면 활성제와 적절히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건하에서 이러한 제제는 미생물의 성장을 막기 위한 방부제를 함유한다.
주사용으로 적합한 제형은 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 일시적인 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(미국 특허 제5,466,468호, 전체가 본 발명에 참조로 포함됨). 모든 경우에, 제형은 멸균되어야하고 용이한 주입 가능성이 존재할 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 만니톨 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산제의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균 및 항진균제에 의해 촉진될 수 있다. 많은 경우에, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아르산 알루미늄 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 초래될 수 있다.
예를 들어, 수용액에서의 투여를 위해, 필요하다면 용액을 적절히 완충시켜야하고, 액체 희석제를 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성으로 만든다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수강내, 신경내, 신경절내 및 뇌실내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명을 고려하여 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투여량은 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해될 수 있고 1,000ml의 피하주사 용액에 첨가하거나 제안된 주입 위치에 주입될 수 있다(예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000 참조). 투여량의 일부 변화는 치료받는 대상의 상태에 따라 필연적으로 발생한다. 투여 담당자는 어떠한 경우에도 개별 대상에 대한 적절한 투여량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여의 경우, FDA 생물 의약품국(FDA Office of Biologics)에서 요구하는 멸균성, 발열성 및 일반 안전성과 순도 표준을 충족해야 한다.
멸균 주사용 용액은 필요한 양의 활성 구성요소를 필요에 따라 상기 다양한 다른 성분과 적절한 용매에서 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기한 것들 중 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 분말과 그 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
본 발명에 개시된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 산 부가염(단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성됨)을 포함한다. 유리 카복실기로 형성된 염은 또한 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제 2 철과 같은 무기 염기 및 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다. 제제화시, 용액은 투여량 제제와 양립 가능한 방식으로 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제제는 주사 가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 제형으로 용이하게 투여된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균 및 항진균제, 등장액 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이런 매질 및 제제의 사용은 당업계에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 치료 조성물에서의 이의의 용도가 고려된다. 보충 활성 성분 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한"이라는 어구는 인간에게 투여될 때 알레르기성 또는 유사한 부작용 반응을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 의미한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당업계에서 잘 이해된다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액; 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로서 주사제로서 제조되며, 또한 주사 전 액체로 제조될 수 있다. 또한 제제는 에멀젼화될 수 있다.
특정 실시태양에서, 조성물은 비내 스프레이, 흡입 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 비강 에어로졸 분무를 통해 폐에 유전자, 폴리뉴클레오타이드 및 펩타이드 조성물을 직접적으로 전달하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,756,353호 및 미국 특허 제5,804,212호(각각 구체적으로 본 발명에 참조로 포함된다)에 기술된다. 마찬가지로 비내 투여용 미립자 수지(Takenaga et al., 1998) 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물(미국 특허 제5,725,871호, 이의 전문이 본 발명에 참조로 포함된다)을 사용하는 약물의 전달은 또한 제약 분야에서 주지되어 있다. 유사하게, 폴리테트라플루오르에틸렌 지지체 기질 형태의 경점막 약물 전달은 미국 특허 제5,780,045호에 기술된다(이의 전문이 본 발명에 참조로 포함된다).
특정 실시태양에서, 전달은 본 발명의 조성물을 적합한 숙주 세포 내로 주입하기 위해 리포솜, 나노 캡슐, 미세 입자, 미세구, 지질 입자, 소포를, 선택적으로 CPP 폴리펩타이드 등과 혼합하여 사용함으로써 발생할 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노구, 또는 나노 입자 등으로 캡슐화되어 전달용으로 제제화될 수 있다. 이런 전달 비히클의 제제 및 사용은 공지되고 통상적 인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 제제 및 조성물은, 본 발명에 기술된 바와 같이, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 요법과 조합하여 세포 또는 동물에 투여하기 위해 약학적으로 허용 가능한 또는 생리학적으로 허용 가능한 용액(예를 들어, 배양 배지)에서 제제화된 임의의 수의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 소분자의 조합으로 구성된 하나 이상의 억제제 및/또는 활성제를 포함할 수 있다. 원한다면, 본 발명의 조성물은 다른 제제, 예를 들어 세포, 다른 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다양한 약학적으로 활성인 제제와 조합하여 투여될 수 있음이 또한 이해될 것이다.
특정 실시태양에서, 본 발명에 따른 제제 또는 조성물은 본 발명에서 고려되는 임의의 수의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 바이러스 벡터의 조합과 접촉된 세포를 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 바이러스 벡터, 예를 들어 rAAV의 전달에 적합한 제제 또는 조성물을 제공한다.
생체외 전달을위한 예시적인 제제는 또한 당업계에 공지된 다양한 형질전환제, 예컨대 인산 칼슘, 전기 천공, 열충격 및 다양한 리포솜 제제(즉, 지질-매개 형질감염)의 사용을 포함할 수 있다. 아래에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 리포솜은 수성 유체의 일부를 포획하는 지질 이중층이다. DNA는 자발적으로 양이온 성 리포솜의 외부 표면에 (이의 전하로 인해) 결합하고 이들 리포솜은 세포막과 상호 작용할 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은, 본 발명에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제(예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지)와 함께 제제화된 치료적 유효량의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 조성물을 제공한다.
본 발명의 특정 실시태양은 약학 분야에 주지되어 있는 것과 같은 다른 제제를 포함할 수 있으며, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000에 기술되어있다.
J. 방법 및 징후
본 발명에 개시된 조성물 및 방법은 신경 질환 또는 신경 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명에 기술된 벡터 또는 조성물은 신경 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용된다.
일부 경우, 본 발명의 방법 및 조성물은 간질을 치료하기 위해 사용된다. 본 발명에 기술된 조성물은 간질 발작을 예방하거나 제어하는데 사용될 수 있다. 간질 발작은 긴장성-간대성, 긴장성, 간대성, 근간대성, 소발작 또는 무긴장성 발작으로 분류될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 조성물 및 방법은 대상에 의해 경험되는 간질 발작 횟수를 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 약 95%, 약 99% 또는 100% 예방 또는 감소시킬 수 있다.
일부 경우에, 본 발명의 방법 및 조성물은 섭식 장애를 치료하기 위해 이용된다. 섭식 장애는 피험자의 신체적 또는 정신적 건강에 부정적인 영향을 주는 비정상적인 섭식 행동으로 정의되는 정신 장애일 수 있다. 어떤 경우에, 섭식 장애는 신경성 식욕부진이다. 다른 경우에, 섭식 장애는 신경성 과식증이다. 일부 경우에, 섭식 장애는 이식증, 반추위 장애, 회피적/제한적 음식 섭취 장애, 폭식 장애(BED), 기타 특정 식이 장애(OSFED), 강박 과식, 당뇨 다식증, 신경성 식욕 부진, 선택적 섭식 장애, 음주 거식증, 임신 거식증 또는 미식가 증후군이다. 일부 경우에, 조성물은 섭식 장애와 관련된 하나 이상의 분자의 생산을 증가시키거나 감소시키는 G-단백질 결합 수용체를 포함한다. 다른 경우에, 조성물은 섭식 장애와 관련된 하나 이상의 분자의 생산을 변경시키는 리간드-게이티트 이온(ligand-gated ion) 채널을 포함한다. 섭식 장애와 관련된 하나 이상의 분자는 바소프레신, 부신피질자극호르몬 방출 호르몬(CRH), 부신피질자극 호르몬(ACTH), 코르티솔, 에피네프린 또는 노르에피네프린; 뿐만 아니라 세로토닌, 도파민, 신경펩타이드 Y, 렙틴 또는 그렐린을 포함하는 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 축의 분자를 제한없이 포함한다.
일부 경우에, 조성물 및 방법은 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 반사 질환(GERD), 중독(예를 들어, 알코올, 약물), 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 수전증, 운동 장애, 심방 세동, 암(예를 들어, 뇌종양), 파킨슨 병 또는 알츠하이머 병의 치료를 위해 사용된다. 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 신경 질환 또는 장애의 다른 비 제한적 예는 의지상실증, 실서증, 알코올 중독, 독서불능증, 동맥류, 일과흑암시, 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 엔젤만 증후군, 실어증, 실행증, 거미막염, 아놀드-키아리 기형, 이스퍼가 증후군, 운동 실조증, 운동 실조증-모세혈관 확장증, 주의력 결핍 과다행동 장애, 청각 장애, 자폐 스펙트럼, 양극성 장애, 구안와사, 상완 신경총 손상, 뇌 손상, 뇌 부상, 뇌 종양, 카나반 질환, 카그라스 증후군, 손목 터널 증후군, 작열통, 중추 통증 증후군, 중추성 수초 용해증, 중핵심 근병증, 뇌 장애, 대뇌 동맥류, 대동맥경화증, 뇌 위축증, 카다실(Cerebral autosomaldominant arteriopathy with subcorticalinfarcts and leukoencephalopathy)(CADASIL), 대뇌 거상증, 뇌성 마비, 뇌 혈관염, 경추 척추 협착증, 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease), 키아리 기형, 무도병, 만성 피로 증후군, 만성염증탈수초다발신경병증(CIDP), 만성 통증, 코핀-로우리 증후군, 혼수상태, 복합 부위 통증 증후군, 압박 신경병증, 선천성 안면 마비, 대뇌피질 기저 퇴행성증후군, 두개 동맥염, 두개골유합증, 크로이츠펠트-야콥병, 누적된 외상 장애, 쿠싱 증후군, 순환기 질환, 거대세포 봉입체 질환(CIBD), 사이토메갈로스바이러스 감염, 댄디-워커 증후군, 도슨병, 드 모르시어 증후군, 데제린-클롬케 마비, 데제린-소타스 질환, 지연 수면기 증후군, 치매, 피부근염, 발달 조정 장애, 당뇨병성 신경병증, 미만성 경화증, 다시증, 다운 증후군, 드라벳 증후군, 듀시엔형 근이영양증, 눌어증, 자율신경실조증, 난산증, 서자장애, 운동이상증, 난독증, 근긴장이상, 빈안장증후군, 뇌염, 뇌류, 뇌삼차신경 혈관종증, 유분증, 야뇨증, 간질, 여성의 간질-지적 장애, 에르브 마비, 피부홍통증, 폭발성 뇌 증후군, 파브리병, 파르 증후군, 기절, 가족성 경련 마비, 열성경련, 피셔 증후군, 프리드라이히 운동 실조증, 섬유 근육통, 포빌레 증후군, 태아 알코올 증후군, 취약 X 증후군, 취약 X 관련 진전/운동 실조 증후군(FXTAS), 가우셔병, 열성발작을 동반한 전신 간질, 게스토만 증후군, 거대 세포 동맥염, 거대 세포 봉입체 질환, 공세포 백색질 장애, 회백질 이소성, 길랑-바레 증후군, 전신 불안 장애, HTLV-1 관련 척수증, 할러포르덴-슈파츠병, 두부 손상, 두통, 반면성 경련, 유전성 경련성 마비, 유전성 다발신경염성 실조증, 이성대상포진, 대상포진, 히라야마 증후군, 히르쉬스프룽병, 홈즈-에이디 증후군, 전전뇌증, 헌팅톤병, 수양성 결핍증, 수두증, 고칼슘증, 저산소증, 면역-매개 뇌척수염, 봉입체 근육염, 색소실소증, 소아 렘프섬병, 소아연축, 염증성 근병증, 뇌내 낭종, 두개강내 고압증, 쌍중심절 15번 염색체 증후군, 주버트 증후군, 카락 증후군, 컨스-세이어 증후군, 킨스번 증후군, 클레네-레빈 증후군, 클리펠 파일 증후군, 크라베 병, 라포라 병, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 란다우-클레프너 증후군, 외측연수(발렌버그) 증후군, 학습 장애, 레이병, 레녹스-가스타우트 증후군, 레슈-니한 증후군, 백혈구 감소증, 백질 퇴행성 백질뇌증, 레위 몸 치매, 잠혈 증, 잠김 증후군, 요추 디스크 질환, 요추 척추 협착증, 라임병-신경계 후유증, 마샤도-조셉 병(척수소뇌성 운동실조증 형태 3), 대두증, 거시증, 멀미 증후군, 대뇌 피질 낭종을 동반한 대뇌 뇌척수백증, 중족뇌증, 거뇌증, 멜커슨 로젠탈 증후군, 메니에르병, 수막염, 멘케스병, 변색성 백혈구감소증, 소두증, 미시증, 편두통, 밀러 피셔 증후군, 미니-뇌졸중(일시적 허혈성 발작), 청각과민증, 미토콘드리아 근병증, 뫼비우스 증후군, 일지성 근위축증, 운동 기술 장애, 모야모야 병, 뮤코다당증, 다발성 경색 치매, 다병소 운동 신경병증, 다발성 경화증, 다계통 위축, 근위축증, 근육통성뇌수막염, 중증 근무력증, 말이집탈락성 광범위 경화증, 소아 근간대성 뇌증, 근종증, 근육병증, 근주 근육병증, 선천성 근육긴장증, 기면증, 신경베체트병, 신경 섬유종증, 신경이완제 악성 증후군, AIDS의 신경 증상, 루푸스의 신경학적 후유증, 신경모세포종, 신경 간질 지질 혈증, 신경세포 이주 장애, 신경 병증, 신경증, 니만피크병, 24시간 수면 장애, 비언어적 학습 장애, 오설리번-맥레오드 증후군, 후각 신경통, 잠재성 척추 유합부전 속발증, 오보하라 증후군, 올리브교 소뇌 위축증, 안구간대경련-근간대경련 증후군, 시신경염, 기립성 저혈압, 이경화증, 과사용 증후군, 반복시, 감각이상, 파킨슨병, 선천 이상근육긴장증, 신생물딸림병, 발작성공격, 패리-롬버그 증후군, PANDAS, 펠리제우스-메르츠바하병, 주기성 마비, 말초 신경병증, 전반적 발달 장애, 빛 재채기 반사, 피탄산 축적병, 피크병, 신경압박, 뇌하수체 종양, PMG, 대상포진후 신경통(PHN), 기립성 저혈압, 프라더-윌리 증후군, 1차 측방 경화증, 프리온병, 진행성 반측성 위축증, 진행성 다 병성 백혈구증, 진행성 핵상 마비, 안면실인증, 가성뇌종양, 사분맹, 사지마비, 광견병, 신경근병증, I형 람세이 헌트 증후군, II형 람세이 헌트 증후군, III형 람세이 헌트 증후군, 라스무센 뇌염, 반사성 신경혈관 위축증, 레프섬병, REM 수면 행동 장애, 반복 스트레스 상해, 불안 장애 다리 증후군, 레트로바이러스-관련 척수병증, 레트 증후군, 레예 증후군, 리듬 운동 장애, 롬베르그 증후군, 무도병, 샌드호프병, 쉴더병, 정신분열증, 감각 처리 장애, 중격-시신경 형성장애, 흔들린 아기 증후군, 대상 포진, 수줍음 끌기 증후군, 쇼그렌 증후군, 수면 무호흡증, 수면 중독 증후군, 배부름 재채기, 소토스 증후군, 경련, 척추 피열, 척수 상해, 척수 종양, 척수 근위축증, 척추 및 전구 근위축증, 척추 뇌실성 운동 장애, 분리뇌, 스틸-리차드슨-올슨제위스키 증후군, 강직인간 증후군, 뇌졸중, 스터지-웨버 증후군, 말더듬, 아급성 경화성 뇌막염, 피질하 동백경화성 뇌증, 표재성 철색소침착증, 시데남 무도병, 실신, 공감각, 척수공동증, 족근관 증후군, 지연성 이상장애, 지연성 이상, 탈로브 낭종, 테이-삭스병, 일시적인 동맥염, 측두엽 간질, 파상풍, 척추 신경근 증후군, 톰센병, 흉부 출구 증후군, 삼차 신경통(Tic Douloureux), 토트 마비, 뚜렛 증후군, 독성 뇌증, 일시적 허혈성 공격, 전염성 해면상 뇌증, 횡단성 척수염, 외상성 뇌 손상, 떨림, 발모광, 삼차 신경통, 열대성 경련성 대뇌 동맥경화증, 수면병, 결절성 경화증, 룬드보그-운베리히트병, 본히펠-린다우병(VHL), 빌리우이스크 뇌척수염(VE), 발렌베르그 증후군, 웨스트 증후군, 휘플래쉬, 윌리암 증후군, 윌슨병 또는 젤웨거 증후군을 치료하기 위해 사용된다.
일부 경우에, 본 발명에 개시된 조성물 및 방법은 뇌암 또는 뇌종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 기술된 벡터 및 조성물로 치료할 수 있는 뇌 암 또는 종양의 비 제한적인 예는 다음을 포함한다: 미분화 성상 세포종(등급 III 신경교종), 성상 세포종(등급 II 신경교종), 뇌간 신경교종, 상행 세포종, 신경절교종, 신경절 신경종, 교모세포종(등급 IV 신경교종), 신경교종, 청소년 모양세포 성상세포종(JPA), 저급 성상 세포종(LGA), 수모세포종, 혼합 신경교종, 핍지교종, 시신경 교종, 털모양 성상세포종(등급 I 신경교종) 및 원시 신경 외배엽(PNET)을 포함하는 신경교종; 탄성 말단 비대증 신경종(전정 신경초종), 말단비대증, 선종, 연골육종, 척삭종, 두개인두종, 표피양 종양, 사구 경정맥 종양, 천막 수막종, 수막종, 뇌하수체 선종, 뇌하수체 종양, 라스케씨 낭종을 포함하는 두개저 종양; 뇌 전이, 전이성 뇌종양을 포함한 전이성 암; 뇌 낭종, 맥락총 유두종, CNS 림프종, 콜로이드 낭종, 낭성 종양, 유피 종양, 척수 배아종, 림프종, 비강 암종, 비 인두 종양, 송과선 종양, 파인 모세포종, 파인 세포종, 상주 세포 수막종 및 혈관 종양을 포함하는 다른 뇌 종양; 성상 세포종, 상행 세포종, 수막종 및 신경초종을 포함하는 척수 종양을 포함한다.
일부 양태에서, 대상에서 신경 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법이 개시되어 있다. 일부 경우에, 본 방법은 신경 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상에게 생물학적으로 비활성인 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 대상은 이종성으로 G 단백질-결합 수용체를 발현할 수 있다. 또 다른 경우에, 대상은 리간드-개폐 이온 채널을 이종적으로 발현할 수 있다. 본 방법은 생물학적으로 비활성인 제제를 투여하기 전에, GPCR 또는 LGIC를 코딩하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계를 더 포함할 수 있다. 특정 예에서, GPCR 또는 LGIC는 본 발명 전반에 걸쳐 기술된 바와 같이 바이러스 벡터에 의해 대상에게 전달된다. 어떤 경우에는 대상은 통증에 대해 치료된다. 다른 경우에, 대상은 포만감 장애(즉, 섭식 장애)에 대해 치료된다. 일부 경우에, 대상은 간질에 대해 치료받지 못한다.
다른 경우에, 상기 방법은 신경 질환을 앓고 있는 대상에게 GPCR 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 전달하는 단계를 포함하며, 상기 대상은 GPCR 또는 LGIC를 이종성으로 발현한다. 상기 방법은 GPCR 또는 LGIC를 활성화시키는 약물을대상에게 투여하여 신경 질환을 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 약물은 GPCR 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 전달 적어도 일주일 후에 대상에게 투여된다. 추가의 경우, 약물은 적어도 3일 연속 매일 대상에게 투여된다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 간질이 아닌 신경 질환을 앓고 있는 대상에게 hM4Di인 GPCR 및 클로자핀-N-옥사이드인 생물학적으로 비활성인 제제를 전달하는 단계를 포함한다.
다른 경우에, 상기 방법은 GPCR 또는 LGIC를 활성화시키는 약물을 GPCR 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 약물은 GPCR 또는 LGIC에 대해 내인성 리간드가 아니다. 일부 경우에, 약물은 카파-오피오이드 수용체(KOR) 결합 약물이 아니다. 추가 경우에, 신경 질환은 간질이 아니다. 다른 추가 경우에, GPCR은 카파-오피오이드 수용체(KAP) 이외의 GPCR이다.
또 다른 경우에, 상기 방법은 GPCR 또는 LGIC를 활성화시키는 약물을 GPCR 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 투여함으로써 신경 질환을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, GPCR 또는 LGIC는 감각 뉴런, 후근 신경절 또는 삼차 신경절에서 선택적으로 발현된다.
다른 경우에, 상기 방법은 GPCR 또는 LGIC를 활성화시키는 약물을 GPCR 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 투여함으로써 신경 질환을 치료하는 단계를 포함하며, 여기서 약물은 FDA-승인을 받았지만 신경 질환의 치료에 대해서는 FDA-승인을 받지 않았다.
다른 경우에, 상기 방법은 GPCR 또는 LGIC를 활성화시키는 약물을 GPCR 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 투여함으로써 신경 질환을 치료하는 단계를 포함하며, 여기서 약물은 0.001μg/kg-10mg/kg의 투여량으로 투여된다.
일부 양태에서, 본 발명은 대상의 해마 속에 AAV-hSYN-GlyRM의 두개내 주입 및 이버멕틴으로 대상을 치료하여 신경계 네트워크, 예를 들어, 기억과 관련된 네트워크를 가역적으로 침묵시키는 것을 고려한다(Obenhaus et al., Front Mol Neurosci. 2016; 9: 75 참조). 일부 실시태양에서, GlyRM 단백질은 F207A 및 A288G 돌연변이를 포함한다.
일부 경우에, 본 발명은 AAV-hSYN-rM3DS, AAV-hSYN-hM3Dq 및 AAV-hSYN-KORD로부터 선택된 AAV 벡터를 대상에 투여하는 단계; 및 CNO를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상에서 파킨슨병을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 경우에, 이식된 도파민 뉴런이 AAV 벡터에 의해 형질 도입된다(Aldrin-Kirk et al., Neuron. 2016, 90(5):955-968 참조).
일부 경우에, 본 발명은 대상에서 AAV-CAG-hM4D 및 AAV-CAG-hM3D로부터 선택된 AAV 벡터를 대상에 투여하는 단계; 및 CNO를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상에서 알츠하이머병을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 지주막하 공간 또는 CA1에 주입된다(Yuan et al., J Neurosci. 2016, 36(2):632-641 참조).
특정 양태에서, 본 발명은 AAV 벡터(예를 들어, AAV-CamKII-hM3Dq)를 대상에게 투여하는 단계; 및 CNO를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상에서 공포 및/또는 불안증을 치료하는 방법을 포함한다. 대상에게 CNO를 투여하는 것. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 편도체에 주입된다(Sengupta et al., The Journal of Neuroscience, 2016, 36(2):385-395 참조).
본 발명은 부분적으로 대상에서 통증을 조절, 관리, 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 방법을 고려한다. "통증"은 대상의 신체에서 불편한 느낌 및/또는 불쾌감을 의미한다. 통증의 느낌은 경미하고 가끔에서 가혹하고 연속적까지 다양하다. 통증은 급성 통증이나 만성 통증으로 분류할 수 있다. 통증은 통각성 통증(즉, 조직 손상에 의해 유발되는 통증), 신경병증성 통증 또는 심인성 통증일 수 있다. 일부 경우에, 통증은 질환(예를 들어, 암, 관절염, 당뇨병)에 의해 유발되거나 연관된다. 다른 경우에, 통증은 손상(예를 들어, 스포츠 손상, 외상)에 의해 유발된다. 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료하기 쉬운 통증의 비 제한적인 예는 말초 신경 병증을 포함하는 신경병증성 통증, 당뇨병성 신경병증, 포진 후 신경통, 삼차 신경통, 허리 통증, 암과 관련된 신경병증, HIV/AIDS와 관련된 신경병증, 환상 사지 통증, 손목 터널 증후군, 뇌졸중 후 중추 통증, 만성 알코올 중독과 관련된 통증, 갑상선 기능 저항증, 요독증, 다발성 경화증과 관련된 통증, 척수 손상과 관련된 통증, 파킨슨병과 관련된 통증, 간질, 골관절염 통증, 류마티스성 관절염 통증, 내장 통증 및 비타민 결핍과 관련된 통증; 및 중추 신경계 외상, 좌상/염좌 및 화상과 관련된 통증을 포함하는 통각성 통증; 심근 경색, 급성 췌장염, 수술 후 통증, 외상 후 통증, 신장 산통, 암과 관련된 통증, 섬유 근육통과 관련된 통증, 손목 터널 증후군과 관련된 통증 및 허리 통증을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법은 대상에서 통증의 수준을 완화시키는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 대상에서 통증 수준은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 만큼 완화된다. 대상에서 통증 수준은 다양한 방법으로 평가될 수 있다. 일부 경우에, 통증 수준은 자기보고에 의해 평가된다(즉, 인간 대상은 자신이 경험하고 있는 통증 수준에 대한 구두 보고를 표현한다). 일부 경우에, 통증 수준은 통증의 행동 지표, 예를 들어, 얼굴 표정, 사지 움직임, 발성, 안절부절 및 가딩(guarding)에 의해 평가된다.이러한 유형의 평가는 예를 들어 대상이 자기보고 할 수 없는 경우(예를 들어, 유아, 의식이 없는 대상, 사람이 아닌 대상) 유용할 수 있다. 통증 수준은 조성물에 의한 치료 이전 대상이 경험하고 있던 통증 수준과 비교하여 본 발명의 조성물에 의한 치료 이후 평가될 수 있다.
다양한 실시태양에서, 대상에서 통증을 제어, 관리, 예방 또는 치료하는 방법은 본 발명에서 고려되는 유효량의 벡터를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않고, 본 발명은 신경 활성을 조절하여 대상에서 통증을 경감시키는 본 발명에 개시된 벡터를 사용하는 것을 고려한다.
다양한 실시태양에서, 신경 세포를 활성화 또는 탈분극시키는 스위치 수용체를 암호화하는 벡터는 통증 감각을 감소시키는 하나 이상의 신경 세포, 예를 들어 억제성 개재뉴런에 투여된다(또는 주입된다). 리간드의 존재하에서, 스위치 수용체를 발현하는 신경 세포는 활성화되고 통증에 대한 민감성을 감소시켜 이러한 신경 세포를 자극하는 진통 효과를 강화시킨다.
다양한 실시태양에서, 신경 세포를 불활성화시키거나 과분극화시키는 스위치 수용체를 암호화하는 벡터는 통증에 대한 통증감 또는 민감성을 증가시키는 하나 이상의 신경 세포, 예를 들어, 통각 수용체, 말초 감각 뉴런, C-섬유, Aδ 섬유, Aβ 섬유, DRG 뉴런, TGG 뉴런 등에 투여된다(또는 주입된다). 리간드의 존재 하에서, 스위치 수용체를 발현하는 신경 세포는 불 활성화되고 통증에 대한 감수성을 감소시키고 진통 효과를 강화시킨다.
통각 수용체의 하위 집단에 대한 스위치 수용체의 발현 표적화는 벡터의 선택(예를 들어, AAV1, AAV1(Y705+731F+T492V), AAV2(Y444+500+730F+T491V), AAV3(Y705+731F), AAV5, AAV5(Y436+693+719F), AAV6, AAV6(VP3 변이체 Y705F/Y731F/T492V), AAV-7m8, AAV8, AAV8(Y733F), AAV9, AAV9(VP3 변이체 Y731F), AAV10(Y733F), 및 AAV-ShH10); 프로모터의 선택; 및 전달 수단의 하나 이상에 의해 성취될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 조성물 및 방법은 통증을 감소 시키는데 효과적이다.
본 발명에서 고려되는 벡터, 조성물 및 방법으로 치료하기 쉬운 통증의 예시적인 예는 급성 통증, 만성 통증, 신경병증성 통증, 통각 장애 통증, 이질통, 염증성 통증, 염증성 통각 과민증, 신경병증, 신경통, 당뇨병성 신경병증, 인간 면역결핍 바이러스-관련 신경병증, 신경 손상, 류마티스성 관절염 통증, 골관절염 통증, 화상, 허리 통증, 눈 통증, 내장 통증, 암 통증(예를 들어, 골암 통증), 치통, 두통, 편두통, 손목 터널 증후군, 섬유 근육통, 신경염, 좌골 신경통, 골반 과민증, 골반 통증, 대상포진 후 신경통, 수술 후 통증, 뇌졸중 후 통증 및 생리통을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
통증은 급성 또는 만성으로 분류될 수 있다. "급성 통증"은 갑자기 시작되고 보통 급격한 특성의 통증을 의미한다. 급성 통증은 경미하고 잠시동안 지속될 수 있거나 심각하고 몇 주 또는 몇 달 동안 지속될 수 있다. 대부분의 경우에, 급성 통증은 3개월 이상 지속되지 않으며 통증의 근본 원인이 치료되거나 치유되면 사라진다. 그러나, 절제되지 않은 급성 통증은 만성 통증을 유발할 수 있다. "만성 통증"은 급성 질환이나 손상의 일상적인 과정을 넘어서 지속되거나 3개월에서 6개월 이상 지속되어, 개인의 건강에 좋지 않은 영향을 미치는 진행중인 또는 재발하는 통증을 의미한다. 특정 실시태양에서, 용어 "만성 통증"은 지속되지 않아야 할 때 지속되는 통증을 의미한다. 만성 통증은 통각성 통증 또는 신경병증성 통증일 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 조성물 및 방법은 급성 통증을 감소시키는데 효과적이다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 조성물 및 방법은 만성 통증을 감소시키는데 효과적이다.
임상 통증은 환자의 증상 중 불편감 및 비정상적인 감각이 특징일 때 존재한다. 개인은 다양한 통증 증상을 나타낼 수 있습니다. 이런 증상은 다음을 포함한다: 1) 둔감하고, 화끈거리고, 또는 찌르는 듯한 자발적인 통증; 2) 유해 자극에 대한 과장된 통증 반응(통각과민); 및 3) 정상적으로 무해한 자극에 의한 통증(이질통-Meyer et al., 1994, Textbook of Pain, 13-44). 다양한 형태의 급성 및 만성 통증을 앓고있는 환자가 유사한 증상을 나타낼 수 있지만, 기본 메커니즘은 다를 수 있으므로, 따라서, 다른 치료 전략이 필요할 수 있다. 통증은 또한 통각성 통증, 염증성 통증 및 신경병증성 통증을 포함하는 상이한 병리생리학에 따른 다수의 상이한 아형으로 분류될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 조성물 및 방법은 통각성 통증을 감소시키는데 효과적이다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 조성물 및 방법은 염증성 통증을 감소시키는데 효과적이다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 조성물 및 방법은 신경병증성 통증을 감소시키는데 효과적이다.
통각성 통증은 조직 손상 또는 손상을 일으킬 가능성을 가진 강력한 자극에 의해 유발된다. 중간 내지 심한의 급성 통각성 통증은 중추 신경계 외상, 좌상/염좌, 화상, 심근 경색 및 급성 췌장염, 수술 후 통증(임의 유형의 외과 수술 후 통증), 외상 후 통증, 신장 산통, 암 통증 및 허리 통증에 의한 통증의 주요한 특징이다. 암 통증은 종양 관련 통증(예컨대, 골 통증, 두통, 안면 통증 또는 내장 통증) 또는 암 치료(예를 들어, 화학요법 후 증후군, 만성 수술 후 통증 증후군 또는 방사선 후 증후군)과 관련된 만성 통증일 수 있다. 암 통증은 또한 화학 요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 방사선 요법에 반응하여 발생할 수 있다. 허리 통증은 탈장되거나 파열된 추간판 또는 요추 후관절, 천장 관절, 척추옆근 또는 뒤쪽 세로인대의 이상으로 인한 것일 수 있다. 허리 통증은 자연적으로 해결될 수 있지만 12주 이상 지속되는 일부 환자에서는, 특히 쇠약해질 수 있는 만성 질환이 된다.
신경병증성 통증은 신경계의 1차 병변 또는 기능장애에 의해 개시되거나 유발되는 통증으로 정의될 수 있다. 신경병증성 통증의 병인은, 예를 들어, 말초 신경병증, 당뇨병성 신경병증, 포진 후 신경통, 삼차 신경통, 허리 통증, 암 신경병증, HIV 신경병증, 환상 사지 통증, 손목 터널 증후군, 뇌졸중 후 중추 통증 및 만성 알코올 중독, 갑상선 기능 저항증, 요독증, 다발성 경화증, 척수 손상, 파킨슨병, 간질 및 비타민 결핍과 관련된 통증을 포함한다.
신경병증성 통증은 통증과 관련되거나 통증에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 상태를 의미하는 통증 장애를 의미하는 용어인 통증 장애와 관련될 수 있다. 통증 장애의 예시적인 예는 관절염, 이질통증, 전형적인 삼차 신경통, 삼차 신경통, 신체형 장애, 감각 저하, 통각과민, 신경통, 신경염, 신경원성 통증, 진통, 무감각 통증, 작열통, 좌골 신경통 장애, 퇴행성 관절 장애, 섬유근통, 내장 질환, 만성 통증 장애, 편두통/두통, 만성 피로 증후군, 복합 부위 통증 증후군, 신경장애, 족저근막 염증 또는 암 관련 통증을 포함한다.
염증 과정은 조직 손상 또는 팽윤 및 통증을 초래하는 외인성 물질의 존재에 반응하여 활성화된 복잡한 일련의 생화학적 및 세포적 사건이다. 관절염 통증은 흔한 염증 통증이다.
본 발명에서 고려되는 벡터, 조성물 및 방법으로 치료할 수 있는 다른 유형의 통증은 근육통, 섬유 근육통, 척추염, 혈청-음성(비-류마티스성) 관절증, 비-관절 류마티스, 이상영양장애, 글리코겐 분해, 다발성근염 및 근염을 포함하는 근골력계 장애로부터 초래된 통증; 협심증, 심근 경색, 승모판 협착증, 심낭염, 레이노 현상, 다발성 경화증 및 골격근 허혈에 의해 유발된 통증을 포함하는 심장 및 혈관 통증; 편두통(전조가 있는 편두통 및 전조가 없는 편두통 포함), 군발 두통, 긴장형 두통 혼합 두통 및 혈관 장애와 관련된 두통과 같은 두통; 및 치통, 귀 통증, 구강 건조 증후군 및 저작근 근막통을 포함하는 안면 통증을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
인간 대상이 경험하는 통증의 양을 감소시키기 위해 본 발명에서 고려되는 조성물 및 방법의 능력은 다양한 통증 척도를 사용하여 결정될 수 있다. 환자 자기보고가 통증 감소 여부를 평가하는데 사용될 수 있다; 예를 들어, Katz and Melzack (1999) Surg. Clin. North Am. 79:231 참조. 선택적으로, 관찰 통증 척도가 사용될 수 있다. LANSS 통증 척도가 통증 감소 여부를 평가하는데 사용될 수 있다; 예를 들어, Bennett (2001) Pain 92:147 참조. 시각 유사 통증 척도가 사용될 수 있다: 예를 들어, Schmader (2002) Clin. J. Pain 18:350 참조. 리커트 (Likert) 통증 척도가 사용될 수 있다; 예를 들어, 0은 통증이 없고, 5는 중간의 통증이고, 10은 가능한 최악의 통증이다. 어린이를 위한 자기보고 통증 척도는, 예를 들어, 얼굴 통증 척도; 왕-베이커 얼굴 통증 평가 척도; 및 컬러 아날로그 척도를 포함한다. 성인을 위한 자가보고 통증 척도는, 예를 들어, 시각적 아날로그 척도; 구두 숫자 등급 척도; 구두 서술 척도; 및 간단한 통증 목록을 포함한다. 통증 측정 척도는, 예를 들어, 알더 헤이 트라이아지 통증 점수(Stewart et al. (2004) Arch. Dis. Child. 89 : 625); 행동 통증 척도(Payen et al. (2001) Critical Care Medicine 29 : 2258); 간단한 통증 목록(Cleeland and Ryan (1994) Ann. Acad. Med. Singapore 23 : 129); 비구두적 통증 지표 검사 목록(Feldt (2000) Pain Manag., 1 : 13); 중환자 관리 통증 관찰 도구(Gelinas et al. (2006) Am. J. Crit. Care 15 : 420); 편안함 척도(Ambuel et al. (1992) J. Pediatric Psychol. 17:95); 달라스 통증 설문(Ozguler et al. (2002) Spine 27 : 1783); 통각계 통증 지수(Hardy et al (1952) Pain Sensations and Reactions Baltimore: Williams & Wilkins Co.); 얼굴 통증 척도-개정(Hicks et al (2001) Pain 93 : 173); 얼굴 다리 활동 울음 달램 척도; 맥길 통증 설문(Melzack (1975) Pain 1 : 277); 설명어 차이 척도(Gracely and Kwilosz (1988) Pain 35 : 279); 수치 11 포인트 박스 (Jensen et al (1989) Clin. J. Pain 5 : 153); 수치 등급 척도(Hartrick et al. (2003) Pain Pract. 3 : 310); 왕-베이커 얼굴 통증 평가 척도; 및 시각적 아날로그 척도(Huskisson (1982) J. Rheumatol., 9 : 768)를 포함한다.
특정 실시태양에서, 신경 세포로 스위치 수용체를 포함하는 벡터를 주입하고 스위치 수용체를 활성화시키는 리간드를 제공함으로써 세포의 활성을 제어하는 단계를 포함하는 방법은 대상에서 통증을 경감시킨다. 이 방법은 일반적인 중추 신경계 우울증과 같은 오프-타켓 효과(off-target effect)가 없는 통증에 대해 상당한 진통을 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 방법은 치료되지 않은 대상과 비교된 대상에서 신경병증성 통증의 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 감소를 제공한다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 벡터는 하나 이상의 신경 세포에 투여되거나 주입된다. 신경 세포는 동일한 유형의 신경 세포 또는 상이한 유형의 신경 세포의 혼합된 집단일 수있다.
한 실시태양에서, 신경 세포는 통각 수용체 또는 말초 감각 뉴런이다.
감각 뉴런의 예시적인 예는 후근 신경절(DRG) 뉴런 및 삼차 신경절(TGG) 뉴런을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
한 실시태양에서, 신경 세포는 신경 통증 회로에 관여하는 억제성 개재뉴론이다.
일부 경우에, 스위치 수용체를 암호화하는 벡터는 이를 필요로하는 대상에게 투여된다. 투여 방법의 비 제한적인 예는 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피내 투여, 복강내 투여, 경구 투여, 주사, 두개내 투여, 척수강내 투여, 비내 투여, 신경절내 투여, 척수내 투여, 대수조 투여 및 신경내 투여를 포함한다. 일부 경우에, 투여는 벡터의 액체 제제의 주사를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 투여는 벡터의 고체 제제의 경구 전달을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 경구 제제는 식품과 함께 투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 벡터는 하나 이상의 신경 세포에 벡터를 주입하기 위해 비경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 척수강내, 신경내, 신경절내, 척수내 또는 뇌실내 투여된다. 다양한 실시태양에서, 벡터는 rAAV이다.
한 실시태양에서, AAV는 감각 신경 또는 통각 수용체, 예를 들어 DRG 뉴런, TGG 뉴런 등에 척수강내(IT) 또는 신경절내(IG) 투여에 의해 투여된다.
IT 경로는 뇌척수액(CSF)에 AAV를 전달한다. 이러한 투여 경로는, 예를 들어, 만성 통증 또는 다른 말초 신경계(PNS) 또는 중추 신경계(CNS) 징후의 치료에 적합할 수 있다. 동물에서, IT 투여는 IT 카테터를 대수조를 통해 삽입하고 꼬리쪽으로 요추 높이로 전진시킴으로써 달성되었다. 인간에서, IT 전달은 탁월한 안전 프로파일을 갖춘 일상적인 침대 절차인 요추 천자(lumbar puncture, LP)로 쉽게 수행될 수 있다.
특정 경우에, 벡터는 신경절내 투여에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 신경절내 투여는 하나 이상의 신경절로 직접 주사를 포함할 수 있다. IG 경로는 AAV를 DRG 또는 TGG 실질에 직접 전달할 수 있다. 동물에서, DRG에 대한 IG 투여는 복잡하고 침습적인 절차가 필요하기 때문에 인간에게 바람직하지 않은 개방 신경외과 적 수술에 의해 수행된다. 사람의 경우에, DRG를 안전하게 표적으로 하는 최소 침습적 CT 영상 유도 기술을 사용될 수 있다. 대류 강화 전달(CED)을 위한 맞춤형 바늘 조립체가 AAV를 DRG 실질에 전달하는데 사용될 수 있다. 비 제한적인 예에서, 본 발명의 벡터는 만성 통증의 치료를 위해 하나 이상의 후근 신경절 및/또는 삼차 신경절에 전달될 수있다. 또 다른 비 한정적인 예에서, 본 발명의 벡터는 간질을 치료하기 위해 결절 신경절(미주 신경)에 전달될 수 있다.
또 다른 특정 경우에, 벡터는 두개내 투여(즉, 뇌에 직접 투여)에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 두개내 투여의 비 한정적인 예에서, 본 발명의 벡터는, 예를 들어, 간질 발작 병소를 치료하기 위해 뇌의 파질 속에, 예를 들어, 포만감 장애를 치료하기 위해 뇌실 시상하부 속에, 또는 예를 들어, 포만감 장애를 치료하기 위해 편도 중심 핵으로 속에 전달될 수 있다. 다른 특정 경우에, 벡터는 신경내 주사 (즉, 신경 내로 직접)에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 신경은, 예를 들어, 만성 통증을 치료하기 위해 좌골 신경으로의 주사 또는 간질 또는 포만감 장애를 치료하기 위해 미주 신경으로의 주사와 같은 치료될 증상을 기초로 선택될 수 있다. 또 다른 특정 경우에, 벡터는, 예를 들어 만성 통증을 치료하기 위해 감각 신경 말단 속에 피하 주사에 의해 대상에게 투여될 수 있다.
벡터 투여량은 대상에게 전달된 벡터 게놈 단위의 수로서 표현될 수 있다. 본 발명에서 사용된 "벡터 게놈 단위"는 1회 투여량으로 투여된 개별 벡터 게놈의 수를 나타낸다. 개별 벡터 게놈의 크기는 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터의 유형에 의존할 것이다. 본 발명의 벡터 게놈은 약 1.0 킬로베이스, 1.5 킬로베이스, 2.0 킬로베이스, 2.5 킬로베이스, 3.0 킬로베이스, 3.5 킬로베이스, 4.0 킬로베이스, 4.5 킬로베이스, 5.0 킬로베이스, 5.5 킬로베이스, 6.0 킬로베이스, 6.5 킬로베이스, 7.0 킬로베이스, 7.5 킬로베이스 , 8.0 킬로베이스, 8.5 킬로베이스, 9.0 킬로베이스, 9.5 킬로베이스, 10.0 킬로베이스 내지 10.0 킬로베이스 초과일 수 있다. 따라서, 단일 벡터 게놈은 10,000개 이상의 염기쌍을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 벡터 투여량은 약 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x 1011, 4 x 1011, 5 x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 2 x 1012, 3 x 1012, 4 x 1012, 5 x 1012, 6 x 1012, 7 x 1012, 8 x 1012, 9 x 1012, 1 x 1013, 2 x 1013, 3 x 1013, 4 x 1013, 5 x 1013, 6 x 1013, 7 x 1013, 8 x 1013, 9 x 1013, 1 x 1014, 2 x 1014, 3 x 1014, 4 x 1014, 5 x 1014, 6 x 1014, 7 x 1014, 8 x 1014, 9 x 1014, 1 x 1015, 2 x 1015, 3 x 1015, 4 x 1015, 5 x 1015, 6 x 1015, 7 x 1015, 8 x 1015, 9 x 1015, 1 x 1016, 2 x 1016, 3 x 1016, 4 x 1016, 5 x 1016, 6 x 1016, 7 x 1016, 8 x 1016, 9 x 1016, 1 x 1017, 2 x 1017, 3 x 1017, 4 x 1017, 5 x 1017, 6 x 1017, 7 x 1017, 8 x 1017, 9 x 1017, 1 x 1018, 2 x 1018, 3 x 1018, 4 x 1018, 5 x 1018, 6 x 1018, 7 x 1018, 8 x 1018, 9 x 1018, 1 x 1019, 2 x 1019, 3 x 1019, 4 x 1019, 5 x 1019, 6 x 1019, 7 x 1019, 8 x 1019, 9 x 1019, 1 x 1020, 2 x 1020, 3 x 1020, 4 x 1020, 5 x 1020, 6 x 1020, 7 x 1020, 8 x 1020, 9 x 1020 또는 그 이상의 벡터 게놈 단위일 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 벡터는 대상에게 적어도 약 1 x 109 게놈 입자/mL, 적어도 약 1 x 1010 게놈 입자/mL, 적어도 약 5 x 1010 게놈 입자/mL, 적어도 약 1 x 1011 게놈 입자/mL, 적어도 약 5 x 1011 게놈 입자/mL, 적어도 약 1 x 1012 게놈 입자/mL, 적어도 약 5 x 1012 게놈 입자/mL, 적어도 약 6 x 1012 게놈 입자/mL, 적어도 약 7 x 1012 게놈 입자/mL, 적어도 약 8 x 1012 게놈 입자/mL, 적어도 약 9 x 1012 게놈 입자/mL, 적어도 약 10 x 1012 게놈 입자/mL, 적어도 약 15 x 1012 게놈 입자/mL, 적어도 약 20 x 1012 게놈 입자/mL, 적어도 약 25 x 1012 게놈 입자/mL, 적어도 약 50 x 1012 게놈 입자/mL, 또는 적어도 약 100 x 1012 게놈 입자/mL의 역가로 투여된다. 바이러스 역가와 관련하여 사용되는 용어 "게놈 입자 (gp)" 또는 "게놈 동가물" 또는 "게놈 복사본"(gc)은 감염성 또는 기능성과 무관하게, 재조합 AAV DNA 게놈을 포함하는 비리온의 수를 의미한다. 특정 벡터 제제에서의 게놈 입자의 수는 본 발명의 실시예 또는 예를 들어, Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10 : 1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278에 기술된 바와 같은 절차에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 벡터는 유체의 부피로 투여될 수있다. 일부 경우에, 벡터는 약 0.1 mL, 0.2 mL, 0.3 mL, 0.4 mL, 0.5 mL, 0.6 mL, 0.7 mL, 0.8 mL, 0.9 mL, 1.0 mL, 2.0 mL, 3.0 mL, 4.0 mL, 5.0 mL, 6.0 mL, 7.0 mL, 8.0 mL, 9.0 mL, 10.0 mL, 11.0 mL, 12.0 mL, 13.0 mL, 14.0 mL, 15.0 mL, 16.0 mL, 17.0 mL, 18.0 mL, 19.0 mL, 20.0 mL 또는 20.0mL 초과의 부피로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 벡터 투여량은 대상에게 투여된 벡터의 농도 또는 역가로 표현될 수있다. 이 경우, 벡터 투여량은 부피 당 벡터 게놈 단위의 수(즉, 게놈 단위/부피)로 표현될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 벡터는 대상에게 적어도 약 5 x 109 감염 단위/mL, 적어도 약 6 x 109 감염 단위/mL, 적어도 약 7 x 109 감염 단위/mL, 적어도 약 8 x 109 감염 단위/mL, 적어도 약 9 x 109 감염 단위/mL, 적어도 약 10 x 109 감염 단위/mL, 적어도 약 15 x 109 감염 단위/mL, 적어도 약 20 x 109 감염 단위/mL, 적어도 약 25 x 109 감염 단위/mL, 적어도 약 50 x 109 감염 단위/mL, 또는 적어도 약 100 x 109 감염 단위/mL의 역가로 투여된다. 바이러스 역가와 관련하여 사용된 용어 "감염 단위(iu)", "전염성 입자" 또는 "복제 단위"는, 예를 들어, McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62 : 1963-1973에 기술된 바와 같이, 복제 센터 분석법으로도 공지된 감염 센터 분석법에 의해 측정한 감염성 및 복제능이 있는 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 의미한다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 벡터는 대상에게 적어도 약 5 x 1010 형질도입 단위/mL, 적어도 약 6 x 1010 형질도입 단위/mL, 적어도 약 7 x 1010 형질도입 단위/mL, 적어도 약 8 x 1010 형질도입 단위/mL, 적어도 약 9 x 1010 형질도입 단위/mL, 적어도 약 10 x 1010 형질도입 단위/mL, 적어도 약 15 x 1010 형질도입 단위/mL, 적어도 약 20 x 1010 형질도입 단위/mL, 적어도 약 25 x 1010 형질도입 단위/mL, 적어도 약 50 x 1010 형질도입 단위/mL, 또는 적어도 약 100 x 1010 형질도입 단위/mL의 역가로 투여된다. 바이러스 역가와 관련하여 사용된 "형질도입 단위(tu)"라는 용어는 본 실시예에 기재된 바와 같이 또는 예를 들어, Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; 또는 Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (LFU 분석)에서 기능 분석에서 측정된 바와 같이 기능 형질전환 유전자 생성물을 생산하는 감염성 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 의미한다.
벡터 투여량은 일반적으로 투여 경로에 의해 결정될 것이다. 특정 예에서, 신경절내 주사는 약 0.1 mL 내지 약 1.0 mL의 부피로 약 1 x 109 내지 약 1 x 1013 벡터 게놈을 포함할 수 있다. 다른 특별한 경우, 척수강 내 주사는 약 1.0 mL 내지 약 12.0 mL의 부피로 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1015 벡터 게놈을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 경우에, 두개내 주사는 약 0.1 mL 내지 약 1.0 mL의 부피로 약 1 x 109 내지 약 1 x 1013 벡터 게놈을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 경우에, 신경내 주사는 약 0.1 mL 내지 약 1.0 mL의 부피로 약 1 x 109 내지 약 1 x 1013 벡터 게놈을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 척수내 주사는 약 0.1 mL 내지 약 1.0 mL의 부피로 약 1 x 109 내지 약 1 x 1013 벡터 게놈을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 경우, 대수조 주입은 약 0.5 mL 내지 약 5.0 mL의 부피로 약 5 x 109 내지 약 5 x 1013 벡터 게놈을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 경우에, 피하 주사는 약 0.1 mL 내지 약 1.0 mL의 부피로 약 1 x 109 내지 약 1 x 1013 벡터 게놈을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 벡터는 주사에 의해 대상에게 전달된다. 주사에 의해 대상에게 전달되는 벡터 투여량은 벡터 주사 속도로서 측정될 수 있다. 벡터 주사 속도의 비 제한적인 예는 다음을 포함한다: 신경절내, 척수내, 두개내 또는 신경내 투여에 대해 1-10㎕/min; 및 척수강내 또는 대수조 투여는 10-1000㎕/min. 일부 경우에, 벡터는 MRI 유도 대류 강화 전달(CED)을 통해 대상에게 전달된다. 이 기술은 증가된 바이러스 확산 및 형질도입이 뇌의 큰 부피 전체에 분포되게 할뿐만 아니라 바늘 경로를 따라 벡터의 역류를 감소시킨다.
다양한 실시태양에서, 통증에 대한 통증감 또는 민감성을 증가시키는 하나 이상의 신경 세포에 신경 세포를 불활성화시키거나 과분극화하는 스위치 수용체를 암호화하는 벡터를 투여하는 단계 및 대상에 스위치 수용체를 발현하는 신경 세포와 특이적으로 결합하는 리간드를 투여하여, 세포를 불활성화시키고, 통증에 대한 민감성을 감소시키며 진통 효과를 강화시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시태양에서, 통증에 대한 통증감 또는 민감성을 감소시키는 하나 이상의 신경 세포에 신경 세포를 활성화 키거나 분극화하는 스위치 수용체를 암호화하는 벡터를 투여하는 단계 및 대상에 스위치 수용체를 발현하는 신경 세포와 특이적으로 결합하는 리간드를 투여하여, 세포를 활성화시키고, 통증에 대한 민감성을 감소시키며 진통 효과를 강화시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
리간드의 제제는 다양한 경로에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 투여 방법의 비 제한적인 예는 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 경피 투여, 피내 투여, 복강내 투여, 경구 투여, 주사, 두개내 투여, 척수강내 투여, 비내 투여, 신경절내 투여 및 신경내 투여를 포함한다. 일부 경우에, 투여는 리간드의 액체 제제의 주사를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 투여는 리간드의 고체 제제의 경구 전달을 포함할 수 있다. 특정 경우에, 리간드는 경구 투여(예를 들어, 알약, 정제, 캡슐 제 등)에 의해 투여된다. 일부 경우에, 경구 조성물을 음식과 함께 투여될 수 있다. 또 다른 특정 경우에, 리간드는 대상의 뇌척수액(CSF)에 전달하기 위해 척수강내 주사(즉, 척수의 지주막 공간 내로)로 투여된다. 또 다른 특정 경우에, 리간드는 국소로 (예를 들어, 피부 패치, 크림, 로션, 연고 등)투여된다.
대상에게 투여되는 리간드의 투여량은 절대적인 제한을 받지 않지만, 조성물 및 이의 활성 성분의 성질 및 이의 원치 않는 부작용(예를 들어, 항체에 대한 면역 반응), 치료되는 대상 및 치료되는 상태의 형태와 투여 방식에 의존될 것이다. 일반적으로, 투여량은 원하는 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 양, 예를 들어 대상이 겪는 통증의 수준을 감소시키거나 약화시키는데 효과적인 양과 같은 치료적 유효량일 것이다. 특정 실시태양에서, 투여량은 또한 예방적 양 또는 유효량일 수있다. 리간드의 치료적 유효량은 투여 경로, 치료되는 징후 및/또는 사용을 위해 선택된 리간드에 의존될 수 있다.
한 실시태양에서, 리간드는 먼저 벡터의 투여 전에 대상에게 투여된다. 치료 유효량의 리간드는 벡터 전달 후 어느 시점에서 대상에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 벡터의 전달 후에, 대상의 하나 이상의 세포가 벡터에 의해 암호화되는 단백질(즉, 스위치 수용체)을 생성하는데 필요한 기간이 있을 것이다. 이 기간 동안, 대상에 대한 리간드의 투여는 대상에게 도움이 되지 않을 수 있다. 이러한 상황에서, 스위치 수용체의 양이 대상의 하나 이상의 세포에 의해 생산된 후에 리간드를 투여하는 것이 적합할 수 있다.
한 실시태양에서, 리간드는 먼저 벡터가 대상에게 투여되는 것과 거의 동시에 대상에게 투여된다.
한 실시태양에서, 리간드는 대상에 대한 벡터의 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 또는 12시간, 일, 주, 달 또는 년에 투여된다. 일부 경우에, 리간드의 치료적 유효량은 벡터의 전달 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일 또는 30일 이상에 투여될 수 있다. 특정 예에서, 치료적 유효량의 리간드는 벡터의 전달 적어도 1주일 후 대상에게 투여된다. 추가의 예에서, 리간드의 치료 유효량은 적어도 3일 연속 매일 환자에게 투여된다.
본 발명의 리간드의 치료적 유효량 또는 투여량은 대상 체중의 ㎏ 당 리간드의 mg 또는 ㎍으로 표현될 수 있다. 일부 경우에, 리간드의 치료 유효량은 약 0.001㎍/kg, 약 0.005㎍/kg, 약 0.01㎍/kg, 약 0.05㎍/kg, 약 0.1㎍/kg, 약 0.5㎍/kg, 약 1 ㎍/kg, 약 2㎍/kg, 약 3㎍/kg, 약 4㎍/kg, 약 5㎍/kg, 약 6㎍/kg, 약 7㎍/kg, 약 8㎍/kg, 약 9㎍/kg, 약 10㎍/kg, 약 20㎍/kg, 약 30㎍/kg, 약 40㎍/kg, 약 50㎍/kg, 약 60㎍/kg, 약 70㎍/kg, 약 80㎍/kg, 약 90㎍/kg, 약 100㎍/kg, 약 120㎍/kg, 약 140㎍/kg, 약 160㎍/kg, 약 180㎍/kg, 약 200㎍/kg, 약 220㎍/kg, 약 240㎍/kg, 약 260㎍/kg, 약 280㎍/kg, 약 300㎍/kg, 약 320 ㎍/kg, 약 340㎍/kg, 약 360㎍/kg, 약 380㎍/kg, 약 400㎍/kg, 약 420㎍/kg, 약 440㎍/kg, 약 460㎍/kg, 약 480㎍/kg, 약 500㎍/kg, 약 520㎍/kg, 약 540㎍/kg, 약 560㎍/kg, 약 580㎍/kg, 약 600㎍/kg, 약 620㎍/kg, 약 640㎍/kg, 약 660㎍/kg, 약 680㎍/kg, 약 700㎍/kg, 약 720㎍/kg, 약 740㎍/kg, 약 760㎍/kg, 약 780㎍/kg, 약 800㎍/kg, 약 820㎍/kg, 약 840㎍/kg, 약 860㎍/kg, 약 880㎍/kg, 약 900㎍/kg, 약 920㎍/kg, 약 940㎍/kg, 약 960㎍/kg, 약 980㎍/kg, 약 1mg/kg, 약 2mg/kg, 약 3mg/kg, 약 4mg/kg, 약 5mg/kg, 약 6mg/kg, 약 7mg/kg, 약 8mg/kg, 약 9mg/kg, 약 10mg/kg 또는 10mg/kg 초과일 수 있다.
특정 실시태양에서, 대상에게 투여된 리간드의 투여량은 kg당 적어도 약 0.001㎍(μg/kg), 적어도 약 0.005㎍/kg, 적어도 약 0.01μg/kg, 적어도 약 0.05μg/kg, 적어도 약 0.1μg/kg, 적어도 약 0.5㎍/kg, kg당 0.001mg(mg/kg), 적어도 약 0.005mg/kg, 적어도 약 0.01mg/kg, 적어도 약 0.05mg/kg, 적어도 약 0.1mg/kg, 적어도 약 0.5mg/kg , 적어도 약 1mg/kg, 적어도 약 2mg/kg, 적어도 약 3mg/kg, 적어도 약 4mg/kg, 적어도 약 5mg/kg, 적어도 약 5mg/kg, 적어도 약 6mg/kg, 적어도 약 7mg/kg, 적어도 약 8mg/kg, 적어도 약 9mg/kg, 또는 적어도 약 10 이상mg/kg이다.
특정 실시태양에서, 대상에게 투여되는 리간드의 투여량은 적어도 약 0.001μg/kg 내지 적어도 약 10mg/kg, 적어도 약 0.01μg/kg 내지 적어도 약 10mg/kg, 적어도 약 0.1μg/kg 내지 적어도 약 10mg/kg, 적어도 약 1μg/kg 내지 적어도 약 10mg/kg, 적어도 약 0.01mg/kg 내지 적어도 약 10mg/kg, 적어도 약 0.1mg/kg 내지 적어도 약 10mg/kg, 또는 적어도 약 1mg/kg 내지 약 10mg/kg 또는 이의 임의의 개재 범위이다.
일부 양태에서, 리간드의 치료 유효량은 몰 농도(즉, M 또는 mol/L)로서 표현될 수 있다. 일부 경우에, 리간드의 치료적 유효량은 약 1nM, 2nM, 3nM, 4nM, 5nM, 6nM, 7nM, 8nM, 9nM, 10nM, 20nM, 30nM, 40nM, 50nM, 60nM, 70nM, 80nM, 90nM, 500nM, 700nM, 800nM, 900nM, 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 200mM, 80mM, 90mM, 100mM, 200mM, 300mM, 400mM, 500mM, 600mM, 700mM, 800mM, 900mM, 1000mM 이상일 수 있다.
리간드의 치료적 유효량은 매일 1회 또는 1회 초과 투여될 수 있다. 일부 경우, 리간드의 치료적 유효량은 필요에 따라(예컨대, 통증 완화가 필요한 경우) 투여된다. 리간드는 순차적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 치료 요법의 지속 기간 동안 매일 중단없이). 일부 경우에, 치료 요법은 1주 미만, 1주, 2주, 3주, 한 달 또는 한 달 초과일 수 있다. 일부 경우에, 리간드의 치료적 유효량은 하루 동안, 적어도 2일 연속, 적어도 3일 연속, 적어도 4일 연속, 적어도 5일 연속, 적어도 6일 연속, 적어도 7일 연속, 적어도 8일 연속, 적어도 9일 연속, 적어도 10일 연속 또는 적어도 10일 연속 초과 동안 투여된다. 특정 경우에, 리간드의 치료적 유효량은 3일 연속 투여된다. 일부 경우에, 리간드의 치료적 유효량은 주당 1회, 주당 2회, 주당 3회, 주당 4회, 주당 5회, 주당 6회, 주당 7회, 주당 8회, 주당 9회, 주당 10회, 주당 11회, 주당 12회, 주당 13회, 주당 14회, 주당 15회, 주당 16회, 주당 17회, 주당 18회, 주당 19회, 주당 20회, 주당 25회, 주당 30회, 주당 35회, 주당 40회, 또는 주당 40회 초과 투여될 수 있다. 일부 경우에, 리간드의 치료적 유효량은 일당 1회, 일당 2회, 일당 3회, 일당 4회, 일당 5회, 일당 6회, 일당 7회, 일당 8회, 일당 9회, 일당 10회 또는 일당 10회 초과 투여될 수 있다. 일부 경우에, 리간드의 치료적 유효량은 적어도 매 시간, 적어도 매 2시간, 적어도 매 3시간, 적어도 매 4시간, 적어도 매 5시간, 적어도 매 6시간, 적어도 매 8시간, 적어도 매 9시간, 적어도 매 10시간, 적어도 매 11시간, 적어도 매 12시간, 적어도 매 13시간, 적어도 매 14시간, 적어도 매 15시간, 적어도 매 16시간, 적어도 매 17시간, 적어도 매 18시간, 적어도 매 19시간, 적어도 매 20시간, 적어도 매 21시간, 적어도 매 22시간, 적어도 매 23시간, 또는 적어도 매일 투여된다. 리간드의 투여량은 대상에게 연속적으로, 또는 일당 1, 2, 3, 4 또는 5회; 주당 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회, 월당 1, 2, 3 또는 4회, 2, 4, 5 또는 6월마다 1회 또는 일년에 1회 또는 더 오랜 기간에 투여될 수 있다. 치료의 기간은 하루, 1, 2 또는 3주, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 또는 11월, 1, 2, 3, 4, 5년 이상 또는 더 길게 지속될 수 있다.
본 발명에 기술된 방법 및 조성물에 의해 치료되는 대상은 인간일 수 있거나 비인간 동물일 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "치료하다" 및 이의 문법적 등가물은 일반적으로 질환의 증상을 감소, 제거 또는 예방하기 위한 조성물 또는 방법의 사용을 의미하며 치료적 효과 및/또는 예방적 효과의 달성을 포함한다. 치료적 효과는 치료되는 근본적인 장애 또는 상태의 박멸 또는 개선을 의미한다. 치료의 예방적 효과는 상태의 위험을 감소시키고, 상태의 진행을 지연시키거나 상태의 발생 가능성을 줄이는 것을 포함한다.
비-인간 동물의 비 제한적인 예는 비인간 영장류, 가축 동물, 애완 동물 및 실험 동물을 포함한다. 예를 들어, 비-인간 동물은 원숭이(예를 들어, 침팬지, 비비, 고릴라 또는 오랑우탄), 구세계 원숭이(예를 들어, 히말라야 원숭이), 신세계 원숭이, 개, 고양이, 들소, 낙타, 암소, 사슴, 돼지, 나귀, 말, 노새, 라마, 양, 염소, 버팔로, 순록, 야크, 마우스, 랫트, 토끼 또는 임의의 다른 비인간 동물일 수 있다. 본 발명에 기술된 바와 같은 조성물 및 방법은 가축 동물의 치료에 적용 가능하다. 가축 동물은 개, 고양이, 말, 암소, 양, 마우스, 랫트, 기니아 피그, 햄스터, 토끼, 뱀, 거북 및 도마뱀을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
K. 키트
본 발명에 유용한 조성물 및 시약은 키트에 포장되어 본 발명의 특정 실시태양의 응용을 용이하게 할 수 있도록 키트에 포장될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 한 실시태양에서, 키트는 본 발명에서 고려되는 재조합 바이러스를 포함한다. 본 발명에서 고려되는 키트의 실시태양은 또한 지침을 포함할 수 있다. 지침은 컴퓨터 판독가능 저장 매체와 같은 전자 저장 매체 상에 제공된 전자적으로 저장된 지침뿐만 아니라 하나 이상의 용기 상에 인쇄된 키트 삽입물에 인쇄된 임의의 원하는 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
키트는 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 임의의 구성요소를 포함할 수 있다. 한 경우에, 키트는 생약학적 조성물을 포함할 수 있다. 생약학적 조성물은 하나 이상의 치료적 유효량으로 제공될 수 있다. 한 경우에, 생약학적 조성물은 GPCR 또는 LGIC를 암호화하는 벡터를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 키트는 본 발명의 GPCR 또는 LGIC를 벡터에 복제하기에 적합한 빈 벡터 및 시약을 포함할 수 있다. GPCR 또는 LGIC의 복제에 적합한 시약의 비 제한적인 예는 주형 DNA 또는 RNA, 역전사 효소, 프라이머, dNTP, DNA 폴리머라제 및 완충액과 같은 GPCR 또는 LGIC 핵산 서열을 증폭하기 위한 시약; 제한 엔도뉴클레아제(즉, 제한 효소), DNA 리가아제 및 완충액과 같은 GPCR 또는 LGIC를 복제하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 키트는 본 발명에 기술된 바와 같은 하나 이상의 치료적 유효량의 리간드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 키트는 하나 이상의 치료적 유효량의 클로자핀-N-옥사이드를 포함한다. 다른 경우에, 키트는 하나 이상의 치료적 유효량의 살비노린 B를 포함한다.
키트는 경구 투여를 위한 정제 제제에 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 키트는 척수강내, 림프절내, 신경내, 두개내, 척수내 또는 피하 투여를 위한 액체 제제 중 임의의 조성물의 치료 유효량을 포함할 수 있다. 조성물은 본 발명에 기재된 임의의 제제(즉, 정제, 겔, 크림 등)로 제공될 수 있다. 일부 경우에, 키트는 건조된(즉, 동결 건조된) 형태 또는 분말 형태의 임의의 조성물을 포함할 수 있다. 건조되거나 분말화된 약물은 액체 용액(즉, 식염수)으로 재구성되어 액체 제제를 형성할 수 있다. 벡터 및 리간드 조성물은 개별적으로(예를 들어, 별개의 키트로) 제공될 수 있다. 키트는 본 발명에 기술된 바와 같은 하나 이상의 부형제(즉, 방부제, 담체 등)를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 조성물의 투여에 적합한 임의의 장치를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물의 주사용 제제를 포함하는 키트는 피하 투여에 적합한 바늘 및 주사 위치의 살균을 위한 알콜 수건을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 키트는 약물 발견을 위한 시약 및 물질을 포함할 수 있다. 이러한 성질의 키트는 화합물 스크리닝에 적합한 세포를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 일차 뉴런, 성상 세포 또는 신경아 교세포일 수 있다. 일부 경우에, 세포가 신경 줄기 세포 또는 신경 전구 세포에서 생성된 뉴런이다. 뉴런은 유도된 다 능성 줄기 세포(iPS)에서 생성될 수 있다. iPS 세포는 다능성(pluripotent) 상태로 복귀한 조작된 세포(예를 들어, 섬유아세포, 피부 세포 등)일 수 있다. 일부 경우에, iPS 세포는 대상 또는 환자로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 환자가 질환을 앓을 수 있다. 일부 경우에, iPS 세포는 뉴런을 생성하기위한 시약 및 지시와 함께 키트에 제공될 수 있다. 본 발명에 기술된 세포는 (예를 들어, 냉동 상태로) 바이알에 제공되거나 배양 준비가 된 접시 상에 제공될 수 있다. 키트는 본 발명의 세포를 성장시키는데 적합한 세포 배양 배지를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 키트는 대상으로부터 세포를 수집하고 iPS 세포를 생성하기 위한 기구 및 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 대상으로부터의 피부 세포(또는 피부 생검)를 수집하기 위한 도구 및 수집된 피부 세포로부터 iPS 세포를 생성하기 위한 시약 세트 (예를 들어, 형질감염 시약, iPS 마커 유전자(예를 들어, Oct4, SOX2, NANOG 등)의 발현을 위한 한 세트의 플라스미드)를 포함할 수 있다. 화합물 스크리닝 키트는 GPCR 또는 LGIC를 암호화하는 벡터 또는 핵산 분자를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 키트는 스크리닝을위한 하나 이상의 후보 화합물을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 후보 화합물은 GPCR 또는 LGIC에 대한 리간드이다. 특정 예에서, 키트는 뉴런에서 표적 GPCR 또는 LGIC를 활성화시키는 화합물을 스크리닝하기 위한 시약 및 도구를 포함할 수 있다. 키트는 세포 배양 조건에서의 뉴런 활성을 측정하기 위한 도구(예를 들어, 패치 클램프 시스템, 전압-민감성 염료 등)를 추가로 포함할 수 있다.
일부 경우에, 키트에 지침이 제공될 수 있다. 지침은 키트에 제공되거나 전자적으로(예를 들어, 월드 와이드 웹) 접근할 수 있다. 이 지침은 본 발명의 조성물을 어떻게 사용하는지에 대한 정보를 추가로 제공할 수 있다. 이 지침은 본 발명의 장치를 어떻게 사용하는지에 대한 정보를 추가로 제공할 수 있다. 이 지침은 본 발명의 방법을 어떻게 실행하는지에 대한 정보를 추가로 제공할 수 있다. 일부 경우에, 이 지침은 투약 정보를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 이 지침은 작동 메커니즘, 약물의 제형, 부작용 위험, 금기 사항 등과 같은 약물 정보를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 키트는 클리닉이나 병원에서 투여를 위해 의사 또는 건강 관리 제공자가 구입한다. 일부 경우에, 키트는 실험실에서 구입하여 후보 화합물을 스크리닝하는 데 사용된다.
본 발명은 다음 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에 설명된 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다; 오히려, 이들 실시태양이 제공되어 본 발명이 철저하고 완전해지며 당업자에게 본 발명의 범위를 충분히 전달할 것이다.
[표 4]
예시적 유전자 치료 벡터 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예
실시예 1. hSYN1-GlyR 알파1 F207A/A288G AAV 벡터의 제조.
V272-pFB-inCap6(Y705 + Y731F + T492V)-inRep-Kan의 복제
주입된 SbfI 위치 및 돌연변이(T492V)를 함유하는 390bp의 cap6 단편을 프라이머 2793F 및 2794R로 PCR 증폭한다. 주입된 BsiWI 위치 및 돌연변이(T492V)를 함유하는 440bp의 cap6 단편을 프라이머 2795F 및 2796R로 PCR 증폭한다. 증폭 생성물을 겔 전기 영동에 의해 분리하고 정제한다.
정제된 390bp 및 440bp PCR 생성물을 오버랩 PCR에 적용하여 프라이머 2793F 및 2796R을 갖는 810bp cap6 단편을 생성한다. 증폭 생성물을 겔 전기 영동에 의해 분리하고 정제한다.
정제된 810bp cap6 단편을 SbfI 및 BsiWI로 분해시키고, SbfI 및 BsiWI로 분해시킨 V220 벡터에 결찰시켜 V272-pFB-inCap6(Y705 + 731F + T492V)-inRep-Kan을 생성시킨다.
프라이머 서열:
프라이머 프라이머 서열 5' to 3' SEQ ID NO:
2793F ATAGGACCCTGCAGGTATAC 16
2794R CGTTTCTAAAGTAAAAACAGACAACAACAA 17
2795F CTGTTTTTACTTTAGAAACGCGCTGCTGCC 18
2796R GTACCAGTTGCCGTACGTCC 19
SWB01-pFB-hSyn-Gly (F207A + A288G)의 클로닝
하기 단편을 PCR 증폭시켰다 : (a) hSyn 프로모터(510bp)를 주형으로서 hSYN 플라스미드를 사용하여 프라이머 2799F 및 2800R로 PCR 증폭하고; (b) 야생형 글리신 수용체 α1 플라스미드를 주형으로 사용하여 프라이머 2801F 및 2802R로 글리신 수용체 알파 1 단편(652bp)을 PCR 증폭한다; (c) 프라이머 2803F 및 2804R 및 야생형 글리신 수용체 알파 1 플라스미드를 주형으로 사용하여 글리신 수용체 알파 1 프래그먼트 (266bp)를 PCR 증폭한다; (d) 프라이머 2805F 및 2806R 및 야생형 글리신 수용체 알파 1 플라스미드를 주형으로 사용하여 글리신 수용체 알파 1 프라 에이트 (461bp)를 PCR 증폭한다; (e) bGHpA 단편 (282bp)을 V261을 주형으로하여 프라이머 2807F, 2808F 및 2809R로 PCR 증폭한다. 증폭 생성물은 겔 전기 영동에 의해 단리되고 정제된다.
정제된 PCR 단편을 오버랩 PCR에서 사용하여 하기의 더 큰 단편을 생성한다 : (1) 단편(a), (b) 및 (c)를 프라이머 2799F 및 2804R에 의한 오버랩 PCR을 사용하여 결합시키고(1338bp); (2) 단편(c), (d) 및 (e)를 프라이머 2803F 및 2809R에 의한 오버랩 PCR을 사용하여 함께 결합시켰다(971bp). 증폭 생성물은 겔 전기 영동에 의해 단리되고 정제된다.
단편 1을 KpnI 및 AvrII로 절단하고 단편 2를 AvrII 및 SphI로 절단하였다. 이들 단편을 KpnI 및 SphI로 절단된 pFB-sc-EGFP에 연결시켜 SWB01-pFB-hSyn-Gly (F207A + A288G)를 생성시킨다.
프라이머 서열:
프라이머 프라이머 서열 5' to 3' SEQ ID NO:
2799F GATCTGGTACCACTAGACTGCAGAGGGCCC 20
2800R GTGGCTAGCAGCTTGAATTCTCGACTGCGCTCTCAGGCAC 21
2801F GAATTCAAGCTGCTAGCCACCATGGCTCGCTCCGCACCCA 22
2802R TGCAGGTGGCTTTACCTGTGTTGTAGTGCT 23
2803F CACAGGTAAAGCCACCTGCATTGAGGCCCG 24
2804R GCAGGCAAACTCCCATCCAAATGTCAATGG 25
2805F GGATGGGAGTTTGCCTGCTCTTTGTGTTCT 26
2806R ATCCTTGTAATCGAGCGGCCGCGTACGCGTCTGGTTGTGGACGTCCTCTC 27
2807F GGCCGCTCGATTACAAGGATGACGACGATAAGGTTTAAATCGATACCGTC 28
2808F AAGGTTTAAATCGATACCGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTG 29
2809R CCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATC 30
재조합 바큘로바이러스를 생성시켜 1 x 1013 벡터 게놈(vg)/mL에서 AAV6-Gly(hSYN-GlyR(F207A/A288G)-FLAG 및 AAV6(Y705F+Y731F+T492V)-Gly(hSYN-GlyR(F207A/A288G)-FLAG)를 생산한다.
실시예 2. 만성 통증의 설치류 모델의 치료.
만성 통증 유도 및 치료
0일: 만성 협착 손상(CCI, CCI/CFA) 또는 예비 신경 손상(SNI) 모델과 같은 확립된 말초 신경 손상 방법을 사용하여 설치류 삼차 신경절 또는 후근 신경절에서 만성 통증을 유도한다. See Bennett & Xie. Pain. 1988, Decosterd & Woolf. Pain. 2000, and Imamura, Kawamoto, & Nakanishi. Exp. Brain Res. 1997 참조. 일부 경우에, 바이러스 벡터 주입 후 신경 손상이 발생할 수 있다.
7일: 대략 1.0-10μL의 부피로 AAV6(Y705F+Y731F+T492V)-HSYN-GLYR(F207A/A288G)-FLAG 또는 AAV6-GLY(HSYN-GLYR(F207A/A288G)-FLAG의 108-1010 벡터 게놈의 신경절내 또는 척수강내 주사를 공개된 방법을 사용하여 하나 또는 여러 개의 후근 신경절 또는 삼차 신경절에서 수행한다. Vit, Ohara, Sundberg et al. Mol Pain. 2009 and Towne, Fischer, Kostic, et al. J Neurosci Methods. 2011, and Pertin, et al. Mol Pain. 2009 참조.
CCI 또는 SNI 후 2 내지 12 주: 이버멕틴은 일당 0.1-10.0 mg/kg의 최종 투여량으로 경구 위관 영양법(PO), 복강 내 주사(IP), 피하 주사(SC) 또는 식수 중을 통해 투여된다. 통증 및 불안 행동 분석은 어퍼란트 분석법(operant assay), 본 프레이(Von Frey) 필라멘트를 통한 기계적 이질통/통각 과민 반응, 하그레이베스(Hargreaves) 방법을 통한 열 이질통/통각 과민 반응, 또는 십자형 높은 미로를 통한 불안 행동을 포함하는 확립된 통각성 제거 분석을 사용하여 진통 수준을 정량화하기 위해 수행한다. review Odd-Geir Berge. Br J Pharmacol. 2011 참조.
통증과 관련된 행동 또는 불안은 대조군에 비해 10%-500%의 정량가능한 개선으로 이버멕틴 존재하에서만 측정가능하게 감소될 것이다. 진통 또는 통증 관련 행동의 감소는 이버벡틴을 투여하지 않은 생리 식염수에서 탐지되지 않을 것이다.
유전자 발현 분석법
바이러스 벡터 주사 후 1 내지 52주: AAV6(Y705F+Y731F+T492V)-HSYN-GLYR(F207A/A288G)-FLAG 또는 AAV6-GLY(HSYN-GLYR(F207A/A288G)-FLAG의 주사 이후, 신경절을 회수하고, 처리하고, 분할하고, 항-FLAG 항체에 의한 GlyR-FLAG 유전자 형질전환 발현에 대해 현미경으로 분석하고, NF200, 페리피린, IB4, 물질 P, TRPV1, CGRP, TrkA, Advillin, ATF3, Iba1, NPY, PKCy 또는 GFAP에 대한 항체로 대조염색하였다.
유전자 발현은 주로 뉴런에 대해 검출 가능하고 주로 국소화될 것이며 주변의 비-뉴런 조직 및 세포에는 주로 존재하지 않을 것이다. 유전자 발현은 대측성 대조군 조직에는 존재하지 않을 것이다.
실시예 3. 만성 통증을 앓고 있는 환자의 치료.
만성 통증을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 척수 지주막하 공간(즉, 척수강내) 내에 12.0mL의 부피로 AAV-hSYN1-hM4Di의 1015개 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 선택적 뉴런 발현을 위한 인간 시냅신-1(SYN1) 프로모터의 제어하에서 인간 무스카린 DREADD, hM4Di를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 클로자핀-N-옥사이드(CNO)에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 필요에 따라(즉, 통증 사건 동안) 100μM CNO를 경구로 자가 투여한다.
실시예 4. 만성 통증을 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 만성 근염 통증을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 하나 이상의 후근 신경절(즉, 요추, 자궁 경부 또는 흉부 DRG로의 신경절내 대류 강화 전달) 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-hSYN1-GlyR-M의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 선택적 뉴런 발현을 위한 인간 시냅신-1(SYN1) 프로모터의 제어하에서 F207A/A288G 돌연변이, GlyR-M을 보유하는 인간 글리신 수용체를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 이버멕틴(IVM)에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 필요에 따라(즉, 통증 사건 동안) 0.1mg/kg IVM을 경구로 자가 투여한다.
실시예 5. 만성 통증을 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 만성 두개내 통증(예를 들어, 삼차 신경통 또는 악관절 기능 장애)을 앓는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 하나 이상의 삼차 신경절(즉, 신경절내 대류 강화 전달) 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-hSYN1-GlyR-M의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 선택적 뉴런 발현을 위한 인간 시냅신-1(SYN1) 프로모터의 제어하에서 F207A/A288G 돌연변이, GlyR-M을 보유하는 인간 글리신 수용체를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 이버멕틴(IVM)에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 필요에 따라(즉, 통증 사건 동안) 0.1mg/kg IVM을 경구로 자가 투여한다.
실시예 6. 만성 통증을 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 만성 췌장 통증(예를 들어, 췌장염 또는 췌장암)을 앓는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 복강 신경 신경총(즉, 뉴런내) 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-hSYN1-GlyR-M의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 선택적 뉴런 발현을 위한 인간 시냅신-1(SYN1) 프로모터의 제어하에서 F207A/A288G 돌연변이, GlyR-M을 보유하는 인간 글리신 수용체를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 이버멕틴(IVM)에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 필요에 따라(즉, 통증 사건 동안) 0.1mg/kg IVM을 경구로 자가 투여한다.
실시예 7. 비만증을 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 비만증을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 미주 신경의 위 분지(즉, 뉴런내) 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-그렐린-GlyR-M의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 선택적 뉴런 발현을 위한 인간 그렐린 프로모터의 제어하에서 F207A/A288G 돌연변이, GlyR-M을 보유하는 인간 글리신 수용체를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 이버멕틴(IVM)에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 과체중 감소(즉, 식욕 억제를 위한)를 위해 경구로 매일 0.1mg/kg IVM을 자가 투여한다.
실시예 8. 비만증을 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 비만증을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 췌장을 자극하는 후근 신경절(즉, 신경절내) 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-TRPV1-GlyR-M의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 선택적 뉴런 발현을 위한 인간 TRPV1 프로모터의 제어하에서 F207A/A288G 돌연변이, GlyR-M을 보유하는 인간 글리신 수용체를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 이버멕틴(IVM)에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 과체중 감소를 위해 경구로 매일 0.1mg/kg IVM을 자가 투여한다.
실시예 9. 비만증을 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 비만증을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 시상하부에서 방실 핵(PVH)(즉, 두개내, 대류 증강된 전달) 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-SIM1-hM3Dq의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 프로오피오멜라노코르틴(POMC) 뉴런에서 선택적 뉴런 발현 및 궁극적으로는 식욕부진 경로의 자극을 위해 인간 단일 염색체 가족 BHLH 전사 인자 1(SIM1) 프로모터의 조절하에서 인간 무스 카린 DREADD, hM3Dq를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 클로자핀에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 과체중 감소(즉, 식욕 억제를 위한)를 위해 경구로 매일 0.15mg/kg 클로자핀을 자가 투여한다.
실시예 10. 비만증을 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 비만증을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 시상하부에서 방실 핵(PVH)(즉, 두개내, 대류 증강된 전달) 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-OXT-hM3Dq의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 선택적 뉴런 발현 및 궁극적으로 식 부진 경로의 자극을 위해 인간 옥시토신(OXT) 프로모터의 제어하에서 인간 무스카린 DREADD, hM3Dq를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 퍼라핀에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 과체중 감소(즉, 식욕 억제를 위한)를 위해 경구로 매일 0.5mg/kg 퍼라핀을 자가 투여한다.
실시예 11. 비만증을 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 비만증을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 시상하부에서 아치형 핵(즉, 두개내) 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피에서 AAV-AgRP-KORD의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 선택적인 뉴런 발현 및 궁극적으로 식욕유발 경로의 억제를 위한 인간 아고우티 관련 펩티드(AgRP) 프로모터의 제어하에서 인간 카파 오피오이드 수용체 DREADD, KORD를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 살비노린-B에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 과체중 감소(즉, 식욕 억제를 위한)를 위해 경구로 매일 0.1mg/kg 살비노린-B를 자가 투여한다.
실시예 12. 비만증을 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 비만증을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 편도 중앙핵(CEA)의 측면 세분(CEI)(즉, 두개강내) 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-PKC-δ-hM3Dq의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 CEA GABA 뉴런에서 선택적인 뉴런 발현을 위해 인간 단백질 키나아제 C-δ(PKC-δ) 프로모터의 제어하에서 인간 무스카린 DREADD, hM3Dq를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 클로자핀에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 과체중 감소(즉, 식욕 억제를 위한)를 위해 경구로 매일 0.15mg/kg 클로자핀을 자가 투여한다.
실시예 13. PTSD를 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 외상 후 스트레스 장애 (PTSD)를 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 C6 성상 신경절(즉, 신경절내) 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-hSYN1-hM4Di의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 선택적 뉴런 발현을 위한 인간 시냅신-1(hSYN1) 프로모터의 제어하에서 인간 무스카린 DREADD, hM4Di를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 클로자핀에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 PTSD 증상(즉 불안)에 대해 경구로 매일 0.15 mg/kg 클로자핀을 자가 투여한다.
실시예 14. 우울증을 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 치료 저항성 우울증(TRD)을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 미주 신경(즉, 신경내) 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-hSYN1-GlyR-M의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 선택적 뉴런 발현을 위한 인간 시냅신-1(SYN1) 프로모터의 제어하에서 F207A/A288G 돌연변이, GlyR-M을 보유하는 인간 글리신 수용체를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 이버멕틴(IVM)에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 우울 증상에 대해 경구로 매일 0.1mg/kg IVM을 자가 투여한다.
실시예 15. GERD를 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 위식도 역류 질환(GERD)을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 하부 식도 괄약근 (LES) 미주 신경 및 근육 내 신경총(즉, 뉴런내) 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-hSYN1-hM3Dq의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 선택적 뉴런 발현을 위한 인간 시냅신-1(hSYN1) 프로모터의 제어하에서 인간 무스카린 DREADD, hM3Dq를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 클로자핀에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 GERD의 증상(즉, 산 역류)에 대해 경구로 매일 0.15mg/kg 클로자핀을 자가 투여한다.
실시예 16. GERD를 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 위식도 역류 질환(GERD)을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 하부 식도 괄약근 (LES) 평활근(즉, 근육내) 내에 직접 전달되는 1.0mL 부피의 AAV-CAG-hM3Dq의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 LES 근세포에서의 발현을 위한 하이브리드 치킨-베타 액틴(CAG) 프로모터의 조절하에서 인간 무스카린 DREADD, hM3Dq를 암호화하고 궁극적으로는 평활근증을 증가시킨다. 주사 2주 후, 환자는 클로자핀에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 GERD의 증상(즉, 산 역류)에 대해 경구로 매일 0.15mg/kg 클로자핀을 자가 투여한다.
실시예 17. 간질을 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시 예에서, 간질과 관련된 발작을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 미주 신경(즉, 뉴런내)에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-hSYN1-GlyR-M의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 선택적 뉴런 발현을 위한 인간 시냅신-1(hSYN1) 프로모터의 제어하에서 F207A/A288G 돌연변이, GlyR-M을 보유하는 인간 글리신 수용체를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 이버멕틴(IVM)에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 간질 증상(즉, 발작)에 대해 경구로 매일 0.1mg/kg IVM을 자가 투여한다.
실시예 18. 간질을 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 간질과 관련된 발작을 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 모터 피질(즉, 두개내피)과 같은 사전 결정된 발작 초점 내에 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-CamKIIα-KORD의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 흥분성 뉴런에서 선택적인 뉴런 발현을 위한 인간 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나아제 IIα(CamKIIα) 프로모터의 제어하에서 인간 카파 오피오이드 수용체 DREADD, KORD를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 살비노린-B에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 간질 증상(즉, 발작)에 대해 경구로 매일 0.1mg/kg 살비노린-B를 자가 투여한다.
실시예 19. 운동 장애를 앓고 있는 환자의 치료.
비 제한적 실시예에서, 운동 장애(예를 들어, 파킨슨성 진전)를 앓고 있는 환자를 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료한다. 환자를 1일에 시상 하부 핵(즉, 두개내 STN)으로 직접 전달되는 1.0mL의 부피의 AAV-CamKIIα-KORD의 1013개의 벡터 게놈으로 치료한다. 이 실시예에서, AAV 벡터는 흥분성 뉴런에서 선택적인 뉴런 발현을 위한 인간 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나아제 IIα(CamKIIα) 프로모터의 제어하에서 인간 카파 오피오이드 수용체 DREADD, KORD를 암호화한다. 주사 2주 후, 환자는 살비노린-B에 대한 처방을 위해 진료소로 돌아간다. 환자는 운동 장애 증상(즉, 진전)에 대해 경구로 매일 0.1mg/kg 살비노린-B를 자가 투여한다.
실시예 20. 스위치 수용체를 발현하는 바이러스 벡터에 의한 통증 치료.
스위치 수용체를 발현하는 바이러스 벡터의 사용은 전문이 본 발명에 참조로 포함된 Iyer, S. M. et al. Optogenetic and chemogenetic strategies for sustained inhibition of pain. Sci. Rep. 6, 30570; doi: 10.1038/srep30570 (2016)에 도시된 바와 같이 통증을 억제하는데 사용될 수 있다.
간략하게, 암컷 C57BL/6 마우스의 좌골 신경에 인간 시냅신-1 프로모터의 제어하에서 SwiChR-eYFP를 갖는 AAV6 벡터를 주사하였다. SwiChR은 단계 기능 억제 채널로돕신이다. 주사 2 내지 3주 후, SwiChR의 강한 발현은 일차 구심성 통각 수용체를 통해 탐지되었다. Id. AAV6-hSyn-SwiChR-eYFP 주사 마우스로부터 얻어진 해리된 배양된 후근 신경절(DRGs)로부터의 기록은 SwiChR이 청색광 펄스에 반응하고, 조명 동안 입력 저항의 현저한 감소를 유도한다는 것을 보여주었다. Id. 경피적으로 전달된 청색광이 SwiChR 발현 마우스에서 통각성 분석법에 영향을 미쳤다. SwiChR, YFP 또는 클로라이드 전도 억제 채널로돕신 iC1C2를 발현하는 마우스에 대한 블라인드 기계적 역치 분석법은 청색광이 iC1C2 + 및 SwiChR + 마우스에서 기계적 철수 역치 및 열 대기 시간 측정치를 통계적으로 유의하게 증가시켰지만 YFP + 마우스에서는 그렇지 않았다. Id. 열 회수 대기 시간은 변형된 하그레아베스(Hargreaves) 장치를 사용하여 평가하였다. 배양된 SwiChR + DRG 뉴런에서, 1회의 1초 청색광 펄스는 광 펄스 동안뿐만 아니라, 이후 수초 동안 전기적으로 유발된 활동 전위의 억제를 유도하는데 충분했으며, 높은 스파이크 억제 확률은 광 자극 후에 60초 직후 관찰되었다. Id. 예상한 바와 같이, 광생성 억제는 적색광을 이용한 조명을 통해 신속하게 종결될 수 있으며, 이는 SwiChR 채널을 폐쇄하게 한다. Id. SwiChR의 이런 '광-이후' 억제 특성은 생체내에서 보유되어, 마우스에서 '광-이후' 기간 동안 광생성 억제를 가능하게 하였다. Id. 적절하게 시간을 정한 보조광 펄스는 SwiChR 매개 억제의 지속 기간을 연장하는데 사용될 수 있다. 일시적으로 희박한 청색광 펄스 1시간 후에도, SwiChR + 마우스는 단일 청색광 펄스 후에 관찰된 상승된 임계치와 통계적으로 구별할 수 없는 안정적으로 상승된 통증 역치를 나타내었다. Id. YFP + 마우스는 기계적 역치에서 유의한 변화를 나타내지 않았다. Id. 포르말린 테스트(일반적으로 사용되는 통증 분석법, 이의 제 1 단계는 주로 통각 수용체의 직접 활성화에 의해 유도되며, 이의 제 2 단계는 염증 및 척수 촉진 메커니즘에 의해 부분적으로 유도된다)는 변환된 무수 1차 구심체의 광생성 억제가 SwiChR + 마우스에서 통각 수용체-유발 제 1 단계 통증 행동을 감소시키는데 충분하지만, 제 2 단계에서 관찰된 광범위한 염증 반응을 완화시키는데는 불충분하다는 것을 나타내었다.
일차 구심성 통각 수용체에서 hM4D(Gi) DREADD의 발현은 기계적 및 열적 통각 수용의 억제를 허용하였다. Id. 암컷 C57BL/6 마우스는 AAV6-hSyn-HA-hM4D(Gi) -IRES-mCitrine을 두개내로 주사하였고, mCitrine 발현은 작은 지름의 통각 수용체에서 관찰되었다. Id. hM4D + 마우스에 복강내 클로자핀-N-옥사이드(CNO) 투여는 기계적 회피 역치를 증가시켰다. Id. 하그레아베스 역치의 강한 억제는 hM4D + 마우스에 대한 CNO 투여 후에 관찰되었으며, 열 감각의 화학적 억제를 입증하였다. Id.
실시예 21. 스위치 수용체를 발현하는 바이러스 벡터를 갖는 신경 분지 결찰 손상 모델에서 통증의 치료.
AAV 벡터 생산
인간 α-1 GlyRM(F207A+A288G)-FLAG cDNA의 발현을 유도하는 인간 시냅신-1(hSYN) 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 제작하였다(벡터의 설명에 대해 도 5 및 SEQ ID NO: 1 참조). 이 카세트를 자체 상보성 AAV 백미드(bacmid)에 서브클로닝하고, 정제하고, Sf9 곤충 세포로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 제조한 다음 증폭시켰다. Sf9 세포를 hSYN-GlyRM 카세트를 함유하는 증폭된 재조합 바큘로바이러스 및 Rep 및 AAV6(Y705+731F+T492V) Cap 유전자를 함유하는 다른 재조합 바큘로바이러스를 사용하여 이중 감염시켜 재조합 AAV 벡터를 생성시켰다. 이들 벡터를 정제하고, qPCR(2.15e13 vg/ml)을 사용하여 바이러스 역가를 측정하고, SDS-PAGE를 사용하여 AAV 벡터(Virovek)의 순도를 확인하였다.
후각 속에 AAV 척수 주사
척추골의 2개의 세그먼트(약 1.5-2mm)를 노출시키기 위해 척추의 확대 수준에서 등쪽 지혈절제술을 실시한 후, 척수강을 절개하여 반사시켰다. 바이러스 용액을 유리 미세 피펫(미네랄 오일로 미리 채워짐)에 넣었다. 마이크로 피펫을 정위 장치에 장착된 수동 마이크로 인젝터에 연결하였다. 바이러스 용액은 후각(왼쪽)을 표적으로 하였다. 노출된 영역 내의 어긋나는 꼬리 축을 따라, 등거리 직선 방식으로 각각 240nl을 6회 주사하였다. 매 주사 후, 1분의 휴식 시간이 관찰된 다음 근육 층을 봉합하고 피부를 스테이플로 막으면서 동물을 가열 패드로 회복시켜 우리로 돌려보냈다. 마지막 행동 테스트 후에 동물을 조직학적 분석을 위해 관류하였다.
후근 신경절(DRG) 내의 AAV-신경절내 주사
주사는 마이크로주사 펌프(microinjection pump)에 장착된 주사기에 폴리에틸렌 튜빙(0.4/0.8mm 내경/외경)에 의해 부착된 미세 지점으로 당겨진 붕규산염 유리 모세관(0.78/1mm 내경/외경)으로 수행하였다. 바늘은 바깥쪽으로 휘둘러진 정위 프레임의 연장된 팔(바늘만 잡고 잡고 조작하는데 사용)에 설치되었다. 배관, 주사기 및 바늘은 모두 물로 채웠다. 1μL의 공기를 바늘에 넣고 1.1μL의 바이러스 벡터 용액을 넣었다. 각 주사마다 바늘에 이 부피를 따로 넣었다. 동물들은 수술 전에 마취시켰다. 등쪽 정중선을 따라 절개한 후, L4와 L5 DRG는 척추의 외측 돌기를 제거함으로써 노출되었다. DRG 위에 놓여있는 상피를 열고 유리 바늘을 노출된 신경절의 표면에서 400μm의 깊이까지 신경절로 삽입했다. 유리 모세관 팁 주위의 조직을 밀봉하기 위해 3분의 지연 후, 1.1μl 바이러스 용액을 0.2μl/분의 속도로 주사하였다. 2분의 추가 지연 후, 바늘을 제거하였다. L4 신경절을 먼저 주사하고 L5 신경절을 주사하였다. 척수 상부의 근육을 5-0 봉합과 함께 느슨하게 봉합하고 상처를 막았다. 동물을 37℃에서 회복시켰고 수술 후 진통제를 주사하였다.
마우스에서 AAV 척수강내 주사
마우스를 먼저 마취시킨 다음, 이들의 머리를 정위 프레임에 고정시키고 수직으로 놓았다. 목덜미 능선의 홈이 노출되도록 목의 기부에 절개를 하였다. 외과 적막에서 뇌척수액이 누출될 정도의 깊이로 절개를하였다(1-2mm). 4cm 32G 척수강내 카테터를 요추 척수 방향으로 천천히 삽입하고 피부를 카테터 주위에 봉합하여 막았다. 그런 후에 마우스를 회복시켰다. 그런 후에, 마우스를 마취시키고 벡터(6μl)를 투여하였다. 카테터에 6μl의 PBS를 흘려보낸 다음 제거하고 생쥐를 회복시켰다.
행동 실험 및 통증 모델
신경병증성 통증 상태를 모방하는 모델에서 기계적 과민성을 생성하기 위해, 기계적 이질통의 유효 모델인 예비 신경 손상(SNI) 모델을 사용하였다(Shields et al, 2003, The Journal of Pain, 4, 465-470). 이 모델은 일반적인 비골 신경과 절개 신경을 절단하고 경골 가지를 분리하여 만들었다(도 7 참조). 상승된 철망 격자 상에 마우스를 위치시키고 폰 프레이(von Frey) 필라멘트로 뒷발의 발바닥 표면을 자극함으로써 기계적 회피 역치를 평가하였다. 차플란 & 야크쉬(Chaplan & Yaksh)의 업-다운(up-down) 방법은 AAV-GlyRM의 척수 주입 전에 기계적 역치를 결정하는데 사용되었다. 척수의 후각에 편측성 벡터 주사 3주 후에, 동물을 다시 검사하여 기계적 역치가 변화하지 않았음을 확인하였다. 벡터 주입에 대한 동측과 반대쪽의 뒷발을 테스트하였다. 이 연구에 포함된 동물 중 어느 것도 GlyRM 형질전환 유전자를 함유하는 AAV의 주사로 인해 역치 변화를 겪지 않았다. 모터 조정은 가속 회전로드(Stoelting, USA)를 사용하여 최고 속도 33rpm으로 테스트하였다. 마우스가 로타로드(rotarod)에서 소비한 시간이 기록되었고, 300초에 종료하였다. 각 마우스는 세 번의 훈련을 거쳐 2시간 후에 테스트하였다. 결과적으로, 모든 마우스에게 이버멕틴(15mg/kg 또는 10mg/kg)을 단일 IP 주사하여 SNI 후 1, 2, 5, 7 및 13 일에 업-다운 방법을 사용하여 기계적 역치를 다시 테스트하였다. 15mg/kg으로 테스트했을 때, 기계적 과민 반응의 완전한 역전이 관찰되었다. 반대쪽면에는 변화가 없었고, 즉, 이버멕틴은 벡터가 없을 때 측정 가능한 효과가 없었다. 반전은 최소 5일 동안 지속되었다. 역치가 손상 후 기준선으로 돌아온 13일째에, 10mg/kg을 IP로 주사하고 다시 비 손상 기준선 역치로의 회복을 관찰하였다. 이 동물들을 48시간 동안 추적하고 역치는 기준선에서 유지되었다. 그런 후에, 동물을 조직학을 위해 관류하였다.
인간 α-1 GlyRM(F207A + A288G)(SWB001 또는 AAV-GlyRM으로도 불림)의 발현을 유도하는 인간 시냅신-1(hSYN) 프로모터를 함유하는 AAV 벡터는 반대편의 손상되지 않은 대조군 면과 비교하여, 이버멕틴의 단일 IP 주사 후 7-10일의 기간 동안 SNI 모델에서 100% 진통을 일으켰다(도 7 참조). 13일까지 이버멕틴 세척 후, 반복적인 이버멕틴 투약은 SNI 모델에서 100% 진통을 일으켰다(도 8 참조).
조직 처리 및 면역조직화학
면역조직화학은 전술한 바와 같이 수행되었다(Braz et al, Neuron, 74(4): 663-675, 2012). 간단히 말하자면, 케타민(60mg/kg)/자일라진(8mg/kg)/아세프로마진(3mg/kg)의 혼합된 식염수로 마취시키고 0.1% 염수 인산염 완충액(PBS)을 경심적으로 관류하고 PBS 속 4% 파라포름알데하이드(PFA)를 경심적으로 관류하였다. 그런 후에 척수를 척추후궁절제술에 의해 추출 후 동일한 고정액에서 2시간 동안 이차고정하고 4℃에서 30% 수크로오스/PBS 용액으로 동결보호하였다. 요천추 후근 신경절(DRGs)도 해부하였고, 동일한 이차고정과 동결보호 프로토콜을 실행하였다.
요추 척수 절편을 저온 유지 장치(Leica Microsystems)를 사용하여 절단하였다. 횡단면(25μm 두께)을 절단하고 PBS가 들어있는 48-웰 플레이트에 넣고 4℃에 보관하였다. DRGs는 TissueTek OCT 화합물(Bayer)에 담갔다. 횡단면(14μm)을 절단하고 슈퍼프로스트 플러스(Superfrost Plus) 슬라이드(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)에 올려 놓고 실온에서 1시간 건조하고 4℃에서 보관하였다. 조직 절편을 PBS/0.3 % Triton X-100(PBS-T, Sigma, St. Louis, MO)에서 3번 세척하고, 1% NGST 용액에서 실온(RT)으로 밤새 1차 항체를 첨가하기 전에, 10% 정상 염소 혈청/PBS/0.3% Triton X-100(NGST)에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 후에, 절편을 PBS-T 용액으로 3회 세척하고, 실온에서 알렉사 형광단-접합 이차 항체로 1시간 동안 배양하였다. 절편을 PBS로 3회 세척하고, 공기 건조시키고, 아쿠아 폴리몬트(Aqua Polymont)(Polysciences, Inc., Warrington, USA)를 사용하여 덮개를 씌웠다. 일차 FLAG 항체(토끼, 1:4000, 시그마 # F7425)를 사용하여 GlyRM-FLAG 형질전환 유전자 발현을 검출하였다. 일차 염색은 1% NGST에서 1:800으로 희석된 알렉사 형광단에 접합된 상응하는 이차 항체로 나타났다. 면역염색된 절편은 Zeiss LSM700 수직 공촛점 형광 현미경으로 영상화하였다. 인간 α-1 GlyRM(F207A + A288G)의 발현을 유도하는 인간 시냅신-1(hSYN) 프로모터를 포함하는 AAV 벡터의 강력한 발현이 다중 투여 경로를 통해 주사 3주 후 관찰되었다(도 6).
실시예 22. 스위치 수용체를 발현하는 바이러스 벡터에 의한 치료의 열 통증 민감성에 대한 효과.
AAV 주사 및 열 회피 잠복기 분석법
0일에, α1GlyR(F207A-A288G) 형질전환 유전자를 함유하는 10 마이크로리터 AAV 벡터의 양측 삼차 신경절 주사를 성체 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 랫트에서 수행하였다. AAV 주사 2개월 후, 이버멕틴 10mg/kg의 단일 IP 주사를 랫트에 투여하였다. 다음날, 수염 패드를 포함하지 않게 뺨에서 털을 깎아내어 열 잠복기 분석을 위해 랫트를 준비하였다. 그런 후에, 직경 2.75 인치 x 8 인치 투명 폴리 카보네이트 실린더에 넣고 환경에 적응시켰다. 랫트는 자연스럽게 자신의 주둥이가 실린더 입구 바깥에 있도록 위치한다. 비디오 모니터링하에, 랫트를 2W의 적외선(808nm) 레이저 조명의 빔에 노출시켜 면도한 뺨 영역에서 약 1mm x 0.5mm의 목표 크기를 투사하였다. 그런 후에 래트는 갑작스런 머리 위치 변화(회피 반사)로 레이저에 의해 생성된 열에 반응하였다. 그런 후에 각 측에 10회 시도까지 순서를 반복하였다. 레이저 조명 개시와 머리 회피 반사 사이의 잠복기는 프레임 단위로 분석을 허용하는 비디오 편집 소프트웨어를 사용하여 비디오에서 측정하였다.
결과
개별 대상 결과를 도 9에 나타내었고 평균 결과는 도 10에 나타내었다. 이버 멕틴으로 전처리한 테스트 랫트의 평균 열 회피 잠복기는 2.69초 이었다. 이버멕틴(10mg/kg)의 IP 투여 후, 평균 회피 잠복기는 5.19초로 결정되었고, 페어드 t-테스트(paired t-test) p 값 = 0.054 이었다. 따라서 이벅멕틴 치료는 열 통증 민감성에서 92.9%의 통각과민 역치 이동을 초래하였다.
전술한 다양한 실시태양은 결합되어 추가적인 실시태양을 제공할 수 있다. 본 발명에 언급되거나 및/또는 응용 데이터 시트에 나열된 미국 특허, 미국 특허 출원 간행물, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비 특허 간행물은 각 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 개별적으로 참조로 포함되도록 표시된 것과 같은 정도로 본 발명에 참조로 포함된다. 추가 실시태양을 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 출판물의 개념을 채용할 필요가 있는 경우, 실시태양의 양태는 변형될 수 있다.
전술한 상세한 설명에 비추어 실시태양 대한 이들 및 다른 변화가 이루어질 수 있다. 일반적으로, 다음의 청구 범위에서, 사용된 용어는 청구 범위를 명세서 및 청구 범위에 개시된 특정 실시태양으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 이런 청구 범위에 대한 균등물의 전체 범위와 함께 가능한 모든 실시태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구 범위는 본 발명에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> SWITCH BIO, INC. Greenberg, Kenneth P. David, Nathaniel Finer, Mitchell H. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING NEUROLOGICAL DISORDERS AND PAIN MANAGEMENT <130> SWCH-004/01WO 322917-2031 <150> US 62/220,087 <151> 2015-09-17 <150> US 62/220,077 <151> 2015-09-17 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6890 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSYN1-GlyRalpha1 F207A/A288G gene therapy vector <400> 1 gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 60 gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 120 acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 180 agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 240 ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 300 ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 360 taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 420 aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat 480 gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 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Claims (267)

  1. 신경 질환을 앓는 대상에게 생물학적으로 비활성인 제제 또는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 대상은 G 단백질-결합 수용체 또는 리간드-개폐 이온 채널(LGIC)을 이종성으로 발현하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 대상은 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 상동성으로 발현하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 대상은 G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 전위성으로 발현하는 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체는 디자이너 드럭(Designer Drug)에 의해 독점적으로 활성화되는 디자이너 수용체(Designer Receptor)(DREADD)인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 DREADD는 hM4Di, hM3Dq, AlstR 또는 KOR-DREADD인 방법.
  7. 제 3 항에 있어서,
    상기 생물학적으로 불활성인 제제는 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀, 살비노린 B, 알라토스타틴, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 DREADD는 hM4Di이며; 상기 생물학적으로 불활성인 제제는 클로자핀-N-옥사이드이며; 상기 신경 질환은 간질이 아닌 방법.
  9. 제 2 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 상기 생물학적으로 비활성인 제제 또는 상기 약물에 의해 활성화되는 방법.
  10. 제 2 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 스위치 수용체인 방법.
  11. 제 2 항에 있어서,
    상기 투여 전에, 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 상기 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 바이러스 벡터에서 상기 대상에게 전달되는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터인 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9로부터 유도되는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV6(Y705+731F+T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8인 방법.
  16. 제 13 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함하는 방법.
  17. 제 11 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 상기 대상에게 전달되는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사인 방법.
  19. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 통증인 방법.
  20. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 포만감 장애인 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 포만감 장애는 비만증, 신경성 식욕 부진증 또는 신경성 대식증인 방법.
  22. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암인 방법.
  23. 제 2 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체는 Gi- 또는 Gq-결합되는 방법.
  24. 제 2 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 흥분성 세포에서 선택적으로 발현되는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 흥분성 세포는 뉴런 또는 근육 세포인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 뉴런은 후근 신경절 또는 감각 뉴런인 방법.
  27. 제 1 항에 있어서,
    상기 투여는 경구, 척수강내 또는 국소 투여를 포함하는 방법.
  28. 제 11 항에 있어서,
    상기 전달은 척수강내, 신경절내, 두개내, 피하, 척추내, 대수조 또는 신경내 전달을 포함하는 방법.
  29. 제 11 항에 있어서,
    상기 생물학적으로 비활성인 제제 또는 상기 약물은 상기 전달의 적어도 일주일 후에 투여되는 방법.
  30. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적으로 비활성인 제제 또는 상기 약물은 0.001㎍/㎏ 내지 10mg/㎏의 투여량으로 투여되는 방법.
  31. 제 11 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 시냅신, TRPV1, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, CamKII, NSE 또는 Advillin 프로모터를 포함하는 방법.
  32. 제 1 항에 있어서,
    상기 대상은 사람인 방법.
  33. 제 1 항에 있어서,
    상기 대상은 가축 동물인 방법.
  34. G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법으로서, 여기서 상기 약물은 생물학적으로 비활성인 제제 또는 합성 리간드인 방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체는 DREADD인 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 DREADD는 hM4Di, hM3Dq, AlstR 또는 KOR-DREADD인 방법.
  37. 제 34 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 스위치 수용체인 방법.
  38. 제 34 항에 있어서,
    상기 생물학적으로 불활성인 제제는 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀, 살비노린 B, 알라토스타틴, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀인 방법.
  39. 제 34 항에 있어서,
    상기 투여는 경구, 척수강내 또는 국소 투여를 포함하는 방법.
  40. 제 34 항에 있어서,
    상기 투여 전에, 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 상기 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 암호화하는 상기 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 전달되는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터인 방법.
  43. 제 42 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9로부터 유도되는 방법.
  44. 제 42 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV6(Y705+731F+T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8인 방법.
  45. 제 40 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 상기 대상에게 전달되는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서,
    상기 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사인 방법.
  47. 제 34 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 통증인 방법.
  48. 제 34 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 포만감 장애인 방법.
  49. 제 48 항에 있어서,
    상기 포만감 장애는 비만증, 신경성 식욕 부진증 또는 신경성 대식증인 방법.
  50. 제 34 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암인 방법.
  51. 제 40 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 시냅신, TRPV1, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, CamKII, NSE 또는 Advillin 프로모터를 포함하는 방법.
  52. G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법으로서, 여기서 상기 약물은 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC에 대한 내인성 리간드가 아닌 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체는 hM4Di, hM3Dq, AlstR 또는 KOR-DREADD인 방법.
  54. 제 52 항에 있어서,
    상기 약물은 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀, 살비노린 B, 알라토스타틴, 클로자핀, 올란자핀, 퍼라핀, 플루퍼라핀, 알로세트론, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀인 방법.
  55. 제 52 항에 있어서,
    상기 투여 전에, 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 상기 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  56. 제 52 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 흥분성 세포에서 선택적으로 발현되는 방법.
  57. 제 56 항에 있어서,
    상기 흥분성 세포는 뉴런 또는 근육 세포를 포함하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서,
    상기 뉴런은 감각 뉴런, 후근 신경절 또는 삼차 신경절인 방법.
  59. 제 55 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 전달되는 방법.
  60. 제 59 항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터인 방법.
  61. 제 60 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9로부터 유도되는 방법.
  62. 제 60 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV6(Y705+731F+T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8인 방법.
  63. 제 55 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 상기 대상에게 전달되는 방법.
  64. 제 63 항에 있어서,
    상기 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사인 방법.
  65. 제 52 항에 있어서,
    상기 약물은 합성 리간드인 방법.
  66. 제 52 항에 있어서,
    상기 약물은 0.001㎍/kg 내지 10mg/kg의 투여량으로 투여되는 방법.
  67. 제 52 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 통증, 비만증, 식욕 부진, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암인 방법.
  68. 다음 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법: G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계, 여기서 상기 대상은 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 이종성으로 발현한다, 및 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 활성화하는 약물을 상기 대상에게 투여하여, 상기 대상에서 상기 신경 질환을 치료하는 단계, 여기서 상기 약물은 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 암호화하는 핵산 분자의 전달의 적어도 1주 후 상기 대상에게 투여된다.
  69. 제 68 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 암호화하는 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 상기 대상에게 전달되는 방법.
  70. 제 69 항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터인 방법.
  71. 제 70 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9인 방법.
  72. 제 70 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV6(Y705+731F+T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8인 방법.
  73. 제 68 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 상기 대상에게 전달되는 방법.
  74. 제 73 항에 있어서,
    상기 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사인 방법.
  75. 제 68 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 통증, 간질, 비만, 식욕 부진, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암인 방법.
  76. 제 68 항에 있어서,
    상기 약물은 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀, 살비노린 B, 알라토스타틴, 클로자핀, 올란자핀, 퍼라핀, 플루퍼라핀, 알로세트론, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀인 방법.
  77. 제 68 항에 있어서,
    상기 약물은 0.001㎍/㎏ 내지 10mg/㎏의 투여량으로 투여되는 방법.
  78. 제 68 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 흥분성 세포에서 선택적으로 발현되는 방법.
  79. 제 78 항에 있어서,
    상기 흥분성 세포는 뉴런 또는 근육 세포인 방법.
  80. 제 79 항에 있어서,
    상기 뉴런은 감각 뉴런, 후근 신경절 또는 삼차 신경절인 방법.
  81. 제 68 항에 있어서,
    적어도 3일 연속 동안 매일 상기 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  82. 다음 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법: G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 활성화시키는 약물을 투여하는 단계, 여기서 상기 약물은 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC에 대한 내인성 리간드가 아니며, 상기 약물은 카파-오피오이드 수용체-(KOR) 결합 약물이 아닌 방법.
  83. 제 82 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체는 카파-오피오이드 수용체(KOR) 이외의 G 단백질-결합 수용체인 방법.
  84. 제 82 항에 있어서,
    상기 이종성 G 단백질-결합 수용체는 DREADD인 방법.
  85. 제 84 항에 있어서,
    상기 DREADD는 hM4Di, hM3Dq, 또는 AlstR인 방법.
  86. 제 82 항에 있어서,
    상기 약물은 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀, 살비노린 B, 알라토스타틴, 클로자핀, 올란자핀, 퍼라핀, 플루퍼라핀, 알로세트론, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀인 방법.
  87. 제 82 항에 있어서,
    상기 투여 전에, 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 상기 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  88. 제 87 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 바이러스 벡터에 의해 전달되는 방법.
  89. 제 88 항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터인 방법.
  90. 제 89 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9인 방법.
  91. 제 89 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV6(Y705+731F+T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8인 방법.
  92. 제 87 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 상기 대상에게 전달되는 방법.
  93. 제 92 항에 있어서,
    상기 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사인 방법.
  94. 제 82 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 통증인 방법.
  95. 제 82 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 포만감 장애인 방법.
  96. 제 95 항에 있어서,
    상기 포만감 장애는 비만증, 신경성 식욕 부진증 또는 신경성 대식증인 방법.
  97. 제 82 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 통증, 간질, 비만증, 식욕 부진, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암인 방법.
  98. 제 82 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 흥분성 세포에서 선택적으로 발현되는 방법.
  99. 제 98 항에 있어서,
    상기 흥분성 세포는 뉴런 또는 근육 세포인 방법.
  100. 제 99 항에 있어서,
    상기 뉴런은 감각 뉴런, 후근 신경절 또는 삼차 신경절인 방법.
  101. 제 82 항에 있어서,
    상기 투여는 경구, 척수강내 또는 국소 투여를 포함하는 방법.
  102. G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법으로서, 여기서 상기 약물은 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC에 대한 내인성 리간드가 아니며, 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 감각 뉴런, 후근 신경절, 삼차 신경절, 미주 신경, 뇌 또는 근육 세포에서 선택적으로 발현되는 방법.
  103. 제 102 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체는 DREADD인 방법.
  104. 제 103 항에 있어서,
    상기 DREADD는 hM4Di, hM3Dq, AlstR 또는 KOR-DREADD인 방법.
  105. 제 102 항에 있어서,
    상기 약물은 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀, 살비노린 B, 알라토스타틴, 클로자핀, 올란자핀, 퍼라핀, 플루퍼라핀, 알로세트론, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀인 방법.
  106. 제 102 항에 있어서,
    상기 투여 전에, 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  107. 제 106 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 바이러스 벡터에서 상기 대상에게 전달되는 방법.
  108. 제 107 항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터인 방법.
  109. 제 108 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9로부터 유도되는 방법.
  110. 제 108 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV6(Y705+731F+T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8인 방법.
  111. 제 106 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 상기 대상에게 전달되는 방법.
  112. 제 111 항에 있어서,
    상기 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사인 방법.
  113. 제 102 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 통증인 방법.
  114. 제 102 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 간질인 방법.
  115. 제 102 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 포만감 장애인 방법.
  116. 제 115 항에 있어서,
    상기 포만감 장애는 비만증, 신경성 식욕 부진증 또는 신경성 대식증인 방법.
  117. 제 102 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체는 Gi- 또는 Gq-결합되는 방법.
  118. 제 102 항에 있어서,
    상기 투여는 경구, 척수강내 또는 국소 투여를 포함하는 방법.
  119. 제 106 항에 있어서,
    상기 전달은 척수강내, 신경절내, 두개내, 피하, 척추내, 대수조 또는 신경내 전달을 포함하는 방법.
  120. 제 102 항에 있어서,
    상기 약물은 상기 전달 적어도 1주 후에 투여되는 방법.
  121. 제 102 항에 있어서,
    상기 약물은 0.001㎍/㎏ 내지 10mg/㎏의 투여량으로 투여되는 방법.
  122. 제 102 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 시냅신, TRPV1, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, CamKII, NSE 또는 Advillin 프로모터를 포함하는 방법.
  123. 제 102 항에 있어서,
    상기 대상은 사람인 방법.
  124. G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계, 및 상기 대상에게 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 신경 질환을 치료하는 방법으로서, 여기서 상기 약물은 FDA 승인을 받았지만 상기 신경 질환의 치료를 위해 FDA 승인을 받지 못한 방법.
  125. 제 124 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 상기 대상에서 발현되는 방법.
  126. 제 125 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 상기 대상에서 이종성으로 발현되는 방법.
  127. 제 126 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 상기 대상에서 상동성으로 발현되는 방법.
  128. 제 127 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC는 상기 대상에서 전위성으로 발현되는 방법.
  129. 제 124 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합 수용체는 DREADD인 방법.
  130. 제 129 항에 있어서,
    상기 DREADD는 hM4Di, hM3Dq, AlstR 또는 KOR-DREADD인 방법.
  131. G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 이종성으로 발현하는 대상에게 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법으로서, 여기서 상기 약물은 0.001㎍/kg 내지 10mg/kg의 투여량으로 투여되는 방법.
  132. 제 131 항에 있어서,
    상기 약물은 클로자핀-N-옥사이드, 날프라핀, 살비노린 B, 알라토스타틴, 클로자핀, 올란자핀, 퍼라핀, 플루퍼라핀, 알로세트론, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 또는 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀인 방법.
  133. G 단백질-결합 수용체 또는 LGIC를 암호화하는 핵산 분자를 대상에게 전달하는 단계 및 상기 G 단백질-결합 수용체 또는 상기 LGIC를 활성화시키는 약물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법으로서, 여기서 상기 약물은 전달 후 적어도 3일 연속으로 상기 대상에게 투여되는 방법.
  134. 제 133 항에 있어서,
    상기 약물은 전달 적어도 일주일 후에 상기 대상에게 투여되는 방법.
  135. 리간드-개폐 이온 채널을 이종성으로 발현하는 대상에게 상기 리간드-개폐 이온 채널을 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법.
  136. 제 135 항에 있어서,
    상기 약물은 글리신, 베타-알라닌 또는 타우린이 아닌 방법.
  137. 제 135 항에 있어서,
    상기 리간드-개폐 이온 채널은 본래 별개의 폴리펩타이드로 암호화된 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열의 융합에 의해 생성된 이온 전도 기공 도메인 및 리간드 결합 도메인을 포함하는 방법.
  138. 제 137 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 cys 루프 수용체 유전자 패밀리의 2개 이상의 구성원을 포함하는 방법.
  139. 제 137 항에 있어서,
    상기 이온 전도 기공 도메인은 음이온을 전도하는 방법.
  140. 제 137 항에 있어서,
    상기 이온 전도 기공 도메인은 양이온을 전도하는 방법.
  141. 제 137 항에 있어서,
    상기 리간드 결합 도메인은 클로자핀-N-옥사이드, 클로자핀, 퍼라핀, 올란자핀, 알로세트론, 플루퍼라핀 또는 N4'-알킬 치환된 CNO 유사체의 결합에 의해 활성화되는 방법.
  142. 제 137 항에 있어서,
    상기 리간드 결합 도메인은 니코틴, 바레니클린 또는 갈란타민의 결합에 의해 활성화되는 방법.
  143. 제 1 항, 제 34 항, 제 52 항, 제 68 항, 제 82 항, 제 102 항, 제 124 항, 제 131 항, 제 133 항 및 제 135 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드-개폐 이온 채널은 GlyR-M, GluCl, PSAM-5HT3HC, PSAM-GlyR, PSAM-nAChR, TRPV1 또는 GABAA인 방법.
  144. 제 135 항 내지 제 143 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약물은 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에피리노멕틴, 아바멕틴, 목시덱틴, PSEM22S, PSEM89S, PSEM9S, 캡사이신 또는 졸피뎀인 방법.
  145. 제 135 항에 있어서,
    투여 전에, 상기 리간드-개폐 이온 채널을 암호화하는 핵산 분자를 상기 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  146. 제 145 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 상기 대상에게 전달되는 방법.
  147. 제 146 항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터인 방법.
  148. 제 147 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV-6 또는 AAV-9로부터 유도되는 방법.
  149. 제 147 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV6(Y705 + 731F + T492V), AAV9(Y731F) 또는 AAV-7m8인 방법.
  150. 제 147 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함하는 방법.
  151. 제 145 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 비-바이러스 방법에 의해 상기 대상에게 전달되는 방법.
  152. 제 151 항에 있어서,
    상기 비-바이러스 방법은 리포펙션, 나노입자 전달, 입자 폭격, 전기천공, 초음파 또는 미세주사인 방법.
  153. 제 135 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 통증인 방법.
  154. 제 135 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 간질인 방법.
  155. 제 135 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 포만감 장애인 방법.
  156. 제 155 항에 있어서,
    상기 포만감 장애는 비만증, 신경성 식욕 부진증 또는 신경성 대식증인 방법.
  157. 제 135 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암인 방법.
  158. 제 135 항에 있어서,
    상기 리간드-개폐 이온 채널은 흥분성 세포에서 선택적으로 발현되는 방법.
  159. 제 158 항에 있어서,
    상기 흥분성 세포는 뉴런 또는 근육 세포인 방법.
  160. 제 159 항에 있어서,
    상기 뉴런은 감각 뉴런, 후근 신경절 또는 삼차 신경절인 방법.
  161. 제 135 항에 있어서,
    상기 투여는 경구, 척수강내 또는 국소 투여를 포함하는 방법.
  162. 제 145 항에 있어서,
    상기 전달은 척수강내, 신경절내, 두개내, 피하, 척추내, 대수조 또는 신경내 전달을 포함하는 방법.
  163. 제 135 항에 있어서,
    상기 약물은 상기 전달 적어도 1주일 후에 투여되는 방법.
  164. 제 145 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 시냅신, TRPV1, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, CamKII, NSE 또는 Advillin 프로모터를 포함하는 방법.
  165. 제 135 항에 있어서,
    상기 대상은 사람인 방법.
  166. 제 135 항에 있어서,
    상기 대상은 가축 동물인 방법.
  167. 리간드-개폐 이온 채널을 이종성으로 발현하는 대상에게 상기 리간드-개폐 이온 채널을 활성화시키는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환의 치료 방법으로서, 여기서 상기 약물은 약물은 0.001㎍/㎏ 내지 10mg/㎏의 투여량으로 투여되는 방법.
  168. 제 167 항에 있어서,
    상기 리간드-개폐 이온 채널은 GlyR-M, GluCl, PSAM-5HT3HC, PSAM-GlyR, PSAM-nAChR, TRPV1 또는 GABAA인 방법.
  169. 제 167 항에 있어서,
    상기 약물은 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에피리노멕틴, 아바멕틴, 목시덱틴, PSEM22S, PSEM89S, PSEM9S, 캡사이신 또는 졸피뎀인 방법.
  170. 제 167 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 통증, 포만감 장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간질, 비만증, 식욕 부진, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암인 방법.
  171. 제 170 항에 있어서,
    상기 통증은 완화되는 방법.
  172. 신경 세포에서 작동 가능한 프로모터를 포함하는 AAV 벡터로서, 여기서 프로모터는 스위치 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되는 AAV 벡터.
  173. 제 172 항에 있어서,
    프로모터는 뉴런 특이적 프로모터인 AAV 벡터.
  174. 제 173 항에 있어서,
    뉴런 특이적 프로모터는 삼차 신경절(TGG) 뉴런 또는 후부 신경절(DRG) 뉴런에서 작동 가능한 프로모터인 AAV 벡터.
  175. 제 173 항 또는 제 174 항에 있어서,
    뉴런 특이적 프로모터는 hSYN1 프로모터, 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II 프로모터, 튜불린 알파 I 프로모터, 뉴런-특이적 엔올라아제 프로모터, 혈소판-유도 성장 인자 베타 사슬 프로모터, TRPV1 프로모터, Nav1.7 프로모터, Nav1.8 프로모터, Nav1.9 프로모터, 또는 Advillin 프로모터인 AAV 벡터.
  176. 제 173 항 내지 제 175 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런 특이적 프로모터는 hSYN1 프로모터인 AAV 벡터.
  177. 제 172 항 또는 제 173 항에 있어서,
    프로모터는 구조성 프로모터인 AAV 벡터.
  178. 제 177 항에 있어서,
    구조성 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터, 바이러스 유사 바이러스 40(SV40), 모로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)(티미딘 키나아제) 프로모터, 천연두 바이러스로부터의 H5, P7.5 또는 P11 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세롤알데하이드 3-인산 탈수소효소(GAPDH), 진핵 세포 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열충격 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 충격 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/치킨 β-액틴(CAG) 프로모터, 또는 β-액틴 프로모터인 AAV 벡터.
  179. 제 172 항 또는 제 173 항에 있어서,
    프로모터는 유도성 프로모터인 AAV 벡터.
  180. 제 179 항에 있어서,
    유도성 프로모터는 테트라사이클린 반응 프로모터, 엑디손 반응 프로모터, 쿠메이트 반응 프로모터, 글루코코르티코이드 반응 프로모터, 에스트로겐 반응 프로모터, PPAR-γ 프로모터 또는 RU-486 반응 프로모터인 AAV 벡터.
  181. 제 172 항 내지 제 180 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 리간드-개폐 이온 채널 또는 G-결합 단백질 수용체를 포함하는 AAV 벡터.
  182. 제 172 항 내지 제 181 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체의 활성은 세포외 리간드에 의해 조절되는 AAV 벡터.
  183. 제 182 항에 있어서,
    리간드는 비-천연적으로 발생되거나 합성되는 AAV 벡터.
  184. 제 182 항 또는 제 183 항에 있어서,
    스위치 수용체를 발현하는 세포의 활성은 세포외 리간드가 스위치 수용체에 결합할 때 증가되며, 선택적으로 활성은 전기생리학적 활성인 AAV 벡터.
  185. 제 172 항 내지 제 184 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 hM3Dq, GsD, PSAM-5HT3HC, PSAM-nAChR 또는 TRPV1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV 벡터.
  186. 제 182 항 내지 제 185 항 중 어느 한 항에 있어서,
    리간드는 PSEM22S, PSEM9S, 캡사이신, 클로자핀, 퍼라핀, 알로세트론, 플루퍼라핀, 올란자핀, 클로자핀-N-옥사이드, 클로자핀-N-옥사이드 유사체: 3-클로로-6-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4] 벤조다이아제핀, 4-(8-클로로-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀-11-일)-1,1-다이메틸피페라진-1-움 요오드화물, 3-클로로-6-(피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀, 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 및 11-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV 벡터.
  187. 제 182 항 또는 제 183 항에 있어서,
    스위치 수용체를 발현하는 세포의 활성은 세포외 리간드가 스위치 수용체에 결합할 때 감소되고, 선택적으로 활성은 전기생리학적 활성인 AAV 벡터.
  188. 제 187 항에 있어서,
    스위치 수용체는 AlstR, hM4Di, KORD, GluCl, PSAM-GlyR, GlyR-M 및 GABA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV 벡터.
  189. 제 172 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 글리신 수용체(GlyR) 폴리펩타이드의 하나 이상의 서브 유닛을 포함하는 AAV 벡터.
  190. 제 172 항 내지 제 189 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 글리신 수용체 α1 서브 유닛(GlyRα1) 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  191. 제 189 항 또는 제 190 항에 있어서,
    GlyRα1 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  192. 제 189 항 내지 제 191 항 중 어느 한 항에 있어서,
    GlyRα1 폴리펩타이드는 아미노산 치환:
    (a) F207A 및 A288G;
    (b) A-1'E, F207A 및 A228G; 또는
    (c) A-1'E, P-2'Δ, T13'V, F207A 및 A228G를 포함하는 AAV 벡터.
  193. 제 189 항 내지 제 192 항 중 어느 한 항에 있어서,
    리간드는 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에프리노멕틴, 아바멕틴 및 목시덱틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV 벡터.
  194. 제 193 항에 있어서,
    리간드는 이버멕틴인 AAV 벡터.
  195. 제 172 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 GluClα 또는 GluClβ 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  196. 제 195 항에 있어서,
    GluClα 또는 GluClβ 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  197. 제 195 항 또는 제 196 항에 있어서,
    리간드는 이버멕틴, 셀라멕틴, 도라멕틴, 에마멕틴, 에프리노멕틴, 아바멕틴 및 목시덱틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV 벡터.
  198. 제 172 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 PSAM-5HT3HC 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  199. 제 198 항에 있어서,
    PSAM-5HT3HC 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  200. 제 198 항 또는 제 199 항에 있어서,
    리간드는 PSEM22S인 AAV 벡터.
  201. 제 172 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 PSAM-GlyR 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  202. 제 201 항에 있어서,
    PSAM-GlyR 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  203. 제 201 항 또는 제 202 항에 있어서,
    리간드는 PSEM89S인 AAV 벡터.
  204. 제 172 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 PSAM-nAChR 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  205. 제 204 항에 있어서,
    PSAM-nAChR 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  206. 제 204 항 또는 제 205 항에 있어서,
    리간드는 PSEM9S인 AAV 벡터.
  207. 제 172 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 TRPV1 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  208. 제 207 항에 있어서,
    TRPV1 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  209. 제 207 항 또는 제 208 항에 있어서,
    리간드는 캡사이신인 AAV 벡터.
  210. 제 172 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 GABAA 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  211. 제 210 항에 있어서,
    GABAA 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  212. 제 210 항 또는 제 211 항에 있어서,
    리간드는 졸피뎀인 AAV 벡터.
  213. 제 172 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 AlstR 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  214. 제 213 항에 있어서,
    AlstR 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  215. 제 213 항 또는 제 214 항에 있어서,
    리간드는 알라토스타틴인 AAV 벡터.
  216. 제 172 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 hM4Di 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  217. 제 216 항에 있어서,
    hM4Di 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  218. 제 216 항 또는 제 217 항에 있어서,
    리간드는 CNO, 날프라핀, 클로자핀, 퍼라핀, 올란자핀, 알로세트론, 플루퍼라핀, 및 N4'-알킬 치환된 CNO 유사체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV 벡터.
  219. 제 218 항에 있어서,
    N4'-알킬 치환된 CNO 유사체는 3-클로로-6-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4] 벤조다이아제핀, 4-(8-클로로-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀-11-일)-1,1-다이메틸피페라진-1-움 요오드화물, 3-클로로-6-(피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀, 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 및 11-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV 벡터.
  220. 제 172 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 KORD 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  221. 제 220 항에 있어서,
    KORD 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  222. 제 220 항 또는 제 221 항에 있어서,
    리간드는 살비노린 B인 AAV 벡터.
  223. 제 172 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 hM3Dq 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  224. 제 223 항에 있어서,
    hM3Dq 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  225. 제 223 항 또는 제 224 항에 있어서,
    리간드는 CNO, 날프라핀, 클로자핀, 퍼라핀, 올란자핀, 알로세트론, 플루퍼라핀, 및 N4'-알킬 치환된 CNO 유사체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV 벡터.
  226. 제 225 항에 있어서,
    N4'-알킬 치환된 CNO 유사체는 3-클로로-6-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4] 벤조다이아제핀, 4-(8-클로로-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀-11-일)-1,1-다이메틸피페라진-1-움 요오드화물, 3-클로로-6-(피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀, 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 및 11-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV 벡터.
  227. 제 172 항 내지 제 188 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스위치 수용체는 GsD 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  228. 제 227 항에 있어서,
    GsD 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  229. 제 227 항 또는 제 228 항에 있어서,
    리간드는 CNO, 날프라핀, 클로자핀, 퍼라핀, 올란자핀, 알로세트론, 플루퍼라핀, 및 N4'-알킬 치환된 CNO 유사체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV 벡터.
  230. 제 229 항에 있어서,
    N4'-알킬 치환된 CNO 유사체는 3-클로로-6-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4] 벤조다이아제핀, 4-(8-클로로-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀-11-일)-1,1-다이메틸피페라진-1-움 요오드화물, 3-클로로-6-(피페라진-1-일)-5H-벤조[b][1,4]벤조다이아제핀, 8-클로로-11-[4-(1,1-다이듀트리오에틸)피페라진-1-일]-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀, 11-(피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀 및 11-(4-에틸피페라진-1-일)-5H-다이벤조[b,e][1,4]다이아제핀으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV 벡터.
  231. 제 172 항 내지 제 230 항 중 어느 한 항에 있어서,
    벡터는 에피토프 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 AAV 벡터.
  232. 제 231 항에 있어서,
    에피토프 태그는 말토스 결합 단백질("MBP"), 글루타티온 S 전이효소(GST), HIS6, MYC, FLAG, V5, VSV-G 및 HA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 AAV 벡터.
  233. 제 172 항 내지 제 230 항 중 어느 한 항에 있어서,
    벡터는 폴리(A)서열을 추가로 포함하는 AAV 벡터.
  234. 제 233 항에 있어서,
    폴리(A)서열은 SV40 폴리(A)서열, 소 성장 호르몬 폴리(A)서열(bGHpA) 또는 토끼 β-글로빈 폴리(A)서열(rβgpA)인 AAV 벡터.
  235. 제 233 항 또는 제 234 항에 있어서,
    폴리(A)서열은 bGHpA인 AAV 벡터
  236. 제 172 항 내지 제 235 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AV 벡터는 하나 이상의 AAV2 역전된 말단 반복(ITR)을 포함하는 AAV 벡터.
  237. 제 172 항 내지 제 236 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV1, AAV1(Y705+731F+T492V), AAV2(Y444+500+730F+T491V), AAV3(Y705+731F), AAV5, AAV5(Y436+693+719F), AAV6, AAV6(VP3 변이체 Y705F/Y731F/T492V), AAV-7m8, AAV8, AAV8(Y733F), AAV9, AAV9(VP3 변이체 Y731F), AAV10(Y733F), 및 AAV-ShH10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 혈청형을 포함하는 AAV 벡터.
  238. 제 172 항 내지 제 237 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV1, AAV5, AAV6, AAV6(Y705F/Y731F/T492V), AAV8, AAV9 및 AAV9(Y731F)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 혈청형을 포함하는 AAV 벡터.
  239. 제 172 항 내지 제 238 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV6, AAV6(Y705F/Y731F/T492V), AAV9 및 AAV9(Y731F)로 이루어진 그룹에서 선택된 혈청형을 포함하는 AAV 벡터.
  240. 제 172 항 내지 제 239 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV6 또는 AAV6(Y705F/Y731F/T492V) 혈청형을 포함하는 AAV 벡터.
  241. 제 172 항에 있어서,
    프로모터는 DRG 뉴런 또는 TGG 뉴런에서 작동 가능하고, 스위치 수용체는 GlyRα1 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  242. 제 172 항에 있어서,
    프로모터는 hSYN-1 프로모터이고, 스위치 수용체는 아미노산 치환 F207A 및 A288G를 추가로 포함하는 GlyRα1 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  243. 제 172 항에 있어서,
    AAV 혈청형은 AAV1, AAV1(Y705+731F+T492V), AAV2(Y444+500+730F+T491V), AAV3(Y705+731F), AAV5, AAV5(Y436+693+719F), AAV6, AAV6(VP3 변이체 Y705F/Y731F/T492V), AAV-7m8, AAV8, AAV8(Y733F), AAV9, AAV9(VP3 변이체 Y731F), AAV10(Y733F) 또는 AAV-ShH10이고, 프로모터는 hSYN-1 프로모터이고, 스위치 수용체는 아미노산 치환 F207A 및 A288G를 추가로 포함하는 GlyRα1 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  244. 하나 이상의 AAV2 ITR, AAV6 혈청형, hSYN-1 프로모터, 및 아미노산 치환체;
    (a) F207A 및 A288G;
    (b) A-1'E, F207A 및 A228G; 또는
    (c) A-1'E, P-2'Δ, T13'V, F207A 및 A228G를 추가로 포함하는 GlyRα1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  245. 하나 이상의 AAV2 ITR, AAV6(Y705F/Y731F/T492V) 혈청형, hSYN-1 프로모터 및 아미노산 치환체 F207A 및 A288G를 추가로 포함하는 GlyRα1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV 벡터.
  246. 제 242 항 내지 제 245 항 중 어느 한 항에 있어서,
    bGHpA를 추가로 포함하는 AAV 벡터.
  247. 제 242 항 내지 제 246 항 중 어느 한 항에 있어서,
    FLAG 에피토프 태그를 추가로 포함하는 AAV 벡터.
  248. 제 172 항 내지 제 247 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 자기-상보적 AAV(scAAV)벡터인 AAV 벡터.
  249. 제 172 항에 있어서,
    AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1을 포함하는 AAV 벡터.
  250. 제 172 항 내지 제 249 항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조성물.
  251. 제 172 항 내지 제 249 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상에서 신경 질환을 관리, 예방 또는 치료하는 방법.
  252. 제 251 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 포만감 장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간질, 비만증, 식욕 부진, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류 질환(GERD), 중독, 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 본태진전, 운동 장애, 심방 세동 또는 뇌암인 방법.
  253. 제 172 항 내지 제 249 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 대상에서 통증을 관리, 예방 또는 치료하는 방법.
  254. 제 172 항 내지 제 249 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 통증을 가진 대상에게 진통을 제공하는 방법.
  255. 제 253 항 또는 제 254 항에 있어서,
    통증은 급성 통증 또는 만성 통증인 방법.
  256. 제 253 항 내지 제 255 항 중 어느 한 항에 있어서,
    통증은 만성 통증인 방법.
  257. 제 253 항 내지 제 255 항 중 어느 한 항에 있어서,
    통증은 급성 통증, 만성 통증, 신경병증성 통증, 통각 장애 통증, 이질통, 염증성 통증, 염증성 통각 과민증, 신경병증, 신경통, 당뇨병성 신경병증, 인간 면역결핍 바이러스-관련 신경병증, 신경 손상, 류마티스성 관절염 통증, 골관절염 통증, 화상, 허리 통증, 눈 통증, 내장 통증, 암 통증(예를 들어, 골암 통증), 치통, 두통, 편두통, 손목 터널 증후군, 섬유 근육통, 신경염, 좌골 신경통, 골반 과민증, 골반 통증, 대상포진 후 신경통, 수술 후 통증, 뇌졸중 후 통증 또는 생리통인 방법.
  258. 제 253 항 내지 제 255 항 중 어느 한 항에 있어서,
    통증은 통각성 통증인 방법.
  259. 제 253 항 내지 제 255 항 중 어느 한 항에 있어서,
    통증은 중추 신경계 외상, 좌상/염좌, 화상, 심근 경색 및 급성 췌장염, 수술 후 통증(임의 유형의 외과 수술 후 통증), 외상 후 통증, 신장 산통, 암 통증 및 허리 통증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 통각성 통증인 방법.
  260. 제 253 항 내지 제 255 항 중 어느 한 항에 있어서,
    통증은 신경병증성 통증인 방법.
  261. 제 260 항에 있어서,
    신경병증성 통증의 원인은 말초 신경병증, 당뇨병성 신경병증, 대상포진 후 신경통, 삼차 신경통, 허리 통증, 암 신경병증, HIV 신경병증, 환상 사지 통증, 손목 터널 증후군, 뇌졸중 후 중추 통증 및 만성 알코올 중독, 갑상선 기능 저하증, 요독증, 다발성 경화증, 척수 손상, 파킨슨병, 간질 및 비타민 결핍과 관련된 통증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  262. 제 260 항에 있어서,
    신경병증성 통증은 관절염, 이질통증, 전형적인 삼차 신경통, 삼차 신경통, 신체형 장애, 감각 저하, 통각과민, 신경통, 신경염, 신경원성 통증, 진통, 무감각 통증, 작열통, 좌골 신경통 장애, 퇴행성 관절 장애, 섬유근통, 내장 질환, 만성 통증 장애, 편두통/두통, 만성 피로 증후군, 복합 부위 통증 증후군, 신경장애, 족저근막 염증 또는 암 관련 통증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 통증 장애와 관련이 있는 방법.
  263. 제 253 항 내지 제 255 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가 실시태양에서, 통증은 염증성 통증인 방법.
  264. 제 253 항 내지 제 255 항 중 어느 한 항에 있어서,
    통증은 근골격계 장애, 근육통, 섬유 근육통, 척추염, 혈청-음성(비-류마티스성) 관절증, 비-관절 류마티스, 이상영양장애, 글리코겐 분해, 다발성근염 및 근염; 심장 및 혈관 통증, 협심증, 심근 경색, 승모판 협착증, 심낭염, 레이노 현상, 다발성 경화증 및 골격근 허혈에 의한 통증; 두통, 편두통, 군발 두통, 긴장형 두통 혼합 두통 및 혈관 장애와 관련된 두통; 안면 통증, 치통, 귀 통증, 구강 건조 증후군 및 저작근 근막통과 관련이 있는 방법.
  265. 제 253 항 내지 제 255 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 172 항 내지 제 249 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터 또는 제 250 항의 조성물은 대상에게 척수강내 투여되는 방법.
  266. 제 253 항 내지 제 255 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 172 항 내지 제 249 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터 또는 제 250 항의 조성물은 대상에게 신경절내 투여되는 방법.
  267. 제 253 항 내지 제 255 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 172 항 내지 제 249 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터 또는 제 250 항의 조성물은 대상에게 신경내 투여되는 방법.
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